與陰離子磷脂和氨基磷脂結合的抗體及其治療和成像用途

與陰離子磷脂和氨基磷脂結合的抗體及其治療和成像用途
【專利摘要】本發明涉及與陰離子磷脂和氨基磷脂結合的選定抗體和耐久霉素肽以及它們在治療病毒感染和癌癥中的用途。本發明公開了關于陰離子磷脂和氨基磷脂在腫瘤血管結構和病毒入侵及傳播中的作用的驚人發現，以及將這些發現用于治療癌癥和病毒感染的組合物和方法。本發明還公開了可結婚并抑制陰離子磷脂和氨基磷脂的有益抗體、免疫綴合物和基于耐久霉素的組合物和聯合，可用于安全有效的治療癌癥、病毒感染和相關疾病。
【專利說明】與陰離子磷脂和氨基磷脂結合的抗體及其治療和成像用途
[0001]發明背景
[0002]本申請是于2003年7月15日提交的中國發明專利申請03816751.4的分案申請。本申請要求于2002年7月15日提交的、系列號為60/396263的共同待審美國臨時申請的優先權，該文件的公布內容，包括說明書、權利要求、附圖和序列在此都特別收編作為參考而并未放棄。
[0003]1.發明領域
[0004]本發明涉及氨基磷脂和陰離子磷脂生物學、腫瘤血管和病毒感染領域。它提供了驚人的新組合物、方法和組合，可用于腫瘤血管的靶向和癌癥治療、抑制病毒侵入和擴散以及治療病毒感染。本發明另外還提供了許多結合并抑制氨基磷脂和陰離子磷脂的優選抗體、免疫綴合物和基于耐久霉素的組合物，可用于治療癌癥、病毒感染和有關疾病。
[0005]2.相關領域描述
[0006]腫瘤細胞對化療劑的抗性在臨床腫瘤學中是一個重要問題。在腫瘤治療中要解決的另一主要問題是期望“全部細胞殺死”，即，殺死所有能不受控生長并取代通過治療可去除的任何腫瘤塊的所謂“克隆源性”惡性細胞。盡管在此領域內有了一定的進展，但這仍是為何許多普遍形式的人類癌癥依然耐受有效的化學治療干預的兩個主要原因。
[0007]對于開發接近全部細胞被殺死的療法這一目的而言，某些類型的腫瘤比其它類型靈易受治療的影響。例如，淋巴瘤等軟組織腫瘤和白血病等血液和血液形成器官的腫瘤通常比癌瘤等實體瘤對化學療法更有反應性。
[0008]軟組織腫瘤和以血液為基礎的腫瘤對化學療法的易感性的一個原因是淋巴瘤和白血病細胞更易于接受化學療法干預。簡而言之，大部分化療劑到達實體瘤塊的所有細胞比到達軟組織腫瘤和以血液為組織的腫瘤的所有細胞要難得多，因此完成全部細胞殺死也要困難得多。增加化療劑的劑量大部分情況下常常會導致毒副作用，這通常限制了常規抗腫瘤劑的效力。
[0009]另一腫瘤治療方法是使用“免疫毒素”，其中用抗腫瘤細胞抗體將毒素投遞至腫瘤細胞。不過，和化學治療方法一樣，免疫毒素療法在應用于實體瘤時也存在著重要的缺點。例如，抗原陰性或抗原缺乏的細胞能繼續存活并再生成腫瘤或導致進一步的轉移。實體瘤對基于抗體的療法有耐受性的另一原因是腫瘤塊對于抗體和免疫毒素等大分子劑來說通常是不能通過的。腫瘤內的物理擴散距離和間質壓力都造成了對此類型療法的限制。
[0010]改良的治療方法是靶向于實體瘤的血管結構。靶向于腫瘤血管而非腫瘤細胞本身具有一定的優越之處，即這不太可能導致抗性腫瘤細胞的發生，而且被靶向的細胞容易接近。此外，血管的破壞導致了抗腫瘤效果的擴大，因為許多腫瘤細胞依賴單一血管來提供其氧氣和養分。例示性的血管靶向劑(VTAs)如美國專利5855866、5965132、6261535、6051230和6451312中所述，這些文獻描述了抗細胞劑和毒素向腫瘤血管結構標記物的靶向投遞。[0011 ] 另一有效的血管靶向方案是將凝血因子靶向于腫瘤血管結構或基質中表達或吸附的標記物(Huang等，1997 ;美國專利申請6093399、6004555、5877289和6036955)。將凝血劑而非毒素投遞至腫瘤血管結構具有另外的優越之處，即降低了免疫原性，甚至減少了產生毒副作用的風險。如美國專利5877289中所述，用于所說的腫瘤特異性“凝血配體”中的優選凝固因子是截短形式的人凝血誘導蛋白質，組織因子(TF)，即血液凝結的主要起始因子。
[0012]最近，氨基磷脂磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)被確定為腫瘤血管結構的特殊標記(Ran等，1998)。這引起了對用于投遞抗細胞劑、毒素和凝血因子至腫瘤血管的新型抗PS和抗PE免疫綴合物的開發(美國專利6312694)。此外，還發現未綴合的抗PS和PE抗體無需與治療劑附著就可發揮抗癌作用，這已知為針對腫瘤血管靶向和治療的氨基磷脂“裸抗體”方法(美國專利6406693)。
[0013]盡管前述免疫綴合物和氨基磷脂血管靶向方法代表了腫瘤治療中的重大進展，但某些外周腫瘤細胞在這些療法所造成的普遍腫瘤破壞當中仍能幸存。因此考慮將抗血管發生的方法與美國專利5855866、6093399、6312694和6406693中的VTA、凝血配體和氨基磷脂靶向方法結合使用，前者抑制了從原先存在的血管和/或循環內皮干細胞中發展出新的血管結構。
[0014]血管發生不僅在胚胎發生、傷口愈合和月經等生理學過程中起著重要的作用，還涉及腫瘤生長、關節炎、牛皮癬和糖尿病性視網膜病等病理活動(Ferrara，1995)。應用于腫瘤治療中時，抗血管發生的方法是以抑制開始發生的血管的增殖(通常在實體瘤的外圍)為基礎的。這些療法通常用于在較常規的干預治療(如外科手術或化療)后降低實體微小轉移的風險或抑制實體瘤的進一步生長。
[0015]美國專利6342219、6524583、6342221和6416758描述了與血管發生的一種主要刺激物血管內皮生長因子_A(VEGF，以前已知為血管滲透因子VPF)結合的抗體和免疫綴合物。這些抗體具有只抑制VEGF與兩個主要VEGF受體中的一個結合的重要優勢。通過阻斷VEGF與VEGF2而非VEGFl的結合，這些抗體在提高安全性的同時，保持了例如巨噬細胞、破骨細胞和破軟骨細胞功能中由VEGFRl所介導的有利功效。
[0016]盡管前述方法促進了腫瘤治療領域的發展，仍然需要開發另外的或可選擇的血管靶向療法。為了擴大治療選擇的數目，需要鑒定腫瘤血管結構的新標記。具有抗癌特性的新的裸抗體的開發會是一個尤其重要的進展，因為它允許相同的靶向部分既作為單一治療劑也作為血管靶向劑用于投遞其它的藥物。在同一分子內具有抗血管發生和抗血管，即腫瘤破壞性特征的治療劑是很有價值的。更重要的進展將是在其它系統中具有抗癌特性和治療作用的治療劑的確定。開發既能治療癌癥又能治療病毒感染(這是此階段最重要的醫學疑癥中的兩種)的制劑應是一個引人注目的重要突破。
[0017]發明簡述
[0018]本發明通過提供新方法和組合物用于安全有效的腫瘤血管靶向、抗血管發生和破壞腫瘤來致力于解決現有技術中的前述需要及其它需要，所說的方法和組合物對于抑制病毒入侵和擴散以及治療病毒感染和疾病也出乎意料地非常有效。本發明在某種程度上基于的是關于腫瘤血管結構中陰離子磷脂的表達和作用以及病毒入侵和擴散中氨基磷脂和陰離子磷脂的參與這些驚人發現。本發明另外還提供了結合氨基磷脂和陰離子磷脂的特別有效的抗體和免疫綴合物，以及與磷脂酰乙醇胺結合的以肽為基礎的一類新型衍生物。
[0019]綜述:在第一個全面的實施方案中，本發明根據下述意外的發現，即諸如磷脂酰肌醇(PD、磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)(以及磷脂酰絲氨酸PS)等的陰離子磷脂是腫瘤血管結構上的易接近且可穩定靶向的標記物，提供了用于腫瘤血管靶向、腫瘤成像和治療的新方法。此實施方案起因于抗PA、P1、PG和其它陰離子磷脂組分的抗體特異地定位于實體瘤的血管結構的意外發現。
[0020]本實施方案的其它方面源自另一意外發現，即，在缺乏與毒素或凝血劑等效應分子綴合的的情況下，抗PA、PI和PG(以及PS)等陰離子磷脂的裸抗體可特異性抑制體內腫瘤血管發生并誘發血管結構的毀壞和腫瘤壞死。本發明因此提供了利用結合陰離子磷脂的單一組分且基于抗體的治療劑進行血管靶向、抗腫瘤發生和腫瘤治療的安全有效的方法。
[0021]本發明的根本不尋常的特征是，至少在很大程度上，陰離子磷脂向腫瘤血管內皮細胞表面的轉位與細胞損傷和細胞凋亡或其它細胞死亡機制無關。因此腫瘤血管結構中陰離子磷脂的表達不是細胞死亡和毀壞的結果或觸發物，而是發生于形態完整的血管內皮細胞中。這意味著腫瘤血管結構中陰離子磷脂的表達不是短暫的，而是足夠穩定的，從而能為治療性干預提供靶目標。
[0022]由于發現了陰離子磷脂在腫瘤血管結構中被穩定誘導，本發明還提供了利用抗陰離子磷脂抗體的免疫綴合物進行腫瘤血管成像和破壞的一系列新方法和組合物。這些免疫綴合物包含有效連接了毒素和凝血劑等治療劑且可用于將診斷劑和治療劑特異投遞至腫瘤血管內皮細胞膜表面的抗陰離子磷脂抗體。治療劑被投遞至與腫瘤血管內皮細胞膜密切接觸，從而可以快速進入靶細胞或迅速與效應細胞、凝血級聯過程中的組分等締合。
[0023]在第二個全面的實施方案中，本發明提供了與氨基磷脂和陰離子磷脂結合的許多優選抗體(以及相關的免疫綴合物和組合物)，所說的抗體具有優于本領域已知的其它抗體的結構和特性。這些所謂的“第二代”或改良的抗體將優選用于本文所述的抗血管發生、抗癌和抗病毒以及其它治療方法中。
[0024]通過提供不具有本領域抗氨基磷脂和陰離子磷脂抗體通常相關聯的病理特性的治療用抗體，本領域所提供的與氨基磷脂和陰離子磷脂結合的新型抗體克服了現有技術中的各種缺點。本發明的開發，在部分程度上，是利用了從本發明
【發明者】對腫瘤血管內皮細胞中磷脂性能的獨特觀察結果中發展而來的新免疫接種和篩選技術，并且勝過了從疾病相關抗磷脂抗體中產生的抗體。這樣的抗體不僅具有獨一無二的特性和改良的安全性，還與比較研究中的已有抗體同樣有效或更有效。利用所提供抗體的特定分類，本發明這些方面的組合物和方法還延伸到了免疫綴合物和化合物的用途。
[0025]在本發明之前，結合氨基磷脂和陰離子磷脂且具有本文所公布的新抗體特性的抗體是未知的。不過，根據本文所公布的發明，目前為本領域提供了產生新的候選抗體的方法以及通過檢測這些抗體從候選抗體集合中鑒定更多的有用抗體的技術。因此，根據本發明，可以制備具有優越特性和氨基磷脂和陰離子磷脂結合特征的一系列抗體，它們不會有現有技術中的抗體相關的顯著缺點和副作用。因此這樣的抗體可用于多種實施方案中，包括抑制血管發生和治療癌癥和病毒感染。
[0026]除了本文所提出的新免疫法和篩選技術之外，現在可以利用單克隆抗體1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4通過競爭和/或功能檢測法鑒定與氨基磷脂和陰離子磷脂結合且具有許多優越特性的抗體。目前，1B12、3B10、9D2和3G4抗體是優選的，因為這些抗體在結合磷脂時不需要血清。更優選單克隆抗體9D2和3G4，目前最優選單克隆抗體3G4(ATCC4545)。為了鑒定與任何前述抗體競爭的另外的抗體，優選3G4，目前優選的檢測法是基于ELISA進行的競爭性檢測法，其中的許多種方法在此進行了描述，而有關的工作實施例也公布于此。
[0027]在第三個全面的實施方案中，本發明提供了與氨基磷脂的一種-磷脂酰乙醇胺(PE)結合的細胞不可滲透且以肽為基礎的新型衍生物。這些“結合PE的肽衍生物”至少包含第一 PE結合肽，優選耐久霉素，它已被修飾成基本上防止了非特異的毒性，這優選通過修飾PE結合肽(優選耐久霉素)而形成基本上細胞不可滲透或基本上無孔形成的結合PE的構建物來實現。
[0028]“基本上細胞不可滲透的”結合PE的構建物或耐久霉素的產生優選通過將結合PE的肽或耐久霉素與至少一種第一細胞不滲透基團結合而完成的。在此描述了許多典型耐久霉素衍生物的合成。“細胞不滲透基團或基團組”可以是小分子、惰性載體或其自身可以是賦予所產生構建物進一步靶向功能的靶向分子，諸如靶向于腫瘤血管結構。因而，結合PE的肽可以是與惰性載體連接的唯一靶向藥劑，或者可以是分別將靶向功能賦予構建物的兩種藥劑之一。此外，結合PE的肽，優選耐久霉素，與效應分子有效的連接，從而使結合PE的肽或耐久霉素提供靶向功能，而所連接的藥劑一旦遞送至靶細胞則具有充分的治療功效。優選的例子是與核苷等抗病毒劑連接的結合PE的肽或耐久霉素。
[0029]由于正常條件下正常細胞表面基本上不存在PE，所以本發明的基本上細胞不可滲透的結合PE的肽可以發揮選擇性結合諸如腫瘤血管內皮細胞、增殖和/或病毒感染細胞等異常細胞或疾病相關細胞表面上的PE的功能。通過與所說的異常靶細胞結合，結合PE的構建物或衍生物抑制或阻斷PE在那些細胞中的功能，因此產生全面的治療效用，如，在腫瘤和/或病毒疾病的治療中。本文公布了基本上細胞不可滲透的結合PE的肽在抑制病毒入侵和擴散中的成功應用。在將結合PE的肽與諸如西多福韋等抗病毒藥劑連接的實施方案中，提供了更有效且更安全的抗病毒療法。
[0030]在第四個全面的實施方案中，本發明進一步提供了抑制病毒復制、感染和擴散的一類重要的新型組合物和方法，可用于治療病毒感染和疾病。這些方法基于的是如下不尋常的觀察結果:結合諸如PS、PE、P1、PA和PG(尤其是PS和PE)等氨基磷脂和陰離子磷脂的抗體和肽會是安全有效的抗病毒劑。本發明不僅已證實了此觀察結果是正確的，還提供了數據顯示結合氨基磷脂和陰離子磷脂的抗體和肽在對抗病毒擴散中出乎意料的有效，意味著這些藥劑可廣泛的應用于一系列病毒感染及相關疾病的治療中。
[0031]這些發現進一步包括使用新類型的免疫綴合物、組合物、藥劑盒和方法，其中抗氨基磷脂或陰離子磷脂(尤其是PS和PE)的抗體與抗病毒藥劑有效連接。基本上細胞不可滲透的結合PE的肽衍生物，如耐久霉素肽衍生物，也可與抗病毒劑連接。因而這些藥劑中的每一種都提供了獨特地靶向于病毒感染細胞的新抗病毒藥物。
[0032]因此，在異常血管發生、癌癥和病毒感染及疾病治療中有效的新型安全治療劑的開發是現有技術中的一個突破。
[0033]盡管可以有效的單獨應用，但本發明的各種方法和組合物還可與其它療法和藥劑結合使用，以提供綜合治療方法和本發明的相關組合物、藥物和藥劑盒。因此，在第五個全面的實施方案中，正如本文將要更詳細描述的，本發明進一步提供了具體的聯合組合物、方法和藥劑盒，如，用于癌癥治療中，發現它們在一起作用時效果意外的好。
[0034]第二代抗體:在本文實施例1V中描述了在產生具有目的特性的抗體中發揮良好功能的某些方法，這些方法包括在所附權利要求中。這些方法可以產生本發明的優勢抗體，代表性的有單克隆抗體 1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2 和 3G4，尤其是 3G4 (ATCC 4545)。
[0035]本發明因此提供了純化的抗體及其抗原結合片段和免疫綴合物，它們與至少一種氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)結合，而且與單克隆抗體1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，優選與9D2或3G4(ATCC 4545)，最優選與3G4有效競爭結合氨基磷脂或陰離子磷月旨，優選PS。
[0036]當用于整個申請文件各處時，術語“一個”、“一種”指“至少一種(個)”、“至少第一種(個)”、“一種(個)或多種(個)”或“眾多”所提及的組分或步驟，除非在其后特別提出了一個上限。因此，一種(個)“抗體”，用于此處時，指“至少第一種抗體”。正如已知任何單一藥劑的量一樣，本領域普通技術人員根據本申請的內容將了解各組合的可行限量和參數。
[0037]在某些方面，抗體將與單克隆抗體1B9、1B12、3B 10、2G7、7C5、9D2或3G4，優選與9D2或3G4 (ATCC 4545)，最優選與3G4有效競爭結合氨基磷脂或陰離子磷脂，優選PS，或者具有單克隆抗體1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，優選9D2或3G4，最優選3G4的氨基磷脂或陰離子磷脂結合特征，如表4中所示；且將不具有血清依賴性，即其結合氨基磷脂或陰離子磷脂時不需要血清；并非來自患病者，且不會顯著抑制體外凝結反應，引起體內顯著的血栓形成或具有狼瘡抗凝劑活性。
[0038]優選的，與文獻中的抗體相比，所說的抗體還將在對照研究中展示結構性質的改良或有利功能特性的范圍或程度的增進，諸如對于IgG而言，具有更高的親合力或顯示出與活化內皮細胞的結合增強，增強了對內皮細胞增殖或血管發生的抑制，提高了腫瘤血管定位、抗癌和/或抗病毒作用。
[0039]因此本發明的獨特方面是以
【發明者】最早的、意外的制備出具有前述、另外公布的和固有的有利特性的抗體為基礎的。目前已提供了一組優選抗體和許多特別優選的抗體，本發明進一步包含一類表位特異性確定的抗體，其中所說的抗體或其抗原結合片段與單克隆抗體 1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2 或 3G4,優選與 9D2 或 3G4 (ATCC 4545)，最優選與 3G4有效競爭抗原的結合，從而它們結合的表位基本上與單克隆抗體1B9、1B12、3B10、2G 7、7C5、9D2或3G4，優選與9D2或3G4，最優選與3G4(ATCC 4545)的結合表位相同。
[0040]根據本說明書和方便獲得的技術文獻、實際知識和起始資料，本申請中要求保護的發明能夠得到實施。盡管如此，以本發明申請者Broad of Regents, The Universityof Texas System的名義提交了產生3G4單克隆抗體的雜交瘤細胞系小鼠雜交瘤Mab3G4-2B 樣品，在美國典型培養物保藏中心(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas,VA20110-2209，美國保存。該樣品是由許可證持有者Peregrine制藥有限公司的附屬機構美國 Avid B1services 有限公司，14272 Franklin 大街，Tustin, CA92780 在 2002 年 7 月8日開始的一周內提交的，2002年7月10日收到，7月12日證明是存活的，2002年7月30日指定ATCC登記號為PTA 4545。
[0041] 此保藏是根據用于專利程序的國際公認的微生物保藏布達佩斯條約有關條款及其細則(布達佩斯條約)進行的。所說的雜交瘤將根據布達佩斯條約的規定在授予美國專利權后由ATCC向公眾提供。已保存的雜交瘤的可獲得性不能解釋為可以違反任何政府當局根據其專利法所批準權利實施本發明的許可。
[0042]根據所研究的抗體、優選的抗體和本文所公布及本領域已知的技術，現在向本領域普通技術人員提供了一種結合氨基磷脂或陰離子磷脂且具有有利特性的新型抗體。這些抗體“類似”或“基于”單克隆抗體1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4。優選的，本發明的抗體是“基于9D2或9D2樣的抗體”，更優選的，本發明抗體是“基于3G4或3G4樣的抗體”。下文針對3G4抗體所用的表述“某某樣”抗體是為了簡明表達，但特別收編于此作為參考，可分別應用于1B9、1B12、3B10、2G7、7C5和9D2抗體。
[0043]3G4樣抗體是所結合表位與單克隆抗體3G4(ATCC 4545)基本上相同或結合第一氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)上的表位與單克隆抗體3G4(ATCC 4545)所結合表位基本相同的抗體或其抗原結合片段。優選的，抗體或其抗原結合片段將結合與單克隆抗體3G4 (ATCC 4545)相同的表位。
[0044]術語“結合與單克隆抗體3G4(ATCC 4545)大約、基本上或本質上相同或同一表位”指抗體與單克隆抗體3G4(ATCC 4545) “交叉反應”。“交叉反應性抗體”是指這樣的抗體，即它們與單克隆抗體3G4(ATCC4545)相比，識別或結合基本上或本質上相同或完全相同的表位、表位位點或共同的氨基磷脂或陰離子磷脂表位或具有對這樣的表位的免疫特異性，從而能與單克隆抗體3G4(ATCC 4545)有效的競爭結合至少一種氨基磷脂或陰離子磷月旨、一種以上的氨基磷脂或陰離子磷脂或單克隆抗體3G4(ATCC 4545)所結合的所有氨基磷脂或陰離子磷脂。“3G4交叉反應性抗體”簡稱為“3G4樣抗體”和“基于3G 4的抗體”，這些術語在此可互換使用，并適用于組合物、用途和方法中。
[0045]由于現在已經提供了具有有利特性的3G4，與單克隆抗體3G4(ATCC4545)相比，結合大約、基本上、本質上或完全相同表位的一種或多種抗體的鑒定是一個直接的技術問題。因為交叉反應性抗體的鑒定是與參照抗體(3G4)相比較確定的，應理解為真實地測定參照抗體(3G4)和待測抗體所結合表位在任何情況下都不是鑒定所結合的表位與單克隆抗體3G4相同或基本上相同的抗體所必需的。不過，本文還是提供了 3G4所結合表位的重要信息且可進一步進行表位作圖。
[0046]交叉反應性抗體的鑒定可以用各種免疫學檢測法中的任一種方便的測定，其中可以測定抗體的競爭。所有這些檢測法在本領域中都是常規的方法且在此有進一步的詳述。美國專利6342219和6342221各自特別收編于此作為參考，其目的是為了對本發明關于如何制備具有下述特點的抗體的教導作一些補充，即，該抗體所結合表位與如3G4等給定抗體相同或基本上或本質上相同，或者與給定抗體有效競爭結合某抗原。
[0047]例如，在待檢驗的試驗抗體獲自不同來源動物或甚至來源于不同種型的情況下，可以應用一種簡單的競爭檢測法，其中對照抗體(3G4)和試驗抗體被混合在一起(或預吸附)并施用至氨基磷脂或陰離子磷脂抗原組合物上，優選PS。“氨基磷脂或陰離子磷脂抗原組合物”指包含本文所述3G4結合抗原的任何組合物，如表4中所述的那些。因此，基于ELISA和蛋白質印跡的方法適用于這樣的簡單競爭試驗。
[0048]在某些實施方案中，在施用于抗原組合物之前，將要或預先混合對照抗體(3G4)和不同量的試驗抗體(如，1: 10或1: 100) —段時間。在另一實施方案中，對照抗體和不同量的試驗抗體可以只在暴露于抗原組合物的期間混合。在任何情況下，通過使用物種或同種型的二抗，都將能只探測被結合的對照抗體，它的結合由于存在基本上識別同一表位的試驗抗體而減少。
[0049]在進行對照抗體和任何試驗抗體(無論是何物種或同種型)之間的抗體競爭試驗時，可以首先用諸如生物素或酶(或甚至放射性)標記等可檢測標記物來標記對照抗體(3G4)，使其隨后能夠被識別。在這些情況下，應該將被標記的對照抗體與待檢測的試驗抗體以各種比率(如1: 10、1: 100或1: 1000)預混合或保溫，并且(任選在一段適當時間后)隨后檢測被標記的對照抗體的反應性，將其與保溫中不存在潛在競爭性試驗抗體情況下的對照值進行比較。
[0050]檢測法還可以是基于抗體雜交的一系列免疫學檢測法中的任一種，對照抗體將通過探測它們的標記物的方式被檢測，如，在生物素化抗體的情況下用鏈霉親和素，或者就酶標記物而言使用有關的生色底物(如，就過氧化物酶而言使用3，3’ 5，5’ -N四甲聯苯胺(TMB)底物)或通過簡單地檢測放射性標記。正如被結合的標記物的減少所證實的，與對照抗體結合同一表位的抗體將能夠有效競爭結合，并因此顯著減少了對照抗體的結合。
[0051]在不存在完全無關抗體的情況下(已標記)對照抗體的反應性將是對照最高值。通過將被標記(3G4)的抗體與完全同一類型的(3G4)未標記抗體一起保溫將獲得對照最低值，這種情況下將發生競爭從而減少被標記抗體的結合。在試驗組的檢測中，試驗抗體存在時被標記抗體的反應性的顯著降低是識別同一表位的試驗抗體(即與被標記(3G4)抗體“交叉反應”的抗體)的指示。
[0052]顯著的減少是“可重復性的”，即觀察到始終如一的結合減少。“顯著的減少”就本申請而言被解釋為在約1: 10和約1: 1000之間的任何比率條件下至少約70%、約75%或約80%的可重現性減少(在ELISA中，與一種或多種氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)結合的3G4的減少)。 具有更嚴格交叉封閉活性的抗體在約1: 10和約1: 1000之間的任何比率條件下將展示至少約82%、約85%、約88%、約90%、約92%或約95%上下的可重現性減少(在ELISA或其它適當的檢測中，與一種或多種氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)結合的3G4的減少)。盡管對于進行本發明而言一點也不需要完全或近似完全的交叉封閉性，如在3G4與一種或多種氨基磷脂或陰離子磷脂的結合中展示約97%或96%左右的可重現性減少，但它當然也不排除在本發明之外。
[0053]就第二代抗體的總體而言，競爭的測定可以參照至少結合磷脂酰絲氨酸的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭與磷脂酰絲氨酸的結合；參照至少結合磷脂酸的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭與磷脂酸的結合；參照至少結合磷脂酰肌醇的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭與磷脂酰肌醇的結合；參照至少結合磷脂酰甘油的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭與磷脂酰甘油的結合；參照至少結合心磷脂的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭與心磷脂的結合；以及任選地參照至少結合磷脂酰乙醇胺的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭與磷脂酰乙醇胺的結合。
[0054]在某些實施方案中，第二代抗體的測定可以參照可結合至少第一和第二氨基磷脂或陰離子磷脂的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭結合此第一和第二氨基磷脂或陰離子磷脂；參照可結合至少第一、第二和第三氨基磷脂或陰離子磷脂的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭結合此第一、第二和第三氨基磷脂或陰離子磷脂；參照可結合至少第一、第二、第三和第四氨基磷脂或陰離子磷脂的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭結合此第一、第二、第三和第四氨基磷脂或陰離子磷脂；參照可結合至少第一、第二、第三、第四和第五氨基磷脂或陰離子磷脂的抗體進行，其中的第二代抗體有效競爭結合此第一、第二、第三、第四和第五氨基磷脂或陰離子磷脂。
[0055]在另外的實施方案中，第二代抗體可表征為與至少一種氨基磷脂或陰離子磷脂呈現顯著結合、與含膽堿的中性磷脂無可檢測到的結合且與本發明的單克隆抗體、優選3G4(ATCC 4545)有效競爭的抗體。
[0056]在具體的實施方案中，抗體展示出與陰離子磷脂PS、PA、P1、PG和CL有顯著結合；磷脂結合特征為PS = PA = PI = PG > CL >> PE，其中>表示與所說磷脂的結合有至少2倍的差異，而>>則表示與所說磷脂的結合有至少10倍的差異；表現出無可檢測到的與磷脂酰膽堿或神經鞘磷脂的結合；且與單克隆抗體3G4(ATCC 4545)有效競爭結合各陰離子磷脂 PS、PA、P1、PG 和 CL。
[0057]優選的，第二代抗體將具有前述特征，并且還展示出與活化、分裂、受傷、凋亡或病毒感染細胞表面存在的至少一種陰離子磷脂的顯著結合。更優選的，抗體還顯著抑制正在分裂中的內皮細胞的增殖卻并未明顯改變靜止細胞，且更優選地沒有顯著的狼瘡抗凝物活性。
[0058]就其功能而言，第二代抗體將優選抑制血管發生，具有抗腫瘤作用和抗病毒作用，優選在體內，且更優選的，在發揮這些作用的同時不會在動物或患者體內引起顯著的血栓形成并發癥。因此，優選的抗體具有抗血管發生、抗腫瘤血管、抗腫瘤和抗病毒劑的聯合特性。
[0059]本發明以雜交瘤ATCC 4545產生的單克隆抗體3G4或所說單克隆抗體的抗原結合片段為例進行了說明。產生可與單克隆抗體3G4(ATCC 4545)結合基本上相同的表位的單克隆抗體的雜交瘤是本發明的另一方面。
[0060]除非另外特別提及或從科學術語學的角度更清楚的說明，在以下組合物、免疫綴合物、藥物、組合、混合物(cocktail)、藥劑盒、第一和第二種醫藥用途以及按照本發明的所有方法的有關描述中，術語“抗體”和“免疫綴合物”或其抗原結合區在本文中是指一系列抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體以及特異的3G4交叉反應性抗體。
[0061]術語“抗體”和“免疫球蛋白”用于此處時，泛指任何免疫學結合劑，包括多克隆和單克隆抗體。根據重鏈恒定區的類型，抗體被歸為五種主要類型之一:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中的某些進一步被劃分為亞型或同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。相應于不同類型免疫球蛋白的重鏈恒定區分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。不同類型免疫球蛋白的亞單位結構和三維構象是眾所周知的。
[0062]一般而言，本發明中所使用的是抗體而非抗原結合區時，IgG和/或IgM是優選的，因為它們是生理學條件下最常見的抗體，還因為它們最容易在實驗室環境中制備。根據它們恒定結構域的氨基酸序列，將哺乳動物抗體的“輕鏈”歸為兩種明顯不同的類型之一:kappa( κ )和IambdaO )。在本發明抗體中基本上沒有對使用κ或λ輕鏈的偏好。
[0063]一般情況下優選使用單克隆抗體(MAbs)或其衍生物。MAbs被認識到具有某些優點，如，可再現性和大規模的生產量，這樣就使它們適于臨床治療。因此本發明提供了小鼠、人、猴子、大鼠、倉鼠、兔和甚至青蛙或雞來源的單克隆抗體。小鼠、人來源或人源化的單克隆抗體通常將是優選的。
[0064]正如本領域技術人員將理解的，術語“抗體”所涵蓋的免疫學結合劑延伸到來自所有物種的所有抗體和其抗原結合片段，包括二聚、三聚和多聚抗體；雙特異性抗體；嵌合抗體；人來源或人源化抗體；重組、基因工程產生和駱駝源化(camelised)抗體及其片段。
[0065]術語“抗體”因此被用于指具有抗原結合區的任何抗體樣分子，且此術語包括諸如Fab’、Fab、F(ab’ )2等抗體片段、單一結構域抗體(DABs)、Fv、scFv(單鏈Fv)、線性抗體、二體(diabodies)、駱駝源化抗體等。制備和使用各種基于抗體的構建物和片段的有關技術在本領域中是眾所周知的(參閱Kabat等，1991，專門收編于此作為參考)。具體而言，有關二體的描述另外參閱EP 404097和WO 93/11161，分別專門收編于此作為參考；而線性抗體則另外描述于Zapata等人(1995)的文獻中，該文獻專門收編于此作為參考。
[0066]在某些實施方案中，本發明的組合物包含至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂的抗體，所說抗體含至少第一可變區，該第一可變區包含與SEQ ID NO:2或SEQ ID N0:4的氨基酸序列至少具有約75%、更優選至少約80%、更優選至少約85%、更優選至少約90%、最優選至少約95%左右同一性的氨基酸序列區；其中所說的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂的抗體至少基本上保持了本發明抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體的生物學特性，如同3G4抗體所示范的一樣。
[0067]關于本發明這些和其它抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體序列的同一性或同源性在此定義為，在將序列比對并且(在需要時)導入缺口以達到最大序列相同性百分比時，候選序列中與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的序列、或者與本發明的其它抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體序列相同的氨基酸殘基的百分率。保持用于序列比較的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體基本上相同或甚至更有效的生物學特性是尤其重要的。這樣的比較是容易進行的，如可利用本文所述的各種檢測法中的一種或多種方法進行。
[0068]在某些優選的實施方案中，本發明的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體包含至少第一可變區，該第一可變區包含具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4氨基酸序列的氨基酸序列區，例如包含由SEQ ID NO:1或 SEQ ID NO:3所示核酸序列編碼的氨基酸序列的可變區。這些序列是含重鏈和輕鏈可變區⑶R1-3 (互補性決定區)的3G4S cFv的Vh和V κ序列。
[0069]在其它優選的實施方案中，提供了與諸如3G4(ATCC 4545)等最初的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體相比具有增強了的或更優越的特性的第二代抗體。
[0070]在某些實施方案中，所應用的抗體將是“人源化的”、部分人源或人來源的抗體。“人源化”抗體通常是來自小鼠或其它非人物種的嵌合單克隆抗體，其中攜帶人的恒定和/或可變區結構域(“部分人來源的嵌合抗體”)。用于本發明中的各種人源化單克隆抗體將是嵌合抗體，其中小鼠、大鼠或其它非人單克隆抗體的至少第一抗原結合區或互補性決定區(CDR)被有效連接或“移植”到人抗體恒定區或“框架”上。
[0071]本文所用的“人源化”單克隆抗體還可以是來自非人物種的單克隆抗體，其中一個或多個選定的氨基酸已被人抗體中更經常觀察到的氨基酸所替換。通過使用常規重組技術，尤其是定位誘變，可以方便的完成這一步。
[0072]還可制備完全來源于人的抗體，而非“人源化”的抗體，并應用于本發明中。所說的人源抗體可以通過以下方式獲自健康的受試者，即，簡單地從人受試者中獲得混合的外周血淋巴細胞群，其中包括抗原呈遞和抗體產生細胞，并通過與免疫學有效量的氨基磷脂或陰離子磷脂樣品混合而刺激體外細胞群。該人抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體生產細胞一旦獲得就可用于雜交瘤和/或重組抗體的生產中。
[0073]另外用于單克隆抗體生產的技術包括用免疫學有效量的氨基磷脂或陰離子磷脂樣品免疫包含人抗體文庫的轉基因動物，優選轉基因小鼠。這還產生了人抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體生產細胞，以供進一步用于雜交瘤和/或重組抗體的生產中，其優勢在于，脾細胞(而非外周血細胞)可方便的獲自轉基因動物或小鼠。
[0074]按照本發明的抗體可以通過選擇與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)實質性交叉反應或競爭的抗體而方便的制備得到。適當的制備過程和方法包括:
[0075](a)制備候選的抗體生產細胞；并
[0076](b)從候選的抗體生產細胞中選擇與單克隆抗體3G4(ATCC PTA4545)實質性交叉反應或競爭的抗體。
[0077]制備適當抗體生產細胞并從中獲得抗體的一種方法可以在給定患者體內原位進行。即，簡單地向患者提供免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或陰離子磷脂樣品將導致合適的抗體產生。因此，雖然抗體仍然“獲自”抗體生產細胞，但它不必從宿主中分離并隨后再提供給患者，而能夠自發的定位于腫瘤血管結構并發揮其生物學抗腫瘤作用。不過，這樣的實施方案并非目前優選的。
[0078]還可通過在體外用氨基磷脂或陰離子磷脂刺激外周血淋巴細胞而獲得適當的抗體生產細胞，并隨后分離和/或純化抗體。
[0079]其它方法包括將包含至少第一免疫原性氨基磷脂或陰離子磷脂組分的免疫組合物施用于動物并從被免疫的動物中選擇與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)實質性交叉反應或競爭的抗體。這些方法通常包括:
[0080](a)通過將含免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或陰離子磷脂的至少一劑、任選一劑以上的組合物施用于動物來免疫動物；并
[0081](b)從被免疫的動物中獲取適當的抗體生產細胞，諸如產生與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)實質性交叉反應或競爭的抗體的抗體生產細胞。
[0082]本文中，優選的“含免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或陰離子磷脂的組合物”是含活化內皮細胞的組合物。“活化內皮細胞”優選制備如下:在至少第一條件下放置內皮細胞，或將內皮細胞與至少第一因子接觸，該條件/因子可活化內皮細胞以及/或模擬腫瘤環境，持續時間是足以基本上保持細胞活力并有效刺激至少一種陰離子磷脂在內皮細胞表面表達的時間。
[0083]有效制備活化內皮細胞的“條件”實例有低氧和/或酸性的環境。有效制備活化內皮細胞的因子的例子有有效濃度的H2O2、凝血酶、炎性細胞因子如IL-1 α、IL-1 β、干擾素或TNF α，以及總體上模擬腫瘤環境的條件和/或因子的組合。
[0084]無論免疫方法的特性或免疫動物的類型是什么，合適的抗體生產細胞可獲自免疫動物，并優選進一步進行人工處理。“被免疫的動物”用于此處時，除非另外特別提及，是非人動物。盡管任何抗體生產細胞都可使用，最優選將脾細胞作為抗體生產細胞的來源。抗體生產細胞可用于制備型方法中，其中包括:
[0085](a)將適當的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體生產細胞與永生化細胞融合以制備產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤；并
[0086](b)從雜交瘤中獲取本發明的適當抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體。
[0087]“適當”的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體生產細胞、雜交瘤和抗體是產生抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或以此形式存在的那些細胞或雜交瘤或抗體，優選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)實質性交叉反應或競爭的抗體。
[0088]基于雜交瘤的單克隆抗體制備方法由此包括含以下步驟的那些方法:
[0089](a)將含免疫學有效量的免疫原性氨基磷脂或陰離子磷脂的至少一劑、任選多劑組合物施用于動物來免疫動物，優選含活化內皮細胞的組合物；
[0090](b)從被免疫動物中制備單克隆抗體生產雜交瘤的集合；
[0091](c)從集合中選擇產生本發明的至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂單克隆抗體的至少第一雜交瘤，所述抗體任選是與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)實質性交叉反應或競爭的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體；并
[0092](d)培養該至少第一抗體生產雜交瘤，以提供該至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂單克隆抗體；并優選
[0093](e)從人工培養的至少第一雜交瘤中獲取所述至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂單克隆抗體。
[0094]在鑒定與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)實質性交叉反應的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體時，選擇步驟可以包括:
[0095](a)將氨基磷脂或陰離子磷脂樣品，優選PS樣品，與有效量的單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)和候選抗體接觸；并
[0096](b)測定候選抗體實質性減少3G4抗體與氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)樣品結合的能力；其中候選抗體實質性減少3G4抗體與氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)樣品結合的能力是與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同表位的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體的指示。
[0097]選擇步驟可進一步包括:
[0098](a)將第一氨基磷脂或陰離子磷脂樣品，優選PS，與有效結合量的單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)接觸并測定與氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)結合的3G4的量；
[0099](b)將第二氨基磷脂或陰離子磷脂樣品，優選PS，與有效結合量的單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)以及有效競爭量的候選抗體接觸，并測定在候選抗體存在的條件下與氨基磷脂或陰離子磷脂，優選PS結合的3G4的量；并
[0100](C)通過選擇減少與氨基磷脂或陰離子磷脂結合的3G4的量的候選抗體來鑒定與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)結合基本上相同的表位的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體，所說的磷脂優選PS，所說的3G4結合減少量優選至少約80%。
[0101]用于本文中時，所有的標準選擇均優選在無血清的條件下進行，以避免產生的抗體可能酷似患者的病態抗體的缺點，所說的病態抗體能與結合蛋白質的氨基磷脂或陰離子磷脂結合。
[0102]將非人動物用于免疫接種時，從這樣的雜交瘤中獲取的單克隆抗體常常具有非人類型的組成。正如本領域技術熟練人員已知和本文進一步公布的內容一樣，所說的抗體可以任選的進行人源化處理、移植或突變。或者，可以使用含有人抗體基因文庫的轉基因動物，諸如小鼠等。這些動物的免疫將因此直接導致適當人抗體的產生。
[0103]產生適當的抗體生產細胞，最優選雜交瘤后，無論生產人或非人的抗體，都可以克隆編碼單克隆抗體的核酸以制備“重組”單克隆抗體。任何重組克隆技術都可利用，包括利用PCR?起動編碼抗體的核酸序列的合成。為此，還有更多的合適單克隆抗體制備方法，包括按如下步驟利用抗體生產細胞的方法:
[0104](a)從適當的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體生產細胞，優選雜交瘤中獲取至少第一適當的編碼抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體的核酸分子或片段；并
[0105](b)在重組宿主細胞中表達所說的核酸分子或片段，以便獲得本發明的重組抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂單克隆抗體。
[0106]不過，還有其它的有效重組技術可供利用，它們適于制備重組單克隆抗體的。這些重組技術包括基于噬菌粒文庫的單克隆抗體制備方法，含以下步驟:
[0107](a)通過將至少一劑、任選多劑組合物施用于動物來免疫動物，所說的組合物含有免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或陰離子磷脂，優選含活化內皮細胞的組合物；
[0108](b)制備免疫球蛋白噬菌粒組合文庫，該文庫表達分離自免疫動物(優選來源于脾)的抗體生產細胞的RNA ；
[0109](C)從噬菌粒文庫中選擇表達至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體的至少第一克隆，任選所述抗體可與單克隆抗體3G4(ATCCPTA 4545)實質性交叉反應或競爭；
[0110](d)從至少第一選定克隆中獲得編碼抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體的核酸，并在重組宿主細胞中表達此核酸，以提供至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體；并優選的
[0111](e)獲得從由所說的至少第一選定克隆中獲得的核酸表達的至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體。
[0112] 此外，在這些基于噬菌粒文庫的技術中，可以應用攜帶人抗體基因文庫的轉基因動物，從而產生重組的人單克隆抗體。
[0113]無論第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體核酸片段的制備方式如何，更多的合適抗體核酸片段都可用標準的分子生物學技術來方便的制備。為了證實任何變體、突變體或第二代抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體核酸片段適用于本發明，將測試核酸片段以證實本發明的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體的表達。優選的，還將測試變體、突變體或第二代核酸片段以證實在標準條件下，更優選標準嚴謹雜交條件下的雜交。例示性的合適雜交條件包括在大約7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、大約0.5MNaP04、大約ImM EDTA中50°C左右雜交；然后用大約1% SDS在42 °C左右漂洗。
[0114]就多種重組單克隆抗體而言，無論是人源的還是非人源的，都是容易制備的，本發明的任何處理方法都可通過向動物提供至少第一核酸片段而實施，所說的核酸片段在患者體內表達生物學有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體。“表達抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂、3G4樣或基于3G4的抗體的核酸片段”通常至少以表達構建物的形式出現，且可以以包含于病毒或重組宿主細胞中的表達構建物的形式出現。本發明優選的基因治療載體通常將是病毒載體，諸如包含于重組逆轉錄病毒、單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、巨細胞病毒(CMV)等病毒中的病毒載體。
[0115]細胞不透性耐久霉素衍生物:本發明另外還提供了基本上細胞不透性的磷脂酰乙醇胺(PE)結合肽構建物和衍生物，它包含已被修飾的至少第一 PE結合肽從而形成基本上細胞不可滲透的PE結合構建物。
[0116]優選的，本發明提供了在藥用可接受載體中包含生物學或治療學有效量的至少第一基本上細胞不可滲透性PE結合構建物的藥物組合物，它包含已被修飾的至少第一 PE結合肽從而形成基本上細胞不透性PE結合構建物。因此，基本上細胞不透性PE結合構建物是用于制藥學、藥理學和治療學，即醫學用途中的構建物，優選用于治療病毒感染。在某些實施方案中，本發明提供了與生物素連接的除肉桂霉素之外的基本上細胞不透性PE結合構建物。
[0117]更優選的，本發明的基本上細胞不透性PE結合肽衍生物是基本上細胞不透性耐久霉素肽衍生物和其藥物組合物。耐久霉素肽通常通過有效連接至少第一細胞不透性基團而被修飾，從而形成基本上細胞不透性耐久霉素衍生物。細胞不透性基團的有效連接可通過SEQ ID NO:9中的第二位氨基酸賴氨酸殘基進行。
[0118]細胞不透性基團在生理學pH下可以攜帶陽性或陰性電荷或者可以是極性的。典型的基團包括硫酸根、磺酸根、磷酸根、羧基、苯酚、季銨離子和胺基團。含有連接了生物素的耐久霉素的藥物組合物是本發明的一個具體實施例。
[0119]基本上細胞不透性的耐久霉素還可與糖、寡糖或多糖、氨基酸、肽、多肽、蛋白質或多元醇基團有效連接。某些細胞不透性耐久霉素是那些與諸如中性親和素(neutravidin)、鏈霉親和素、白蛋白或惰性免疫球蛋白載體蛋白等惰性載體蛋白有效連接的耐久霉素，其中尤其優選與人IgG(HIgG)連接的耐久霉素。細胞不透性耐久霉素的其它例子包括與靶向劑(優選結合腫瘤細胞、腫瘤血管結構或腫瘤基質或病毒感染細胞的靶向劑)連接的耐久霉素。與腫瘤細胞、腫瘤血管結構或腫瘤基質成分結合的靶向劑的例子參閱美國專利6093399,6004555,5877289和6036955，各自特別收編于此作為參考。
[0120]腫瘤治療:本發明進一步提供了含至少第一純化的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物的組合物，任選該抗體與單克隆抗體3G4(ATCC PTA4545)基本上結合相同的表位，或者含基本上細胞不透性PE結合肽衍生物、優選基本上細胞不透性耐久霉素衍生物的組合物。這些組合物是優選的藥用可接受組合物，包括為諸如靜脈內注射等腸胃外投藥而配制的組合物，或為了以脂質體或氣霧劑形式施用而配制的組合物。
[0121 ] 本發明提供了包括3G4交叉反應的、3G4樣的或基于3G4的抗體在內的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體和基本上細胞不透性耐久霉素衍生物的許多制備方法和用途。就所有的方法而言，除非特別提及，術語“一個(種)”用于指所述方法中的“至少一個(種)”、“至少第一種(個)”、“一個(種)或多個(種)”或“多個(種)”步驟。這與治療方法中的施用步驟尤其有關。因此，本發明不僅可以應用不同的劑量，還可以使用不同數目的劑量，如注射或吸入，可多達并包括多種注射或吸入。在施用抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或免疫綴合物或基本上細胞不透性耐久霉素衍生物之前、之后或期間都可以使用組合療法。
[0122]本發明還提供了具有重要生物學意義的各種有用的體外使用方法和用途。首先提供的是結合氨基磷脂或陰離子磷脂，優選PS或PE的方法和用途，這通常包括將含氨基磷脂或陰離子磷脂，優選PS或PE的組合物接觸至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同的表位的抗體，或接觸基本上細胞不透性耐久霉素衍生物。“接觸”是在有效允許結合復合物形成的條件下進行的，并對由此形成的任何復合物進行檢測。檢測方法和用途可用于生物學樣品，如用于診斷細胞凋亡、腫瘤和病毒感染細胞，另外還提供了基于此的診斷藥劑盒。
[0123]本發明還提供了增殖抑制方法和用途，它們優選使用本發明的抗體、抗原結合片段和免疫綴合物。抑制內皮細胞增殖和/或遷移的方法通常包括在有效抑制內皮細胞增殖和/或遷移的條件下使含內皮細胞群在內的細胞群或組織接觸含生物學有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體(任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同的表位的抗體)或其抗原結合片段的組合物。
[0124]前述方法和用途可在體外和體內進行，在后一種情況下，其中組織或細胞位于動物內，而抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體被施用于動物。在兩種情況下，所說的方法和用途都可成為用于抑制血管發生的方法和用途，包括在有效抑制血管發生的條件下使含有潛在生血管性血管的組織或血管群接觸含生物學有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段的抗血管發生性組合物，任選所述抗體與單克隆抗體3G4 (ATCCPTA 4545)基本上結合相同的表位。
[0125]在潛在生血管性血管群離體維持的情況下，本發明在藥物開發項目中也具有效用。附帶可靠陽性和陰性對照的體外篩選試驗可用作藥物開發的第一個步驟來抑制或促進血管發生，以及用于闡述有關血管發生過程的更多信息。在潛在生血管性血管群位于動物或患者體內的情況下，抗血管性發生組合物作為一種療法施用于動物。
[0126]針對已經患上或有危險患上特征為不希望有的、不適當的、異常的、過多的和/或病態的血管形成的任何疾病或病癥的動物和患者，可提供抗血管發生和抗血管療法。本領域普通技術人員眾所周知，因為異常的血管發生廣泛的存在于疾病和病癥中，一種給定的抗血管發生療法一旦顯示出在任何可接受模型系統中是有效的，就可用于治療整個范圍內與血管發生相關的疾病和病癥。
[0127]本發明的方法和用途特別意圖用于已經患上或有危險患上以下疾病的動物和患者中:任何形式的血管化腫瘤；黃斑變性，包括與年齡相關的黃斑變性；關節炎，包括類風濕性關節炎；動脈粥樣硬化癥和動脈粥樣斑塊；糖尿病性視網膜病和其它的視網膜病；甲狀腺增生，包括格雷夫斯氏病；血管瘤；新生血管性青光眼；和牛皮癬。
[0128]本發明的方法和用途還意圖用于已經患上或有危險患上以下疾病的動物和患者中:動靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤和血管再狹窄，包括血管成形術后的再狹窄。這些治療方法和用途的其它預期目標是已經患上或有危險患上以下疾病的動物和患者:血管纖維瘤、皮炎、子宮內膜異位癥、血友病性關節、肥厚性瘢痕、炎性疾病和病癥、化膿性肉芽腫、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘附。
[0129]如同特別收編于此作為參考的美國專利5712291中所述的，前述被治療疾病類型中的各類都決非對可用本發明治療的疾病種類的窮舉。為了某些特殊的目的將美國專利5712291收編于此作為參考,所說的目的包括:識別可用抗血管形成療法有效治療的許多其它疾病；顯示一旦確定類型的抑制血管發生的化合物已公布并申請專利，則所有血管形成疾病的治療都代表了一個統一的概念(在本案例中，是抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同的表位的抗體)；以及通過只來自單一模型系統的數據顯示可實現所有血管形成性疾病的治療。
[0130]除了血管形成性和血管類疾病的治療外，本發明重要的統一的方面是用于治療已經患有或有危險患癌癥的動物和患者的組合物和方法。所有的癌癥治療方法和用途包括施加或使用至少第一純化的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同的表位的抗體，或者施加或使用基本上細胞不透性的PE結合肽衍生物，優選基本上細胞不透性的耐久霉素衍生物。以治療有效量將所說的構建物施用于患癌癥的動物或患者。
[0131]本發明的癌癥治療方法，即使是利用抗體的療法，也不是單純依賴于發揮抗血管和/或抗血管形成作用的。本發明的癌癥治療方法和用途適于治療所有形式的癌癥，包括已經患有或有危險患血管性實體瘤、轉移性腫瘤或來自原發腫瘤的轉移性病灶的動物和患者。
[0132]未綴合的或“裸露的抗體”及其片段以及該抗體或其抗原結合片段與治療劑有效連接的免疫綴合物都可用于本發明的抗癌治療中。因此，除非另外特別提及或以科學術語解釋的更清楚，術語“抗體及其片段”用于此處時，是指“未綴合的或裸露的”抗體或片段，它未與另一藥劑連接，具體而言是未與治療或診斷劑連接。這些定義并未排除抗體的修飾，諸如，舉例說來，為了提高抗體的生物學半壽期、親合力、親和性或其它特性而進行的修飾，或者抗體與其它效應子的組合。
[0133]在以免疫綴合物為基礎治療癌癥的方法中，所述抗體或其抗原結合片段與一系列生物學、治療性的和/或所謂的第二抗癌劑(抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體本身，是第一抗血管發生劑)中的任意一種或多種有效連接，后者可以具有直接或間接的抗癌作用。
[0134]因此，本發明另外還提供了用于遞送選定的治療劑或診斷劑至腫瘤的方法。這樣的實施方案包括向患腫瘤的動物或患者施用至少含第一免疫綴合物的生物學有效量的組合物，在所說的免疫綴合物中診斷劑或治療劑與抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段有效連接，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同的表位的抗體。
[0135]因此本發明的組合物以及方法和用途包括含有與至少第一生物學、治療或診斷劑有效連接的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體的組合物，所說抗體任選是與抗體3G4(ATCCPTA 4545)基本上結合相同的表位的抗體。抗體優選與放射治療劑、抗血管發生劑、細胞凋亡誘導劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞的細胞毒性劑或細胞因子(或抗病毒藥物，如下所述)連接。
[0136]用于連接的某些優選藥劑是體內診斷劑，如，使綴合物可作為代用標記用于化學治療的診斷劑。
[0137]優選用于抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或基于3G4的治療用綴合物中的藥劑是補足或增強抗體效力的藥劑和/或為特殊腫瘤類型或患者選擇的藥劑。“補足或增強抗體效力的治療劑”包括放射治療劑、血管滲透性增強劑、某些細胞因子、抗血管發生藥劑、細胞凋亡誘導劑和抗微管蛋白藥物，其中的任意一種或多種治療劑均可使用。
[0138]目前優選的藥劑是細胞毒性劑gelonin ;細胞因子，諸如TNFa、IL-12和LEC(肝表達的趨化因子)；具有抗血管發生作用的抗癌劑，如表E中所示；誘導細胞凋亡的抗癌劑，如表F中所示；和來自考布他汀家族的抗微管蛋白藥物。特別優選的藥劑是多西他賽。
[0139]本發明的癌癥治療組合物和方法還可與其它療法和診斷法聯合使用。“聯合”一詞就與治療劑聯合的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂或基于3G4的抗體而言，還包括聯合的組合物、藥物、混合物、藥劑盒、方法，其中的治療劑是以前體藥物的形式出現的。
[0140]聯合的癌癥治療方法是指這樣的方法，即，其中將至少第一純化的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA4545)基本上結合相同表位的抗體，或者基本上細胞不透性PE結合肽衍生物，優選基本上細胞不透性耐久霉素衍生物，與治療有效量的至少第二治療劑或抗癌劑聯合施用于患癌癥的動物或患者。
[0141]本發明進一步提供了組合物、藥物組合物、治療藥劑盒和藥用混合物，其中，任選地在至少第一組合物或容器中，含生物學有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA4545)基本上結合相同表位的抗體，或其抗原結合片段或免疫綴合物，或基本上細胞不透性PE結合肽衍生物，優選基本上細胞不透性耐久霉素衍生物；和生物學有效量的至少第二生物學藥劑、組分或系統，優選至少第二治療劑或抗癌劑。
[0142]“至少第二生物學藥劑、組分或系統”經常會是治療或診斷劑、組分或系統，但也可以不是如此。例如，至少第二生物學藥劑、組分或系統可以包含用于修飾抗體的組分和/或用于將其它藥劑與抗體連接的組分。某些優選的第二生物學藥劑、組分或系統是前體藥物或用于制備和使用前體藥物的組分，包括用于制備前體藥物本身的組分和用于改造本發明的抗體使其在所說的前體藥物或ADEPT實施方案中發揮功能的組分。
[0143]在待治療疾病是癌癥的情況下，“至少第二治療或抗癌劑”將包含于治療藥劑盒或混合物中。術語“至少第二抗癌劑”是參考作為第一抗癌劑的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、3G4構建物或基本上細胞不透性PE結合肽衍生物(優選基本上細胞不透性耐久霉素衍生物)而選擇的。本發明的抗體因此可以聯合化學治療劑、放射治療劑、細胞因子、抗血管發生劑、細胞凋亡誘導劑或抗癌免疫毒素或凝血配體(coaguligands)。“化學治療劑”還包括基因、載體、反義構建物和核酶。
[0144]目前優選的第二抗癌劑是具有抗血管發生作用的抗癌劑，如表E所示；誘導細胞凋亡的抗癌劑，如表F中所示；和來自考布他汀家族的抗微管蛋白藥物。特別優選的藥劑是多西他賽。
[0145]就本發明的組合物、藥劑盒和/或藥物而言，聯合有效量的治療劑可包含于單一的容器或容器裝置中，或包含于不同的容器或容器裝置中。混合物通常被混合在一起以便聯合使用。常常優選按靜脈注射配制的藥劑。還可包括成像組分。藥劑盒中還可包括使用該至少第一抗體和所包括的一種或多種其它生物學藥劑的說明書。
[0146]一般而言，該至少第二抗癌劑可與抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、基于3G4的治療劑或基本上細胞不透性耐久霉素衍生物基本上同時施用于動物或患者，例如來自單一藥物組合物或來自緊接著一起施用的兩種藥物組合物。
[0147]或者，在施用抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、基于3G4的治療劑或基本上細胞不透性耐久霉素衍生物后順次的時間點將至少第二抗癌劑施用于動物或患者。“在順次的時間點”用于此處是指“錯開的時間”，這樣至少第二抗癌劑在與施用抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、基于3G4的治療劑或基本上細胞不透性耐久霉素衍生物不同的時間施用給動物或患者。兩種藥劑的給藥相隔有效的時間，以便使兩種藥劑都能發揮它們各自的療效，即，它們以“生物學有效的時間間隔”進行施用。至少第二抗癌劑可在抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、基于3G4的治療劑或基本上細胞不透性耐久霉素衍生物施用之前或之后間隔生物學有效時間施用于動物或患者。
[0148]還可進行腫瘤成像，優選用可檢測標記物標記的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或基于3G4的抗體構建物進行。依照本發明的成像可以探測凋亡前和凋亡的細胞，因此它可以在治療后用作替代標志。或者，因為所形成的圖像將預示著待使用治療劑的結合位點，所以可在治療前進行成像。因此癌癥治療可通過如下步驟進行:
[0149](a)形成腫瘤圖像，即將診斷最少量的至少第一可檢測標記的腫瘤結合劑施用于患腫瘤的動物或患者，優選抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或基于3G4的抗體構建物，其中含有與腫瘤結合劑或抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或基于3G4的抗體有效連接的診斷劑，從而形成腫瘤的可檢測圖像；并
[0150](b)隨后對同一動物或患者施用治療最適量的至少第一裸露的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或3G4抗體或利用了所說抗體的治療劑-抗體構建物，從而引起抗腫瘤作用。
[0151]為此提供了成像和治療制劑或藥物，它們通常包含:
[0152](a)含診斷有效量的可檢測標記的腫瘤結合劑的第一藥物組合物，優選抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或基于3G4的抗體構建物，組合物中包含與腫瘤結合劑或抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或基于3G4的抗體有效連接的可檢測劑；和
[0153](b)含治療有效量的至少一種裸露抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或3G4抗體或利用所說抗體的治療劑-抗體構建物的第二藥物組合物。
[0154]治療病毒感染:本發明尤其重要和不尋常的進展是用于治療或預防病毒感染的有關組合物、聯合、藥劑盒、方法、用途和藥物。本發明的抗病毒療法涉及本發明前述和其它治療劑中的任一種或多種的施加或使用。
[0155]首先，如同上述針對組合物和癌癥治療所述的，本發明的抗病毒組合物和治療方法涉及至少第一純化的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同表位的抗體，或者基本上細胞不透性PE結合肽衍生物，優選基本上細胞不透性耐久霉素衍生物的施加或使用。在基本上細胞不透性PE結合肽衍生物中，優選使用的是基本上細胞不透性耐久霉素衍生物，諸如與生物素連接的耐久霉素或與HIgG連接的耐久霉素。
[0156]由于發現了本發明的抗體和肽與病毒感染之間存在著不尋常的關系，本發明進一步提供了一系列新的治療劑用于治療病毒感染。具體而言，本發明提供了抗氨基磷脂或陰離子磷脂(尤其是PS和PE)的抗體，它們與至少第一抗病毒劑有效連接。本發明另外還提供了基本上細胞不透性PE結合肽衍生物，優選耐久霉素肽衍生物，其與至少第一抗病毒劑有效連接。用于連接本發明抗體和肽的適當抗病毒劑包括表G中所列舉的類型。
[0157]因此，總而言之，本發明的抗病毒組合物和治療方法涉及對受病毒感染的動物或患者施用含治療有效量的至少第一純化的抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或其抗原結合片段或抗病毒免疫綴合物的組合物，所述抗體任選是與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同表位的抗體，或者是施用含治療有效量的基本上細胞不透性PE結合肽衍生物(優選基本上細胞不透性耐久霉素衍生物)或其抗病毒免疫綴合物的組合物。
[0158]本發明的抗病毒治療方法適于治療動物和人、甚至是植物中的所有病毒。本發明的治療劑可抑制病毒入侵，但優選抑制來自受感染宿主細胞的病毒的復制、流出(egress)和擴散。如表H中所示，本發明適于治療感染脊椎動物，尤其是人的所有病毒，尤其是在人體內呈致病性的病毒。可用本發明治療的病毒感染和相關疾病包括表J中所列舉的病毒和疾病，舉例說來就是治療CMV、RSV和沙粒病毒感染，以及肝炎、流行性感冒、肺炎、拉沙熱和AIDS。
[0159]本發明的抗病毒治療組合物和方法還可與其它療法和診斷法聯合使用。這些“聯合的”使用是將獨立的抗病毒劑在聯合組合物、藥物、混合物、藥劑盒和治療方法中聯合起來施用。
[0160]前述癌癥和抗病毒治療方法和用途常常包括將藥用有效量的組合物系統性施用于動物或患者，如通過穿皮膚、肌肉內、靜脈內注射等。對于治療病毒感染，尤其是呼吸性病毒感染而言，優選將組合物遞送至肺，這可用氣霧劑來達到目的。無論如何，可以使治療劑定位于腫瘤或病毒感染位置的任何施藥途徑都將是可接受的。因此，其它適當的遞送途徑包括口服、直腸投藥、鼻飼、局部用藥和陰道用藥。對于治療關節炎的用途和方法來說，例如可以采用滑膜內施藥，如美國專利5753230中針對其它的免疫學藥劑所述的，該文獻特別收編于此作為參考。對于與眼睛相關的疾病來說，應考慮眼用制劑和施藥方式。
[0161]“施用”一詞用于此處是指，以有效發揮其治療作用的一定量和一定的持續時間提供或遞送抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體或基于3G4的治療劑或基本上細胞不透性PE結合肽衍生物，優選耐久霉素衍生物。在某種程度上，由于它的簡單性和可重復性，通常優選蛋白質性治療劑的被動施藥方式。
[0162]無論如何，術語“施用”在此處用于指遞送治療劑的任何和所有的方式。“施用”的含義因此包括以有效方式提供產生抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、基于3G4的抗體或耐久霉素衍生物治療劑的細胞。在這樣的實施方案中，可能期望將所說細胞制備或包裝于選擇性可滲透膜、結構或可移植裝置中，通常是可通過移除來終止治療的裝置。從外部施藥仍將是一般優選的方式，因為它代表了可以使用藥量被嚴密監測和調控的非侵入型方法。
[0163]本發明的治療方法和用途還延伸到以能有效導致其體內表達的方式提供編碼抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、基于3G4或耐久霉素衍生物治療劑的核酸。任何基因治療技術都可應用，諸如裸DNA遞送、重組基因和載體、基于細胞的遞送，包括患者細胞的離體操作，等等。脂質體和隱蔽的脂質體將優選用于某些實施方案中。
[0164]本發明的藥物組合物和治療方法中應用了“治療有效量的”抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體，任選與單克隆抗體3G4(ATCC PTA 4545)基本上結合相同表位的抗體，或這些抗體的抗原結合片段或免疫綴合物，或基本上細胞不透性PE結合肽衍生物，優選基本上細胞不透性耐久霉素衍生物。“治療效果”和由此而來的“治療有效量”對于癌癥治療和抗病毒治療來說是用不同的參數檢測的。
[0165]在癌癥治療中，要求藥劑的量在施用于動物或患者后可以有效的特異性殺死至少一部分腫瘤細胞、腫瘤或腫瘤內血管內皮細胞；特異性誘導至少一部分腫瘤細胞、腫瘤或腫瘤內血管內皮細胞中的細胞凋亡；特異性促進至少一部分腫瘤或腫瘤內血管中的凝血；特異性堵塞或破壞腫瘤的至少一部分血液輸送管道；特異性誘導至少一部分腫瘤內的壞死；和/或引起腫瘤的衰退或緩解。
[0166]在治療病毒感染和相關疾病中，藥劑的量是可以有效抑制病毒感染進行中所需的一種或多種活動，諸如病毒入侵，和優選的，來自受感染宿主細胞的病毒復制、進出和擴散。所說的量還可以以阻礙病毒復制、擴散和進行感染的形式殺死或去除至少一部分受病毒感染的細胞。總而言之，要求藥劑的量是在施用于動物或患者時能有效減少、顯著減少或消滅病毒感染的量。
[0167]術語“優先地”和“特異性地”用于此處時是指抗氨基磷脂或抗陰離子磷脂抗體、基于3G4的治療劑或基本上細胞不透性PE結合肽衍生物，優選耐久霉素衍生物，基本上局限于在發病部位達到抗癌或抗病毒效果，且基本上不會在動物或患者正常健康組織中引起凝血、破壞和/或組織壞死。健康細胞和組織的結構和功能基本上保持不受本發明實施的損害。
[0168]附圖簡述
[0169]以下圖表組成了本說明書的一部分，用于進一步證明本發明的某些方面。本發明可以參照這些圖表中的一個或多個并結合本文所提供的具體實施方案的詳述而得到更好的理解。本專利的美國文件包含至少一幅彩圖。如果需要并付必需的費用，帶彩圖的本專利復印件將由專利商標局提供。
[0170]圖1.抗PS抗體(3SB)對小鼠內人何杰金氏淋巴瘤、3LL小鼠肺癌和B16小鼠黑素瘤中血管內皮細胞的定位。對患腫瘤的SCID小鼠靜脈內注射20yg抗PS(3SB)或抗CL(Dll)小鼠IgM。I小時后用鹽水灌注血液循環系統。I小時后處死小鼠，收獲腫瘤和器官并速凍。用山羊抗小鼠IgM-過氧化物酶綴合物檢測冰凍切片上的小鼠IgM。在所有腫瘤中抗PS抗體都特異地定位于血管處(箭頭所指)。在注射對照樣品抗CL IgM的小鼠中未觀察到其定位。
[0171]圖2A和圖2B.9D2抗體和膜聯蛋白V與吸附于塑料制品上的磷脂的結合。磷脂被吸附于微量滴定板的塑料上。用10%的血清封閉后，在存在10%血清的條件下加入6.66nM-0.005nM濃度范圍的9D2抗體(圖2A)或膜聯蛋白(圖2B)。洗滌平板后，分別用山羊抗大鼠IgM-HRP和兔抗膜聯蛋白V IgG及隨后加入的抗兔HRP檢測被結合的9D2抗體和膜聯蛋白V。
[0172]圖3.競爭性磷脂脂質體抑制9D2抗體和膜聯蛋白V與經過氧化氫處理過的內皮細胞上的陰離子磷脂的結合。9D2抗體和膜聯蛋白V(6.66nM)與含10%血清的各種磷脂脂質體(200 μ g/ml)DPBS緩沖液預保溫。分別用山羊抗大鼠IgM-HRP和兔抗膜聯蛋白V IgG及隨后加入的抗兔HRP檢測被結合的9D2抗體和膜聯蛋白V。測定存在或缺乏競爭性脂質體條件下的結合。三份平行試樣測定值的標準偏差小于平均值的10%。
[0173]圖4.生物素化9D2抗體和膜聯蛋白V在小鼠中同位MDA-MB-231人乳癌內血管內皮細胞和腫瘤細胞中的定位。對在乳房脂墊處有MDA-MB-231腫瘤的Nu/Nu小鼠靜脈內注射50μ g生物素化的9D2抗體或100 μ g生物素化的膜聯蛋白V。I小時后，用鹽水灌注它們的血液循環系統。切除腫瘤和器官并速凍。用鏈霉親和素-HRP綴合物檢測冰凍切片上被定位的9D2和膜聯蛋白V。將來自用鹽水或對照大鼠IgM注射的小鼠的腫瘤切片作為陰性對照。
[0174]圖5.低氧和炎性細胞因子對PS暴露的聯合作用。在含氧量正常的(白色柱)和低氧的(灰色柱)條件下用IL-1 α和TNF α處理bEnd.3細胞24小時。在這些條件下細胞單層保持完整并存活。通過檢測1251-膜聯蛋白V的結合測定PS的外在化。PS的暴露水平表示為在用放線菌素D和TNF α聯合處理的細胞中的百分數。
[0175]圖6Α和圖6Β.抗PS抗體(3SB)在有同基因和異基因腫瘤的動物中的抗腫瘤作用。將IXlO7個細胞的小鼠結直腸癌Colo26(圖6A)或人何杰金氏淋巴瘤L540 (圖6B)分別皮下注射入BALB/c小鼠(圖6A)或雄性CB17SCID小鼠(圖6B)的右側。待腫瘤長至大小約0.6-0.9cm3后，對小鼠(每組4只)腹膜內注射20μ g裸露的抗PS抗體(空心正方形)或鹽水(空心圓)。每隔48小時重復類似處理3次。每天監測動物的腫瘤大小和體重。當腫瘤長至2cm3時處死小鼠，或者如果腫瘤出現壞死或潰瘍的征兆時也可提前處死。對照小鼠IgM給出了與鹽水類似的結果。
[0176]圖7.9D2抗體在攜帶L540人何杰金氏淋巴瘤的小鼠中的抗腫瘤作用。與對照(空心正方形)相反，對攜帶腫瘤的小鼠組腹膜內注射100 μ g 9D2抗體(實心圓圈)，每周3次。每周兩次用卡鉗測量腫瘤大小。以腫瘤體積對腫瘤細胞注射后的天數作圖。括弧內的數字表明腫瘤衰退的小鼠數目/每組小鼠的總數目。
[0177]圖8A、圖8B、圖8C、圖8D、圖8E、圖8F和圖8G.在有同基因和異基因腫瘤的動物中抗PS抗體3G4的抗腫瘤作用。將小鼠Meth A腫瘤細胞(圖8A)、人MDA-MB-231乳癌細胞(圖8B和圖8E)、人何杰金氏淋巴瘤L540細胞(圖8C和圖8D)以及MDA-MB-231癌細胞(圖8F和圖8G)注射入小鼠。處理前使腫瘤長到所示的大小。人何杰金氏淋巴瘤細胞可被允許長至形成大腫瘤。每組小鼠每周3次腹膜內注射10yg 3G4抗體，與對照相反(3G4在圖8A、圖8B和圖8C中被指出 ，而在圖8D、圖8E和圖8F中則用空心圓圈表示)。每周監測動物腫瘤尺寸兩次。將腫瘤體積對腫瘤接種后的天數(圖8A)或對處理天數(圖8B和圖8C)作圖，共20-30天(圖8A、圖8B和圖8C;括弧內的數字表明腫瘤衰退的小鼠數目/每組小鼠的總數目)或60天(圖8D、圖8E和圖8F)。3G4抗體和嵌合的3G4抗體(ch3G4)用于處理MDA-MB-231癌細胞，與對照相反(圖8G)。
[0178]圖9A和圖9B.3G4抗體對體外CMA復制的抑制。用3G4處理被CMV感染的HHF-R2細胞(最上方的兩個圖)。對照孔未經處理(下方的兩個圖)或用同種型匹配的對照IgG3抗體GV39G處理(中間的兩個圖)。在不同的時間點觀察細胞:第3天(左邊的柱)和第9天(右邊的柱)。被感染細胞在熒光顯微鏡下呈現綠色。抗體施用濃度為100 μ g/ml (圖9A)和 50 μ g/ml (圖 9B)。
[0179]圖10.體外CMV復制的濃度依賴型抑制。用不同濃度的3G4處理被CMV感染的HHF-R2細胞(上方的組圖)。對照孔未經處理(下方的圖)或用同種型匹配的對照1863抗體GV39G處理(中間的組圖)。在第9天觀察細胞。被感染細胞在熒光顯微鏡下呈現綠色。
[0180]圖11A、圖1IB和圖11C.經抗體處理的細胞中CMV病毒負載量和病毒復制周期晚期復制抑制的定量。以0.01pfu/細胞的低感染復數用CMV感染人成纖維細胞單層，并用指定濃度的3G4抗體、對照抗體GV39G或對照抗秋水仙堿抗體C44 (圖1lA ;未處理，未處理對照)處理。以3pfu/細胞的高感染復數用CMV感染人成纖維細胞單層，并用50 μ g/ml或100 μ g/ml的3G4抗體或對照抗體GV39G(圖11B)處理。以高感染復數用CMV感染人成纖維細胞單層，在感染后的指定時間點加入3G4抗體或對照抗體GV39G(圖11C)。在圖11A、圖1lB和圖1lC各圖中，用標準噬斑檢測法對細胞內和上清液中的病毒水平進行定量。
[0181]圖12.3G4UB9和3SB抗體對RSV體外復制的抑制作用。用3G4UB9和3SB處理受RSV感染的A-549細胞，以未處理細胞作為對照。用1B9(綠色)和3SB (紅色)處理導致病毒復制呈現對數減少(與藍色的對照相比較)。3G4的更顯著的抗病毒效果用粉色顯
/Jn ο
[0182]圖13A、圖 13B、圖 13C、圖 13D、圖 13E、圖 13F、圖 13G、圖 13H、圖 131、圖 13J、圖 13K、圖13L、圖13M、圖13N、圖130、圖13P、圖13Q和圖13R。耐久霉素衍生物的結構。描繪了來自實施例XV的實例性耐久霉素衍生物的化學結構。在圖13A至圖130的各化合物中，已將PE結合肽耐久霉素與細胞不透性基團連接以便防止構建物發揮顯著的、非特異的毒性作用。耐久霉素母體環肽的示意性結構如圖13P中所示。線性序列用SEQ ID N0:9表示，而序列中被修飾氨基酸的結構如圖13Q中所描述的。圖13R描繪了示范性的耐久霉素抗病毒構建物，其中的耐久霉素與西多福韋連接。
[0183]圖14A、圖14B、圖14C和圖14D。耐久霉素衍生物的結合特異性。按實施例XV中所述制備耐久霉素衍生物并按實施例XV中所述用ELISA和競爭性ELISA測定它們的特異性。圖14A，耐久霉素衍生物對一組磷脂的磷脂結合概況，顯示了對PE的特異性；圖14B，血清對PE結合無顯著的影響；圖14C和圖14D，來自競爭性ELISA，證實了耐久霉素衍生物對PE的特異性。
[0184]圖15。耐久霉素衍生物對CMV體外復制的抑制作用。用耐久霉素衍生物(DLB)4NA和(DM)nHIgG處理被CMV感染的HHF-R2細胞。對照孔未處理。在不同的時間點觀察細胞:第4天(左圖)和第6天(右圖)。被感染的細胞在熒光顯微鏡下呈現綠色。(DLB)4NA和(DM)nHIgG抑制來自逐個感染細胞的病毒擴散。
[0185]圖16。抗PS抗體對分裂內皮細胞的選擇性抑制作用。如實施例XVIII中所述檢測抗PS抗體3SB、9D2和3G4在體外對內皮細胞的抑制作用。與對靜止(匯合)細胞的作用相反，3SB、9D2和3G4抗體中的每一種都展示了對于分裂中的(亞匯合)內皮細胞的選擇性抑制作用。9D2和3G4抗體均具有比3SB更強的抑制作用。
[0186]圖17A和圖17B。在患腫瘤的小鼠中3G4抗體的抗血管發生和血管靶向作用。用10yg/劑的3G4抗體(處理組，右邊的組圖)或相同劑量的同種型匹配對照抗體(對照組，左邊的組圖)每周 3次處理患MDA-MB-231同位腫瘤的裸鼠。處理結束后,灌注動物并將腫瘤速凍，切片并用小鼠血管結構的泛內皮標記-抗小鼠CD31抗體(大鼠，抗小鼠CD31)染色(圖17A)，或者包埋于石蠟中并用H&E染色(圖17B)。比較來自對照和被處理動物的腫瘤切片，顯示了 3G4的施用導致了抗血管發生(圖17A)和血管靶向(圖17B)效果。
[0187]圖18A和圖18B。3G4抗體互補決定區(⑶Rs)的DNA和氨基酸序列。展現了重鏈(圖 18A ；SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2)和輕鏈(圖 18B ；SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4)的DNA和氨基酸序列，且顯示了 DNA序列中的限制性位點。前導序列與成熟蛋白質區別開來，它的起始在圖18A和圖18B中分別以第一個箭頭指示。給出了移植包含人恒定區的各可變序列的典型方法，其中相應人恒定區序列(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)的第一部分在圖18A和圖18B中分別用第二個箭頭指示。
[0188]圖19A和圖19B。IgG抗PS抗體3G4和IgM抗PS抗體3SB與PS結合的比較。用高達3.375nM的抗體濃度通過ELISA測定IgM抗體3SB ( ?)以及兩個IgG抗體-3G4 ( ▲)和3Β10(.)與PS的結合(圖19Α)。還分別展示了 3SB(^)、3G4(AJ和3Β10(.)抗體在濃度高至0.06ηΜ時與PS的結合(圖19Β)。
[0189]圖20。用競爭性磷脂脂質體抑制3G4抗體與固定化PS的結合。將3G4抗體(0.1 μ g/ml)與從純磷脂(PS-L、PE-L、P1-L、PC-L、CL-UPA-L 和 PG-L)制備而來的各種脂質體或單獨的緩沖液(對照)一起預保溫30分鐘。然后將混合物加入被PS包被的ELISA平板中，漂洗并用二抗和OPD檢測被結合的抗體。圖中顯示了在所列舉脂質體存在條件下的結合，并與無任何脂質體存在條件下3G4抗體的結合進行了比較。
[0190]圖21。嵌合3G4與磷脂的結合。按實施例XIX中所述制備嵌合3G4抗體(ch3G4)。磷脂(PS、P1、PE、PC、SM、CL、PG和PA)吸附于微量滴定板的塑料上。封閉后，以所示濃度添加嵌合3G4抗體。漂洗平板并通過二抗結合和呈色檢測被結合的嵌合3G4抗體。
[0191]圖22。嵌合3G4在體內對腫瘤血管內皮的定位。將生物素化的ch3G4(上方的組圖)和對照IgG(下方的組圖)施用于患MD-MBA-435S腫瘤的小鼠。腫瘤切片用Cy3綴合的鏈霉親和素染色來檢測生物素化的抗體(左邊的組圖)。用MECA 32抗體以及隨后加入的FITC標記的抗大鼠IgG 二抗染色來檢測血管內皮(中間的組圖)。將紅色和綠色的圖形合并(右邊的組圖)，其中腫瘤血管內皮上結合的生物素化蛋白質呈現黃色。通過疊合圖像上的黃色顯示了被定位的3G4抗體和血管內皮MECA32標記物的重合染色結果(上方右圖)。
[0192]圖23。3G4增強了 PS陽性細胞的巨噬細胞吞噬作用。用綠色熒光染料CFDA標記HL-60腫瘤細胞，并用200 μ M H2O2誘導PS暴露。收獲處理過的細胞并用5 μ g/ml 3G4或同種型匹配對照抗體(BBG3)調理I小時。然后將靶細胞加入巨噬細胞中，后者是從小鼠骨髓中分離的并在容器內的載玻片上于含5ng/ml GM-CSF的培養基中培養35天。2小時后，固定載玻片并在熒光顯微鏡下對胞噬作用進行直觀計數。結果表示為發生胞噬作用的巨噬細胞的百分數(已吞噬了至少一個腫瘤細胞的巨噬細胞)。
[0193]圖24A和圖24B。多西他賽誘導內皮細胞上PS的暴露。用1nM多西他賽處理人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人微血管內皮細胞(HMVEC) 24小時。收獲細胞，用PBS漂洗，并與lOμg/ml 3G4—起在冰上放置30分鐘。然后將細胞洗兩次，加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG，并將細胞再在冰上放置30分鐘。然后漂洗細胞，并用FACSCalibur血細胞計數器(Becton-Dickinson, San Jose, CA)通過CellQuest搜索軟件進行FACS分析。與未處理的細胞相比，處理過的HUVEC (圖24A)和HMVEC (圖24B)均顯示了與3G4結合的顯著增加。
[0194]圖25A、圖25B和圖25C。用多西他賽誘導腫瘤細胞上PS的暴露。用1nM多西他賽處理小鼠路易斯肺癌(lewis lung carcinoma) 3LL、小鼠結腸癌Colo26和人乳癌MDA-MB-435細胞24小時。收獲細胞，用PBS漂洗，并與10 μ g/ml 3G4 一起在冰上放置30分鐘。然后將細胞洗兩次，加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG并將細胞再在冰上放置30分鐘。然后漂洗細胞，并用FACSCalibur血細胞計數器(Becton-Dickinson, San Jose, CA)通過CellQuest搜索軟件進行FACS分析。與未處理的細胞相比，處理過的3LL(圖25A)、Colo26(圖25B)和MDA-MB-435 (圖25C)均顯示了與3G4結合的顯著增加。
[0195]圖26.用多西他賽誘導人乳癌MDA-MB-231細胞上PS的暴露。用1nM多西他賽處理人乳癌MDA-MB-231細胞24小時。收獲細胞，用PBS漂洗并與嵌合3G4(ch3G4)或對照-人IgG —起在冰上放置30分鐘。然后漂洗細胞兩次，如上所述，加入FITC標記的抗IgG并通過FACS分析細胞。與對照-人IgG相比，ch3G4的結合有顯著的增加。
[0196]圖27.用抗PS抗體處理增加了受mCMV感染的小鼠的成活率。按實施例XXI中所述，用mCMV感染Balb/C小鼠并用3G4或ch3G4處理小鼠。感染90天后監測小鼠的成活率。
[0197]圖28.用耐久霉素-生物素衍生物DLB處理增加了受CMV感染的小鼠的成活率。按實施例XXII中所述，用mCMV感染Balb/C小鼠并用DLB處理小鼠。感染90天后監測小鼠的成活率。
[0198] 圖29A和圖29B。嵌合3G4與被牛痘病毒感染的細胞的結合。用牛痘病毒感染U937細胞并在感染后的第2天用嵌合3G4抗體(ch3G4)或對照人IgG (HIgG)染色。圖29A，未感染的U-937細胞。圖29B，被牛痘病毒感染的U937細胞。圖29A和圖29B中的峰是:左峰(紅色)，只加二抗的對照；中間峰(藍色)，對照HIgG ;右峰(綠色)，ch3G4。
[0199]圖30A、圖30B、圖30C和圖30D。用3G4抗體抑制Pichinde病毒的體外復制。用Pichinde病毒以0.01pfu/個細胞的感染復數感染Vero細胞。用100 μ g/ml 3G4(圖30A)或同種型匹配對照抗體GV39G(圖30B)處理被感染的細胞。在感染后第2天，用胰蛋白酶收獲細胞并使其粘附于載玻片上。用丙酮固定細胞，并用抗PIC兔多克隆血清以及隨后加入的山羊抗兔生物素綴合二抗染色。被感染的細胞染色呈紅褐色。單獨施加二抗的樣品未被染色(圖30C)。經3G4處理細胞中被感染細胞占對照處理細胞中被感染細胞的百分數也顯示于圖中(圖30D)。
[0200]圖31。耐久霉素-人IgG(HIgG)綴合物抑制體內MethA腫瘤的生長。按實施例XXV中所述，用耐久霉素-HIgG綴合物(D-SIAB) nHIgG(其中用SIAB接頭將耐久霉素與HIgG綴合)或者用對照HIgG處理具有MethA腫瘤細胞的BALB/c小鼠。
[0201]圖32.耐久霉素綴合物無細胞毒性。用MTT檢測法檢測天然耐久霉素化合物和生物素化耐久霉素構建物DLB對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的細胞毒性作用。
[0202]圖33。耐久霉素-抗體綴合物增強了巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬作用。通過將耐久霉素與一種小鼠IgG2a抗體C44連接產生耐久霉素-C44 (DuC44)，構建出耐久霉素抗體綴合物。在DuC44、對照小鼠抗體BBG3和3G4抗體存在的條件下將凋亡的HL-60細胞與小鼠骨髓來源的巨噬細胞一起保溫。吞噬作用以攝取呈陽性的吞噬細胞的百分數方式評估。數據是平均值土 S.E.。
[0203]例證性的實施方案的描述
[0204]實體瘤和癌在人類所有癌癥中所占比例超過90%。雖然在淋巴瘤和白血病的治療中已經研究了單克隆抗體和免疫毒素的應用(Vitetta等，1991)，但是這些藥劑在抗癌和其它實體瘤的臨床試驗中無效的結果令人失望(Abrams和Oldham, 1985)。基于抗體的治療無效的首要原因是大分子不容易轉運進入實體瘤。甚至一旦進入了腫瘤塊內，由于腫瘤細胞間存在緊密連接、纖維基質、間質壓力梯度和結合位點屏障，這些分子也不能均勻分布(Denekamp, 1990 ；Dvorak 等人，1991)。
[0205]在開發用于治療實體瘤的新策略的過程中，涉及靶向腫瘤血管結構而非腫瘤細胞的方法具有明顯優勢。有效破壞或阻斷腫瘤血管，則阻止了經過腫瘤的血流并導致雪崩式的腫瘤細胞死亡。抗體-毒素和抗體-凝血劑構建物，例如選擇性破壞和/或堵塞腫瘤血管的VTA，早已有效用于特異性靶向并破壞腫瘤血管結構，導致腫瘤壞死(Burrows等人，1992 ;Burrows 和 Thorpe，1993 ；W0 93/17715 ；W0 96/01653 ;Huang 等，1997 ;分別收編于此作為參考)。
[0206]VTAs在實體瘤的已有血管上發揮其主要的作用，而不同于阻止新血管形成的抗血管發生藥劑。VTAs相比于其它癌癥治療劑有許多優越之處。首先，僅僅一條血管為成百上千的腫瘤細胞提供營養并促進代謝廢物的去除，只要在某一點被破壞就會阻斷上下游的血流。因此VTAs對于已建立的腫瘤尤其有效。其次，無需殺死內皮細胞，盡管這是一個有效的機制。血液凝結的形成或局部引發的變化就足夠了。第三，內皮細胞與血流相鄰，保證了足夠的藥物遞送。第四，靶目標是不太可能具有造成藥物抗性的遺傳突變的正常二倍體細胞。第五，生物學活性的代用標記，即血流，是可檢測的。
[0207]第六，對血管功能的短暫影響可能足以產生顯著的抗腫瘤效用。研究表明，在局部缺血2小時內體內99%以上的腫瘤細胞能被殺死。最后，與血管發生抑制劑不一樣，VTAs只需間歇施用以便協同加強常規療法的作用，而無需幾個月或幾年的長期施用。
[0208]在以下專利中有對細胞毒性VTAs的描述:美國專利號5，660，827 ；5, 776,427 ；5，855，866 ;5，863，538 ;5，965，132 ;6，004，554 ;6，051，230 ;6，261，535 和 6，451，312，分別收編于此作為參考。其中的抗體、生長因子或其它的結合配基用于特異遞送凝血劑至腫瘤血管結構，這樣的藥劑被稱為“凝血配體”。凝血配體VTAs參閱以下專利:美國專利號6，093，399 ;6，004，555 ;5，877，289 和 6，036，955，分別收編于此作為參考。
[0209]目前優選用于凝血配體的凝血劑是截短的組織因子(tTF) (Huang等人，1997 ；WO 96/01653 ;美國專利號5，877，289)。TF是血液凝結的主要起始因子(Ruf等，1991 ;Edgington等，1991)。在損傷位點，血液中的因子VII/VIIa開始接觸并結合血管周圍組織內細胞上的TF。存在磷脂表面時，TF=VIIa復合物激活因子IX和X。這繼而導致凝血酶、纖維蛋白、和最終血塊的形成(Ruf和Edgington, 1994)。
[0210]缺失胞質和跨膜結構域的重組、截短形式的組織因子(tTF)是誘發凝血能力比天然TF低約5個數量級的可溶性蛋白質(Stone等，1995 ;Huang等，1997)。這是因為TF需要聯合磷脂與VIIa形成復合物，從而有效激活IXa或Xa。不過，當tTF通過靶向抗體或藥劑的方式遞送至腫瘤血管內皮時，它重新接近脂質表面并恢復血栓形成活性(Huang等，1997 ;美國專利號 6，093，399，6，004，555，5，877，289 和 6，036，955)。由此形成了選擇性地在腫瘤血管引起血栓的凝血配體。
[0211]截短的TF具有幾個優勢，使其被推薦用于血管靶向凝血配體中:人tTF易于獲取，且人蛋白質對人體只具有可忽略的或微弱的免疫原性；人tTF在包括小鼠在內的實驗動物中是完有功能的；且靶向tTF具有高潛能，因為它可引發凝血蛋白質級聯反應的激活，產生大大增強了的效應(美國專利號 6，093，399，6，004，555，5，877，289 和 6，036，955)。
[0212]已經描述了在腫瘤內皮上可供利用、但在正常內皮上基本上不存在的多種合適的革巴分子。例如，可以利用被表達的革巴，諸如endoglin、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA, TIE、與LAM-1反應的配體、VEGF/VPF受體、FGF受體、α ν β 3整聯蛋白、ple1tropin、或內皮唾液酸蛋白(美國專利號5，855, 866 ；5, 877, 289 ；Burrows等人，1992 ；Burrows 和 Thorpe, 1993 ；Huang 等人，1997 ；Liu 等，1997 ；Ohizumi 等，1997 ;分別收編于此作為參考)。
[0213]吸附的靶是另一組合適的靶，諸如VEGF、FGF、TGF^、HGF、PF4、PDGF, --ΜΡ、結合TIE的配體、或腫瘤相關性纖連蛋白異構體(美國專利號5，877，289，5，965，132，6，051，230和6，004，555)。纖連蛋白異構體是可結合受體整聯蛋白家族的配體。腫瘤相關性纖連蛋白異構體是腫瘤血管結構和腫瘤基質二者的可祀向成分。單克隆抗體BC-1 (Carnemolla等，
1989)特異結合腫瘤相關性纖連蛋白異構體。
[0214]如美國專利號5，776，427，5，863，538和6，036，955所述，通過天然的腫瘤環境或人為干預后可誘導的其它靶目標也是可靶向的實體。當與正常組織的預先抑制和腫瘤血管誘導結合使用時，也可以采用MHC II類抗原作為靶目標(美國專利號5，776，427，5，863，538，6，004，554 和 6，036，955)。
[0215]目前優選用于臨床的一個靶目標是血管內皮粘附分子-1(VCAM-1)(美國專利號5，855，866,5, 877，289,6, 051，230,6, 004，555 和 6，093，399)。VCAM-1 是由炎性細胞因子IL-1 a、IL-4(Thornhill等，1990)和TNFa (Munro，1993)誘導的細胞粘附分子，它在體內的作用是向急性發炎部位補充白細胞(BeviIacqua, 1993)。
[0216]VCAM-1存在于許多人類惡性腫瘤的血管內皮細胞中，包括成神經細胞瘤(Patey等，1996)、腎癌(Droz 等，1994)、非小細胞肺癌(Staal -van den Brekel 等，1996)、淋巴肉芽腫病(何杰金氏病)(Patey等，1996)和血管肉瘤(Kuzu等，1993)，還存在于良性腫瘤血管內皮細胞上，諸如痣(Patey等，1996)和血管瘤(Kuzu等，1993)。VCAM-1在人體中的組成性表達僅限于甲狀腺、胸腺和腎的一些血管(Kuzu等，1993 ；Brui jn和Dinklo, 1993),而在小鼠內則限于心臟和肺的血管(Fries等，1993)。
[0217]本文給出的某些數據甚至進一步補充了美國專利5，855，866，5，877，289，6，051，230，6，004，555和6，093，399中所提供的數據，并證明了抗-VCAM-1.tTF凝血配體的施用選擇性地誘導了血栓癥和腫瘤梗死。所展示的結果是以帶L540人何杰金淋巴瘤的小鼠為材料得到的。當作為異種移植物生長于SCID小鼠中時，就炎性細胞因子的表達以及其血管結構上VCAM-1和其它內皮細胞活化分子的存在而言,該腫瘤顯不與人類疾病非常類似(Diehl 等，1985)。
[0218]利用共價連接的抗-VCAM-1.tTF凝血配體(其中tTF直接與抗-VCAM-1抗體直接連接)，本文顯示了凝血配體選擇性地定位于腫瘤血管處，誘導那些血管的血栓形成，在攜帶L540何杰金實體瘤的小鼠中引起了整個腫瘤發生壞死并延緩了腫瘤的生長。腫瘤通常需要直徑至少約0.3cm才能對凝血配體產生反應，因為在較小的腫瘤上沒有VCAM-1。估計可能是因為在小腫瘤中，腫瘤細胞或浸潤腫瘤的宿主細胞分泌的細胞因子水平對于VCAM-1 的誘導來說太低了。這與美國專利 5，855，866，5，877，289，6，051，230，6，004，555 和6，093，399中的研究結果是一致的，其中的發明顯示出在較大的實體瘤中最有效。
[0219]盡管最初更多的是在腫瘤周邊觀察到VCAM-1染色，凝血配體明顯地結合并堵塞輸送血液的血管一因為它能減少所有腫瘤區的血流。此外，有一
【發明者】還考慮到由于最初施加凝血配體所引起的凝血酶的產生有可能導致中樞血管上進一步的VCAM-1誘導作用(Sluiter等，1993)，從而產生擴大的信號并導致對腫瘤內區域的明顯破壞。這種類型的凝血配體誘導的其它可靶向標記物的表達以及由此產生的信號放大在美國專利6，036，955中有所描述。
[0220]正如本文所顯示的，盡管通過施加抗VCAM-1凝血配體觀察到其定位于小鼠心臟和肺中表達VCAM-1的血管上，但此構建物并未在這樣的非腫瘤部位誘發血栓形成。而且，抗VCAM-1凝血配體對小鼠的毒性并不比具有無關特異性的對照凝血配體更大，再次表明了 VCAM-1在心臟和肺血管上的組成性表達不會產生毒性。由于VCAM-1是人類腫瘤血管內皮中天然存在的標記物，此結果對于當前凝血配體療法的臨床進展尤為重要。另一方面，此現象還為
【發明者】提供了獨一無二的視野，導致了完全不同的破壞腫瘤血管結構的方法。
[0221]A.利用裸露的抗氨基磷脂抗體治療腫瘤
[0222]
【發明者】試圖了解抗VCAM-1凝血配體能結合組成性表達于心臟和肺血管上的VCAM-1卻不會在那些血管中引起血栓形成這一現象背后的機制。對于此只憑經驗觀察到的現象有許多科學的可能性解釋，通常與腫瘤環境中的前血檢形成特性以及心臟和肺中任何血纖維蛋白溶解誘因相關。
[0223]一般而言，在凝血系統(纖維蛋白沉積)和纖溶系統(纖維蛋白被酶降解)之間存在著生物學平衡。不過，在惡性病，尤其是腫瘤中，此平衡被破壞，導致了凝血的異常激活(血凝過快或“前血栓形成狀態”)。盡管進行了大量的研究，直到最近才了解了腫瘤環境中前血栓形成狀態的明確分子機制。
[0224]在詳細分析許多可能后，
【發明者】推斷抗VCAM-1凝血配體之所以不會在正常組織血管內引起血栓形成是由于這些血管內腔表面缺乏氨基磷脂-磷脂酰絲氨酸(PS)。因此，為了證實這一理論，不僅需要證明在這些正常血管上無磷脂酰絲氨酸，還需要證實它們存在于腫瘤相關血管的內腔側面上。
[0225]因此，
【發明者】用免疫組織化學染色來確定靜脈內注射入患腫瘤小鼠體內的單克隆抗磷脂酰絲氨酸(抗PS)抗體的分布狀態。這些研究顯示，在心臟和肺中表達VCAM-1的血管缺乏PS，而在腫瘤中表達VCAM-1的血管也表達PS。
【發明者】還發現結合PS的膜聯蛋白V在體外和體內均阻斷抗VCAM-1.tTF凝血配體的作用，這進一步證實了在凝血配體的作用中需要表面PS的表達。
[0226]因此，至少在某種程度上，抗VCAM-1凝血配體在正常心臟和肺血管上無血栓形成作用的原因可以解釋為:由于缺乏氨基磷脂-磷脂酰絲氨酸，意味著正常血管上沒有凝血復合物組裝所需要的前凝血表面。在缺乏表面PS的情況下，抗VCAM-1 -tTF與表達VCAM-1的心臟和肺血管結合，但不會誘發血栓形成。相反，在腫瘤中表達VCAM-1的血管顯示出同時表達了表面PS。因此，凝血配體與腫瘤血管結合，并局部激活了凝血因子，從而形成了堵塞的血栓。
[0227]除了描述抗VC AM-1凝血配體的腫瘤特異性血栓形成作用外，在腫瘤血管內腔表面上氨基磷脂-磷脂酰絲氨酸的特異表達還使
【發明者】能夠解釋早期研究中觀察到卻不能理解的前血栓形成表型。PS表達在腫瘤血管結構的前血栓形成狀態中起了重要的作用。
[0228]在他們發現代表性的氨基磷脂-磷脂酰絲氨酸特異地表達于腫瘤血管內腔表面而不表達于正常血管中后，
【發明者】推斷其它的氨基磷脂也具有作為治療干預靶目標的可能。
【發明者】因此以靶向于氨基磷脂-磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺(PE)為基礎開發了腫瘤血管系統靶向和治療方法。
[0229]本發明的
【發明者】研究中尤其令人意外的發現是施用未綴合的抗氨基磷脂抗體對于腫瘤治療是有效的。由此，通過使用可與氨基磷脂結合的未綴合或“裸露的”抗體，為腫瘤治療提供了新的重要的途徑。這些腫瘤血管結構靶向和治療方法參閱收編于此作為參考的美國專利6，406，693。盡管在本領域公認的動物模型中的抗腫瘤作用在美國專利6，406，693中得到了證明并在本文中進一步擴展，但是由美國專利6，406，693之前的研究并不能預測到氨基磷脂用作安全有效的腫瘤血管結構可靶向標記物的能力。
[0230]一旦氨基磷脂作為腫瘤血管結構特異標記物的發現得到證實，
【發明者】開始開發一系列靶向氨基磷脂的免疫毒素和凝血配體用于腫瘤治療中。正如美國專利6，406，693中所解釋的，這導致了裸露抗氨基磷脂抗體用于腫瘤治療的意外發現。在有關將毒素或凝血劑遞送至腫瘤血管結構時利用氨基磷脂進行靶向的可能性研究中，
【發明者】意外的發現在未附加任何效應子的情況下裸露的抗PS抗體對體內腫瘤血管具有破壞作用。抗氨基磷脂抗體既特異定位于腫瘤血管系統又發揮伴隨的破壞作用從而導致腫瘤壞死的能力是根本未曾預料到的。
[0231]在其它實施方案中，本發明提供了不尋常且改進了的“第二代”抗PS抗體在腫瘤療法中作為裸露抗體。本文公布了一組第二代抗PS抗體，其中單克隆抗體9D2和3G4 (ATCC4545)是目前優選的，本文還與此一起公布了產生和選擇具有所說優越特性的更多抗體的特殊免疫接種和篩選技術。本文還顯示了抗PS抗體對腫瘤血管的損害至少在某種程度上是通過宿主效應物介導的。正如本文所講述的，由本發明
【發明者】的這些和其它了解可以優化裸露抗體療法，包括單獨使用和與本文所教導的其它抗癌劑結合使用的情況。
[0232]B.利用抗陰離子磷脂抗體治療腫瘤
[0233]美國專利6，406，693說明了氨基磷脂-磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺通常與不同細胞中質膜雙層的內表面分離(Gaffet等，1995 Julien等，1995),這種脂質分離產生了不對稱的跨雙層。盡管膜不對稱性的存在已被討論相當一段時間了，但對其存在的原因和產生及調控的機制仍了解甚少(Williamson和Schlegel, 1994),尤其是在除了血小板之外的細胞中。
[0234]
【發明者】在較早的時候證實了 PS移位至腫瘤血管內皮細胞表面，并且至少在顯著的程度上，這種現象的發生與細胞凋亡或其它細胞死亡機制無關(美國專利號6，406，693)。因此，在腫瘤環境中PS的表面表達不是細胞死亡的結果，也不是由它引起了即時的細胞毀壞。盡管在各種實體瘤中完整血管內皮細胞上始終可以檢測到PS的暴露，腫瘤血管內皮卻不是真正凋亡的，而是形態學上完好的(盡管不同于正常組織中的情形)，而且是代謝活躍的。這對于基于PS靶向的治療方法來說是重要的，意味著PS向腫瘤血管內皮細胞外膜的移位對于PS用作成功治療(利用裸露的抗體或治療性綴合物)的可靶向實體是足夠穩定的。
[0235]盡管在美國專利6，406，693 (和6，312，694，見下文)中有重要的發現，但基于磷脂的腫瘤血管內皮細胞靶向這一推測只局限于氨基磷脂的靶向，如PS和PE。通過開發對不同磷脂和氨基磷脂具有強特異性的生物學方法，本發明的
【發明者】目前已確定了在腫瘤血管內皮細胞上不可思議地上調了的新的磷脂范圍。這些是陰離子磷脂，本文中顯示出它們也是腫瘤血管系統的特異且穩定的標記，使利用可與陰離子磷脂結合的裸露抗體和免疫綴合物二者進行治療干預成為可能。
[0236]陰離子磷脂正常條件下在靜息哺乳動物細胞表面基本上是不存在的。磷脂酰絲氨酸這種最豐富的質膜陰離子磷脂，正常條件下在大部分細胞類型中被緊密隔離于質膜內表面(Williamson 和 Schlegel, 1994 ；ZwaaI 和 Schroit, 1997)。憐脂酸肌醇(PI)是另一種主要的陰離子磷脂，也主要位于質膜的內表面(Calderon和DeVires，1997)。次要的陰離子磷脂-磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)只在一些細胞類型中檢測到，但它們也表現出主要位于質膜的內表面(Hinkovska-Galcheva等，1989)。另一種陰離子磷脂_心磷脂存在于線粒體膜上而非質膜上(Daum, 1985)。
[0237]中性磷脂也不對稱地分布于質膜內。中性磷脂-磷脂酰乙醇胺(PE)主要位于內表面。含膽堿的中性磷脂-磷脂酰膽堿(PC)和鞘磷脂(SM)主要位于外表面。
[0238] PS和PE的不對稱性通過ATP-依賴型轉運蛋白-氨基磷脂移位酶(Mg2+ATPase)來維持，該酶催化氨基磷脂從質膜外表面向內表面轉運(Seigneuret和Devaux, 1984)。PS和PE不對稱性的喪失或崩潰是由于質膜內這些磷脂向外運動所造成的，或者是由于對移位酶的抑制(Bitbol等，1987 ;Comfurius等，1990)、PS轉運蛋白的激活和/或變頻酶(scramblase)的激活所引起的，變頻酶是雙向轉運所有磷脂的Ca2+依賴型酶(Zhao等，1998)。
[0239]在不同的病理和生理狀態下都觀察到了 PS不對稱性的喪失，包括細胞損傷、程序性細胞死亡和凋亡(Blankenberg等，1998 ；Bombeli等，1997)、細胞衰老(Herrmann和Devaux, 1990)、血小板的活化(Rote 等，1993 ；ZwaaI 等，1989)、受傷(Boyle 等，1996)和惡性轉化(Sugimura等，1994)。PS的暴露還在成肌細胞(Sess1ns和Horwitz, 1981)和營養細胞(Adler等，1995)的胞間融合、細胞遷移(Vogt等，1996)和細胞脫粒(Demo等，1999)中起著一定的作用。內皮細胞對由凝血酶(Qu等，1996)、|丐離子載體或佛波酯(Julien等，1997)、高脂血癥(Lupu等，1993)和非溶胞濃度的補體蛋白質C5b_9 (Christiansen等，1997)所誘導的Ca2+流量增加產生反應而將PS外在化。在無外源激活劑或細胞損傷的情況下在惡性細胞內也觀察到自發的PS暴露(Utsugi等，1991)。
[0240]膜PS暴露后產生幾個主要的后果。有吞噬作用的巨噬細胞識別、附著和消滅PS陽性的衰老和凋亡細胞(McEvoy等，1986 ；Tait和Smith, 1999)。PS還介導T淋巴細胞與凝血酶活化的內皮細胞附著(Qu等，1996)。補體系統被PS激活并促成PS陽性細胞的裂解(Test和Mitsuyoshi，1997)。最后，PS的暴露通過為凝血復合物的裝配和活化提供帶負電荷的脂類表面而促使前凝血劑移動至內皮上(Williamson和Schlegel, 1994 ；Bombeli等，
1997)。長期以來已對腫瘤內皮的前血栓形成特征有所認識(Donati和Falanga，2001)。
[0241]盡管科學文獻集中于PS上，并且
【發明者】的早期工作局限于諸如PS和PE等氨基磷月旨(美國專利號6，406，693和6，312，694)，本發明的
【發明者】猜測在腫瘤血管結構上可能有更寬范圍的磷脂變得暴露。由于腫瘤微環境的應激狀態增加，
【發明者】推斷在腫瘤血管結構中許多陰離子磷脂可能上調，從而為治療性干預提供了潛在的新機會。
[0242]
【發明者】認識到腫瘤內皮的損傷和活化是由以下物質引起的:1)腫瘤來源的細胞因子，諸如白介素-1和腫瘤壞死因子，它們激活內皮并誘導細胞粘附分子的表達(Shaughnessy等，1989 ;0rr等,2000) ；2)由粘附于內皮上的白細胞產生的活性氧類型(ROS) (Orr 等，2000);和 3)作為代謝副產物(Shaughnessy 等，1989 ；Soares 等，1994)或由于暴露于復氧后的低氧血中(Zulueta等，1995)由腫瘤細胞自身產生的R0S。這些觀察結果暗示可能由腫瘤內皮中的這些應激產生Ca2+流量，接著通過變頻酶的活化或氨基磷脂移位酶的抑制而引起PS和PE的暴露。
[0243]另一方面，
【發明者】進一步推斷不只是氨基磷脂PS和PE，陰離子磷脂在腫瘤血管結構中也會上調。為了檢測細胞表面陰離子磷脂，
【發明者】創造了新的單克隆抗體9D2，它與陰離子磷脂而非中性磷脂反應。9D2因此與普通的氨基磷脂結合劑區別開來，因為它與陰離子氨基磷脂PS結合，而不與中性氨基磷脂PE結合。9D2抗體還比天然配體膜聯蛋白V更特異于陰離子磷脂，其中膜聯蛋白V除了與陰離子磷脂結合外還強烈結合PE(Blankenberg等，
1998)。
[0244]正如本申請所詳述的，
【發明者】發現9D2和膜聯蛋白V在靜脈內注射入帶各種類型實體瘤的小鼠中后特異地定位于腫瘤內皮。此發現證實了
【發明者】的假設，即陰離子磷脂通常在腫瘤血管內皮表面變得暴露，且可用作腫瘤治療(和成像)的靶分子。本發明因此提供了一系列新方法和基于抗體的組合物，可用于靶向陰離子磷脂和治療腫瘤，在裸露抗體和細胞毒性藥物、細胞因子、凝血劑等的投遞中均可如此。除了如美國專利6，406，693和6，312，694中所述靶向于PS之外，本發明目前優選的靶向陰離子磷脂是PI ( 一種主要的陰離子磷脂)、PA和PG，在某些實施方案中還考慮使用靶向CL。
[0245]本發明的主要發現之一是陰離子磷脂暴露于腫瘤內皮的表面(實施例VI)。此現象通過兩種選擇性結合陰離子磷脂的獨立藥劑得到證明:單克隆抗體9D2，這是
【發明者】為了證明此點而特別開發的，還有膜聯蛋白V。9D2抗體和競爭性抗體是本發明更優選的組分。
[0246]9D2抗體和膜聯蛋白以高親合力和特異性結合吸附于塑料上、作為脂質體或者體外活化或凋亡內皮細胞膜表面上所展示的陰離子磷脂。9D2與PS、PA和CL強結合，但與PI和PG的結合則弱得多。正如過去所發現的，膜聯蛋白V除了結合PS、CL、PA、PI和PG之外，還結合 PE (Andree 等，1990 ；Schlaepfer 等，1987 ；Boustead 等，1993 ；Blackwood 和 Ernst,
1990)。9D2抗體對陰離子磷脂的識別在血清存在與否的條件下都是相同的，表明結合不需要血清輔因子。9D2與陰離子磷脂的結合不需要Ca2+離子，而膜聯蛋白V的結合則需要Ca2+。
[0247]對PS包被平板的交叉封閉研究顯示9D2和膜聯蛋白V不會相互阻斷與PS的結合。這表明所說的兩種藥劑識別PS分子上的不同表位，或更有可能識別不同包裝形式的PS。膜聯蛋白V被認為結合平坦的PS表面,而抗PS抗體則被認為結合六角形包裝的PS (Rauch和Janoff, 1990) 0兩種形式都可能存在于PS包被的平板上。這些實際的交叉封閉研究(實施例VI)還用于表明，一旦提供一參照抗體(如9D2)，就能方便的鑒定出有效競爭結合陰離子磷脂的抗體，即與參照抗體基本上結合相同表位的抗體。
[0248]本申請還顯示，9D2抗體和膜聯蛋白V特異性定位于腫瘤血管和體內檢測的所有腫瘤的壞死區內和周圍的腫瘤細胞(實施例VI)。腫瘤中15-40%的血管具有陰離子磷脂陽性內皮。相反，正常組織中沒有血管具有可檢測到的外在化陰離子磷脂。
[0249]9D2對腫瘤血管的染色特異性通過以下幾點得到證明:1)用對照大鼠IgM則無腫瘤血管的染色；2)用制備自陰離子磷脂的脂質體可以封閉9D2或膜聯蛋白V與經H2O2-處理的體外內皮細胞的結合，而制備自中性磷脂的脂質體則不能；3)用去污劑或有機溶劑從腫瘤部分提取走磷脂就消除了染色；和4)9D2或膜聯蛋白都不定位于正常器官的靜止內皮上。
[0250]腫瘤血管結構中由9D2或膜聯蛋白定位的主要陰離子磷脂有可能是PS，因為它是最豐富的陰離子磷脂，并且它在細胞表面的暴露受環境變化或損傷的調控。不過，其它的陰離子磷脂(如P1、PA、PG)也有可能暴露，盡管它們沒有這么豐富。
[0251]盡管用9D2未檢測到，但主要的中性磷脂PE仍有可能與PS —起造成在腫瘤血管上可以觀察到的膜聯蛋白定位。還已知PE暴露于腫瘤內皮上，且PE在質膜中的位置受到與PS相似的方式調節(美國專利6，406，693) JE部分地被氨基磷脂移位酶隔離在質膜的內表面，盡管速度較PS慢(Devaux，1992)，而且它還被變頻酶轉運到外表面(Zhou等，1997)。象PS 一樣，PE在細胞凋亡和細胞活化期間也會暴露(Emoto等，1997 ；Umeda和Emoto，1999)。
[0252]為了檢驗腫瘤內皮細胞上陰離子磷脂暴露的機制，進行了一系列的研究，其中用已知存在于腫瘤微環境中的各種因子和條件來處理體外內皮細胞(實施例VII)。低氧血后的復氧、酸性和凝血酶使PS在活內皮細胞上的暴露比所有細胞凋亡情況下觀察到的提高了 10-22%的水平。炎性細胞因子(TNFa和IL-1)也會微弱但明確的誘發PS暴露。
[0253]這些發現與腫瘤中低氧血/復氧結合炎性因子、凝血酶和酸性會誘導陰離子磷脂暴露于血管內皮的可能性是相一致的。盡管對于實施本發明來說并不需要了解確切的機制，但作為代謝的副產物或對低氧血的響應，腫瘤細胞可能產生ROS (Zulueta等，1995)。腫瘤細胞釋放的細胞因子可能誘導了內皮上介導活化巨噬細胞、多形核細胞和血小板與腫瘤內皮的粘附的白細胞粘附分子和進一步的ROS分泌。然后ROS可能通過含巰基轉運分子的氧化或脂類的過氧化誘導PS移位(Herrmann和Devaux, 1990),這可能是通過引起Ca2+的流入或細胞內忙備Ca2+的釋放而實現的(Wang和Joseph, 2000)。
[0254]PS和其它陰離子磷脂的暴露在某種程度上解釋了長久以來認識到的腫瘤內皮的前凝血狀態(Donati和Falanga, 2001)。陰離子磷脂提供了凝血因子聚集和裝配的表面(Bevers等，1985 ；Dachary-Prigent等，1996)。它還為幫助白細胞浸潤入腫瘤的循環巨曬細胞(McEvoy等，1986)、T淋巴細胞(Qu等，1996)和多形核細胞提供了附著位點。
[0255]可結合陰離子磷脂的抗體和其它配體因此可被用于腫瘤血管的靶向、成像和/或治療。由于以下幾個原因，陰離子磷脂作為腫瘤靶十分引人注目:它們是豐富的(每個細胞上存在3xl06個PS分子)；它們位于腫瘤血管的內腔表面，可以直接到達從而便于血液中血管靶向劑的結合；它們存在于各種實體瘤的絕大部分腫瘤內皮細胞上；且它們在正常組織的內皮細胞上基本上沒有。
[0256]應用血管靶向劑的藥物或凝血劑也顯示出在攜帶大實體瘤的小鼠中非常有效，且有時還有療效(Huang 等，1997 ;Nilsson 等，2001 ;美國專利 5，660，827，5，776，427，5，855，866，5，863，538，5，965，132，6，004，554，6，051，230，6，261，535，6，093，399，6，004，555，5，877，289和6，036，955)。本發明因此提供了針對陰離子磷脂的裸露抗體和血管靶向劑用于在人類癌癥的診斷和治療中靶向腫瘤血管結構。
[0257]盡管實施本發明不需要對針對陰離子磷脂和氨基磷脂的裸露抗體如何在腫瘤治療中發揮作用有準確的分子水平的了解，
【發明者】還是考慮了可能造成所觀察到的內皮細胞被殺死現象的幾種機制。最可能的機制(尤其是對于本文所述的3G4抗體來說)是Fe結構域介導的免疫效應子功能，諸如抗體依賴型細胞毒性(ADCC)、補體依賴型細胞毒性(CDC)和抗體介導的胞噬作用。細胞介導的細胞毒性、補體介導的細胞裂解和/或凋亡、抗體誘導的細胞信號傳導和/或對細胞骨架的擾亂也可能涉及在內。
[0258]抗陰離子磷脂和氨基磷脂的完整抗體，尤其是3G4，與血管內皮細胞表面的結合意味著抗體的Fe部分突出入血管的內腔。由于抗體Fe片段激活了補體途徑，所觀察到的細胞破壞可能是補體指導的細胞裂解的結果。因此抗體結合激活了補體依賴型凝血級聯反應，引起多組分復合物的裝配并最終產生能透過靶細胞的裂解復合物。“補體激活的ADCC”還可在破壞細胞中起作用，其中補體與抗體包被的靶細胞結合，而具有補體受體的細胞，如嗜中性粒細胞，會裂解靶細胞。
[0259]當裸露或未綴合抗體，包括其抗原結合片段，與陰離子磷脂和氨基磷脂在腫瘤血管內皮細胞表面結合時，它們將在內腔表面形成一抗體包被層。這可以起到吸引諸如細胞毒性T細胞和/或天然殺傷(NK)細胞等免疫效應細胞的作用,然后免疫效應細胞將在血管內皮細胞上發揮細胞介導的細胞毒性功能。
[0260]與陰離子磷脂和氨基磷脂的抗體結合還可在腫瘤血管內皮細胞中誘導細胞凋亡。盡管尚無已知的有關與PS的抗體結合真正誘導凋亡的報道(而非有關PS是凋亡產生的標記)，
【發明者】仍考慮這可能是所觀察到的抗腫瘤效應的另一可能機制。
[0261]還可能的是腫瘤血管內皮細胞表面上與陰離子磷脂和氨基磷脂的抗體結合可能引起細胞內骨架組織的紊亂。由于細胞骨架在膜表面的組織中起著重要的作用，且由于抗體的結合可能擾亂(或進一步擾亂)了膜，抗體與陰離子磷脂和氨基磷脂的結合可能將變化傳遞至與膜雙分子層相互作用的細胞骨架蛋白。已知骨架蛋白的空間結構可控制膜的穩定性和細胞形狀，且有可能某些細胞骨架平衡狀態的擾亂可能對細胞的完整性具有深遠的影響。
[0262]本發明作用的另一機制可能是與內皮細胞表面陰離子磷脂和氨基磷脂的抗體結合可能通過目前未確定的途徑起始信號的轉導。抗體結合還可能擾亂已知的信號轉導，如通過改變膜受體、信號轉導蛋白、膜通道等的構象和/或相互作用。有關細胞破壞(凋亡)的信號可以被引發或模擬，并且/或者保護/內環境穩定的信號可能被抑制。
[0263]盡管存在科學方面的興趣，但實施本發明無需確定抗陰離子和氨基磷脂的裸露抗體造成血管破壞的確切性質。既然已顯示這些類的抗體的施用有利地在體內產生了抗腫瘤效用，這樣的療法就能應用，而不管造成此現象的分子機制是什么。因此，可結合陰離子磷脂和氨基磷脂的裸露抗體的應用代表了腫瘤治療中的一個重要進展，在制備和成本上都具有優勢。
[0264]C.抗陰離子磷脂和氨基磷脂抗體
[0265]由于本發明鑒定出了一類新型腫瘤血管系統標記，即陰離子磷脂，因此，可與一種或多種陰離子磷脂結合的裸露的抗體和免疫綴合物(任選的與氨基磷脂聯合)目前可以用于腫瘤診斷和治療中。
[0266]Cl.多克隆抗體
[0267]本領域眾所周知用于制備并鑒定抗體的方法(參閱如《抗體:實驗室手冊》(Antibodies:A Laboratory Manual)冷泉港實驗室，1988 ;本文收入作為參考)。為了制備多克隆抗血清，用本文所述含免疫原性陰離子磷脂和/或氨基磷脂(包括用H2O2處理過的細胞和其它藥劑)的組合物免疫動物，并由經免疫動物收集抗血清。廣泛的動物物種可以用于生產抗血清。用于生產抗血清的動物通常是兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、或山羊。因為兔的血量相對較大，所以優選兔用于生產多克隆抗體。
[0268]用于生成多克隆抗體的免疫原組合物的量隨免疫原的本質以及用于免疫的動物而變化。多種途徑可以用于施用本發明免疫原:包括皮下、肌肉內、真皮內、靜脈內、腹膜內、和脾內。可以通過在免疫后多個時間點由經免疫動物取血樣來監控多克隆抗體的生成。還可以給予第二次加強注射。重復加強和測效價過程，直至達到合適的效價。當獲得期望效價水平時，可以給經免疫動物放血，分離并保存血清。動物還可用于產生單克隆抗體。
[0269]正如本領域眾所周知的，特定組合物的免疫原性可以通過使用稱為佐劑的免疫應答非特異性刺激劑而獲得增強。例示性佐劑包括完全弗氏佐劑，其包含殺死的結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫應答非特異性刺激劑；不完全弗氏佐劑；和氫氧化鋁佐劑。
[0270] 還可能期望加強宿主的免疫系統，這可以通過將陰離子磷脂和氨基磷脂與載體相聯合或偶聯來實現。例示性載體是鑰孔蟲?血藍蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其它清蛋白，諸如卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、或兔血清清蛋白，也可以作為載體使用。
[0271]正如本領域眾所周知的，指定組合物的免疫原性可以變化。然而，產生針對陰離子磷脂和氨基磷脂的抗體并不特別困難。例如，通過肌肉內注射含磷脂酰絲氨酸的聚丙烯酰胺凝膠和用磷脂酰絲氨酸-細胞色素C囊泡免疫的兔子內可產生高度特異的抗磷脂酰絲氨酸抗體(Maneta-Peyret等，1988 ；1989 ;分別收編于此作為參考)。利用丙烯酰胺植入物增加了抗體的產生(Maneta-Peyret等，1988 ；1989)。以此方式產生的抗磷脂酰絲氨酸抗體能原位檢測人血小板上的磷脂酰絲氨酸(Maneta-Peyret等，1988 ；1989)。Inoue、Rote和Rauch的研究小組還開發了抗PS和抗PE抗體(見下文)。
[0272]盡管針對陰離子磷脂和氨基磷脂的抗體的產生可以通過各種方法完成，本文實施例IV中還是描述了某些優選的方法。
[0273]C2.單克隆抗體
[0274]現在本領域還眾所周知用于產生單克隆抗體(MAb)的各種方法。大多數標準單克隆抗體生成技術通常由符合制備多克隆抗體的路線開始(《抗體:實驗室手冊》(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港實驗室，1988 ;本文收入作為參考)。通過用免疫原性陰離子磷脂和/或氨基磷脂組合物免疫動物來起始多克隆抗體應答，當獲得期望的效價水平時 ，經免疫動物可以用于生產MAb。優選的，利用本文所述的特殊篩選和選擇技術挑選具有所探尋特征的抗體。
[0275]通過使用眾所周知的技術，諸如美國專利號4，196，265 (本文收入作為參考)中例示的技術，可很容易制備MAb。這種技術通常涉及用選定的免疫原組合物免疫合適的動物。以能有效刺激抗體生成細胞的方式施用免疫組合物。優選動物是嚙齒類動物，諸如小鼠和大鼠，但是也可以使用兔、綿羊、和蛙的細胞。使用大鼠可能有些好處(Goding，1986，第60-61頁；本文收入作為參考)，但是優選小鼠，最優選BALB/c小鼠，因為它是最常規使用的且通常具有較高的穩定融合百分比。
[0276]免疫后,選擇有潛力生成預期抗體的體細胞,具體而言是B淋巴細胞(B細胞)，用于產生mAb。這些細胞可以由脾、扁桃體、和淋巴結活組織樣本或者由外周血樣品獲得。優選脾細胞和外周血細胞，因為前者是處于成漿細胞分裂階段的抗體生成細胞的豐富來源，而后者易于獲得。通常，需要免疫一組動物，切下具有最高抗體效價的動物脾臟，并用注射器對獲得的脾進行勻漿而獲得淋巴細胞。來自經免疫小鼠的脾通常包含大約5x107-2x108個淋巴細胞。
[0277]然后將來自經免疫動物、生成抗體的B淋巴細胞與永生化骨髓瘤細胞融合，永生化骨髓瘤細胞通常與免疫的動物屬于相同物種。適用于雜交瘤生產融合程序的骨髓瘤細胞系優選是不產生抗體的，具有高融合效率，并具有酶缺陷，使其不能在只支持期望的融合細胞(雜交瘤)生長的某些選擇性培養基中生長。
[0278]正如本領域技術人員知道的，可以使用大量的骨髓瘤細胞中的任一種(Goding，第65-66頁，1986 ;Campbell，第75-83頁，1984 ;本文收入作為參考)。例如，當經免疫動物是小鼠時，可以使用 P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Agl4、F0、NS0/U、MPC_ll、MPC11-X45-GTG 1.7、和 S194/5XX0 Bul ;對于大鼠，可以使用 R210.RCY3、Y3_Ag 1.2.3、IR983F、4B210、或上文所列的小鼠細胞系；對于人細胞融合，可使用U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2、和 UC729-6。
[0279]用于產生抗體生成脾細胞或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的雜交細胞的方法通常包括在存在促進細胞膜融合的(化學的或電學的)藥劑的條件下將體細胞與骨髓瘤細胞以4:1的比例混和，但是比例可以在約20: I與約1:1之間變化。Kohler和Milstein(1975 ;1976 ;本文收入作為參考)已經描述了使用仙臺病毒(Sendai virus)的融合方法，Gefter等人(1977 ;本文收入作為參考)已經描述了使用聚乙二醇(PEG)，諸如37% (v/v)PEG的方法。電誘導融合方法的使用也是合適的(Goding，第71-74頁，1986 ;本文收入作為參考)。
[0280]融合程序常常以大約lx10_6-lxl0_8的低頻率產生能存活的雜交細胞。然而這不是問題所在，因為通過在選擇性培養基中進行培養，能夠區分能存活的融合雜交細胞與親本未融合細胞(特別是通常可持續進行無限期分裂的未融合的骨髓瘤細胞)。選擇性培養基通常是在組織培養基中包含阻斷核苷酸從頭合成的藥劑的培養基。例示性和優選的藥劑是氨基蝶呤、氨甲喋呤、和重氮絲氨酸。氨甲喋呤和氨甲喋呤阻斷嘌呤和嘧啶二者的從頭合成，而重氮絲氨酸只阻斷嘌呤合成。當使用氨甲喋呤或氨甲喋呤時，要向培養基中添加次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸來源(HAT培養基)。當使用重氮絲氨酸時，要向培養基中添加次黃嘌呤。
[0281]優選的選擇性培養基是HAT。只有能夠進行核苷酸補救途徑的細胞才能夠在HAT培養基中存活。在骨髓瘤細胞中補救途徑的關鍵酶是缺陷的，如次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，因此它們不能存活。B細胞能夠進行該途徑，但是它們在培養中的壽命是有限的，通常在大約2周內死亡。因此，能夠在選擇性培養基中存活的細胞只有由骨髓瘤與B細胞形成的雜交細胞。
[0282]這種培養提供了雜交瘤細胞群，由此可選擇特定的雜交瘤。通常在微量滴定板中培養由單克隆稀釋的細胞，隨后在大約2-3周后對各個克隆的上清液檢驗期望的反應性，從而選擇雜交瘤。測定法應當是靈敏的、簡單的、且快速的，諸如放射性免疫測定法、酶免疫測定法、細胞毒性測定法、噬斑測定法、斑點免疫結合測定法、等等。
[0283]然后對選擇的雜交瘤進行系列稀釋，并克隆形成產生抗體的各個細胞系，可以無限繁殖這些克隆來提供mAb。可以以兩種基本方式用這些細胞系產生mAb。其一是將雜交瘤樣品注射(通常為腹腔內)進入組織相容性動物，這些動物與提供體細胞和骨髓瘤細胞用于最初融合的動物種類相同。經注射動物形成腫瘤，分泌由融合的雜交細胞產生的特定單克隆抗體。然后可以對動物進行穿刺來吸取體液(諸如血清或腹水)，提供高濃度的mAb。另一種方法是在體外培養單個細胞系，此時通常分泌mAb進入培養基，由此可容易的獲得高濃度的mAb。
[0284]通過每種方法產生的mAb通常將進一步純化，如使用過濾、離心、和各種層析法，諸如HPLC或親和層析法，本領域技術人員眾所周知所有純化技術。這些純化技術都涉及分級分離，以將期望抗體與混和物其它成分分開。特別適用于抗體制備的分析方法包括例如蛋白A-Sepharose和/或蛋白G-Sepharose層析法。
[0285]D.抗陰離子磷脂和氨基磷脂的第二代抗體
[0286]本發明提供了結合氨基磷脂和陰離子磷脂的“第二代”抗體，所說的抗體具有改良的特性且/或不具有現有技術中抗體相關的缺點。本文描述了這樣一組抗體，其中單克隆抗體9D2和3G4是目前優選的，尤其優選3G4 (ATCC 4545)抗體。本發明還提供了特殊的免疫和篩選技術，它可以產生具有優越特性和/或較少缺點的“類似”或“競爭性”抗體。
[0287]Dl.抗體特性
[0288]本發明的第二代抗體結合氨基磷脂和陰離子磷脂，且不具有通常與抗這些磷脂的抗體相關的致病特性。這就在某種程度上使得
【發明者】可能開發新的免疫和篩選技術。
[0289]抗磷脂綜合癥(APS)與所謂“抗心磷脂”抗體和“狼瘡抗凝血抗體”的自身抗體相關。這些綜合癥與傾向靜脈和動脈血檢檢塞、血小板減少癥和許多神經系統綜合癥相關。在這些患者中的抗磷脂抗體因此是“致病抗體”。
[0290]盡管多年來被描述成“抗磷脂抗體”和“抗PS抗體”，但這些致病抗體實際上識別結合心磷脂、PS或二者的蛋白質輔因子，而非磷脂本身(Galli等，1990 ；1993 ；McNeil等，1990 ；Rote, 1996)。抗心磷脂抗體識別β 2-糖蛋白I上的特殊區域(第281位殘基和第288位殘基之間)，而狼瘡抗凝血抗體識別凝血酶原。類似的，疾病狀態下存在的抗PE抗體結合PE與蛋白質的組合，所述蛋白質諸如低分子量和高分子量激肽原(HK)、激肽釋放酶原和因子XI聯合結合PE (Sugi和McIntyre，1995 ； 1996a ； 1996b)。基于此類型的蛋白質識別，患者中的抗磷脂抗體頂替了磷脂的蛋白質輔因子，從而產生了疾病的癥狀。
[0291]基于其并非與蛋白質輔因子聯合的氨基磷脂和陰離子磷脂，而是“真正的”抗磷脂抗體這一點，特別選擇出了本發明的抗體。這樣，本發明的抗體不結合或置換磷脂的蛋白質輔因子，因此可以安全施用。事實上，用高劑量的本發明抗體長時期處理的小鼠未顯示出凝血能力的改變，而當注射抗心磷脂或狼瘡抗凝血抗體時，小鼠會有APS的反應。
[0292]無論基本機制為何，人群中存在的抗磷脂抗體都與自身免疫疾病相關，如，系統性紅斑狼瘡(Branch 等，1987 ；Staub 等，1989 ；Drouvalakis 和 Buchanan, 1998 ；Smirnov 等，1995 ；Rauch 等，1986 ；Rauch 和 Janoff, 1990)和復發性流產(Rote 等，1995 ；Rote 等，1996 ；Vogt等，1996 ；1997 ;Katsuragawa等，1997)。當本發明的抗體施用于小鼠或猴子時,不會產生這樣的癥狀。
[0293]此外，被諸如9D2和3G4 (ATCC 4545)等本發明抗體識別的表位與膜聯蛋白V識別的不一樣。本文顯示，所說的藥劑不會相互交叉阻斷各自與磷脂的結合。3G4和9D2抗體所識別的表位可能是六角形包裝形式的PS，這是具有免疫原性的形式。膜聯蛋白除了結合六角形形式的PS外，還可能結合平坦的PS。六角形的PS集中于與細胞活化相關的質膜突出中和凋亡細胞上的“泡”中。因此，諸如9D2和3G4(ATCC 4545)抗體等的本發明抗體的有限分布進一步造成了無可檢測到的細胞毒性和無抗體凝血效果。
[0294]為了產生具有優越特性且/或減少或基本上無副作用的抗氨基磷脂和陰離子磷脂抗體，本發明提供了優選的免疫接種和篩選方法。其它的免疫技術和抗體在文獻中已有報道(Umeda等，1989 ;Igarashi等，1991 ;Rote等，1993),包括那些具有針對所涉及脂肪酸的報道特異性的文獻(Levy等，1990 ；Qamar等，1990)。另一方面,本發明的免疫技術、特別是對無血清依賴性的抗體的選擇也提供了特別的有利之處。
[0295]Umeda等(1989)報道了識別磷脂酰絲氨酸的立體特異表位的單克隆抗體的產生。不過，Umeda的方法具有用沙門氏菌包裹的氨基磷脂樣品直接將磷脂酰絲氨酸免疫小鼠脾臟的缺點(Umeda等，1989)。Umeda等(1989)所報道的許多抗體還展示了抗凝血活性,這是一個缺點，而本發明抗體并不如此。3G4抗體的結合模式與Umeda等(1989)的PSC8抗體不同。
[0296]本發明的抗體還具有識別所有或大部分陰離子磷脂的優勢，它能提供更多的結合靶目標。因此，本發明的第二代抗體可以定義為，如本文表4中所述，與9D2或3G4(ATCC4545)抗體具有基本上相同或完全相同的磷脂特異性且不依賴于血清的抗體。
[0297]Igarashi等(1991)也報道了抗PS抗體的誘導，但再次使用了脾內免疫接種，并且當再次靜脈注射抗原時只觀察到了微弱的效價增加。大部分來自Igarashi等(1991)的MAbs與DNA交叉反應，且許多展示了狼瘡抗凝血活性，這些缺點均不存在于本發明
【發明者】開發的抗體中。本發明優選的3G4抗體的結合模式也不同于Igarashi等(1991)表1中的那些抗體。
[0298]其它研究者已報道了與一種以上陰離子磷脂交叉反應的小鼠單克隆抗體的狼瘡抗凝血活性(Alving等，1987 ；Rauch&Janoff, 1990),而本發明的
【發明者】則未經歷任何困難就可得到無狼瘡抗凝血活性的抗體。這代表了本發明的方法、抗體和競爭性抗體的獨特優勢。
[0299]除了避免使用來自患者的抗體之外，如Rauch等(1986)、Hasegawa等(1994)、Ravirajan等(1995)和Menon等(1997)中所述的抗體,本申請還通過與本領域中的已有抗體(如Rote等(1993)所述的3SB抗體)的并列比較證明了本發明提供抗體的優越特性。盡管3SB抗體具有適用于本文所公布的各種方法的特性，本發明
【發明者】開發的抗體在比較研究中仍然勝過3SB抗體，例如，如本文所示，與3SB抗體相比，3G4抗體的抗病毒作用增強(實施例XIII)。
[0300]本發明的抗體還以其親和力為特征。在本發明之前，本領域中的抗體具有相對弱的親和力(按其報道的)。在某些實施方案中，本發明的第二代抗體因此被定義為，如表3中所述，對PS的親和力至少與9D2或3G4(ATCC 4545)抗體對PS的親和力(具體而言，如本文所述在ELISA中檢測到的親和力)相同且不依賴于血清的抗體。
[0301]更優選的，本發明的第二代抗體被定義為，如表3中所述，對PS的親和力至少與9D2或3G4(ATCC 4545)抗體對PS的親和力相同且如本文表4中所述與9D2或3G4(ATCC4545)抗體具有基本上相同或相同的磷脂特異性且不依賴于血清的抗體。最優選的，第二代抗體是如表3中所述對PS的親和力至少與3G4(ATCC 4545)抗體對PS的親和力相同且如本文表4中所述與3G4(ATCC 4545)抗體具有相同的磷脂特異性且不依賴于血清的抗體。
[0302]D2.CDR 技術
[0303]抗體由可變區和恒定區組成。如本文所用，涉及抗體的術語“可變的”指抗體序列中廣泛不同并用于每一種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的可變結構域某些部分。然而，可變性并不是均勻分布在整個抗體可變結構域上，而是集中在輕鏈和重鏈可變結構域中都有的稱為“高變區”的三個區段中(除了下文所討論的駱駝源化抗體之外)。
[0304]可變結構域中更高度保守的部分稱為框架區(framework reg1n,FR)。天然輕鏈和重鏈的可變結構域各包含4個FR(分別為FR1、FR2、FR3、和FR4)，主要采用β -折疊片構象，由3個高變區相連，它們形成環，連接(在某些情況中是構成)β -折疊片結構部分。
[0305]每條鏈中的高變區由FR緊密維持在一起，并與其它鏈的高變區一起有助于形成抗體的抗原結合位點(Kabat等人，1991 ;本文特別收入作為參考)。恒定結構域不直接涉及抗體與抗原的結合，但是展示多種效應物功能，諸如抗體參與依賴抗體的細胞毒性。
[0306]如本文所用，術語“高變區”指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變結構域第24-34位(LI)、第50-56位(L2)、和第89-97位(L3)殘基，重鏈可變結構域第31-35位(Hl)、第50-56位(H2)、和第95-102位(H3)殘基；Kabat等人，1991，本文收入作為參考)和/或來自“高變環”的殘基(即輕鏈可變結構域第26-32位(LI)、第50-52位(L2)、和第91-96位(L3)殘基和重鏈可變結構域第26-32位(Hl)、第53-55位(H2)、和第96-101位(H3)殘基)。“框架”或“FR”殘基是除了本文定義的聞變區殘基以外的可變結構域殘基。
[0307]本文提供了 3G4抗體(ATCC 4545)的Vh和V κ鏈的DNA和推導的氨基酸序列，分別見SEQ ID N0:l、2、3和4。這些序列包含抗體重鏈和輕鏈可變區的⑶Rl_3。借助本文提供的序列和其它信息以及現有技術知識，目前能夠產生一系列3G4樣和改進的抗體和抗原結合區，并因此包含在本發明內。
[0308]在某些實施方案中，本發明提供了由保藏號為ATCC 4545的雜交瘤所產生的抗體的至少一個CDR。在另一實施方案中，本發明提供了 CDR、抗體或其抗原結合區，它結合至少第一氨基磷脂或陰離子磷脂，優選PS，而且它包括由保藏號為ATCC 4545的雜交瘤所產生的抗體的至少一個⑶R。
[0309]本發明的其它方面涉及具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的至少一種CDR，或其變體或誘變形式。本發明的其它方面涉及CDR、抗體或其抗原結合區，它結合至少第一氨基磷脂或陰離子磷脂，優選PS，且包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的至少一種CDR，或其變體或誘變形式，其中所說的變體或誘變形式保持了與該氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)的結合。
[0310]在一個具體實施方案中，本發明提供了抗體或其抗原結合區，其中3G4抗體(ATCC4545)框架區已從小鼠IgG改變成人IgG，諸如人IgGl，或其它IgG亞類，從而降低在人體內的免疫原性。在其它實施方案中，在3G4抗體(ATCC 4545)序列中檢測T細胞表位的存在，正如本領域中已知的。然后可改變相應序列以去除T細胞表位，即使抗體“脫免疫”。
[0311]3G4抗體的Vh和Vk鏈的DNA和氨基酸序列(SEQ ID N0:l、2、3和4)的可用性意味著現在能夠用CDR技術制備一系列抗體。具體而言，對在CDR中進行隨機突變，并篩選產物，以鑒定出具有較高親合力和/或更高特異性的抗體。這樣的誘變和選擇是抗體領域內常規實施的。由于本文所公布的優越的篩選技術，這種方法尤其適用于本發明。
[0312]這些技術可用于產生相對于其來源親本抗體諸如9D2或3G4(ATCC4545)來說生物學特性有所改良的抗體變體。這些變體或第二代化合物通常是在親本抗體中包含一處或多處高變區殘基取代的取代變體。用于產生這些取代變體的便利方法是使用噬菌體展示的親和力成熟法。
[0313]在使用噬菌體展示的親和力成熟法中，對幾個高變區位點(如6-7個位點)進行突變，從而在每個位點產生所有可能的氨基酸替代。由此產生的抗體變體以單價方式，作為與每個顆粒內包裝的M13的基因III產物的融合體形式展示在絲狀噬菌體顆粒上。然后，如本文公開的，對噬菌體展示的變體篩選其生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點，可以進行丙氨酸掃描誘變來鑒定顯著有助于抗原結合的高變區殘基。
[0314]⑶R改組和植入技術也可用于本發明的抗體，優選9D2和3G4 (ATCC4545)抗體。⑶R改組是將⑶R序列插入一特殊的框架區(Jirholt等，1998，特別收編于此作為參考)。⑶R植入技術允許⑶R序列隨機組合入單一的主體框架中(Soderlind等，1999，2000，分別收編于此作為參考)。利用這樣的技術，可將例如3G4 (ATCC 4545)抗體的⑶R序列誘變而產生眾多的不同序列，它們被摻入骨架序列中，并對所產生的抗體變體篩選期望特征，如較高親和力。
[0315]根據本文所公布的內容，抗體、優選9D2和3G4(ATCC 4545)抗體的抗原結合片段還可以被最小化，從而提高穩定性。這可以基于免疫球蛋白VH和VH-樣結構域通過制備單一結構域結合蛋白質來完成(Nuttall等，2000，特別收編于此作為參考)。
[0316]或者/另外，可以描繪并分析抗原-抗體復合物的晶體結構，從而鑒定抗體與靶氨基磷脂或陰離子磷脂(如PS)之間的接觸點。這些接觸殘基和鄰近殘基是替代的候選者。一旦產生了這些變體，如本文所述，對變體理進行篩選，選擇出在一種或多種相關測定法中顯示出相似但是不同或甚至更好的特性的抗體用于進一步的開發。
[0317]D3.胳馬它源化抗體(camelized antibodies)
[0318]本發明另外的實施例是“駱馬它源化”抗體。來自camels和llamas (Camel Idae,camelids)的抗體包括一種獨特類型的抗體，它沒有輕鏈，因此只由重鏈組成。這些抗體已被稱為“駱駝源化抗體”。這樣的抗體的抗原結合位點是單一的結構域，被稱作Vhh(VHH)。
[0319]本文提供了 3G4 (ATCC 4545)抗體Vh和V κ鏈的DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO:
1、2、3和4)，這樣可制備駱駝源化形式的3G4抗體。可以進行突變和結構修改，以將Vh-'對中的Vh改造成保留足夠可變性的單一結構域Vhh(Muyldermans等,2001,特別收編于此作為參考)。這樣的Vhh構建體是具有強抗原結合能力的小而強且有效的識別單元(Riechmann和Muyldermans, 1999),它具有可與常規Vh-V1j對不易接近的新表位相互作用的更多優勢。因此，camelised抗體雖然類似于Fv片段，但具有更多的優勢。
[0320]美國專利5，800，988、美國專利 6，005，079、PCT 申請 WO 94/04678、PCT 申請 WO94/25591、Riechmann&Muyldermans (1999)和 Muyldermans 等(2001)都分別收編于此作為參考，以便進一步描述和進行駱駝源化抗體的生產。因此，3G4抗體的CDR可以移植到CameIidae抗體重鏈免疫球蛋白的可變結構域框架上。
[0321]D4.CDR 序列
[0322]因此，本發明的更多方面涉及編碼抗體重鏈和輕鏈⑶R區的分離DNA片段和重組載體，諸如9D2和3G4抗體，優選3G4(ATCC 4545)的重鏈和輕鏈，還涉及通過DNA技術的應用產生和利用表達這些⑶R區的重組宿主細胞和噬菌體。
[0323]本發明由此提供了含編碼保藏號為ATCC 4545的雜交瘤所產生的抗體的至少一種CDR的核酸序列的分離多核苷酸。本發明另外提供了分離的多核苷酸，它包含編碼結合至少第一氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)、并包含保藏號ATCC 4545的雜交瘤所產生的抗體的至少的一種CDR的CDR、抗體或其抗原結合區的核苷酸序列。
[0324]本發明的其它方面涉及包含編碼具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的至少一種CDR的核苷酸序列或其變體或誘變形式的分離多核苷酸。本發明的其它方面涉及包含編碼CDR、抗體或其抗原結合區(它可結合至少第一氨基磷脂或陰離子磷脂，優選PS，且包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的至少一種CDR)的核苷酸序列或其變體或誘變形式的分離多核苷酸，其中所說的變體或誘變形式保持了與所述氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)的結合。
[0325]在本發明的其它方面，分離的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示核苷酸序列或其變體或誘變形式。具體而言，所述分離的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的核苷酸序列或其變體或誘變形式，該核苷酸序列編碼可結合至少第一氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)的CDR、抗體或其抗原結合區，其中任何的所說變體或誘變形式保持了與氨基磷脂或陰離子磷脂(優選PS)的結合。
[0326]本發明由此涉及可由任何哺乳動物(優選人或鼠)分離的不含總基因組DNA、并能夠表達抗陰離子磷脂或抗氨基磷脂抗體重鏈和輕鏈(諸如9D2和3G4，優選SG4(ATCC4545))的CDR區的多核苷酸和DNA片段。如本文所用，術語“多核苷酸區段”和“DNA區段”指已分離的不含特定物種總基因組DNA的多核苷酸和DNA分子。術語“多核苷酸區段”和“DNA區段”包括DNA片段和這些片段的小片段，還有重組載體，包括例如質粒、粘粒、嗤囷體、病毒等等。
[0327]相似的，包含編碼抗陰離子磷脂或抗氨基磷脂抗體(諸如9D2和3G4，優選3G4)重鏈和輕鏈的純化CDR區的編碼片段或分離基因部分的DNA片段，指包含這些編碼序列(而且在某些方面包含調控序列)、與其它天然存在的基因或蛋白質編碼序列基本上分離開的DNA片段。在這方面，術語“基因”簡便的用于指功能性蛋白質、多肽、或肽編碼單元。本領域技術人員可以理解，這種功能性術語包括表達或可能適合于表達合適的抗原結合蛋白質、多肽、或肽的天然抗體編碼序列和更小的基因工程化片段。
[0328]“與其它編碼序列基本上分離開”指感興趣的編碼片段或分離基因部分構成DNA片段編碼區的重要部分，而且該DNA片段不含天然編碼DNA的大部分，諸如大染色體片段或其它功能基因或cDNA編碼區。當然，這指最初分離的DNA片段，不排除后來人工添加的基因或編碼區。
[0329]在特定實施方案中，本發明涉及分離的編碼片段或分離的基因部分，和摻入了編碼抗陰離子抗體或抗氨基磷脂抗體重鏈和輕鏈(諸如9D2和3G4，優選3G4的重鏈和輕鏈)⑶R區的DNA序列的重組載體，所述⑶R區包含具有與氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4有至少大約75%;更優選至少大約80%;更優選至少大約85%;更優選至少大約90%、91%、92%、93%、94%;最優選至少大約95%、96%、97%、98%或99%左右氨基酸序列同一性的氨基酸序列區的至少第一序列區；其中所述⑶R區至少基本上維持氨基酸序列SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:2的CDR區的生物學特性。
[0330]如本文公開的，序列中可以包含某些生物學上功能等同的氨基酸或“保守性替代”。其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其特意經基因工程改造以改進CDR或含CDR的抗體的特性，本領域普通技術人員是知道的，本文將進一步描述。
[0331 ] 也可以理解，氨基酸和核酸序列可以包含額外殘基，諸如額外的N或C端氨基酸或者5’或3’序列而仍然屬于本發明的序列，條件是序列符合上文提出的標準，優選在涉及蛋白質表達時包括生物學蛋白質活性的維持或改進。末端序列的添加包括位于編碼區5’或3’部分側翼的各種非編碼序列以及控制區。
[0332]因此，本發明的核酸片段可以與其它DNA序列聯合，諸如啟動子、多聚腺苷酸化信號、額外的限制酶切位點、多克隆位點、其它編碼片段、等等，使得它們的整體長度可能顯著變化。因此預計可以采用幾乎任何長度的核酸片段，總長度優選受到意欲采用的重組DNA方案中制備和使用便利性的限制。
[0333] 因此，重組載體形成本發明的另外方面。特別有用的載體預計包括將DNA片段編碼部分置于啟動子控制之下的載體。通常，將采用重組或異源啟動子，即在天然環境中與編碼序列通常不相連的啟動子，當然并不僅限于此。這些啟動子可以包括細菌、病毒、真核、和哺乳動物啟動子，只要啟動子有效指導DNA片段在選擇用于表達的細胞類型、生物體、或甚至動物中的表達即可。
[0334]用于蛋白質表達的啟動子和細胞類型組合的使用對于分子生物學領域技術人員而言是知道的。采用的啟動子可以是組成性的或可誘導的，而且可以在指導導入的DNA片段高水平表達的適當條件下使用，這在諸如大量生產重組蛋白質或肽中是有益的。
[0335]本發明核酸序列的表達可以方便的通過本領域普通技術人員知道的、本文進一步描述的任何一種或多種標準技術來實現。例如，關于融合蛋白質重組表達的后續描述同樣可以應用于在核酸水平上不與另一種編碼序列可操作相連的抗體和抗體片段。
[0336]E.更多的抗體制備技術
[0337]El.來自噬菌粒文庫的抗體
[0338]重組技術現在能夠由編碼一系列抗體的重組基因制備具有期望特異性的抗體(Van Dijk等人，1989 ;本文收入作為參考)。某些重組技術涉及對使用由經免疫動物的脾分離的RNA而制備的組合免疫球蛋白噬菌體表達文庫進行免疫學篩選來分離抗體基因(Morrison 等人，1986 ；ffinter 和 Milstein, 1991 ；Barbas 等，1992 ;本文收入作為參考)。
[0339]對于這些方法，使用由經免疫動物的脾分離的RNA來制備組合型免疫球蛋白噬菌粒文庫，并通過使用表達抗原的細胞和對照細胞進行淘選來選擇表達適當抗體的噬菌粒。這種方法相對于傳統雜交瘤技術的優勢是可以在一輪中產生并篩選多達大約14倍的抗體，而且通過H鏈與L鏈的組合產生了新的特異性，進一步增加了產生適當抗體的可能性。
[0340]用于在細菌中產生多樣性抗體分子大型文庫的一種方法是利用細菌噬菌體λ作為載體(Huse等人，1989 ;本文收入作為參考)。使用λ載體的抗體生成涉及將重鏈和輕鏈DNA序列群克隆到分開的起始載體中。隨后隨機組合載體形成單一載體，來指導重鏈和輕鏈共表達形成抗體片段。由用選定抗原免疫的動物的脾細胞(或其雜交瘤)分離mRNA并進行擴增，優選通過PCR?或相關擴增技術，獲得重鏈和輕鏈DNA序列。重鏈和輕鏈序列通常使用引物進行擴增，所述引物將限制性位點引入擴增DNA片段末端，有助于將重鏈和輕鏈片段克隆到起始載體中。
[0341]用于產生并篩選全部或部分合成的抗體結合位點或互補位的大型文庫的另一種方法利用了由絲狀噬菌體(諸如M13、fl、或fd)衍生的展示載體。這些稱為“噬菌粒”的絲狀噬菌體展示載體可產生具有不同的和新的免疫特異性的單克隆抗體大型文庫。這種技術使用絲狀噬菌體外殼蛋白膜錨定結構域作為在絲狀噬菌體復制裝配階段過程中聯系基因產物與基因的方法，而且已經用于由組合型文庫克隆并表達抗體(Kang等人，1991 ；Barbas等人，1991 ;本文收入作為參考)。
[0342]美國專利號5，658，727描述了這種用于絲狀噬菌體展示的常用技術，本文收入作為參考。在最常用的方面，這種方法為使用單一載體系統由抗體基因庫同時克隆并篩選預先選定的配體結合特異性提供了一種系統。對文庫的分離成員篩選預先選定的配體結合能力能夠將表達的抗體分子的結合能力與用于由文庫分離成員編碼基因的便利方法聯系起來。
[0343]通過將融合多肽靶向進入細菌細胞周質以便裝配功能性抗體與噬菌體裝配過程中將融合多肽靶向至絲狀噬菌體顆粒外殼上以便方便的篩選感興趣文庫成員進行組合，可以實現表達與篩選的聯系。通過融合多肽中存在的分泌信號結構域來提供周質靶向。通過融合多肽中絲狀噬菌體外殼蛋白膜錨定結構域(即cpIII或cpVIII衍生的膜錨定結構域)的存在來提供噬菌體顆粒靶向。
[0344]可以通過重鏈和輕鏈基因的改組，通過改變克隆的文庫重鏈基因的一個或多個互補決定區、或通過易錯聚合酶鏈式反應將隨機突變導入文庫，來增加基于絲狀噬菌體的組合型抗體文庫的多樣性。美國專利號5，580，717,5, 427，908,5, 403，484、和5，223，409描述了用于篩選噬菌粒文庫的其它方法，本文收入作為參考。
[0345]已經開發了用于篩選大型組合型抗體文庫的另一種方法，其中利用了多樣化重鏈和輕鏈序列群在絲狀噬菌體(諸如M13、fl、或fd)表面的表達(美國專利號5，698，426，本文收入作為參考)。通過聚合酶鏈式反應(PCR?)合成了兩套多樣性重鏈(He)和輕鏈(Lc)序列群。將這些序列群克隆到分開的含表達必需元件的基于M13的載體中。重鏈載體包含基因VIII (gVIII)外殼蛋白序列，使得重鏈序列的翻譯產生gVII1-Hc融合蛋白質。隨機組合兩套載體群，使得只有包含He和Lc序列的載體部分連接成單個環狀載體。
[0346]組合型載體指導He與Lc序列二者的共表達，用于兩種多肽的裝配和M13表面表達(美國專利號5，698，426，本文收入作為參考)。組合步驟將兩套多樣性序列群的不同He和Lc編碼序列隨機帶入單個載體。來自每個獨立載體的載體序列對于產生存活噬菌體是必需的。另外，既然兩種起始載體中只有一種包含假的gVIII序列，那么在噬菌體表面不能夠實現功能性抗體片段作為Lc相關性gVII1-Fc融合蛋白質的共表達，除非載體序列連接成單個載體。
[0347]在琥珀抑制子菌株中進行抗體文庫的表面表達。He序列與gVIII序列之間的琥珀終止密碼子在無抑制子菌株中拆開了兩種成分。分離由無抑制子菌株產生的噬菌體并感染抑制子菌株，將在表達過程中將He序列與gVIII序列聯系起來。感染后培養抑制子菌株能夠在M13表面以gVIII融合蛋白質(gVII1-Fab融合蛋白質)形式共表達文庫內所有抗體種類。或者，可以由無抑制子菌株分離DNA，然后導入抑制子菌株來實現相同效果。
[0348]通過標準親和分離程序對表面表達文庫篩選可結合預先選定的分子的特異性Fab片段。這些方法包括例如淘選(Parmley和Smith，1988 ;本文收入作為參考)、親和層析法、和固相印跡程序。優選淘選，因為可以在小體積中容易的、快速的篩選高效價噬菌體。而且，該程序可以選擇群體中用其它方法檢測不到的較少Fab片段種類，并擴增成基本上均一的群體。可以在擴增噬菌體群后對編碼多肽的核酸進行測序來鑒定選定的Fab片段。
[0349]美國專利號5，667，988和5，759，817描述了用于產生多樣性抗體文庫并篩選期望結合特異性的另一種方法，本文收入作為參考。該方法涉及使用簡并寡核苷酸和引物延伸反應將簡并性引入免疫球蛋白可變重鏈和輕鏈可變結構域CDR區，并將誘變的多肽展示在噬菌顆粒表面，由此以噬菌粒文庫的形式制備雜二聚體免疫球蛋白分子文庫。此后，對展示蛋白篩選結合預先選定的抗原的能力。
[0350]用于產生雜二聚體免疫球蛋白分子的方法通常涉及(I)將感興趣的重鏈或輕鏈V區編碼基因導入噬菌粒展示載體；(2)通過使用包含抗體V區基因CDR同源區且包含產生隨機化編碼序列的簡并區的寡核苷酸進行引物延伸，將隨機化結合位點導入噬菌粒展示蛋白載體，形成展示載體的大型群體，其中的每一個都能夠表達在噬菌粒表面展示蛋白上展示的不同的假定結合位點；(3)在絲狀噬菌體顆粒表面表達展示蛋白和結合位點；并(4)使用親和技術來分離(篩選)表面表達的噬菌體顆粒，諸如針對預先選定的抗原進行噬菌體顆粒淘選，由此分離所含展示蛋白包含可結合預先選定的抗原的結合位點的一種或多種噬菌粒。
[0351]美國專利號5，702, 892描述了用于產生多樣性抗體文庫并篩選期望結合特異性的這種方法的另一種形式，本文收入作為參考。在這種方法中只采用重鏈序列，對重鏈序列中編碼⑶RI或⑶RIII高變區的所有核苷酸位置進行隨機化，并獨立于任何生物學過程而產生⑶R遺傳變異性。
[0352]在這種方法中，對兩個文庫進行改造，即對重鏈基因結構框架內的寡核苷酸基序進行遺傳改組。通過CDRI或CDRIII的隨機突變，重建重鏈基因高變區，產生高度多樣化序列集合。由突變基因序列集合編碼的重鏈蛋白有可能具有免疫球蛋白的所有結合特征，同時只需要兩條免疫球蛋白鏈之一即可。
[0353]具體而言，在不存在免疫球蛋白輕鏈蛋白的情況中實踐這種方法。將展示經修飾的重鏈蛋白的噬菌體文庫與已固定化的配體一起溫育，來選擇編碼可特異性結合固定化配體的重組蛋白質的克隆。然后將結合的噬菌體與固定化配體解離，通過在細菌宿主細胞中的生長進行擴增。擴增表達不同重組蛋白質的各個病毒斑，然后可以對各個克隆測定結合活性。
[0354]E2.來自人淋巴細胞的抗體
[0355]抗磷脂抗體存在于人種群中。不過，這些抗體通常與疾病相關，本發明中應優選避免使用它們。另一方面，來自健康受試者的人淋巴細胞可適于作為起始材料用于產生本發明中所用的抗體。
[0356]體外免疫或抗原刺激也可以用于產生本發明的人抗體。這些技術可以用于刺激來自正常、健康個體的外周血淋巴細胞，其中僅僅需要用陰離子磷脂和氨基磷脂對抗體生成細胞進行體外刺激。
[0357]這種“體外免疫”涉及通常在淋巴細胞混和群(混和淋巴細胞培養物，MLC)內進行的未免疫B淋巴細胞的抗原特異性激活。體外免疫還可以由B細胞生長和分化因子及淋巴因子獲得支持。由這些方法產生的抗體常常是IgM抗體(Borrebaeck等人，1986 ;本文收入作為參考)。
[0358]美國專利號5，681，729描述了能夠獲得主要產生IgG或IgA抗體的人淋巴細胞的另一種方法，本文收入作為參考。一般地，這種方法涉及將人淋巴細胞移植到免疫缺陷型動物中，使得人淋巴細胞“參與”該動物體；用期望抗原免疫動物，生成可產生對抗原具有特異性的抗體的人淋巴細胞；并由動物回收產生該抗體的人淋巴細胞。由此產生的人淋巴細胞可以用于產生單克隆抗體:即使產生抗體的人淋巴細胞永生化，克隆獲得的永生化、人起源、產生抗體的淋巴細胞，并由克隆的永生化人起源淋巴細胞回收對期望抗原具有特異性的單克隆抗體。
[0359]在這種技術中可采用的免疫缺陷型動物是那些在移植了人淋巴細胞后不展示排異的動物。這些動物可以通過物理的、化學的、或生物學的處理而人工制備。可以采用任何免疫缺陷型動物。人淋巴細胞可以由人外周血、脾、淋巴結、扁桃體等等獲得。
[0360]動物中移植的人淋巴細胞的“參與”可以通過僅僅對動物施用人淋巴細胞來實現。施用途徑不限于且可以是例如皮下、靜脈內、或腹膜內。人淋巴細胞的劑量不受限制，通常可以是每只動物16-1O8個淋巴細胞。然后用期望的抗原免疫免疫缺陷型動物。
[0361 ] 免疫后，通過任何傳統方法由血液、脾、淋巴結、或其它淋巴組織回收人淋巴細胞。例如，單核細胞可以通過Ficoll-Hypaque (比重:1.077)離心法進行分離，并通過塑料盤吸附法除去單核細胞。來自免疫缺陷型動物的污染細胞可以通過使用對該動物細胞具有特異性的抗血清而除去。可以通過例如用該免疫缺陷型動物的脾細胞免疫另一種不同動物并由該不同的經免疫動物回收血清來獲得抗血清。可以在任何階段進行抗血清處理。也可以通過采用在細胞表面表達作為標記物的人免疫球蛋白的免疫學方法來回收人淋巴細胞。
[0362]通過這些方法，可以獲得主要產生對一種或多種選定陰離子磷脂和氨基磷脂具有特異性的IgG和IgA抗體的人淋巴細胞。然后通過永生化、選擇、細胞培養、和抗體生成，由人淋巴細胞獲得單克隆抗體。
[0363]E3.含人抗體文庫的轉基因小鼠
[0364]重組技術現在可用于制備抗體。除了上文公開的組合型免疫球蛋白噬菌體表達文庫，另一種分子克隆方法是由含人抗體文庫的轉基因小鼠制備抗體。美國專利號5，545，807描述了這些技術，本文收入作為參考。
[0365]在最常用的方面，這些方法涉及產生在其種系中插入了遺傳物質的轉基因動物，所述遺傳物質編碼至少部分的人起源免疫球蛋白，或者可以重排而編碼免疫球蛋白集合。可以由人來源產生所述插入的遺傳物質，或者可以人工合成。遺傳物質可以編碼至少部分的已知免疫球蛋白，或者可以經修飾而編碼至少部分的經改變免疫球蛋白。
[0366]插入的遺傳物質在轉基因動物中表達，導致生成至少部分由插入的人免疫球蛋白遺傳物質衍生的免疫球蛋白。發現遺傳物質在轉基因動物中發生重排，使得可以產生部分由插入的遺傳物質衍生的免疫球蛋白集合，甚至有時插入的遺傳物質以錯誤位置或錯誤幾何學摻入種系也如此。
[0367]可以以DNA的形式將插入的遺傳物質克隆到原核載體中，諸如質粒和/或粘粒。使用酵母人工染色體載體(Burke等人，1987 ;本文收入作為參考)，或者通過導入染色體片段(Richer和Lo，1989 ;本文收入作為參考)，可以插入較大的DNA片段。可以以傳統方式將插入的遺傳物質導入宿主，例如通過注射或其它程序引入受精卵或胚胎干細胞。
[0368]在優選方面，可利用最初不攜帶編碼免疫球蛋白恒定區的遺傳物質的宿主動物，使得產生的轉基因動物在產生免疫球蛋白時將只使用所插入的人遺傳物質。這可以通過使用天然存在的缺乏相關遺傳物質的突變宿主，或者通過人為制備突變體(如在細胞系中產生最終除去了相關遺傳物質的宿主)來實現。
[0369]當宿主動物攜帶編碼免疫球蛋白恒定區的遺傳物質時，轉基因動物將攜帶天然存在的遺傳物質和所插入的遺傳物質，并將產生由天然存在的遺傳物質、插入的遺傳物質、和這兩種遺傳物質的混和物衍生的免疫球蛋白。在這種情況中，可以通過篩選由轉基因動物衍生的雜交瘤來獲得期望的免疫球蛋白，如利用抗體基因表達的等位基因排斥或差異染色體丟失現象。
[0370]一旦制備了合適的轉基因動物，即可簡單地用期望免疫原免疫動物。根據插入物質的性質，動物可能產生嵌合免疫球蛋白，如混和小鼠/人起源的免疫球蛋白，其中外源遺傳物質只編碼免疫球蛋白一部分；或者，動物可能產生完全外來的免疫球蛋白，如完全人起源的免疫球蛋白，其中外源遺傳物質編碼整個免疫球蛋白。
[0371]可以由免疫后的轉基因動物產生多克隆抗血清。可以由動物獲得免疫球蛋白生成細胞來產生感興趣的免疫球蛋白。優選由轉基因動物產生單克隆抗體，如融合來自該動物的脾細胞與骨髓瘤細胞，并篩選產生的雜交瘤以選擇產生期望抗體的雜交瘤。本文描述了用于這些過程的適用技術。
[0372]在另一種方法中，可以以這樣一種方式將遺傳物質摻入動物，使得在體液(諸如血清或動物的外部分泌物，諸如乳汁、初乳、或唾液)中產生期望抗體。例如，在體外將編碼至少部分的人免疫球蛋白的遺傳物質插入編碼乳蛋白的哺乳動物基因，然后通過如注射將該基因導入哺乳動物受精卵，由此卵可能發育成產生乳汁的成年雌性哺乳動物，乳汁中包含至少部分由插入的人免疫球蛋白遺傳物質衍生的免疫球蛋白。然后可以由乳汁收獲期望抗體。本領域技術人員知道用于進行這些過程的適用技術。
[0373]通常采用上述轉基因動物來產生單一同種型的人抗體，更具體的說是B細胞成熟必需的同種型，諸如IgM，可能還有IgD。用于產生人抗體的另一種優選方法是使用美國專利號 5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016、和 5，770，429 (本文收入作為參考)中描述的技術，其中轉基因動物據描述能夠由B細胞發育需要的同種型轉變成其它同種型。
[0374]在B淋巴細胞的發育過程中，細胞最初產生IgM，其結合特異性由有效重排的Vh和Vl區決定。隨后，每個B細胞及其后代合成具有相同L和H鏈V區的抗體，但是它們可能轉變H鏈的同種型。μ或δ恒定區的使用很大程度上是通過改變剪接決定的，使得IgM和IgD在單個細胞中共表達。其它重鏈同種型U、α、和ε)只在基因重排事件刪除了 Cy和C5外顯子后天然表達。這一基因重排過程，稱為同種型轉變，通常通過位于緊鄰每個重鏈基因(除了 5)上游的所謂轉變片段之間的重組而發生。各個轉變片段的長度為2-10kb，主要由短重復序列組成。
[0375]由于這些原因，優選轉基因在用來進行同種型轉變的每個轉變區上游大約l_2kb內摻入轉錄調控序列。這些轉錄調控序列優選包括啟動子和增強子元件，更優選包括與轉變區天然相連(即存在于種系結構中)的5’側翼(即上游)區。雖然來自一個轉變區的5’側翼區可以可操作連接用于轉基因構建的不同轉變區，但是在一些實施方案中，優選轉基因構建物中摻入的每個轉變區具有在天然種系結構中緊接著上游的5’側翼區。涉及免疫球蛋白轉變區序列的序列信息是知道的(Mills等人，1990 ；Sideras等人，1989 ;本文收入作為參考)。
[0376]在美國專利號5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016、和5，770，429描述的方法中，轉基因動物所含的人免疫球蛋白轉基因在B細胞發育的整個途徑中正確發揮功能，導致同種型轉變。因此，在這種方法中，構建這些轉基因來產生同種型轉變和下列一項或多項:(I)高水平和細胞類型特異性表達，(2)功能性基因重排，(3)等位基因排斥的應答和激活，⑷足夠大的初級庫的表達，(5)信號轉導，(6)體細胞超突變，和
(7)免疫應答過程中轉基因抗體基因座的顯性化。
[0377]對轉基因功能的重要要求是產生的初級抗體庫的多樣性足以觸發針對廣泛抗原的再次免疫應答。重排的重鏈基因包含信號肽外顯子、可變區外顯子、和一列串聯的多結構域恒定區(其中的每一個都由幾個外顯子編碼)。每個恒定區基因編碼不同種類免疫球蛋白的恒定部分。在B細胞發育過程中，刪除了 V區近端恒定區，導致重鏈新類型的表達。對于每類重鏈，RNA剪接的不同模式產生跨膜的和分泌的免疫球蛋白二者。
[0378]人重鏈基因座包含大約200個V基因片段，跨越2Mb ;大約30個D基因片段，跨越大約40kb ;6個J片段，群集于大約3kb內；和9個恒定區基因片段，跨越大約300kb。整個基因座在14號染色體長臂遠端部分跨越大約2.5Mb。包含所有6種已知Vh家族成員，D和J基因片段，以及μ、δ、^3、^1、和α I恒定區的重鏈轉基因片段是知道的(Berman等人，1988 ;本文收入作為參考)。相似地構建了包含來自人輕鏈基因座的所有必需基因片段和調控序列的基因組片段。
[0379]成功重排的免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因的表達常常通過在轉基因非人動物中抑制內源免疫球蛋白基因的重排而具有顯性效果。然而，在某些實施方案中，期望達到內源Ig基因座的完全滅活，使得不能通過例如轉基因與內源Ig序列之間的轉變而形成包含人可變區和非人(如鼠)恒定區的雜合免疫球蛋白鏈。使用胚胎干細胞技術和同源重組，可以容易的消除內源免疫球蛋白庫。例外，可以使用多種技術(諸如反義技術)來實現內源Ig基因的抑制。
[0380]在本發明的其它方面,可能期望產生反式轉變的(trans-switched)免疫球蛋白。包含這些嵌合的反式轉變免疫球蛋白的抗體可用于期望具有非人(如鼠)恒定區的多種應用中，如用于在宿主中保留效應物功能。鼠恒定區的存在相對于人恒定區能夠提供優勢，例如提供鼠效應物功能(如ADCC、鼠補體固定)，從而能夠在小鼠疾病模型中檢驗這種嵌合抗體。在動物檢驗后，可以通過如由來源(雜交瘤克隆)進行PCR擴增或cDNA克隆來分離人可變區編碼序列，并剪接成編碼期望的人恒定區的序列，編碼更適合于人治療性用途的人序列抗體。
[0381]E4.人源化抗體(humanized antibody)
[0382]人抗體用于人的治療通常具有至少3個潛在優勢。第一，因為效應物部分是人的，所以它與人免疫系統其它部分的相互作用可能更好，如通過依賴補體的細胞毒性(CDC)或依賴抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)更有效的破壞靶細胞。第二，人免疫系統不會將抗體識別成外來物質。第三，人體循環中的半衰期將與天然產生的人抗體相似，使得所需劑量較小，給藥頻率較低。
[0383]本文提供了用于制備人抗體的多種方法。除了人抗體，“人源化”抗體也具有許多優勢。“人源化”抗體通常是來自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或其它物種并包含人恒定區和/或可變區結構域或特定變化的嵌合或突變單克隆抗體。本領域技術人員眾所周知用于產生所謂的“人源化”抗VEGF抗體的技術。
[0384]人源化抗體也享有上述優勢。第一，效應物部分仍是人的。第二，人免疫系統不會將框架或恒定區識別成外來的，因此針對這種注射抗體的抗體應答應當比針對完全外來的小鼠抗體的低。第三，與注射的小鼠抗體相反，注射的人源化抗體的半衰期與天然產生的人抗體大概更相似，也使得所需劑量較小且頻率較低。
[0385]已經描述了用于產生人源化抗體的大量方法。可以利用通過二硫鍵結合在一起的抗體結構域的受控重排，形成新的人造蛋白質分子或“嵌合”抗體(Konieczny等人，1981 ；本文收入作為參考)。重組DNA技術也可以用于構建編碼小鼠抗體輕鏈和重鏈可變結構域與人抗體輕鏈和重鏈恒定結構域的DNA序列之間的融合基因(Morrison等人，1984 ;本文收入作為參考)。
[0386]可以通過分子方法將編碼鼠單克隆抗體抗原結合部分或互補決定區(OTR)的DNA序列移植到編碼人抗體重鏈和輕鏈框架的DNA序列中(Jones等，1986 ；Riechmann等人，1988 ;各自引入本文作為參考)。表達的重組產物稱為“重塑(reshaped)”或人源化抗體，其包含人抗體輕鏈和重鏈的框架和鼠單克隆抗體的抗原識別部分CDR。
[0387]美國專利號5，639，641描述了用于產生人源化抗體的另一種方法，本文收入作為參考。這種方法經重新鋪面(resurfacing)提供了因可變區展現人表面而具有改進的治療功效的人源化嚙齒類抗體。在這種方法中:(I)產生抗體重鏈和輕鏈可變區群的位置比對，給出一組重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露位置，其中所有可變區的比對位置至少大約98%是相同的；(2)對嚙齒類抗體(或其片段)確定一組重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露氨基酸殘基；(3)鑒定與該組嚙齒類表面暴露氨基酸殘基最近似相同的一組重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露氨基酸殘基；(4)用步驟(3)中鑒定的重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露氨基酸殘基組替代步驟(2)中確定的重鏈和輕鏈可變區框架表面暴露氨基酸殘基組，不作改變的是距嚙齒類抗體互補決定區的任何殘基的任何原子5人以內的那些氨基酸殘基；和(5)產生具有結合特異性的人源化嚙齒類抗體。
[0388]美國專利號5，693，762,5, 693，761,5, 585，089、和 5，530，101 描述了用于產生人源化抗體的類似方法，本文收入作為參考。這些方法涉及產生具有來自供者免疫球蛋白的一個或多個互補決定區(CDR)和可能的額外氨基酸以及來自人受者免疫球蛋白的框架區的人源化免疫球蛋白。每一條人源化免疫球蛋白鏈除了 CDR之外，通常還包含來自能夠與該CDR相互作用而發揮結合親和力的供者免疫球蛋白框架的氨基酸，諸如與免疫球蛋白供者內CDR緊鄰或者據分子模擬預測相距大約3Λ以內的一個或多個氨基酸。重鏈和輕鏈都可以通過使用美國專利號5， 693，762,5, 693，761,5, 585，089、和5，530，101 (本文收入作為參考)描述的多種位置標準中的任一項、任意組合、或所有標準來進行設計。當組合形成完整抗體時，人源化免疫球蛋白在人中基本上沒有免疫原性，并基本上保留與免疫球蛋白供者相同的針對原始抗原的親和力。
[0389]美國專利號5，565，332和5，733，743描述了用于產生人源化抗體的另一種方法，本文收入作為參考。這種方法將人源化抗體的概念與也在本文詳細描述的噬菌粒文庫結合起來。一般地說，這種方法利用來自針對感興趣抗原的抗體或抗體群的抗原結合位點的序列。由此，對于單一的嚙齒類抗體，可以將包含抗體中部分抗原結合位點的序列與能夠在組合時產生完整抗原結合位點的人抗體序列多樣性文庫聯合起來。
[0390]由這一方法產生的抗原結合位點與由⑶R移植產生的不同，其中只有原始嚙齒類抗體的部分序列有可能以相似方式接觸抗原。選擇的人序列有可能在序列和與抗原的接觸方面與最初的結合位點不同。然而，由部分原始序列與抗原的結合和抗原及其抗原結合位點的形狀造成的約束，有可能驅動人序列與抗原的相同區域或表位的新接觸。這一過程因此稱為“表位蓋印選擇” (epitope imprinted select1n, EIS)。
[0391]由動物抗體開始，一種方法可以選擇出對部分人源抗體。這些抗體可能與人抗體在序列方面足夠相似，可直接或在改變少數關鍵殘基后用于治療。可以通過各個殘基的定點誘變或通過整個環的CDR移植來取代那些與人序列殘基不同的殘基，從而將選定抗體的嚙齒類成分與人序列殘基之間的序列差異降至最低。然而，也可以產生完全為人序列的抗體。EIS由此提供了用于產生可相應地與動物或部分人源抗體結合相同表位的部分人源或完全人源抗體的方法。在EIS中，可以將抗體片段庫展示在絲狀噬菌體表面，并通過噬菌體與抗原的結合來選擇具有抗原結合活性的片段的編碼基因。
[0392]美國專利號5，750，078、5，502，167、5，705，154、5，770，403、5，698，417、5，693，493,5, 558，864,4, 935，496、和4，816，567描述了在本發明中試圖用于使抗體人源化的其它方法，本文收入作為參考。
[0393]E5.經 PCR? 的誘變
[0394]定點誘變是一種有用的技術，可通過其DNA的特異性誘變而用于制備各種抗體。通過將一個或多個核苷酸序列變化導入DNA，本技術還能夠容易的用于制備并檢驗體現了一個或多個上述考慮的序列變體。
[0395]雖然有許多方法適用于誘變，但是目前通常優選使用聚合酶鏈反應(PCR?)。此技術提供了快速、有效的將期望突變導入給定DNA序列中的方法。下文具體描述了如何使用PCR?將點突變導入序列中，這可以用于改變由給定序列編碼的氨基酸。此方法經改動也適于將限制性酶切位點導入DNA分子。
[0396]在此方法中，可將合成的寡核苷酸設計成能在擴增片段的一端摻入點突變。PCR?之后，通過用Klenow片段處理使擴增片段成為平端，然后連接平端化片段并亞克隆至載體中以便于序列分析。
[0397]為了制備期望誘變的模板DNA，可使用待突變區側翼的限制性位點將DNA亞克隆至高拷貝數的載體，如PUC19中。然后使用質粒微量制備法制備模板DNA。使用自動合成儀合成適當的寡核苷酸引物，該引物基于親本序列，但含有期望的點突變，其5’端側翼是限制性酶位點。通常要求引物與模板DNA有大約15個堿基是同源的。可通過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化引物，但用于PCR?中時，并不絕對需要這么做。然后，應使寡核苷酸的5’末端磷酸化。
[0398]應使用含有期望點突變的寡核苷酸引物，通過PCR?擴增模板DNA。擴增緩沖液中的MgCl2濃度通常為大約15mM。通常應如下進行大約20-25輪PCR?循環:95°C變性35秒；50°C雜交2分鐘；72°C延伸2分鐘。PCR?通常包括于72°C最后一次延伸循環約10分鐘。在最后的延伸步驟之后，應在反應混合物中加入約5個單位的Klenow片段，于約30°C再保溫15分鐘。需要有Klenow片段的外切核酸酶活性，以使末端成為平端并適于平端克隆。
[0399]通常通過非變性的瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分析得到的反應混合物，以證實擴增已產生預定的產物。可通過除去大多數礦物油，用氯仿抽提以除去殘留的油，用經緩沖的酚抽提，然后用100%乙醇沉淀濃縮來處理反應混合物。接著，用能夠切割寡核苷酸側翼序列的限制性酶消化大約一半的擴增片段。在低融點瓊脂糖凝膠上純化經消化的片段。
[0400]為了亞克隆片段和檢查點突變，可通過平端連接將兩種擴增片段亞克隆至經適當消化的載體中。然后用于轉化大腸桿菌，隨后使用微量制備法從中制備質粒DNA。通過DNA測序分析質粒DNA中的擴增部分以確認產生了正確的點突變。這一點至關重要，因為TaqDNA聚合酶會將額外的突變導入DNA片段。
[0401]使用依次PCR?步驟也可實現點突變的導入。在此程序中，使包含突變的兩種片段互相退火，并通過相互引發的合成而延伸。然后通過第二個PCR?步驟擴增此片段，從而避免了上述方案中需要的平端連接。在此方法中，如上所述進行模板DNA的制備、寡核苷酸引物的產生、和第一次PCR?擴增。然而，在此方法中，選定的寡核苷酸與模板DNA應有大約15-大約20個堿基的一段序列是同源的，它們互相之間還必須重疊大約10個堿基或更多。
[0402]在第二次PCR?擴增中，可使用各個擴增片段和各個側翼序列引物，并使用上述條件進行大約20-25輪PCR?循環。可使用上述步驟再次亞克隆片段并檢查點突變是否正確。
[0403]在使用上述任一方法時，通常優選通過擴增盡可能小的片段來導入突變。當然，也應仔細考慮如寡核苷酸的解鏈溫度這樣的參數，該參數通常受寡核苷酸的GC含量和長度的影響。本領域技術人員眾所周知這些方法的實施及其優化(必要時)，多種出版物進一步描述了有關內容，如《分子生物學現行方案》(Current Protocol in Molecular B1logy)(1995,本文收入作為參考)。
[0404]當進行定點誘變時，可以采用表A作為參考。
[0405]表A
[0406]
【權利要求】
1.純化的抗體或其抗原結合片段、或該抗體或其抗原結合片段的免疫綴合物，其中所述抗體是保藏為ATCC PTA 4545的單克隆抗體3G4或嵌合抗體，所述嵌合抗體中保藏為ATCC PTA 4545的單克隆抗體3G4的抗原結合片段可操作性地附著了人抗體的恒定區。
2.權利要求1的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體，所述嵌合抗體中保藏為ATCCPTA4545的單克隆抗體3G4的抗原結合片段可操作性地附著了人抗體的恒定區。
3.包含純化的抗體或其抗原結合片段、或該抗體或其抗原結合片段的免疫綴合物的組合物，其中所述抗體是保藏為ATCC PTA 4545的單克隆抗體3G4或嵌合抗體，所述嵌合抗體中保藏為ATCC PTA 4545的單克隆抗體3G4的抗原結合片段可操作性地附著了人抗體的恒定區。
4.權利要求3的組合物，其中所述抗體是雙特異性抗體、重組抗體或基因工程化抗體或者其抗原結合片段。
5.權利要求3的組合物,其中所述抗體是scFv、Fv、Fab’、Fab二聚體、二體、線性抗體或抗體的F(ab’)2抗原結合片段，或者CDR、單價片段、駱駝源化或單一結構域抗體。
6.權利要求3的組合物，其中所述抗體是嵌合抗體，所述嵌合抗體中保藏為ATCCPTA4545的單克隆抗體3G4的抗原結合片段可操作性地附著了人抗體的恒定區。
7.權利要求3-6中任一項的組合物，其中所述抗體可操作性地附著了生物學試劑、治療劑或診斷劑。
8.權利要求7的組合物，其中所述抗體可操作性地附著了細胞毒素、化療劑、放療劑、抗血管發生劑、凋亡誘導 劑、類固醇、抗代謝物、抗微管蛋白藥、考布司汀、抗生素、細胞因子、烷化劑或凝血劑。
9.權利要求7的組合物，其中所述抗體可操作性地附著了體內診斷劑，所述體內診斷劑是使用非侵入式成像可檢測的。
10.權利要求9的組合物，其中所述抗體可操作性地附著了順磁性的、X射線成像的或放射性的同位素。
11.權利要求9的組合物，其中所述抗體可操作性地附著了銦m、碘125、碘131、鎵68、锝99m、或釓。
12.權利要求3-11中任一項的組合物，其中所述組合物是藥學上可接受的組合物。
13.權利要求3-11中任一項的組合物，其中所述組合物是氣霧組合物。
14.權利要求3-11中任一項的組合物，其中所述組合物是脂質體或納米顆粒組合物。
15.權利要求14的組合物，其中所述組合物是隱蔽的或PEG化的脂質體組合物，其上包被了所述抗體或其抗原結合片段或免疫綴合物。
16.權利要求15的組合物，其中所述隱蔽的或PEG化的脂質體還包含額外的治療劑。
17.權利要求3-16中任一項的組合物，其中所述組合物還包含額外的生物學試劑、治療劑或診斷試劑。
18.權利要求17的組合物，其中所述額外的治療劑是抗血管發生劑或抗癌劑。
19.權利要求18的組合物，其中所述額外的治療劑是細胞毒素、化療劑、放療劑、抗血管發生劑、酪氨酸激酶抑制劑、凋亡誘導劑、類固醇、抗代謝物、葉酸類似物、抗微管蛋白藥、拓撲異構酶抑制劑、紫杉烷、考布司汀、嘧啶類似物、抗生素、鉬配位復合物、細胞因子、烷化劑或凝血劑。
20.權利要求18的組合物，其中所述額外的治療劑是多西他賽、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、伊立替康、順鉬或碳鉬。
21.可檢測地標記的肽，其包含可操作性地附著了體內診斷劑的耐久霉素肽，所述體內診斷劑是使用非侵入式成像可檢測的。
22.權利要求21的可檢測地標記的肽，其中所述體內診斷劑是锝99m。
23.包含可檢測地標記的肽的組合物，所述可檢測地標記的肽包含可操作性地附著了體內診斷劑的耐久霉素肽，所述體內診斷劑是使用非侵入式成像可檢測的。
24.權利要求23的組合物，其中所述體內診斷劑是使用核磁成像裝置可檢測的。
25.權利要求23的組合物，其中所述體內診斷劑是使用Y閃爍相機或檢測儀可檢測的。
26.權利要求23的組合物，其中所述體內診斷劑是順磁性的、X射線成像的或放射性的同位素。
27.權利要求23的組合物，其中所述體內診斷劑是銦m、碘125、碘131、锝99m、釓或鎵。
28.權利要求27的組合物，其中所述體內診斷劑是锝99m。
29.權利要求3-20中任一項的組合物，用于治療中。
30.權利要求3-20中任一項的組合物，用于抑制血管發生。
31.權利要求3-20中任一項的組合物，用于治療癌癥。
32.權利要求3-20中任一項的組合物，用于與化療或放療聯合治療癌癥。
33.權利要求3-6、9-11或23-28中任一項的組合物，用于成像或診斷。
34.權利要求3-20中任一項的組合物在制備用于通過抑制血管發生而治療或預防疾病的藥物中的用途。
35.權利要求34的用途，其中所述藥物可用于治療或預防黃斑變性、關節炎、類風濕關節炎、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網膜病、甲狀腺增生、格雷夫斯病、血管瘤、新生血管性青光眼、或牛皮癬。
36.權利要求3-20中任一項的組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
37.權利要求3-20中任一項的組合物在制備可用于與化療或放療聯合治療癌癥的藥物中的用途。
38.權利要求9-11或23-28中任一項的組合物在制備用于成像或診斷與細胞表面存在的氨基磷脂相關聯的疾病或病癥的藥物中的用途。
39.權利要求38的用途，其中所述藥物包含權利要求9-11中任一項的組合物，所述組合物用于成像或診斷疾病或病癥，在所述疾病或病癥中，在疾病位點的細胞在細胞表面表達氨基磷脂、磷脂酰絲氨酸。
40.權利要求38的用途，其中所述藥物包含權利要求23-28中任一項的組合物，所述組合物用于成像或診斷疾病或病癥，在所述疾病或病癥中，在疾病位點的細胞在細胞表面表達氨基磷脂、磷脂酰乙醇胺。
41.權利要求38的用途，其中所述疾病是癌癥。
42.權利要求38的用途，其中所述疾病是病毒感染疾病。
43.權利要求38的用途，其中所述疾病是血栓癥、肺栓塞、心肌梗死或動脈粥樣硬化。
44.權利要求43的用途，其中所述疾病是心肌梗死。
【文檔編號】A61P9/10GK104130327SQ201210153265
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2003年7月15日 優先權日:2002年7月15日
【發明者】P·E·索普, M·M·蘇亞雷斯, 黃賢明, 何進, S·蘭 申請人:得克薩斯大學體系董事會