專利名稱：一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于禽類用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉及其制備方法。
背景技術(shù)：
鴨痕(Duckplape)又名鴨病毒性腸炎(Duck virus enteritis, DVE),是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病的特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都高。早在1923年Baudet氏在荷蘭首次發(fā)現(xiàn)本病，直到1940年Bos氏首次提出鴨瘟的名稱，并確認(rèn)是一種不同于雞瘟的新病毒病。以后在歐、美各國均有本病發(fā)生的報(bào)道。鴨瘟在我國流行的正式報(bào)道是黃引賢1957年在廣東首先提出的，隨后武漢、上海、浙江、江蘇、廣西、湖南和福建等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，至80年代傳播到東北各省。1957年以來，本病廣泛流行于我國華南、華中、華東養(yǎng)鴨業(yè)較發(fā)達(dá)地區(qū)，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，1963年全國農(nóng)業(yè)科學(xué)規(guī)劃會(huì)議將防制鴨瘟作為重點(diǎn)課題，其后許多單位進(jìn)行了大量的防治研究工作，并成功地研制了各類預(yù)防用疫苗，從而有效地控制了本病的發(fā)生和流行，有力地保障了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。鴨瘟病是養(yǎng)鴨業(yè)中常見的疾病，容易大范圍內(nèi)爆發(fā)從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。主要防治方法包括抗病毒藥、中西藥及制劑、卵黃抗體及其他生物制劑等，其中卵黃抗體是最有效的治療鴨發(fā)生病毒病的方法。卵黃抗體IgY是的一種免疫球蛋白Ig，IgY在功能上相當(dāng)于哺乳動(dòng)物IgG，但結(jié)構(gòu)上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空間構(gòu)象。卵黃抗體具有很多優(yōu)越性。(I)由于鳥類與哺乳類動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)的差距，鳥類更適于生產(chǎn)抗哺乳動(dòng)物抗原的特異性抗體。卵黃抗體不會(huì)激發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)，不與抗哺乳動(dòng)物抗原的抗體發(fā)生反應(yīng)，不與哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的Fe 受體結(jié)合，這在免疫診斷中具有重要意義。(2)卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產(chǎn)、加工、攝食及消化過程中保證其穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。多項(xiàng)試驗(yàn)表明，IgY 具有較好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱。卵黃抗體較易保存，4°C條件下存放5年或室溫條件下存放6個(gè)月對抗體活性無明顯影響。(3)卵黃抗體量大，成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)。卵黃中抗體濃度能長期維持在相當(dāng)于甚至超過血清抗體濃度的水平上。I只產(chǎn)蛋(以平均每周產(chǎn)蛋5-6枚,平均每枚蛋蛋黃大約15mL計(jì)算)所產(chǎn)蛋生產(chǎn)的抗體量相當(dāng)于90_100mL血清或 180-200mL血液中抗體的量，例如I只兔子I個(gè)月可提取IgG約200mg，而I個(gè)月I只蛋可從蛋中提取IgY 2000mg以上。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物的采血不僅對動(dòng)物本身是極大的應(yīng)激，而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，大規(guī)模生產(chǎn)是不切實(shí)際的，而利用蛋生產(chǎn)抗體要方便的多?？偟膩碇v， 卵黃抗體對動(dòng)物沒有毒副作用，用高免卵黃抗體治療動(dòng)物疾病不但避免了高免血清價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，而且可以避免高免血清在治療過程中引起的副作用，是一種很有前途的新型免疫球蛋白制劑。因此，卵黃抗體在禽畜疾病診斷、治療和預(yù)防的應(yīng)用越來越多。目前卵黃抗體的制備及生產(chǎn)工藝已經(jīng)成熟，可以保質(zhì)保量的生產(chǎn)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉，該凍干粉的優(yōu)點(diǎn)是干粉保存時(shí)間長、溶解快、抗體效價(jià)高、生物活性良好，本產(chǎn)品的抗體純度高于市場現(xiàn)在產(chǎn)品。本發(fā)明的目的在于提供一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉，包括以下重量百分?jǐn)?shù)的各組分鴨瘟卵黃抗體 86-91%、辛酸 O. 8-1. 0%、甲醛O. 2-0. 3%、硫柳汞 O. 01-0. 02%、3_4%葡萄糖、1-2% 山梨醇、2-3% 甘氨酸、2-3%甘露醇。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種所述鴨瘟卵黃抗體凍干粉的制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得高免蛋，將高免蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干得到鴨瘟高免卵黃抗體凍干粉。所述鴨瘟卵黃抗體凍干粉的制備方法，具體步驟為I)分離毒株制備疫苗本次病毒樣品主要從福建采集鴨瘟樣品，經(jīng)過無菌采集臨床上發(fā)病癥狀明顯的病例，將采集的樣品研磨，經(jīng)過3次凍融，15000rpm/min高速離心留取上清液，將上清液接種于雞胚囊中傳代方式得到病毒株FJ株，根據(jù)GenBank登錄號為 EF643557公布UL28基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接至PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受細(xì)胞DH5 α，測序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp ；2)免疫健康鴨群制得蛋免疫接種鴨瘟滅活疫苗I. 5mL (含毒103 2ELD5(l/0. 1M1)， 第一次免疫健康鴨群使用鴨瘟滅活疫苗，每次免疫間隔7天時(shí)間，以后免疫加I倍量,免疫三次，第二次免疫后開始檢測抗體效價(jià)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；3)水稀釋法酸化處理分離高免蛋卵黃，加入等體積的無菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65 V水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為
4.9-5. 2的、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，靜置沉淀，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液；4)辛酸處理；向步驟3)上清液中加入辛酸，加入量為溶液體積的O. 8-1. 0%，混勻， 靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min，20000rpm/min，留取上清液，靜置；5)用O. 45 μ m的濾膜對步驟4)所得上清液過濾，再采用截流分子量大于30KD (的濾膜孔徑進(jìn)行超濾濃縮，使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5mL/500羽份為止。6)向步驟5)所得卵黃溶液加入甲醛、硫柳汞防腐，甲醛的加入量為O. 2-0. 3%，硫柳汞為 O. 01-0. 02% ；7)再加入輔料3-4%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇；8)預(yù)凍將濃縮后的卵黃抗體液放置-80°c，充分冷凍。9)將步驟8)所得卵黃抗體溶液凍干，凍干曲線程序是-40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。本發(fā)明免疫采用是健康的鴨作為免疫對象，這可以增加針對性，可以使抗體效價(jià)快速達(dá)到I :256 ，提高工作效率，應(yīng)用同種動(dòng)物產(chǎn)生多元抗體針對鴨種預(yù)防免疫范圍廣、強(qiáng)度大。通過鴨強(qiáng)化免疫后制成的卵黃抗體對鴨病毒性肝炎病見效快、療效顯著，而且針對性強(qiáng)，同時(shí)對鴨的這種病具有很好的預(yù)防效果。本申請制備方法中在酸化水處理時(shí)應(yīng)用了巴氏消毒的溫度加熱卵黃液，不僅達(dá)到消毒的作用同時(shí)可以提高抗體的回收率和酸化處理時(shí)溶液的澄清度，制得的卵黃抗體的優(yōu)勢特征過生物活性高、溶解快、機(jī)體吸收快、臨床治療見效快、抗體凍干粉保存時(shí)間長、效價(jià)降低速度減緩等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。實(shí)施例I.本實(shí)施例的鴨瘟卵黃抗體凍干粉包括以下組分鴨瘟卵黃抗體90. 79%、 甲醛O. 2%、硫柳汞O. 01%,3%葡萄糖、1%山梨醇、2%甘氨酸、2%甘露醇，辛酸I. 0%,以上試劑為分析純。本實(shí)施例鴨瘟卵黃抗體凍干粉的制備方法，具體步驟為I)免疫健康鴨群制得蛋免疫接種鴨瘟滅活疫苗I. 5mL (含毒103 2ELD5(l/0. IMl)， 第一次免疫健康鴨群使用鴨瘟滅活疫苗，每次免疫間隔7天時(shí)間，以后免疫加I倍量,免疫三次，第二次免疫后開始檢測抗體效價(jià)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；2)收集高免蛋，將高免蛋經(jīng)過消毒、晾干，分離卵黃，打碎，加入等體積的無菌水， 攪拌混勻，直到 顏色發(fā)白為止，得到卵黃溶液；3)將上述的卵黃液放入60°C水浴鍋內(nèi)加熱30min，期間要間斷性的攪拌，使其受熱均勻；4)加熱后加入原卵黃液體積的6倍預(yù)冷pH為4. 8鹽酸水溶液，混勻，靜置，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液；5)將步驟4)得到的上清液中按體積加入O. 8%辛酸，混勻，靜置，棄除上浮雜質(zhì)，留取下清液，離心IOmin, 20000rpm/min,取上清液；6)將步驟5)上清液經(jīng)過O. 45 μ m濾膜過濾，得到濾液，經(jīng)過超濾裝置截流分子量大于30KD的物質(zhì)，采用循環(huán)方式濃縮至使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5mL/500 羽份為止。7)濃縮液按體積加入甲醛量為O. 2%，硫柳汞量為O. 01% ；8)配制過程中，加入輔料為3%葡萄糖、1%山梨醇、2%甘氨酸、2%甘露醇等物質(zhì)；9)預(yù)冷，根據(jù)凍干曲線程序?qū)⑴渲坪玫臐饪s液進(jìn)行預(yù)凍，這一步必須將產(chǎn)品放置-80°C徹底冷凍；10)按照凍干曲線設(shè)定凍干程序。凍干曲線程序是_40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。為了檢測卵黃抗體在常溫下的放置時(shí)抗體效價(jià)變化，以此來確定本產(chǎn)品的保質(zhì)期，做了以下試驗(yàn)將本品保存在37°C培養(yǎng)箱中，保存24個(gè)月，分別I周、2周、I月、2月、4 月、8月、12月、16月、20月、24月后，用瓊脂擴(kuò)散(AGP)法，測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣品的卵黃抗體效價(jià)變化，結(jié)果見表I。表I.常溫放置凍干粉不同時(shí)間段效價(jià)的變化
權(quán)利要求
1.一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉，其特征在于包括以下重量百分?jǐn)?shù)的各組分鴨瘟卵黃抗體 86-91%、辛酸 O. 8-1. 0%、甲醛 O. 2-0. 3%、硫柳汞 O. 01-0. 02%,3-4% 葡萄糖、1-2% 山梨醇、 2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。
2.一種如權(quán)利要求I所述鴨瘟卵黃抗體凍干粉的制備方法，其特征在于具體步驟為1)免疫健康鴨群制得蛋免疫接種鴨瘟滅活疫苗I.5mL (含毒103_2ELD5(i/0. I M1)，第一次免疫健康鴨群使用鴨瘟滅活疫苗，每次免疫間隔7天時(shí)間，以后免疫加I倍量，免疫三次， 第二次免疫后開始檢測抗體效價(jià)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；2)水稀釋法酸化處理分離高免蛋卵黃，加入等體積的無菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白， 得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65°C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為4. 9-5. 2 的、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，靜置沉淀，取上清液， 離心 20min, 15000rpm/min,留上清液；3)辛酸處理；向步驟3)上清液中加入辛酸，加入量為溶液體積的O.8-1. 0%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心IOmin, 20000rpm/min,留取上清液,靜置；4)用O.45mm的濾膜對步驟4)所得上清液過濾，再采用截流分子量大于30KD的濾膜孔徑進(jìn)行超濾濃縮，使500mL/500羽份的卵黃抗體液濃縮至2. 5 mL/500羽份為止。5)向步驟4)所得卵黃溶液加入甲醛、硫柳汞防腐，甲醛的加入量為O.2-0. 3%，硫柳汞為 O. 01-0. 02% ；6)再加入輔料3-4%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇；7)預(yù)凍將濃縮后的卵黃抗體放置_80°C，充分冷凍。8)將步驟7)所得卵黃抗體溶液凍干，凍干曲線程序是_40°C開始升華，2h后升到_35°C保持14h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉，包括以下重量百分?jǐn)?shù)的各組分鴨瘟卵黃抗體87-90%、辛酸0.8-1.0%、甲醛0.2-0.3%、硫柳汞0.01-0.02%、3-4%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。該凍干粉保存時(shí)間長、溶解快、抗體效價(jià)高、生物活性良好，本產(chǎn)品的抗體純度高于市場現(xiàn)在產(chǎn)品。本發(fā)明同時(shí)公開了一種鴨瘟卵黃抗體凍干粉的制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得高免蛋，將高免蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、凍干等得到鴨瘟高免卵黃抗體凍干粉。本發(fā)明制備方法中在酸化水處理時(shí)應(yīng)用了巴氏消毒的溫度加熱卵黃液，不僅達(dá)到消毒的作用同時(shí)可以提高抗體的回收率和酸化處理時(shí)溶液的澄清度，制得的卵黃抗體的優(yōu)勢特征過生物活性高、抗體保存時(shí)間、效價(jià)降低速度減緩等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P31/14GK102716483SQ20121017570
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者吳紅云, 徐榮君, 徐進(jìn), 郭俊清 申請人:鄭州后羿制藥有限公司