專利名稱：植物類抗癌靶向納米制劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域，具體是涉及ー種植物類抗癌靶向納米制劑及其制備方法。
背景技術：
植物類藥物中的紫杉醇、多西紫杉醇屬于廣譜抗癌藥，已廣泛用于治療乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤。在應用過程中這類抗癌藥主要面臨的問題包括溶解度低，毒副作用高，生物利用率低，易產生抗藥性等。為了解決溶解度低的問題，這類藥的傳統制劑需要大量使用增溶劑如聚氧こ烯蓖麻油。然而，該輔料不僅可以引起許多副反應，如血管舒張，血壓過低，呼吸困難，以及嚴重過敏等癥狀，而且，該輔料也不具備對癌細胞的靶向性，抗癌藥的生物利用度低下，輔料的毒副作用極為顯著。為了解決輔料毒副作用的問題，人們發明了納米給藥系統，如紫杉醇的蛋白給藥系統和脂質體給藥系統(US Patent 6，096，331，US Patent 5，916，596)。這類納米給藥系統利用紫杉醇和載體的疏水作用，形成納米小球，以增加紫杉醇的溶解性；由于載體白蛋白和脂質體的生物相容性，在紫杉醇注射過程中對人體不產生任何毒副作用，因而減小了病人由于輔料的毒副反應所承受的痛苦。由于這類載體的平均粒徑在130-150納米之間，表面的親水基團不豐富，它們在體內循環過程中易被網狀內皮系統中的單核巨噬細胞系統吞噬和清除，然后導向肝、脾、肺、骨髓等單核巨噬細胞系統(MPS)，同時，在這些器官中也可通過EPR (Enhanced Permeability retention)增強滲透和保留作用聚集，因此,現有的納米抗癌藥給藥系統不僅可以增加抗癌藥的溶解度，而且對肝、肺等巨噬細胞豐富的器官有一定的靶向性。這類通過EPR作用的靶向性被稱之為被動靶向。以紫杉醇/白蛋白納米給藥系統為例，這個系統是由白蛋白與紫杉醇結合形成的納米微粒，這些微粒的大小大在100到150納米之間，只有人體紅細胞的百分之一。在制備過程中，紫杉醇溶于有機溶劑如三氯甲烷，在高壓均質條件下紫杉醇溶液與白蛋白溶液共混，通過與白蛋白結構中的疏水部分結合形成疏水的內核，白蛋白的親水部位則將其疏水內核包裹，形成一個保護層起到穩定所包裹的藥物和納米顆粒的作用。在系統給藥時，由于體內單核巨噬細胞的吞噬作用，紫杉醇/白蛋白納米粒在體內循環過程中逐步累積到肝，肺，脾等部位，因此，其對這些部位的腫瘤細胞有較好的被動靶向治療作用；然而，對其它部位如乳腺等部位則其靶向效果并不好；此外，紫杉醇和白蛋白主要是通過疏水作用形成復合物，當其被注射到體內后，由于體內存在大量的白蛋白，體內的白蛋白很容易置換結合在納米粒中的紫杉醇；復合物中的紫杉醇也可以迅速與體內的白蛋白結合，因為正常細胞既可以吞噬普通的白蛋白，也可以吞噬帶有紫杉醇的的白蛋白，所以，紫杉醇/白蛋白復合物對正常細胞的毒性也會較高。紫杉醇/脂質體納米給藥體系通過脂質體對紫杉醇的包埋，增加紫杉醇的溶解度，在注射過程中由于脂質體的生物相容性，對病人產生的毒副作用較小。然而，在體內脂 質體立即與紫杉醇分離，紫杉醇與體內的白蛋白結合。與聚氧こ烯蓖麻油比較，雖然兩者都可増加紫杉醇的溶解度，藥物動力學相似，但是脂質體的毒副作用則比后者大幅降低。從上面的描述可以看到，已有的抗癌藥給藥系統的主要缺點為1、載體在體內不穩定，如脂質體在體內很快分散，抗癌藥與體內的循環系統中的白蛋白結合，這樣載體實際上只起到對抗癌藥增溶的作用而在體內不能起到藥物的載體和載體的靶向的作用；2、被動革巴向性由于載藥納米粒子的大小在100到150納米之間,在體內循環過程中，大部分載藥納米粒子很容易被體內單核巨噬細胞所吞噬，在肝、脾、肺等組織內聚集，對這些組織內的腫瘤有較好的療效作用，但對其它部位的腫瘤則療效有限；3、抗癌藥不能與載體形成穩定的復合物，藥物容易游離到血液中與其中的白蛋白結合；4、納米抗癌藥在體外的溶液中的穩定性只有數小時到一天的時間，抗癌藥與白蛋白形成的復合物緩慢解離。
發明內容
本發明的目的之ー是提供ー種植物類抗癌靶向納米制劑，該植物類抗癌靶向納米制劑穩定性好，并具有生物靶向性。 實現上述目的的技術方案如下ー種植物類抗癌靶向納米制劑，其重量百分比的組成如下人血白蛋白43 — 60% ；植物類抗癌藥物I. 5 — 7. 5% ;分子量為3000-1. 8xl06Da 的透明質酸24 — 40% ；納米粒子穩定劑3· 5 — 15%，其余組分為水(通常為I — 10%),構成總和為100%。優選地，所述植物類抗癌靶向納米制劑，其重量百分比的組成如下人血白蛋白45 — 50% ；植物類抗癌藥物4 一 5% ；分子量為3000-1. 8xl06Da 的透明質酸32 — 38% ；納米粒子穩定劑5 — 7%，其余組分為水(通常為1_7%)。優選地，所述透明質酸的分子量為5000-2. OxlO5Da0優選地，所述納米粒子穩定劑是d-α生育酚琥珀酸聚こニ醇酯(TPGS)、ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0嵌段共聚物或PVP。這些聚合物的疏水部分與紫杉醇、多西紫杉醇結合并進入白蛋白的疏水區域，親水部分則在白蛋白表面形成ー層親水層，起到穩定白蛋白和紫杉醇所形成的復合物的作用。優選地，所述植物類抗癌藥物是紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿及其衍生物。靶向分子透明質酸既可以通過非共價鍵與白蛋白形成復合物起到靶向作用，也可以通過共價鍵與白蛋白形成共軛物起到靶向作用。通過共價鍵制備靶向分子和藥物載體的共軛物有兩種エ藝可以使用，其中先制備靶向分子的活性酷再將靶向分子接到藥物載體上比直接通過偶聯將靶向分子接到藥物載體上反應更利于控制，所形成的共軛物是由靶向分子和白蛋白通過酰胺鍵形成的而非白蛋白上的氨基和羧基通過酰胺鍵形成的。本發明的另ー目的是提供上述植物類抗癌靶向納米制劑的制備方法。實現上述目的的技術方案如下植物類抗癌靶向納米制劑的制備方法，包括以下步驟
(I)制備透明質酸-白蛋白共軛物將透明質酸和人血白蛋白加入到無菌水中溶解，調節溶液pH為5. 0-6.0，將1-2倍透明質酸摩爾數的EDCI (I-こ基-3-(3-ニ甲胺丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽)加入到上述溶液中，在室溫下攪拌過夜，反應完畢后，透析除去未鍵合的透明質酸、未反應的EDCI和EDCI的反應產物，冷凍干燥后用PBS緩沖液溶解得到人血白蛋白/透明質酸溶液；或將透明質酸完全溶于O. IM的MES(2-(N-嗎啡啉)こ磺酸)緩沖液中，然后加入的偶聯劑EDCI和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫下攪拌反應，得到透明質酸琥珀酰亞胺活性脂；再將透明質酸琥珀酰亞胺活性脂加入到人血白蛋白的水溶液中，調節溶液PH 7.0-7. 5，室溫下攪拌反應；反應完畢后透析除去未反應的原料和反應副產物，冷凍干燥后，得透明質酸-人血白蛋白共軛物；將透明質酸-人血白蛋白共軛物用PBS緩沖液溶解，得到人血白蛋白/透明質酸溶液；或將人血白蛋白凍干粉，透明質酸溶于PBS緩沖液中，得到人血白蛋白/透明質酸溶 液；(2)配制植物類抗癌藥溶液將植物類抗癌藥物和納米粒子穩定劑溶于有機溶劑中，得到抗癌藥溶液；( 3 )在高速均質、高壓均質或超聲處理條件下，將上述抗癌藥溶液加入到人血白蛋白/透明質酸溶液中，然后除去有機溶劑；過濾冷凍干燥得到植物類抗癌靶向納米制劑。在其中一些實施例中，所述有機溶劑為ニ氯甲烷、氯仿、ニ氯甲烷與こ醇混合物、或氯仿與こ醇混合物。更優選地，所述有機溶劑為氯仿或こ醇與氯仿的混合物。步驟(3)中，通過旋轉蒸發儀加熱至30_45°C減壓蒸發除去有機溶剤。本發明的發明人通過大量實驗發現，透明質酸與白蛋白既可以通過離子鍵和高分子鏈間的鏈纏結作用形成高分子的絡合物，又可以通過共價鍵形成更為穩定的共軛聚合物，透明質酸在納米粒子的表面形成ー層親水層，以避免納米材料中的白蛋白與血液中的人血白蛋白發生作用，同時避免納米粒子被循環系統中的巨噬細胞所吞噬。人血白蛋白、抗癌藥和納米穩定劑通過特定的エ藝和制備條件形成緊密和穩定的疏水納米核心，在優選的エ藝條件采用高壓均質的方法可制得的粒徑在IOOnm左右的靶向納米制劑。我們選用透明質酸另ー個原因是因為HA是自然發生的生物聚合物，在我們的身體的許多器官中都有它的存在。HA具有生物相容性和生物可降解性而且是細胞外基質的主要組成之一。⑶44是HA在細胞表面的主要受體，它在上皮細胞，造血細胞和神經元細胞等正常細胞上分布較少，而在癌細胞如淋巴癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞和肺癌細胞上則過分表達。因此，癌細胞對HA的親和作用和細胞吞噬作用則遠遠高于正常細胞。因此,我們可以利用HA對癌細胞表面上的CD44的特異結合，以HA為靶向分子，以CD44為受體，設計出對癌細胞具有生物靶向性的納米釋藥載體。為了解決已有釋藥系統的問題，本發明設計的釋藥體系具備以下的組分和結構I、藥物載體如人血白蛋白，既能用于藥物的包埋并通過形成納米材料增加藥物的溶解性，延長藥物在體內的循環，又能與靶向分子結合，形成穩定的復合物；2、靶向分子如透明質酸，用于目標腫瘤細胞表面的受體如CD44的生物靶向，同時在白蛋白載體表面形成ー層親水的凝膠層，既保護納米粒子不被體內單核細胞吞噬，阻擋載藥納米粒子與體內游離的白蛋白作用，防止抗癌藥被游離的白蛋白置換，又可作為藥物分子通過擴散和溶解機制逃離納米粒子的最后一道屏障；3、納米粒子穩定劑，如疏水分子膽固醇，ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0崁段聚合物，d-α生育酚琥珀酸聚こニ醇酷、PVP等，這類分子不僅可以通過疏水作用輔助抗癌藥入紫杉醇與白蛋白形成穩定的復合物，也可以利用其親水高分子鏈防止循環系統中的白蛋白接近靶向納米粒子以減少抗癌藥被置換；4、抗癌藥如紫杉醇，多西紫杉醇，喜樹堿等；5、靶向納米粒子粒徑等于或者小于100納米以逃過體內網狀內皮系統，避免在肝區、肺、脾等器官遭到攔截，以延長納米載藥系統在體內的循環時間以利于靶向納米抗癌藥在腫瘤部位的生物靶向性及累積。本發明所述的植物類抗癌靶向納米制劑，其具有以下的優點1、藥物納米體系在體內環境中穩定，載體和藥物能形成良好的復合體；2、載體的靶向性應是主動靶向即載體表面的生物靶向分子能與腫瘤細胞上的特異受體結合形成生物靶向性，而非被動靶向性；3、納米粒子的粒徑小于或者略大于100納米，有利于納米粒子在體內循環系統中進行較長時間循環而不被單核巨噬細胞吞噬和被肝臟內的網狀系統攔截；4、納米抗癌藥在溶液中的穩定性好，適于在溶液狀態下長期保存，即載體和抗癌藥能夠形成穩定的復合物。
圖I是本發明的的實施例14靶向納米制劑的穩定性比較結果示意圖；圖2是本發明的實施例14的靶向納米制劑的生物靶向性比較結果示意圖；圖3是本發明的實施例14的靶向納米制劑對腫瘤的抑制作用比較結果示意圖；圖4是實施例11、實施例17靶向納米制劑與泰帝素；羥基喜樹堿注射液與穩定性比較結果示意圖；圖5是實施例11、實施例17靶向納米制劑對腫瘤的抑制作用比較結果示意圖；圖6是實施例11、實施例17靶向納米制劑的生物靶向性比較結果示意圖。
具體實施例方式白蛋白和透明質酸在特定酸堿條件下入pH 3-7可以通過相互間的離子鍵及范德華カ形成穩定的復合物或者通過脂質酸上的羧基和白蛋白上的自由氨基脫水形成酰胺鍵形成共軛物。然后加入抗癌藥如紫杉醇、多稀紫杉醇和納米材料穩定劑如膽固醇再調控溶液的酸堿度和溫度通過納米粒子核心的白蛋白變性使上數種組分形成一個緊密的疏水的納米核心及一個親水的外殼。這個緊密的核心有助于抗癌藥的包埋和避免抗癌藥的游離出納米球；親水的透明質酸層則既可以避免納米粒子被循環體系中的巨噬細胞吞噬，又可以靶向腫瘤細胞表面的CD44受體。本發明所用的白蛋白為注射用人血白蛋白，購自安普萊士，上海萊士血制品有限公司。使用前透析除去產品中的添加剤，冷凍干燥得不含添加劑的白蛋白。以下通過具體實施例對本發明進行進一歩的闡述。實施例I制備紫杉醇/TPGS/透明質酸/白蛋白納米制劑(I)將500mg人血白蛋白凍干粉，500mg分子量5000Da的透明質酸溶于20mLPBS緩沖液中；調整溶液的PH為5. 5，得到白蛋白/透明質酸溶液；(2)將50mg的紫杉醇，50mgTPGS溶于ImL的氯仿中；在攪拌條件下將紫杉醇溶液加入到上述白蛋白/透明質酸溶液中，形成初乳；(3)初乳在高壓均質機(9000-40000psi)處理下得到納米乳劑，納米乳劑轉入旋轉蒸發儀在30-45°C減壓蒸發快速除去有機溶劑，無菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末；凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下穩定時間小于10小吋。經納米激光粒度儀測定，通過上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在160納米。實施例2制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑(I)稱取500mg人血白蛋白凍干粉，溶于20mL無菌水中；加400mg分子量為5KDa的透明質酸到白蛋白溶液中，在充分攪拌下將白蛋白完全溶解；隨后，用O. IN的鹽酸調整溶液的pH為5. 5 ;將二倍于透明質酸摩爾數的EDCI加入到上述溶液中，在室溫下攪拌過夜；反應完畢后，透析除去未鍵合的透明質酸、未反應的EDCI和EDCI的反應產物，然后冷凍干燥；將上述冷凍干燥的透明質酸-白蛋白共軛物溶于20mL PBS緩沖液中；調整溶液的pH為5. 5，得到白蛋白/透明質酸溶液； (2)將50mg的紫杉醇，50mgTPGS溶于ImL的氯仿中；在攪拌條件下將紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明質酸溶液中，形成初乳；(3)初乳在高壓均質機(9000-400(K)psi)處理下得到納米乳劑，納米乳劑轉入旋轉蒸發儀在30-45°C減壓蒸發快速除去有機溶劑，無菌條件下冷凍干燥得到紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放24小時，未見有沉淀生成。經納米激光粒度儀測定，通過上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在140納米。實施例3制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質酸-白蛋白共軛物先制備透明質酸活性脂將400毫克的透明質酸(分子量5KDa)溶解在IOmLO. IMMES緩沖液中，加入I. 2倍透明質酸摩爾數的EDCI，與I. 2倍透明質酸摩爾數的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應30分鐘即制得透明質酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無菌水中，加入上述透明質酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應60分鐘；反應完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內，透析除去未反應的試劑和反應副產物；將透析后透明質酸-白蛋白溶液冷凍干燥，將凍干的透明質酸-白蛋白溶于PH為5. 5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS緩沖液)中，得到白蛋白/透明質酸溶液；(2)制備紫杉醇溶液稱取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于ImL的氯仿中得紫杉醇溶液；(3)制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑在攪拌條件下將紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明質酸溶液中，形成初乳；初乳在高壓均質機(9000-40000psi)處理下得到納米乳剤，納米乳劑轉入旋轉蒸發儀在30-45°C減壓蒸發快速除去有機溶劑，無菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放24小時，未見有沉淀生成。經納米激光粒度儀測定，通過上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在100納米。實施例4制備紫杉醇/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3,透明質酸的量由400mg改為200mg。納米粒子的平均粒徑為110納米，穩定時間小于36小時。實施例5制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑
具體實施過程同實施例3，紫杉醇的量由50mg調整為30mg。實施例6制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，紫杉醇的量由50mg調整為75mg。納米粒子的平均粒徑為110納米，與實施例3相比穩定時間變短。實施例7制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，透明質酸的分子量由5000變為20000。納米粒子的平均粒徑為120納米，穩定時間基本不變。實施例8制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑
具體實施過程同實施例3，穩定劑TPGS量由50mg變為150mg。納米粒子的平均粒徑為110納米，與實施例3相比穩定時間幾乎不變。實施例9制備紫杉醇/ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，除了穩定劑由TPGS變為ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0。納米粒子的平均粒徑為125納米。實施例10制備紫杉醇/PVP/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，除了穩定劑由TPGS變為PVP。納米粒子的平均粒徑為110納米。實施例11制備多西紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，除了藥物由紫杉醇變為多烯紫杉醇。納米粒子的平均粒ィ5為I ο納米。實施例12制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，除了溶劑由氯仿改為ニ氯甲烷。實施例13制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，除了溶劑由氯仿改為こ醇ニ氯甲烷1:9 (LOmL)0與實施例3相比，得到的納米制劑粒徑更小，穩定時間更長，但紫杉醇體外24h釋放多于實施例3的制劑。實施例14制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑具體實施過程同實施例3，除了溶劑由氯仿改為こ醇氯仿1:9 (I. OmD0與實施例3相比，得到的納米制劑粒徑更小，穩定時間更長，與實施例13類似。實施例15制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質酸-白蛋白共軛物先制備透明質酸活性脂將400毫克的透明質酸(分子量5KDa)溶解在IOmLO. IMMES緩沖液中，加入I. 2倍透明質酸摩爾數的EDCI，與I. 2倍透明質酸摩爾數的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應30分鐘即制得透明質酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無菌水中，加入上述透明質酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應60分鐘；反應完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內，透析除去未反應的試劑和反應副產物；將透析后透明質酸-白蛋白溶液冷凍干燥；(2)制備紫杉醇溶液稱取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于I. OmLl I的こ醇/氯仿混合液中使之全部溶解即得紫杉醇溶液；(3)制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑將凍干的透明質酸-白蛋白溶于pH為5. 7的磷酸鹽緩沖溶液中，在高速均質條件下(10000-20000rpm,5min)將紫杉醇溶液加入到白蛋白/透明質酸溶液中，形成納米乳劑；納米乳劑轉入旋轉蒸發儀在30-45°C減壓蒸發快速除去有機溶劑，無菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放4-6小時，觀察到有沉淀生成。經納米激光粒度儀測定，通過上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在300納米以上。實施例16制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質酸-白蛋白共軛物
先制備透明質酸活性脂將400毫克的透明質酸(分子量2xl05Da)溶解在IOmLO. IM MES緩沖液中，加入I. 2倍透明質酸摩爾數的EDCI，與I. 2倍透明質酸摩爾數的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應30分鐘即制得透明質酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無菌水中，加入上述透明質酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應60分鐘；反應完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內，透析除去未反應的試劑和反應副產物；將透析后透明質酸-白蛋白溶液冷凍干燥；(2)制備紫杉醇溶液稱取50mg，紫杉醇，50mgTPGS溶于I. OmLl 9的こ醇/氯仿混合液中使之全部溶解即得紫杉醇溶液；(3)制備紫杉醇/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑將凍干的透明質酸-白蛋白溶于pH為5. 7的磷酸鹽緩沖溶液中，加入到白蛋白/透明質酸溶液中，用超聲波處理器處理5min，功率200W，形成納米乳劑，納米乳劑轉入旋轉蒸發儀在30-45°C減壓蒸發快速除去有機溶劑，無菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放4小時，觀察到有沉淀生成。經納米激光粒度儀測定，通過上述方法制備的納米粒子的粒徑超過300納米。實施例17 :制備喜樹堿/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑(I)制備透明質酸-白蛋白共軛物先制備透明質酸活性脂將400毫克的透明質酸(分子量5KDa)溶解在IOmLO. IMMES緩沖液中，加入I. 2倍透明質酸摩爾數的EDCI，與I. 2倍透明質酸摩爾數的N-羥基硫代琥珀酰亞胺；在室溫下攪拌反應30分鐘即制得透明質酸琥珀酰亞胺活性脂；將500mg人血白蛋白凍干粉溶解在IOmL無菌水中，加入上述透明質酸的琥珀酰亞胺活性脂溶液中；調整PH值至7. 0-7. 2，在室溫下攪拌反應60分鐘；反應完成后加入到分子量截至為10，000的透析膜內，透析除去未反應的試劑和反應副產物；將透析后透明質酸-白蛋白溶液冷凍干燥；(2)制備喜樹堿溶液稱取50mg喜樹堿,50mgTPGS溶于ImL的氯仿中得喜樹堿溶液；(3)制備喜樹堿/TPGS/透明質酸-白蛋白納米制劑將凍干的透明質酸-白蛋白溶于pH為5.5的磷酸鹽緩沖溶液中，在攪拌條件下將喜樹堿溶液加入到白蛋白/透明質酸溶液中，形成初乳。初乳在高壓均質機(9000-40000psi )處理下得到納米乳劑，納米乳劑轉入旋轉蒸發儀在30-45 V減壓蒸發快速除去有機溶劑，無菌條件下冷凍干燥得到凍干粉末。凍干粉用生理鹽水重懸后在室溫下置放24小時，未見有沉淀生成。經納米激光粒度儀測定，通過上述方法制備的納米粒子的平均粒徑在110納米。實施例18(I)納米制劑中各組分含量測定取IOmg上述實施例制備的納米制劑，加入Iml氯仿，用漩渦振蕩器充分震蕩，萃取出制劑中的藥物及穩定劑，取出上清液，經O. 22 μ m濾膜過濾后，用高壓液相色譜檢測藥物及穩定劑含量。用純化水把不溶部分溶解，用高壓液相色譜法檢測透明質酸濃度，雙縮脲法檢測白蛋白含量。(2)納米制劑在溶液中穩定性考查
取凍干的上述實施例制備的納米制劑10mg，用2mL無菌過濾后的生理鹽水重懸，置室溫下保存，觀察混懸液狀態、有無沉淀及出現沉淀時間。(3)紫杉醇與人血清白蛋白結合的穩定性的比較將50mg紫杉醇納米制劑放入截流分子量為5000的透析膜中置于pH值為7. 2的PBS緩沖溶液(含O. 2%質量分數的土溫80)中。定時取出定量的PBS緩沖溶液，用O. 22微米的濾膜過濾，然后用高壓液相色譜進行分析。表I各實施例納米制劑的相關參數(其余組分為水，構成總和為100%)
權利要求
1.ー種植物類抗癌靶向納米制劑，其特征是，其重量百分比的組成如下 人血白蛋白43 — 60% ； 植物類抗癌藥物1. 5 — 7. 5% ； 分子量為3000-1. 8xl06Da的透明質酸24 — 40% ； 納米粒子穩定劑3. 5 — 15% ； 其余組分為水，構成總和為100%。
2.根據權利要求I所述的植物類抗癌靶向納米制劑，其特征是，其重量百分比的組成如下 人血白蛋白45 — 50% ； 植物類抗癌藥物3 — 5% ； 分子量為3000-1. 8xl06Da的透明質酸32 — 38% ； 納米粒子穩定劑5 — 7% ； 其余組分為水，構成總和為100%。
3.根據權利要求I或2所述的植物類抗癌靶向納米制劑，其特征是，所述透明質酸的分子量為 5000-2xl05Da。
4.根據權利要求I或2所述的植物類抗癌靶向納米制劑，其特征是，所述納米粒子穩定劑是d- α生育酚琥珀酸聚こニ醇酷、ΡΕΟ-ΡΡΟ-ΡΕΟ嵌段共聚物、PVP中的ー種或幾種。
5.根據權利要求I或2所述的植物類抗癌靶向納米制劑，其特征是，所述植物類抗癌藥物是紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿及其衍生物。
6.制備權利要求1-5任一項所述的植物類抗癌靶向納米制劑的方法，其特征是，其步驟如下 (1)制備透明質酸-白蛋白共軛物 將透明質酸和人血白蛋白加入到無菌水中溶解，調節溶液PH為5. 0-6. O,將1-2倍透明質酸摩爾數的EDCI加入到上述溶液中，在室溫下攪拌過夜，反應完畢后，透析除去未鍵合的透明質酸、未反應的EDCI和EDCI的反應產物，冷凍干燥后用PBS緩沖液溶解得到人血白蛋白/透明質酸溶液；或 將透明質酸完全溶于O. IM的MES緩沖液中，然后加入偶聯劑EDCI和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，室溫下攪拌反應，得到透明質酸琥珀酰亞胺活性脂；再將透明質酸琥珀酰亞胺活性脂加入到人血白蛋白的水溶液中，調節溶液PH 7.0-7. 5，室溫下攪拌反應；反應完畢后透析除去未反應的原料和反應副產物，冷凍干燥后，得透明質酸-人血白蛋白共軛物；將透明質酸-人血白蛋白共軛物用PBS緩沖液溶解，得到人血白蛋白/透明質酸溶液；或 將人血白蛋白凍干粉，透明質酸溶于PBS緩沖液中，得到人血白蛋白/透明質酸溶液； (2)配制植物類抗癌藥溶液將植物類抗癌藥物和納米粒子穩定劑溶于有機溶劑中，得到抗癌藥溶液； (3)在高速均質、高壓均質或超聲處理條件下，將上述抗癌藥溶液加入到人血白蛋白-透明質酸溶液中，然后除去有機溶劑；過濾冷凍干燥得到植物類抗癌靶向納米制劑。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是，所述有機溶劑為ニ氯甲烷、氯仿、ニ氯甲烷與こ醇混合溶劑、或氯仿與こ醇混合溶劑。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是，所述有機溶劑為氯仿或こ醇與氯仿的混合物。
9.根據權利要求6 — 8任一項所述的制備方法，其特征是，步驟(3)中，通過旋轉蒸發儀中加熱至30-45°C減壓蒸發除去有機溶剤。
全文摘要
本發明公開了一種植物類抗癌靶向納米制劑及其制備方法，其特征是，其重量百分比的組成如下人血白蛋白43－60%；植物類抗癌藥物1.5－7.5%；分子量為3000-1.8x 106Da的透明質酸24－40%；納米粒子穩定劑3.5－15%，其余組分為水，構成總和為100％。其制備方法包括制備透明質酸-白蛋白共軛物；配制植物類抗癌藥溶液；制備靶向納米制劑。該植物類抗癌靶向納米制劑穩定性好，并具有生物靶向性。
文檔編號A61K9/19GK102688200SQ20121014299
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者劉鋒 申請人:劉鋒