一種抑制人類免疫缺陷病毒的真菌提取物的制備方法
【專利摘要】一種抑制人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的真菌提取物的制備方法，所依賴的菌株是炭團菌屬真菌Q-s-4(Hypoxylon?sp.)。真菌Q-s-4經液體發酵培養，制備發酵產物的提取物。該方法可用于真菌Q-s-4的大規模工業化培養，并以發酵產物為原料，工業化生產發酵產物的提取物。利用該方法制備的提取物，具有顯著抑制HIV-1整合酶的活性，并有抗菌活性，在治療艾滋病和細菌感染的新藥研發方面具有重要價值。
【專利說明】一種抑制人類免疫缺陷病毒的真菌提取物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，具體地說涉及一種能夠抑制人類免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶表達的內生真菌提取物的制備技術。
技術背景
[0002]獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDs)由感染人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)導致。自1981年由美國疾病控制中心首次報道以來，現已經成為世界主要致死病之一。到2007年為止，世界范圍內約有3340萬人感染HIV病毒，其中2240萬居住在非洲撒哈拉以南地區，約三分之二的人口感染HIV病毒。截至2010年底，全球中低收入國家中約有660萬人接受了抗逆轉錄病毒藥物治療，比2001年增長了近22倍。目前臨床上應用的近30種抗HIV-1藥物，輔以高效抗逆轉錄病毒療法(Highly Active Antiretroviral Therapy, HAART)可以在一定程度上延長HIV感染者的生存期和改善感染者的生活質量。但是，由于HIV疫苗研究進展的緩慢以及越來越多變異HIV的挑戰，研究開發新型抗HIV化學藥物及治療方法仍然具有重要意義。HIV進入人體后，主要通過與宿主細胞膜直接融合進入細胞，HIV的復制周期主要包括吸附及穿入、逆轉錄與環化、整合、轉錄、翻譯、病毒顆粒裝配、病毒體成熟、出芽等階段。抗HIV物質針對不同的作用位點發揮抗病毒作用現階段，主要抗HIV藥物主要分為五大類:(I)HIV-1逆轉錄酶制劑；(2) HIV-1進入抑制劑；(3) HIV-1蛋白酶抑制劑；(4) HIV-1整合酶抑制劑；(5)其它。
[0003]因此，基于HIV-1病毒的不穩定性，變異迅速，新細菌株和病毒株不斷出現導致原有藥物治療譜窄，耐藥性嚴重等新特性，科研工作者針對HIV-1復制周期的各個階段廣泛的尋找和研究用于不同靶點的有效藥物，旨在抑制HIV-1的復制。
[0004]近年來，我國藥用植物內生真菌及活性成分的研究成為藥物開發的一個非常重要的領域，大自然為很多疾病提供了治療藥物的來源，許多藥用植物已經被報道具有抗HIV-1的特性，這也應該是我國新藥研究的優勢所在，一旦發現活性，往往以該結構為先導化合物，合成活性更強、可溶性好及毒性低的藥物。但大量開采植物會導致植物資源枯竭，環境污染破壞。內生真菌是存在于植物正常部位而不引起宿主植物明顯癥狀的一類真菌。植物與其內生真菌的關系是互惠共生的。近年來一些研究表明，與藥用植物共生的內生真菌能夠產生與宿主相同或相似的生理活性成分。利用發酵法生產與植物相同或相似的次生代謝產物，具有可大規
[0005]模工業化生產和易于進行質量控制等優點，并不會對自然資源造成破壞。所以從真菌發酵產物中尋找新型抗HIV和抗菌藥物或先導化合物的研究，是當今國內藥物研發的重要方向和活躍領域，也為我國新藥研究的優勢所在。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供真菌液體發酵培養的方法和真菌發酵產物提取物制備的方法，該方法制備成本低，工藝簡單、生產周期短，且污染小，可用于真菌的大規模工業化培養，并以真菌發酵物為原料工業化生產發酵產物的提取物。
[0007]本發明的另一目的是提供上述發酵產物的提取物用于抗人類免疫缺陷病毒的研發和應用。
[0008]為實現上述目的，本發明采用的技術是:液體發酵培養真菌Q-s-4，發酵產物分離為菌絲體和發酵液兩個部分，用有機溶劑分別對菌絲體和發酵液部分進行提取，得到發酵產物的提取物。本發明所利用的真菌Q-s-4是從菊科蒿屬植物黃花蒿(Artemisia annuaL.)的莖中分離得到的，經鑒定為炭團菌(Hypoxylon sp.)。該菌種于2012年4月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6039。保藏和存活證明見附件。
[0009]具體地說，本發明所述的技術步驟如下:
[0010]1.真菌的發酵培養
[0011]將真菌Q-s-4自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于含PDA培養基的平皿中，于25°C恒溫培養5-12天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，將菌片打碎，接入麥麩液體培養基進行發酵培養。麥麩液體培養基組成按重量百分含量計算為:麥麩1-5% (煮20-30分鐘，取汁)，葡萄糖1-4%, KH2PO40.1-0.4%, MgSO40.1-0.3%，其余成分為水，培養基pH自然。三角瓶或其他容器裝液 體培養基，裝量為容器體積的30-60%。培養基滅菌后接入真菌Q-s-4，22-26°C振蕩暗培養12-30天，振蕩轉速90-130轉/分鐘。
[0012]2.真菌發酵產物的獲得
[0013]真菌Q-s-4經發酵培養后，用80-120目尼龍網過濾，分為菌絲體和發酵液兩個部分；菌絲體部分用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分；發酵液部分40-60°C真空減壓濃縮至原發酵液體積的10-20%。
[0014]3.真菌發酵產物提取物的制備
[0015]①菌絲體用甲醇或95 %乙醇超聲提取2-3次，每次40-60分鐘，每次提取溶劑用量(V)為菌絲體重量(W)的8-12倍；或菌絲體用甲醇、95%乙醇或丙酮滲漉提取，提取溶劑用量(V)為菌絲體重量(W)的12-15倍，所得提取液于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體總提取物；
[0016]②發酵液濃縮物加入95%乙醇或無水乙醇進行醇沉，溶劑用量(V)為發酵液濃縮物體積(V)的3-5.5倍，靜置2處分層，收集上清液，于40-601:減壓濃縮后干燥，得到發酵液總提取物。
[0017]③分別將菌絲體總提取物和發酵液總提取物均勻分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，至有機溶劑層無色；分別合并各溶劑萃取液，于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體和發酵液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取部位。
【具體實施方式】
[0018]實施例:
[0019]1.真菌的發酵培養
[0020]將炭團菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.)自低溫保藏的斜面試管菌種活化后,轉接于含PDA培養基的平皿中，于25°C恒溫培養5天，分別在菌落邊緣打孔成直徑均勻的菌片，并以小碎塊接入麥麩液體培養基。
[0021]麥麩液體培養基組成為:麥麩20克/升(煮30分鐘，取汁)，葡萄糖30克/升，KH2P042克/升，MgSO4I克/升。250mL三角瓶裝培養基lOOmL，122°C滅菌22分鐘，按上述方法接入炭團菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.),于25°C振蕩暗培養14天,搖床轉速120轉/分鐘。
[0022]2.真菌發酵產物的獲得
[0023]真菌Q-s-4經過發酵培養后，用100目尼龍網過濾，分為菌絲體和發酵液兩部分；菌絲體部分用蒸餾水沖洗干凈，擠壓除去水分；發酵液部分常壓加熱濃縮至原發酵液體積的 20%。
[0024]3.真菌發酵產物提取物的制備
[0025]①菌絲體用甲醇超聲提取2次，每次60分鐘，第一次和第二次提取的溶劑用量(V)分別為菌絲體重量(W)的12倍和10倍；合并兩次提取液，60°C減壓濃縮后干燥，得菌絲體總提取物；
[0026]②發酵液濃縮物加入95%乙醇醇沉，95%乙醇的用量(V)為發酵液濃縮物體積(V)的4倍，于8°C靜置24h分層，收集上清液，于60°C減壓濃縮，得到發酵液總提取物。
[0027]③分別將菌絲體總提取物和發酵液總提取物均勻分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取至各有機溶劑層無色；合并各萃取液，于60°C減壓濃縮后冷凍干燥，得到菌絲體和發酵液的石油醚提取部分、乙酸乙酯提取部分和正丁醇提取部位。
[0028]比較例:
[0029]1.真菌發酵產物提取物對人類免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶的抑制作用
[0030]真菌Q-s-4接種到PDA培養基的平皿中，25 °C恒溫培養7天，接入麥麩液體培養基中。培養基組成為:麥麩30克/升(煮20分鐘，取汁)，葡萄糖20克/升，KH2P043克/升，MgSO4L 5克/升。250mL三角瓶裝培養基125mL，121°C滅菌25分鐘。滅菌培養基接入真菌Q-s-4，于25°C振蕩暗培養21天，搖床轉速100轉/分鐘。
[0031]結束培養后，用100目尼龍網過濾，分離菌絲體和發酵液。菌絲體用水沖洗干凈，擠壓除去水分，用95%乙醇超聲提取3次，提取時間分別為60分鐘、40分鐘和40分鐘，提取溶劑用量(V)分別為菌絲體濕重(W)的10倍、8倍和8倍。合并三次提取液，50°C減壓濃縮，干燥，得到菌絲體的總提取物。發酵液濃縮至原體積的10%，加入3.5倍體積95%乙醇進行醇沉，室溫放置24h分層。收集上清液，50°C減壓濃縮后干燥，得到發酵液總提取物。
[0032]分別將菌絲體總提取物和發酵液總提取物均勻分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取至有機溶劑層無色；合并各萃取液，于50°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體和發酵液的石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。
[0033]將各部分提取物倍比稀釋，利用HIV-1整合酶鏈轉移反應測定提取物對HIV-1整合酶的抑制率，實驗數據見表I。實驗結果顯示:菌絲體石油醚和乙酸乙酯提取部位在所測試濃度對HIV-1整合酶的抑制作用隨濃度增加而增加，超過一定濃度，抑制作用達到平衡。菌絲體和發酵液的石油醚和乙酸乙酯的提取部位對HIV-1整合酶均有顯著的抑制作用；正丁醇部位沒有顯示明顯的活性。菌絲體的石油醚和乙酸乙酯提取部位對HIV-1整合酶的半數抑制濃度(IC5tl)分別為11.983ii g/mL和7.436y g/mL。發酵液的石油醚和乙酸乙酯提取部位對HIV-1整合酶的半數抑制濃度(IC5tl)分別為46.314 u g/mL和10.926 u g/mL。[0034]表I真菌Q-s-4發酵產物提取物對HIV-1整合酶的抑制作用
[0035]
I
【權利要求】
1.一種制備保藏編號為CGMCC N0.6039的炭團菌屬真菌Q_s_4 (Hypoxylon sp.)的發酵產物提取物的方法，包括步驟: (1)真菌的發酵培養 將真菌Q-s-4自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于含PDA培養基的平皿中，于25°C恒溫培養5-12天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基中進行發酵培養； 液體培養基組成按重量百分含量計算為:麥麩1-5 %，煮20-30分鐘，取汁，葡萄糖1-4%, KH2PO40.1-0.4%, MgSO40.1-0.3%，pH自然；三角瓶或其他容器裝液體培養基，裝量為容器體積的30-60% ;滅菌后接入真菌Q-s-4，22-26°C振蕩暗培養12-30天，振蕩轉速90-130轉/分鐘； (2)真菌發酵產物的獲得 真菌Q-s-4經發酵培養后，用80-100目尼龍網過濾，分離菌絲體和發酵液；菌絲體用水沖洗干凈，擠壓除去大部分水分；發酵液40-60°C減壓濃縮至原發酵液體積的10-20% ； (3)真菌發酵產物提取物的制備 ①菌絲體用甲醇或95%乙醇超聲提取2-3次，每次40-60分鐘，每次提取用的溶劑體積為菌絲體重量的8-12倍；或菌絲體用甲醇、95 %乙醇或丙酮滲漉提取，提取用的溶劑體積為菌絲體重量的12-15倍；所得提取液于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到菌絲體總提取物； ②發酵液濃縮物加入95%乙醇或無水乙醇進行醇沉，所用溶劑體積為發酵液濃縮物體積的3-5.5倍，放置24h分層 ，收集上清液，于40-60°C減壓濃縮后干燥，得到發酵液總提取物； ③上述兩種總提取物，分別分散于水中，依次以石油醚和乙酸乙酯萃取至溶劑層無色；合并各萃取液，于40-60°C減壓濃縮后冷凍干燥，得到各總提取物的石油醚部位和乙酸乙酯部位。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:按上述方法制備的保藏編號為CGMCCN0.6039的炭團菌屬真菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.)的提取物，能夠抑制人類免疫缺陷病毒整合酶的活性，能夠用于抗人類免疫缺陷病毒藥物的研究和應用。
【文檔編號】A61K36/062GK103451234SQ201210172132
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月30日 優先權日:2012年5月30日
【發明者】郭順星, 梁寒峭, 陳曉梅, 張大為, 王春蘭, 邢詠梅, 李春艷, 李兵 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所