專利名稱：Ints6基因小激活rna在制備抗前列腺癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及靶向上調INTS6基因的小激活RNA在制備抗前列腺癌，提別是激素非依賴性前列腺癌藥物中的應用。
背景技術：
前列腺癌正嚴重威脅著我國50歲以上男性的健康。內分泌治療是臨床上治療前列腺癌的常用方法。但是絕大多數前列腺癌患者在內分泌治療f 2年內病情出現進展，繼續應用內分泌治療藥物，并不能控制病情發展。前列腺癌細胞由激素依賴轉變為激素非依、賴，是前列腺癌內分泌治療失敗、患者死亡最主要的原因。2006年Li等報道靶向基因啟動子區的dsRNA (雙鏈RNA, double-strandedRNA)能引起序列特異性的基因轉錄激活。并把此現象命名為RNA引起的基因激活(RNA activation, RNAa),而把這樣的 dsRNA 稱為小激活 RNAs (small activatingRNAS, saRNAs)。該項技木通過改變染色體的結構導致內源性靶基因表達增強。它能激活許多失活的抑癌基因或増加活性較低的基因的表達量，從而起到治療腫瘤的作用。INTS6 是一種抑癌基因，全稱 Integrator complex subunit 6 gene, 1999 年由 IWieland和Zhengnan Yin兩個團隊同時報道,在《Oncogene》雜志的同一期刊登。INTS6定位于人類染色體13ql4. 2附近，由于這一區段在許多腫瘤細胞中存在缺失，因此INTS6又被命名Delete In Cancer I (DICEl)。INTS6調控的信號網絡仍未完全闡明，有研究指出INTS6可能參與WNT信號通路的調節，在腫瘤中扮演抑癌基因的角色。INTS6在前列腺癌組織和細胞株中存在表達缺失。文獻報道，雜合性缺失(loss of heterozygosity, L0H)和表觀遺傳學改變雙重打擊造成前列腺癌中INTS6表達下調。INTS6成為RNA激活干預前列腺癌的理想靶標。
發明內容
本發明的目的是提供ー種靶向上調INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應用。本發明通過特定序列的小雙鏈RNA誘導激素非依賴性前列腺癌細胞中INTS6基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的増殖和運動能力，達到抑制腫瘤生長和進展的目的。所述靶向上調INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由2對(4條)21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，其序列分別為dsINTS6-374 S (SEQ ID N0:l):5，-CCA CUU UAC UCAACC CUU C [dTdT] -3，，dsINTS6_374 AS (SEQ ID N0:2):5，-GAA GGG UUG AGU AAA GUGG [dTdT] -3’ ；dsINTS6-390 S (SEQ ID N0:3) :5’ -CUA ACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT]-3，，dsINTS6-390 AS (SEQ ID N0:4) :5，-UGG ACA AAC ACC UGG UUA G [dTdT] -3，。每條鏈的3’端均懸掛突出兩個核苷酸(通常為dTdT，中間19個核苷酸配對)。本發明的有益之處小RNA操作簡單,成本較低；用量較少，20nM的轉染濃度即可達到良好的激活效果；激活作用確切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA誘導基因表達屬于表觀遺傳學調節，不破壞基因組的完整性，因此應用較為安全。
圖I是不同位點dsRNAs對PC3細胞內INTS6 mRNA表達的影響程度，數據來源于3次獨立實驗的平均值和標準差。圖2是不同位點dsRNAs對Dul45細胞內INTS6 mRNA表達的影響程度，數據來源于3次獨立實驗的平均值。圖3是dsINTS6-374/-390上調PC3細胞內INTS6蛋白的表達，β -actin表達量作為內參。圖4是dsINTS6-374/-390上調Dul45細胞內INTS6蛋白的表達，β-actin表達 量作為內參。圖5是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明顯抑制PC3細胞活性，數據以平均值土
標準差表示。圖6是MTT法提示dsINTS6-374/-390能明顯抑制Dul45細胞活性，數據以平均值土標準差表示。圖7是dsINTS6-374/_390處理后PC3細胞平板克隆形成能力減弱。圖8是流式細胞儀檢測提示dsINTS6-374/-390能誘導PC3細胞發生Gl期周期阻滯，數據來源于3次獨立的實驗，結果以平均值和標準差顯示。圖9是dsINTS6-374/_390處理組穿至transwell膜下表面的PC3細胞數較少，Migration :細胞遷移實驗；invation :細胞侵襲實驗。圖10是dsINTS6-374/-390處理組穿至transwell膜下表面的Dul45細胞數較少，Migration :細胞遷移實驗；invation :細胞侵襲實驗。圖11是dsINTS6-374/_390處理后，PC3裸鼠移植瘤生長較對照組明顯放緩。圖12是免疫組化顯示處理組移植瘤組織中，腫瘤細胞尤其是胞核中INTS6表達增強。
具體實施例方式為了更好地理解本發明的實質，本發明結合附圖和實施例作進ー步的說明。但這些具體實施方案不是要以任何方式限制所要求保護的發明范圍。實施例I dsRNAs上調前列腺癌細胞中INTS6基因的表達 實驗方案
1.細胞系人激素非依賴性前列腺癌細胞株PC3、Dul45(上海細胞所)
2.dsRNAs合成dsRNAs均由上海吉凱生物技術有限公司化學合成。3.實驗分組
20nM的dsINTS6-374和-390組、無意義dsRNA對照組(dsControl)和空白轉染試劑組(mock)。dsControl組dsRNA與已知人基因組序列非同源正義鏈，5’_ACU ACU GAG UGACAG UAG A [dTdT]-3’ (SEQ ID NO: 5);反義鏈，5’ -UCU ACU ⑶ C ACU CAG UAG U [dTdT]-3， (SEQ ID N0:6)。4.細胞培養及轉染細胞培養在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640培養基中，放置于C02含量為5%的37oC細胞培養箱內。轉染前一天細胞傳代后種于培養板中，密度大約30 40%。dsRNAs經過脂質體Lipofectamine 2000包裹后轉染入細胞，以6孔板為例(其余培養器皿根據底面積之間的比例調整試劑量)，每孔取3μ1 20 μ M dsRNAs儲存液和5μ1脂質體分別溶于250μ1無血清培養基，5min后混合，室溫靜置20min后加入培養板中，補充含血清培養基使dsRNA終濃度為20nM，作用持續48至144小時。5.逆轉錄ー聚合酶鏈反應(RT-PCR):
利用Trizol Reagent將各實驗組的細胞提取總RNA，紫外分光光度計準確定量。取3 μ g 總 RNA 進行逆轉錄。GAPDH 上游引物(SEQ ID NO: 7 ): 5 ’ -ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3 ’，下游引物(SEQ ID N0:8):5，-GCAGTGATGGCATGGACTGT-3’，INTS6 上游引物(SEQ ID NO:9):5，- TGCCCATCTTACTGTTCCTG-3，，下游引物(SEQ ID N0:10):5，_ TCTTCGAAAGTGACCAGC-3，。采用SYBR Green染料法進行熒光實時定量PCR (real-time PCR)檢測，結果按照2-delta法標準化到對照組進行比較。
6.蛋白印跡(Western Blot)
細胞轉染72 h后，收集細胞，利用RIPA細胞裂解液提取總蛋白，BCA (ニ喹啉甲酸)法測定蛋白濃度，并調整待測樣本的蛋白質含量。每孔加20ug的蛋白電泳、轉膜、封閉，把膜放入稀釋的一抗中，溫和振湯3h后直4度冰箱中過夜。再溫和振湯2 h ,回收一抗后在Tris緩沖液中洗膜30 min，中間更換Tris緩沖液2_3次，分別把膜置于稀釋的ニ抗中溫和振蕩lh，后在Tris緩沖液中洗膜30 min，中間換液3-4次。曝光、顯影及定影，用底片掃描儀掃描X線膠片。結果如下
I.兩對dsRNAs對激素非依賴前列腺癌細胞內INTS6 mRNA表達的影響對激素非依賴前列腺癌細胞PC3和Dul45分別轉染20nM dsRNAs(dsINTS6-374、_390)以及對照dsRNA(dsControl)并設置空白對照組，72小時后利用RT-PCR檢測INTS6的mRNA表達情況，與對照組相比，dsINTS6-374、-390作用組細胞內的INTS6 mRNA明顯增加，是對照組的2倍以上(參見圖1，圖2)。2. dsINTS6-374/-390上調前列腺癌細胞內INTS6蛋白的表達
進ー步通過Western Blot檢測PC3和Dul45細胞轉染72小時后各作用組細胞內INTS6蛋白表達情況，與對照組相比，dsINTS6-374/-390作用組細胞內的INTS6蛋白增加(參見圖
3、4)。實施例2 dsINTS6-374/-390上調INTS6在體外對激素非依賴前列腺癌細胞的抑制作用
實驗方案
I.細胞系同實施例I。2. dsRNAs合成同實施例I。3.實驗分組同實施例I。4.細胞培養及轉染同實施例I。5.四唑鹽(MTT)比色法
取對數生長期的癌細胞，胰酶消化制成單細胞懸液，以每孔2000 5000個細胞的密度將細胞種于96孔培養板內(為保證結果的準確性，在實驗前測定細胞的貼壁率、倍增時間以及不同接種數目細胞的生長曲線，再確定每孔細胞的接種數，以保證培養終止時細胞不至于過滿)，將培養板置于37°C，5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱內培養過夜后，吸去舊培養液，加入20nM dsINTS6-374/-390，并設立陰性對照(dsControl)和空白對照(Mock)。作用48 144小時后，每孔加入20μ1 MTT溶液(5 mg/ml)，37°C孵育4小時后棄培養基，每孔加入DMSO 150μ1，室溫放置10分鐘，待結晶溶解后用酶標儀在490 nm波長處測定其吸光度(OD)值。按下述公式計算細胞存活率存活率=治療組OD值/空白對照組OD值X 100% ；
6.平板克隆形成
經胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock組處理72h后的細胞，分別取400個細胞種于六孔板的孔中培養，直至出現肉眼可見的克隆形成，100%甲醛固定細胞，結晶紫染色，觀察各處理組細胞克隆形成的數量。7.流式細胞儀檢測細胞周期
經胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390、dsControl以及Mock組處理72h后的細胞，70%酒精固定，用PBS洗滌并細胞計數，取含有IXlO5個細胞的懸液，RNA酶處理細胞去除RNA，4°C、2000rpm離心5分鐘，棄上清液，每個樣本加入500μ1的PI染料，室溫避光保存30分鐘，Beckman Coulter FC500流式細胞儀檢測,粗數據使用modfit軟件判讀,計算GO/Gl、S和G2/M各期細胞的比例。8. Transwell穿膜實驗檢測細胞運動能力
利用孔徑8 μ m (略小于細胞直徑)的transwell小室檢驗細胞的遷移和侵襲能力。小室的上室采用無血清的培養基，小室的下室采用含20%血清的培養基，由此建立趨化梯度。經胰酶消化后收集20nM dsINTS6-374/-390,dsControl以及Mock組處理72h后的細胞，分別將8X IO4個不同處理組的細胞置于上室的低血清環境中培養，比較一定時間后趨化至下室的細胞數，從而評價細胞的運動能力。其中，使用無基質膠的transwell小室評價細胞的遷移能力，使用基質膠預先處理的transwell小室評價細胞的侵襲能力。結果如下
I. dsINTS6-374/-390抑制激素非依賴前列腺癌細胞的活性
為了明確dsINTS6-374/-390對激素非依賴前列腺癌細胞生長和活性的抑制程度，我們進行了 MTT試驗。在96孔板中，分別對PC3和Du 145細胞轉染20nM的dsINTS6_374/-390和dsControl RNA,并設置空白對照組mock,姆個組共設置4個復孔,結果均標準化到mock組(以mock組為I)。參見圖5、6，dsINTS6-374/-390對兩種癌細胞的抑制作用出現在48h時間點，且持續至144h。在轉染144h時，dsINTS6-374/-390對兩種癌細胞的抑制率均超過50%。2. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依賴性前列腺癌細胞的體外克隆形成能力 利用平板克隆形成，研究dsINTS6-374/-390抑制激素非依賴性前列腺癌細胞活性是
否與細胞增殖減弱有夫。對前列腺癌細胞PC3分別轉染20nM的dsINTS6-374/-390和對照dsRNA (dsControl)，觀察處理后每400個細胞最終在平板中形成克隆的數量。結果顯示，與對照RNA組相比，dsINTS6-374/-390處理的PC3細胞形成克隆的數目更少。(參見圖7)
3.dsINTS6-374/-390能誘導激素非依賴性前列腺癌細胞發生Gl期阻滯 對前列腺癌細胞PC3和Dul45分別轉染20nM的dsINTS6_374/-390和對照dsRNA(dsCon),72小時后利用PI染色，通過流式細胞儀檢測研究細胞周期分布。如圖8所示，dsINTS6-374/-390處理組G0/G1期細胞增加而S期細胞減少。4. dsINTS6-374/-390能抑制激素非依賴性前列腺癌細胞的體外運動能力
利用transwell穿膜實驗，研究dsINTS6-374/-390處理后激素非依賴性前列腺癌細胞PC3和Dul45運動能力的變化。結果顯示，與對照RNA組相比，dsINTS6_374/-390處理的PC3和Dul45穿至transwell膜下表面的細胞數較少。(參見圖9、10)
實施例3 dsINTS6-374上調INTS6在體內抑制激素非依賴性前列腺癌的生長 實驗方案
I.細胞系人激素非依賴前列腺癌細胞株PC3。2.動物模型采用4周齡BALB-c裸鼠,皮下荷瘤。成瘤后分non-sense dsRNA對照組和dsINTS6-374/-390 RNA組進行干預，每組4只。3.給藥方案瘤內注射30ii g脂質體包被的RNA，3天一次，共三周。4.結果觀察同步觀察瘤體大小變化情況。最后處死裸鼠，免疫組化染色觀察腫瘤組織中INTS6蛋白的表達。結果如下 小激活RNA能夠激活PC3裸鼠皮下移植瘤中INTS6的表達，同時抑制移植瘤的生長利用PC3細胞在裸鼠皮下成瘤，移植瘤內重復注射dsINTS6-374/-390小激活RNA，移植瘤生長受到抑制，同時瘤組織內INTS6表達增強。(參見圖11、12)。
權利要求
1.ー種靶向上調INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應用，所述靶向上調INTS6基因的小RNA的核苷酸序列由4條21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，其序列分別為dsINTS6-374 S :5，-CCA CUU UAC UCA ACC CUU C [dTdT] -3’，dsINTS6-374 AS :5’ -GAA GGG UUG AGU AAA GUG G [dTdT] -3’ ；dsINTS6-390 S :5’ -CUAACC AGG UGU UUG UCC A [dTdT] -3’，dsINTS6_390 AS :5’ -UGG ACA AAC ACC UGG UUA G[dTdT] -3’。
2.根據權利要求I所述的ー種靶向上調INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應用，其特征在干，每條鏈的3’端均懸掛突出兩個核苷酸，為dTdT，中間19個核苷酸配對。
3.根據權利要求I所述的ー種靶向上調PAR-4基因的小RNA在制備抗膀胱癌藥物中的應用，其特征在于，所述藥物還有制劑允許的賦形劑。
全文摘要
本發明提供一種靶向上調INTS6基因的小RNA在制備抗激素非依賴性前列腺癌藥物中的應用。所述的小RNA的核苷酸序列由4條21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈的3’端均懸掛突出兩個核苷酸，通常為dTdT，中間19個核苷酸配對。本發明通過特定序列的小雙鏈RNA誘導激素非依賴性前列腺癌細胞中INTS6基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖和運動能力，達到抑制腫瘤生長和進展的目的。本發明的小RNA操作簡單，成本較低；用量較少，20nM的轉染濃度即可達到良好的激活效果；激活作用確切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA誘導基因表達屬于表觀遺傳學調節，不破壞基因組的完整性，因此應用較為安全。
文檔編號A61P35/00GK102657878SQ20121013090
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月1日 優先權日2012年5月1日
發明者楊凱, 林奕偉, 毛祺琦, 秦杰, 胡政麾, 茅葉青, 謝立平, 鄭祥毅, 金勇豐, 陳弘 申請人:浙江大學