專利名稱：抗人血清白蛋白單鏈抗體及其碳端連接多肽藥物的方法
技術領域：
本發明涉及一種單鏈抗體，特別是涉及一種抗人血清白蛋白單鏈抗體及其碳端連接多肽藥物的方法。
背景技術：
目前，以多肽為主的生物藥物在世界范圍內呈現出迅速推廣的態勢。多肽類生物藥物藥效顯著，并能夠治療許多化合物類藥品無法見效的遺傳類疾病。但是，多肽類生物藥物在使用中的最大問題之一是此類藥物在人體內的衰減周期一般較短，致使用藥頻率相對較高。給病人帶來較大的治療成本和用藥痛苦。因此，延長多肽類生物藥物的半衰期就成為生物制藥學領域亟待解決的課題。
目前用于延長多肽類生物藥物半衰期的方法主要有包括構建突變體、PEG修飾以及與大分子蛋白融合等。這些方法都能有效地延長多肽類生物藥物的半衰期，但是也存在一些問題。通過突變體的構建通常可以降低多肽對水解酶的敏感性，有效地延長多肽類生物藥物的半衰期，但是很多半衰期較長的突變體會改變藥物的活性，要獲得一個即能夠滿足半衰期要求，同時又不改變藥物活性的突變體十分困難。因此，該技術不適宜在蛋白藥物領域廣泛推廣應用，PEG化修飾可以在提高蛋白藥物的穩定性的同時降低其免疫原性，但是有影響多肽類生物藥物的生物活性的潛在可能，同時，對經過PEG化處理的多肽類生物藥物進行純化較為困難，增加了生產過程中的難度和生產成本。通過與具有較長半衰期的人體蛋白直接融合是一種切實可行的延長藥物半衰期的有效方法，但是這種融合方式大大增加了多肽類生物藥物的分子量，給生產和純化帶來了很多問題，分子量的增加也會改變藥物的某些藥代動力學特性，可能使其難以達到靶點所在位置，進而影響藥效。
發明內容
為解決上述技術問題，本發明提供一種可以有效延長半衰期的單鏈抗體以及使用該單鏈抗體組合形成的藥物組合物。本發明的目的之一是提供一種特異性抗人血清白蛋白(HSA)單鏈抗體。本發明的目的之二是提供一種含有所述的特異性抗人血清白蛋白(HSA)單鏈抗體與多肽類藥物形成藥物組合物的方法，以及利用這種方法延長藥物半衰期的方法。在本發明的第一個目的中提供了一種單鏈抗體的VH鏈區域，它的互補決定區CDR具有選自下組⑶R的氨基酸序列
CDRl: C-SEQ-05CDR2: C-SEQ-06CDR3: C-SEQ-07
所述的單鏈抗體VH鏈區域以C-SEQ-02所示的氨基酸序列為一個較佳的序列。在本發明的第一個目的中，本發明還提供了一種單鏈抗體的VL鏈區域，它的互補決定區⑶R具有選自下組⑶R的氨基酸序列CDRl: C-SEQ-08CDR2: C-SEQ-09CDR3: C-SEQ-OlO
所述的單鏈抗體VL鏈區域以C-SEQ-04所示的氨基酸序列為一個較佳的序列。在本發明的第一個目的中，本發明還提供了一種單鏈抗體。其VL鏈區域具有如權利要求I所指明的互補識別區；其禮鏈區域具有如權利要求3所指明的互補識別區；其乂!1鏈以C-SEQ-02所示的氨基酸序列為一個較佳的序列。其VH鏈以C-SEQ-04所示的氨基酸序列為一個較佳的序列。其VH鏈區域和VL鏈區域使用如C-SEQ-Ol所示或C-SEQ-03所示的蛋白連接鉸鏈連接。
在本發明的第二個目的中提供了一種單鏈抗體與多肽藥物連接形成組合物的連接方法。它使用如C-SEQ-Ol所示或如C-SEQ-03所示的蛋白連接鉸鏈從單鏈抗體的碳端與多肽類藥物連接。在本發明的第二個目的中，本發明還提供了一種通過上述單鏈抗體有效延長生物藥物半衰期的方法。它采用本發明所述的單鏈抗體的碳端和藥物形成組合物。它含有上述與單鏈抗體的氨基酸序列和任意一種多肽類藥物的序列。與現有技術相比本發明的有益效果為本發明中的單鏈抗體它具有分子量小，抗體特異性強，免疫源性弱，水溶性好，易于通過發酵方式大規模生產，產物均一性強等特點，單鏈抗體非常適合與多肽類生物藥物融合，通過菌類發酵整體表達過程大批量生產，人血清白蛋白分子量為150Kda，在人體中的半衰期長達19天，借助其與人源化抗人血清白蛋白單鏈抗體片段所形成的組合物，可有效延長多肽類生物藥物的半衰期，同時，由于單鏈抗體分子量很小，融合表達后的抗體-多肽類生物藥物組合體本身的分子量依然可保持在小于20Kda較低水平。避免了潛在的免疫源性，也降低了生產過程中的難度和生產成本。
圖I是電泳檢測結果示意 圖2是進行體外細胞加藥測試結果示意 圖3是人源化抗人血清白蛋白單鏈抗體與藥物結合物在小鼠體內測試結果示意圖。
具體實施例方式下面對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例一，獲得本發明中的單鏈抗體
I、構建人源抗體庫
從人源化單鏈抗體庫中篩選對人血清白蛋白具有特異性識別能力的抗體可變區序列，人源抗體庫是通過采集外周淋巴細胞中合成的免疫球蛋白重鏈與輕鏈的諸多基因片段，用聚合酶鏈反應的方法擴增，并剪接至噬菌體載體中，用引物舉例如下，一個用于尋找輕鏈CDR的引物例子正向引物5’ -GATATCCAACTTACCCAATCC-3’逆向引物5’ -CCTCTTTATTTCTACCTTGG-3’，一個尋找重鏈CDR的引物例子正向引物5’-GAAGTCCAGCTGCTCG-3’ ，逆向引物5’-CGAAGAGACTGTGACTAGCGT-3’ 。
抗體分子片段被噬菌體表達并展示于噬菌體表面，利用人血清白蛋白(HSA)為抗原對顯露于噬菌體表面的抗體進行篩選，得到特異性最佳的抗體。2、抗體篩選
將凍存于_86°C細胞株懸液500μ L加入19. 5mL的LB培養液中，在37°C溫度，250rpm頻率，O. 5L燒瓶條件下溫育16小時，用離心機以12000rpm的轉速將溫育后的細胞懸液離心，棄去離心后的上清液，將離心沉淀物重懸于LB培養液中，達到10n/mL以上的滴度，作為懸液A，將純化的人血清白蛋白(HSA)包被在50mL聚氧乙烯細胞培養瓶中，將懸液A加入上述細胞培養瓶中，形成109/mL噬菌體顆粒濃度，在37°C溫度下溫育I小時，棄去細胞培養瓶中的培養液，使用溶有O. 5%濃度Tween-20的PBS洗滌細胞培養瓶壁5次，在培養瓶中加入
2.OmL的103/mL的EColi細胞，在37°C溫度，250rmp頻率，條件下溫育16小時，將整個過程循環重復5次。將經過上述篩選獲得的細胞以105/mL濃度均勻涂布在含有O. 1%卡那霉素的瓊脂 平板上培養，取平板上的單一細胞株1056株轉移至11個96孔板上繼續培養，每孔I株，在37°C溫度，250rmp頻率，條件下溫育16小時，溫育結束后，在板式離心機中以5000rmp的速度離心30分鐘，取上清保藏。取上述上清5μ L，加入用20μ g/mL濃度的人血清白蛋白溶液溫育包被的96孔板，在37°C溫度下溫育I小時，用溶有O. 5%濃度Tween-20的PBS洗滌微孔板5次，加入辣根酶標記的兔抗人抗體，在37°C溫度下溫育I小時，再用溶有O. 5%濃度Tween-20的PBS洗滌微孔板5次。加入200 μ L的DAB顯色劑和I μ L的過氧化氫,在37°C溫度下溫育20分鐘后讀取560nm波長吸光光度，選取吸光光度最強的數個樣本孔所對應的抗體可變區克隆為下一步制作重組ScFv單鏈抗體的樣本。3、親和力測試
在抗體篩選過程中得到294抗原-抗體反應呈陽性的克隆，利用重組人單鏈抗體純化系統ProteinL親和色譜分離純化重組的單鏈抗體，將純化后的單鏈抗體進行親和力測試，親和力測試采用常用的Scatchard親和力分析法，得到親和力最強的3個克隆
9.12 X IO^7M ；3. 09 X 1(Γ6Μ和9. 70 X 1(Γ6Μ，選擇此3個親和力最強的接種在IOOmL的LB培養液中，在37°C溫度、250rmp頻率的條件下溫育10小時，再利用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導培養10小時，選取其中表達量最高的一株，命名為10D7進行編碼序列的分析和表達載體的架設。實施例二，單鏈抗體的編碼序列的分析，重組和表達載體的架設
將實施例I中產生的10D7株在LB培養液中增殖，然后利用DNA提取試劑盒將細胞株中的質粒純化，通過限制性內切酶剪切和2%的瓊脂凝膠電泳純化分離，獲得重鏈可變區編碼序列，同法獲得輕鏈可變區編碼序列，用人源抗體可變區通用引物進行聚合酶鏈反應擴增，然后將獲得的擴增產物送至Eurofin公司進行測序，測序得到的DNA序列和蛋白序列的結果顯示在表2. I和表2. 2中，其中表2. I所列出的序列為人源化抗人血清白蛋白單鏈抗體的輕鏈區域(C-SEQ-04)，及其可變區序列(C-SEQ-08，C-SEQ-09和C-SEQ-010)，表2. 2所列出序列為人源化抗人血清白蛋白單鏈抗體的重鏈區域(C-SEQ-03)，及其可變區序列(C-SEQ-05, C-SEQ-06 和 C-SEQ-07)。表2. I :輕鏈序列(VL)的一個較佳實例，即 C-SEQ-04。(包括 C-SEQ-08，C-SEQ-09
權利要求
1.一種單鏈抗體的VH區域，其特征在于其互補識別區的氨基酸序列具有如下CDR的氨基酸序列CDRl: C-SEQ-05CDR2: C-SEQ-06CDR3: C-SEQ-07。
2.如權利要求I所述單鏈抗體的VH區域，其特征在于所述VH區域以C-SEQ-02所示的氨基酸序列為一種表現形式。
3.一種單鏈抗體的VL區域，其特征在于其互補識別區的氨基酸序列具有如下CDR的氨基酸序列CDRl: C-SEQ-08CDR2: C-SEQ-09CDR3: C-SEQ-O10。
4.如權利要求I所述單鏈抗體，其特征在于所述VL區域以C-SEQ-04所示的氨基酸序列為一種表現形式。
5.一種用于連接單鏈抗體VL鏈區域和單鏈抗體VH鏈區域的蛋白連接鉸鏈區域，其特征在于，它具有如C-SEQ-Ol或C-SEQ-03所示的氨基酸序列。
6.一種用于連接單鏈抗體區域與多肽類藥物序列的蛋白連接鉸鏈區域，其特征在于，它具有如C-SEQ-Ol或C-SEQ-03所示的氨基酸序列。
7.一種單鏈抗體，其特征在于，其VL鏈區域具有互補識別區，所述的互補識別區具有選自下組CDR的氨基酸序列；CDRl: C-SEQ-08CDR2: C-SEQ-09CDR3: C-SEQ-010 ； 其VH鏈區域具互補識別區，所述的互補識別區具有選自下組CDR的氨基酸序列；CDRl: C-SEQ-05CDR2: C-SEQ-06CDR3: C-SEQ-07 ； 其VH區域以C-SEQ-02所示的氨基酸序列為一種表現形式； 其VL區域以C-SEQ-04所示的氨基酸序列為一種表現形式； 其VH鏈區域和VL鏈區域使用如C-SEQ-Ol所示或如C-SEQ-03所示的蛋白鉸鏈連接。
8.—種單鏈抗體與多肽類藥物連接形成藥物組合物的方法。
9.其特征在于，它含有單鏈抗體和任意多肽類藥物的序列。
10.所述的單鏈抗體其VH鏈區域以C-SEQ-02所示的氨基酸序列為一種表現形式；其VL鏈區域以C-SEQ-04所示的氨基酸序列為一種表現形式，所述的單鏈抗體與多肽類藥物的氨基酸序列使用如C-SEQ-Ol所示或C-SEQ-03所示的蛋白連接鉸鏈從單鏈抗體的氮端連接。
全文摘要
本發明公開了一種抗人血清白蛋白單鏈抗體及其碳端連接多肽藥物的方法，單鏈抗體的VH鏈區域具有如C-SEQ-05、C-SEQ-06、C-SEQ-07所示的互補識別區的CDR氨基酸序列；所述的單鏈抗體的VL鏈區域具有如C-SEQ-08、C-SEQ-09、C-SEQ-010所示的互補識別區的CDR氨基酸序列；單鏈抗體與多肽類藥物的氨基酸序列使用如C-SEQ-01所示或C-SEQ-03所示的蛋白連接鉸鏈從單鏈抗體的氮端連接；本發明中的單鏈抗體具有分子量小，抗體特異性強，免疫源性弱，水溶性好，易于通過發酵方式大規模生產，并且公開了一種使用本發明中的單鏈抗體制造的組合物，該藥物可有效延長多肽類生物藥物的半衰期。
文檔編號A61P3/10GK102827277SQ20121012532
公開日2012年12月19日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者楊艷坤, 龍泉, 張芃芃, 楊冬, 劉冰 申請人:拜明(蘇州)生物技術有限公司