專利名稱：一種治療食管癌的中藥的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥，特別是一種治療食管癌的中藥。
二、背景技術 食管癌是常見的惡性腫瘤之一，我國每年約有25萬新診斷的食管癌病例，占全世界食管癌病例數的一半，并以河南、河北、陜西為食管癌發病率最高，特別是河南省林州一直為世界所關注，林州35-64歲男性發病率高達478. 87/10萬，臨床上治療食管癌效果不佳，五年生存率不到15%。食管癌屬于中醫“噎嗝”范疇，對它認識具有悠久的歷史和豐富的臨床經驗，臨床上辨證治療，合用放、化療、手術，或單獨應用中藥，起到增效、減毒、改善生存質量、延長生存期等多種效應，進一步研究發現，部分中藥能防治化學藥物致癌、抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡、提高機體免疫力等，但是，目前臨床上中醫治療食管癌多為辨證治療，缺乏專用于治療食管癌的新中藥，因此，加強針對食管癌的中藥研究開發，對于提高臨床防治水平和能力，減少食管癌患者死亡率具有重要意義。
發明內容
針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種治療食管癌的中藥，可有效解決臨床上治療食管癌效果不佳，食管癌患者死亡率高的問題。本發明解決的技術方案是該中藥由重量計的旋覆花7-10份、當歸4-7份、黃連3-6份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為98-75%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法冷凍干燥或低溫負壓干燥成固態，粉碎即可，制成的中藥占生藥的重量比為
4.5-6. 5% (冷凍干燥或低溫負壓干燥均為常規方法，現有技術，不再多述)。產品特點1.組方小，費用低；2.療效確切；3.純中藥制劑；4.安全便捷；5.符合中醫藥組方理論。中醫認為食管癌多由憂思郁怒、飲食酒傷、年老體虛、它病轉化等多種因素所引起，初起之時，氣滯、痰阻、血瘀等邪氣阻滯于食管，阻塞食管，使食管狹窄；病邪日久不祛，耗傷津血，臟腑失養，食管干澀，則飲食難下。病機包括氣郁、痰阻、血瘀、氣血津虧等，其中痰血互阻、毒邪郁滯最為常見，也是導致食管癌不斷發展的主要機理。本發明中藥中旋覆花味苦、辛、咸，性微溫，歸肺、胃經，具有降氣止嘔，消痰散結，通利血脈之功效；《神農本草經》認為它主治“結氣，脅下滿，驚悸；除水，去五臟間寒熱，補中，下氣”，《本草發明》則說“旋復花，消痰導飲、散結利氣之味”;《本草綱目》還認為“旋復所治諸病，其功只在行水、下氣、通血脈爾”；《醫學人門》直接說它可“逐水，消痰，止咽噎”，由此旋覆花可以通過它的降氣止嘔、化痰散結、活血通脈的功效起到治療食管癌的作用，在本發明中藥中作為君藥；當歸，性溫，味甘、辛，歸肝、心、脾經，具有補血活血，調經止痛、潤腸通便、下氣止咳嘔之作用。《神農本草經》認為它“味甘，溫，主咳逆上氣”；《藥性論》說它可“止嘔逆、虛勞寒熱，破宿血”;《本草正》則說“當歸，其味甘而重，故專能補血，其氣輕而辛，故又能行血，補中有動，行中有補，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也”；因此，當歸和君藥旋復花配合既可化痰活血起到散結消瘤的作用、又可降氣止嘔，同時又可以養血以補正氣，緩解食管癌患者津枯血燥所致之便秘，在本發明中藥中作為臣；黃連，味苦，性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經，具有瀉火解毒、清熱燥濕之功能，《神農本草經》認為它“味苦，寒，主治熱氣”，在本發明中，取其瀉火解毒已消除痰瘀郁久所產生痰瘀毒、熱毒，同時又以寒涼之性，制約旋復花、當歸之溫，使本發明中藥寒熱陰陽平和，為佐使藥，三藥配合，共湊降氣化痰活瘀，清熱解毒散結，抑制腫瘤生長之功能。
四
圖I為本發明中藥對Eca9706細胞生長的抑制作用時效關系(％ )圖。 五具體實施例方式以下結合實際情況對本發明的具體實施方式
作詳細說明實施例I本發明由重量計的旋覆花7份、當歸4份、黃連3份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為98%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法冷凍干燥成固態，粉碎。實施例2本發明由重量計的旋覆花8份、當歸5份、黃連4份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為95%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法冷凍干燥成固態，粉碎。實施例3本發明由重量計的旋覆花9份、當歸6份、黃連5份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為85%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法低溫負壓干燥成固態，粉碎。實施例4本發明由重量計的旋覆花10份、當歸7份、黃連6份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為75%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法低溫負壓干燥成固態，粉碎。本發明中藥是基于食管癌病機，在整理和篩選古今治療食管癌(噎膈)驗方及實驗室研究基礎上此研發而成，具有降氣化痰活瘀，清熱解毒散結，抑瘤生長之功能，主治食管癌，中醫辨證為痰氣交阻、瘀血阻滯證，痰瘀互阻證兼熱毒盛證等，本發明中藥體內、外實驗具有良好的抗食管癌作用，且毒性小，相關資料如下抗食管癌中藥抑制腫瘤生長及急毒實驗I. I 材料I. I. I 藥物旋覆花,菊科植物歐亞旋覆花Inula britannica L.的干燥頭狀花序；黃連,毛茛科植物黃連Coptischinensis, Franch的根莖；當歸，傘形科當歸Angelica sinensis Diel的根；購于河南中醫學院三附院，經河南中醫學院中藥鑒定專家鑒定為真品.1. I. 2細胞株人食管癌細胞株Eca9706購于中國醫學科學院細胞中心。I. I. 3動物BALB/C(nu/nu)雌性裸小鼠，4_6周齡，由中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供。I. I. 4 主要試劑DMEM 高糖培養基(GIBCO)、胎牛血清(Hyclone)MTT(Sigma)I. I. 5主要儀器設備=Heraeus細胞培養箱(德國Kendro);倒置顯微鏡(ZESS)，紫外分光光度計(BioMate)，SG-603生物安全柜(Bake)，ELx800型酶標儀(BI0-TEK)，游標卡尺(上海量具刀刃廠)I. 2 方法I. 2. I藥物提取中藥旋覆花90g、當歸60g、黃連50g，加入體積濃度為98_75 %的乙醇2000ml，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，用旋轉蒸發儀45°C濃縮至100ml，轉移至蒸發皿，低溫負壓干燥，所得提取物置_20°C冰箱保存，備用，計算出制成的中藥占生藥的重量比為
4.5-6. 5%0I. 2. 2細胞培養生長于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37°C、5% C02培養箱，每間隔48h更換一次培養基，試驗時，細胞用消化液(含w = 0. 02%乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)和w = 0. 25%胰蛋白酶以I : I比例配制)進行消化，并接種于96孔板中或OlOO培養皿中。I. 2. 3裸小鼠飼養SPF級動物房，飼養的房間每2次/周紫外線照射，出入人員更換潔凈工作衣，裸鼠食物、墊料進行濕熱消毒后烘干使用，飲用水加入鹽酸使PH在3-4之間，定期喂養消毒后的黃豆，一切嚴格無菌操作。I. 2. 4MTT法測定細胞生長抑制作用量效關系以1父104細胞/孔接種96孔平面培養板，于371，5% CO2，飽和濕度的CO2培養箱培養24小時。設對照組、中藥組，每組3個復孔，藥物劑量為12. 5 u g/ml、25 u g/ml、50 u g/ml、100 u g/ml,200 u g/ml，繼續培養48小時，去除培養上清，每孔加入0. 5mg/ml的MTT 100ml，繼續培養2小時，小心吸去上清，并加入100 u I DMSO溶解紫色沉淀，用酶標儀在波長為570nm(/630nm)，測定OD值，按公式抑制率(％ ) = (I-實驗孔平均A570/630值/對照孔平均A570/630值)X 100%I. 2. 5MTT法測定細胞抑制作用實效關系選用對數生長期的貼壁腫瘤細胞，用胰酶消化后，調至2. 5X IO4個/ml的細胞懸液，接種在96孔培養板中，200 u I/孔，37°C,5% CO2,培養24h，分別加入高(75%抑制率)、中(50%抑制率)、低劑量(25%抑制率)中藥122 ii g/ml、77 ii g/ml、33 ii g/ml，每組6個復孔，分別于24h、36h、48h、72h檢測，方法如上。I. 2. 6人食管癌細胞株Eca9706裸鼠移植瘤模型建立體外復蘇、培養人食管癌細胞株Eca9706細胞，在細胞的指數生長期收集細胞，1000轉/分離心，無血清DMEM培養基洗滌2次，計數，用不含血清的DMEM培養基，稀釋至稀釋至I. 5X IO6細胞/ml，以0. 2ml/鼠，右腋下皮下接種。30只裸小鼠，隨機取6只為空白組，其余24只造模，造模裸小鼠隨機分為4組，每組6只。4組分別為模型組、中藥高劑量組、中劑量組、低劑量兩組，根據生藥和成品的比率、成人一天所用生藥量及體外半數抑制率確定動物用藥劑量，所有處理自造模后第二天開始高劑量組應用668mg/kg,中劑量組334mg/kg,低劑量組167mg/kg。每日一次,每只0. 2ml,自腫瘤長出之日起，每10天稱體重，測量腫瘤大小，以上處理連續進行40天后，脫頸椎處死裸小鼠，剝離腫塊。腫瘤大小和藥物抑制率自腫瘤肉眼可見之日起，每10天用游標卡尺測量腫瘤的最長徑L(mm)和垂直方向的最大橫徑W(mm),按李氏法V(mm3) = LXW2/2計算腫瘤體積,計算抑瘤率=(I-給藥組平均瘤體積/對照組平均瘤體積)X 100%。1.2. 7急性毒性實驗健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±0.5g，鄭州大學動物中心提供。
I. 2. 7. I半數致死量(LD50)的測定取小鼠50只，禁食12h，禁水2h，隨機分為5(A B C DE)組，每組 10 只，灌服劑量分別為 5196mg/kg(A)、3111mg/kg⑶、1863mg/kg(C)、1116mg/kg(D)、668mg/kg(E),每只鼠每次灌胃0. 4ml,分別相當臨床人日用量(折合成生藥)的 233、140、84、50、30 倍。I. 2. 7. 2最大給藥量測定動物數共20只，禁食12小時后給藥，一次給藥無法測出LD50，一日內連續兩次給小白鼠灌胃給藥5196mg/kg，每隔6小時一次，藥后連續觀察14天。I. 2. 8統計方法計量數據應用軟件SpSS13. 0進行單因素方差分析，并應用該軟件進行相關分析和曲線擬合。2.實驗結果2. I中藥對人食管癌細胞株Eca9706生長和形態的影響顯微鏡下觀察，對照組細胞貼壁生長，細胞界限清楚，核分裂相明顯，有偽足伸出；黃連組細胞呈條狀，細胞輪廓非常明顯，胞質極度粗糙，內充滿多量顆粒狀物質。2. 2中藥對腫瘤細胞生長的影響中藥可抑制人食管癌細胞株Eca9706細胞的生長，并且隨藥物濃度的增加，對細胞生長抑制呈現劑量-效應依賴關系(見表I)。表I中藥對Eca9706細胞生長的抑制作用
藥物濃度U g/ml)
藥物劑量12. 52550100200
抑制率(％)_11. 81_28. 60 35. 26_55. 6598. 43應用概率法置信區間為95%計算半數抑制量(IC5tl) :76.84iig/ml，最高值為110. 25，最低值為 52. 95。2. 3中藥對Eca9706細胞生長的抑制作用時效關系中藥高、中、低劑量組可抑制人食管癌細胞株Eca9706細胞的生長，并且隨時間而增加，對細胞生長抑制呈現時間-效應依賴關系，高劑量效果最好，中劑量效果次之(見圖I)。2. 4中藥對Eca9706移植瘤荷瘤裸鼠一般情況的影響整個實驗過程各組動物都未出現死亡。模型組皮膚顏色枯槁無光澤，消瘦，精神委靡，弓背，余各組一般情況無太大差別，動物活動靈敏度由高到低依次為中劑量組> 高劑量組 > 低劑量 >模型組。2. 5中藥對Eca9706移植瘤荷瘤裸鼠體重的影響20天之前各組小鼠體重接近，之后模型組體重隨著時間增加而逐漸減輕，而各用藥組緩慢增加，結果運用重復測量方差分析，所取各時間點因素交互作用有統計學差異(P=O. 0012)，除低劑量組外的各組與模型組比較差異均有統計學意義(P < O. 05)，高劑量和空白組和低劑量比有統計學意義(P < O. 05)，其他各組之間比較差異無統計學意義(P >
O.05)，(見表 2)。
表2中藥對Eca9706移植瘤荷瘤裸鼠體重的影響
時間樣品量(只)20天30天40天
空白組620·12±1·02 21·14±1·11 21·62±1·31
#
對照組619·23±0·98 18·76±0·72 17·21±1·12
高劑量621·46±1·21 20·66±1·32 20·16±1·23
#Θ
中劑量620·97±1·15 20·12±1·17 20·24±1·05
#Θ
620.16±0.85 19.68±1.25 19.71±1.28
低劑量* ☆注和對照組比較#ρ < O. 05，*ρ > O. 05 ;和空白組比較Θ ρ > O. 05，^p < O. 052. 6中藥對Eca9706移植瘤增殖的抑制效果自接種至成瘤大約需要8天時間，瘤體在接種初期生長緩慢，接種32天左右時，瘤體快速生長，中藥組高、中、低劑量組都有一定抑制腫瘤生長的作用，且具有一定劑量依賴性(見表3)。表3觀察第20和40天的腫瘤體積和藥物抑制情況)
■ ^iJ ( 0] 對照組(6只)高劑量(6只)中劑量組(6 ) 低劑量(6只)
日由20 OO nn-Loo on 21.86±15·71 36.08 ±21·24# 60.72±18·13
^天 82.00±29·20#Θ☆*
大74.56%5 6.00%25.95%
小40,, , co 66.29±27·81 96.78 ±32·15 142.58 ±38·46
抑天 212.23±46·63φ@Θ
制
68.76%54.40%32.81%注20天和對照組比較#p < O. 05，*p > O. 05 ;和低劑量組比較Θ ρ > O. 05，女ρ< O. 05。40天和對照組比較 p〈0. 01;和低劑量組比較 >0. 05, ip < O. 05。2. 7中藥急性毒性實驗結果半數致死量(LD50)的測定觀察七天。結果動物無一死亡，沒有引出半數致死量。最大給藥量測定結果動物無一死亡，在第2次給藥后，動物活動明顯減少。但第2天后，動物就恢復正常活動。觀察期間，除給藥當天動物停止進食和有活動改變外，第2天起，動物恢復正常進食，活動也無異，體重有增長，毛色光亮，皮毛無疏松，口、眼、鼻、耳無異常分泌物，大小便正常。七天后處死動物，肉眼剖檢心、肝、脾、肺、腎、胃腸等重要臟器，結果均未見異常改變。3.結論
3. I抗食管癌中藥體外實驗表現有很好的抗食管癌效應，并呈劑量和時間依賴性；3. 2抗食管癌中藥能夠很好抑制動物食管癌細胞移植瘤生長，呈劑量依賴性，對減弱腫瘤對動物的損傷，在體重和形態上對食管癌移植瘤動物有所改善；3. 3抗食管癌中藥半數致死量未能測出；3. 4抗食管癌中藥一日兩次給藥的最大給藥量為5196mg/kg體重，按生藥量計，相當于104g/kg體重,為臨床用量的233倍,試驗連續觀察14天,動物無一死亡；3. 5抗食管癌中藥有良好的抗食管癌作用，且毒性小，是治療食管癌藥物上的創新，有顯著的臨床意義。
權利要求
1.一種治療食管癌的中藥，其特征在于，由重量計的旋覆花7-10份、當歸4-7份、黃連3-6份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為98-75%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法冷凍干燥或低溫負壓干燥成固態，粉碎。
2.根據權利要求I所述的治療食管癌的中藥，其特征在于，由重量計的旋覆花7份、當歸4份、黃連3份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為98%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法冷凍干燥成固態，粉碎。
3.根據權利要求I所述的治療食管癌的中藥，其特征在于，由重量計的旋覆花8份、當歸5份、黃連4份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為95%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法冷凍干燥成固態，粉碎。
4.根據權利要求I所述的治療食管癌的中藥，其特征在于，由重量計的旋覆花9份、當歸6份、黃連5份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為85%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法低溫負壓干燥成固態，粉碎。
5.根據權利要求I所述的治療食管癌的中藥，其特征在于，由重量計的旋覆花10份、當歸7份、黃連6份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為75%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45°C下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法低溫負壓干燥成固態，粉碎。
全文摘要
本發明涉及治療食管癌的中藥，可有效解決臨床上治療食管癌效果不佳，食管癌患者死亡率高的問題，其解決的技術方案是，由重量計的旋覆花7-10份、當歸4-7份、黃連3-6份制成，將旋覆花、當歸、黃連粉碎，加入旋覆花、當歸、黃連重量的10倍量體積濃度為98-75%的乙醇，室溫下，時時振搖浸泡7天，過濾，得濾液，于45℃下旋轉蒸發去除乙醇，再常規方法冷凍干燥或低溫負壓干燥成固態，粉碎即可，制成的中藥占生藥的重量比為4.5-6.5%，本發明組方小，費用低，療效確切，純中藥制劑，安全便捷，是治療食管癌藥物上的創新。
文檔編號A61P35/00GK102614268SQ20121013182
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者劉學俊, 吳耀松, 尹素改, 陳玉龍, 馬俊華 申請人:河南中醫學院