專利名稱：繁縷多糖組合物及其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及繁縷多糖組合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，特別涉及一種按中藥活性成分分離純化后再由一定比例混合均勻的繁縷多糖組合物及其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及到含有繁縷多糖組合物的制劑及保健品，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
病毒是最小的病原微生物，是一類不具細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有遺傳、復(fù)制等生命特征的微生物，其核心是核糖核酸或脫氧核糖核酸(DNA)，病毒的傳播最廣，是目前世界上發(fā)病率較高的傳染性疾病之一。由病毒引起的疾病常見(jiàn)的有傳染性肝炎、皰疹、腦炎、病毒性呼吸道感染、流感和皰疹性角膜炎等。在臨床上較多的疾病與病毒感染有關(guān)，據(jù)國(guó)外統(tǒng)計(jì)資料報(bào) 道，近3/4的傳染病是由病毒引起的，1984年國(guó)際病毒分類學(xué)會(huì)(ICTV)已公布的55種病毒中有18種屬于致病病毒，不同的病毒感染引起不同的疾患，需要不同的抗病毒藥物治療?？共《靖腥镜耐緩胶芏?，如直接抑制或殺滅病毒、干擾病毒吸附、阻止病毒穿入細(xì)胞、抑制病毒生物合成、抑制病毒釋放或增強(qiáng)宿主抗病毒能力等。目前臨床上用的抗病毒藥物雖然較多，但大多為核苷類衍生物，其主要作用靶點(diǎn)為病毒DNA聚合酶，以酶反應(yīng)底物類似物的形式與正常底物競(jìng)爭(zhēng)，直接降低或阻斷DNA聚合酶的活性，表現(xiàn)出較佳的抗病毒活性，但其具有易產(chǎn)生耐藥性，抗病毒范圍窄，毒副作用大，價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。近年來(lái)，許多中草藥用于病毒性疾病的防治引起人們的關(guān)注，如葉下珠、虎杖、金銀花、紫草、貫眾、大黃等用于某些病毒感染性疾病的防治取得顯著療效。繁縷(Stellaria media(L. ) Villar.)為石竹科繁縷屬一年或兩年生草本植物，具有清熱解毒、益氣養(yǎng)血、健脾益腎之功效；主治痢疾、癰瘡腫毒、乳癰、腸癰、癤腫、跌打損傷，產(chǎn)后瘀滯腹痛等。根據(jù)文獻(xiàn)記載全世界大約有120種，廣布于溫至寒帶地區(qū)，我國(guó)產(chǎn)63種15變種和2變型，各省均產(chǎn)之。繁縷作為民間醫(yī)藥，應(yīng)用廣泛。繁縷富含黃酮、酚酸、多糖、皂苷類、有機(jī)酸、生物堿等生物活性成分，目前研究表明繁縷具有廣譜的抗病毒作用。多糖(polysaccharide)是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成,是一類分子機(jī)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均稱為多糖。該類物質(zhì)在自然界植物中尤為重要，研究表明多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗癌、降血糖、治療肝腎疾病及消炎鎮(zhèn)痛等生物活性。目前繁縷多糖的研究主要停留在粗多糖水平，主要是粗多糖的提取和生物活性等方面的研究。中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1521193A所述的繁縷多糖及其組合物的制備方法，指出繁縷多糖組合物為80 90%的總黃酮和10 20%的粗多糖混合而成，具有一定的抗艾滋病病毒和皰疹病毒的作用，這僅僅只是繁縷粗多糖的提取制備，所得到的多糖含有蛋白質(zhì)、色素等其他成分，未見(jiàn)均一性繁縷多糖的相關(guān)報(bào)道，更未見(jiàn)由繁縷多糖按一定比例混合成繁縷多糖組合物及其在制備抗病毒藥物中應(yīng)用的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于對(duì)繁縷的活性組分進(jìn)行研究，提供一種具有藥用價(jià)值的新的繁縷多糖組合物，并公開(kāi)其在制備抗病毒藥物和抗病毒的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)抗病毒相關(guān)制劑及保健
品O本發(fā)明所述的繁縷多糖組合物，是由繁縷Stellaria media(L.) Villar.新鮮全草經(jīng)一定的處理方式分離純化，再由分離純化的5種分子量均一的繁縷多糖按一定比例范圍混合而成，5種繁縷多糖釆用現(xiàn)代分析技術(shù)，分析其分子量、分子量分布、摩爾比及其單糖組成，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，其提取及分離純化流程見(jiàn)附圖I。本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)方法快速、準(zhǔn)確，該組合物未有文獻(xiàn)報(bào)道具有廣譜抗病毒的作用。本發(fā)明所述的繁縷多糖組合物中的繁縷多糖可從下列植物中提取，這些植物包括植物繁縷或繁縷屬植物，屬下物種主要有阿里山繁縷Stellaria arisanensis var. Leptophylla Hayata、矮陷繁縷 Stellaria depressa、白毛繁縷 Stellaria
箐姑草 Stellaria vestita var. amplexicaulis、藏南繁縷 Stellaria zangnanensis、叉歧繁縷Stellaria dichotoma、叉歧繁縷(原變種)、長(zhǎng)辧繁縷Stellaria dichotoma、長(zhǎng)辧繁縷(原變種)、長(zhǎng)裂繁縷Stellaria mart janovii、長(zhǎng)毛箐姑草Stellaria pilosa、長(zhǎng)葉繁縷Stellaria longifolia、長(zhǎng)葉繁縷(原變種)、常綠禾葉繁縷Stellariagraminea var. viridescens、錯(cuò)那繁縷 Stellaria decumbens var. arenarioides、大葉繁縷 Stellaria delavayi、單子繁縷、墊狀偃臥繁縷 Stellaria decumbens var. pulvinata、凍原繁縷Stellaria irrigua、獨(dú)子繁縷Stellaria monosperma、獨(dú)子繁縷(原變種)、短辧繁縷 Stellaria brachypetala、純萼繁縷 Stellaria amblyosepala、多花繁縷Stellaria nipponica、多花偃臥繁縷 Stellaria decumbens var. polyantha、蛾眉繁縷Stellaria omeiensis、二柱繁縷 Stellaria bistyla、番羽白繁縷 Stellaria discolor、繁縷Stellaria media、繁縷(原變種)、覆瓦繁縷Stellaria imbricata、高山雀舌草Stellaria uliginosa var. alpina、禾葉繁縷 Stellaria graminea、禾葉繁縷(原變種)、賀蘭山繁縷 Stellaria alaschanica、湖北繁縷 Stellaria henryi、雞腸繁縷 Stellarianeglecta、吉隆繁縷 Stellaria gyirongensis、江孜繁縷 Stellaria gyangtseensis、睫毛長(zhǎng)葉繁縷 Stellaria gyangtseensis、康定繁縷 Stellaria souliei、林繁縷 Stellariabungeana var. stubendorfii、柳葉繁縷 Stellaria salicifolia、卵葉繁縷 Stellariaovatifolia、毛禾葉繁縷 Stellaria graminea var. pilosula、莓苔狀繁縷 Stellariaoxycoccoides、米林繁縷Stellaria mainlingensis、密花繁縷Stellaria congestiflora、密柔毛繁縷 Stellaria yunnanensis f. villosa、綿柄繁縷 Stellaria lanipes、綿毛繁縷Stellaria lanata、內(nèi)彎繁縷 Stellaria infracta、尼泊爾繁縷 Stellaria nepalensis、帕米爾繁縷Stellaria winkleri、千針萬(wàn)線草Stellaria yunnanensis、千針萬(wàn)線草(原變種)、箐姑草Stellaria vestita、箐姑草(原變種)、雀舌草Stellaria uliginosa、雀舌草(原變種)、傘花繁縷Stellaria umbellata、沙生繁縷Stellaria arenaria、濕地繁縷 Stellaria uda、石生繁縷、石竹葉繁縷 Stellaria dianthifolia、縫辧繁縷 Stellariaradians、天蓬草、網(wǎng)脈繁縷 Stellaria reticulivena、巫山繁縷 Stellaria wushanensis、無(wú)辧繁縷 Stellaria apetala、無(wú)荀繁縷 Stellaria ebracteatav、西藏繁縷 Stellariatibetica、細(xì)柄繁縷 Stellaria petiolaris、細(xì)葉繁縷 Stellaria filicaulis、線形葉荀繁縷 Stellaria crassifolia Ehrh. var. linearis、線葉繁縷 Stellaria dichotoma var.linearis、腺毛繁縷 Stellaria nemorum、小繁縷 Stellaria pusilla、小花繁縷 Stellariamedia var. micrantha、小傘花繁縷 Stellaria parviumbellata、興安繁縷 Stellariacherleriae、亞傘花繁縷 Stellaria subumbellata、巖生繁縷 Stellaria petraea、偃臥繁縷 Stellaria decumbens、偃臥繁縷(原變種)、葉荀繁縷 Stellaria crassifolia Ehrh. >葉荀繁縷(原變種)、銀柴胡 Stellaria dichotoma var. lanceolata、圓萼繁縷 Stellariastrongylosepala、沼生繁縷 Stellaria palustris、中國(guó)繁縷 Stellaria chinensis、中華禾葉繁縷 Stellaria graminea var. chinensis、皺葉繁縷 Stellaria monosperma var.japonica、維花繁縷 Stellaria monosperma var. paniculata、準(zhǔn)噶爾繁縷 Stellariasoongorica。本發(fā)明所述的繁縷多糖組合物，含I % 95%繁縷多糖A、5% 90%繁縷多糖B、11 % 54 %繁縷多糖C和D、I % 30 %繁縷多糖E ;采用高效凝膠滲透色譜法檢測(cè)，結(jié)果表明，繁縷多糖A分子量分布在15000 30000Da之間，主要集中在20000左右；繁縷多糖B、C、D分子量分布在6000 20000Da之間，主要集中在13000、12000和10000左右；繁縷多糖E重均分子量分布在5000 lOOOODa，其中5種多糖分子量分布指數(shù)均小于2，見(jiàn)附圖2。經(jīng)氣相色譜法分析(見(jiàn)附圖3)結(jié)果表明，繁縷多糖A、B、C、D、E是由鼠李糖、 阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6種單糖殘基組成，比例分別為(I 5 I
9 I 8 17 3 68 11 95)、(I 10 4 6 I 17 96 5 13 24 64)、(6 33 7 25 I 12 I 11 45 20 73)、(I 5 I 0 0. 5 I
9 2 15 I 66)、(I 14 25 64 0 I : I 18 I 26 40)。SDS-PAGE法分析可知該組合物中無(wú)糖肽。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于公開(kāi)上述繁縷多糖組合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的病毒包括乙肝病毒、艾滋病病毒、皰疫病毒、流感病毒、腸道病毒和腺病毒，其中皰疹病毒包括HSV-I、HSV-2和水痘-帶狀皰疹病毒。本發(fā)明組合物制備抗病毒藥物以常規(guī)藥用制劑的形式來(lái)使用，所述組合物可以以藥學(xué)上可接受的形式給予來(lái)滿足不同的給藥方式，如以固體、溶液。凝膠、脂質(zhì)體等形式給予。含有本發(fā)明的組合物的自己可以是適合口服使用的形式，如片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、乳液等，按照藥用制劑生產(chǎn)領(lǐng)域中任何已知的方法可以制備口服使用的所需制劑，用于臨床的抗病毒藥物。上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和其它常用的添加劑，如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸鎂、石膏粉、滑石粉、明膠、甘露醇、乙二醇、橄欖油、花生油、抗壞血酸等。上述的制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、繁縷多糖組合物具有廣譜的抗病毒活性，該組合物及其抗病毒活性為首次報(bào)道。此藥物其最大優(yōu)點(diǎn)是天然產(chǎn)物，與現(xiàn)有抗病毒藥相比，毒性小，無(wú)不良反應(yīng)，可長(zhǎng)期使用無(wú)反彈，有望開(kāi)發(fā)為新型的抗病毒的藥物。2、與直接使用的中草藥相比，繁縷多糖組合物作為具體化學(xué)組分的物質(zhì)直接作為抗病毒的藥效成分，用量少，減少毒副作用對(duì)機(jī)體的傷害，臨床用藥簡(jiǎn)單；3、繁縷多糖組合物結(jié)合相關(guān)的制劑技術(shù)，開(kāi)發(fā)價(jià)值高，生產(chǎn)方便，工藝簡(jiǎn)單，具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖I繁縷多糖提取、分離純化流程2繁縷多糖分子量測(cè)定HGPC圖其中A、B、C、D、E分別為繁縷多糖A、B、C、D、E的HGPC圖譜HGPC色譜條件凝膠色譜柱為TSK-GEL3000SW系列，流動(dòng)相為0. 71 %硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02%疊氮鈉)，柱溫35°C，示差折光檢測(cè)器(檢測(cè)器溫度35°C )，流速0. 5ml mirT1，取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20 注入液相色譜儀。圖3繁縷多糖單糖組成GC分析圖其中A、B、C、D、E分別為繁縷多糖A、B、C、D、E單糖分析GC圖色譜柱HP-5毛細(xì)管色譜柱(30_X0. 32nmX0. 25 u m);程序升溫100°C (5°C / min) — 190°C (4°C /min) — 240°C (5min);載氣高純氮?dú)猓贿M(jìn)樣口溫度200°C ;進(jìn)樣口采用分流模式，分流比:150 I ;檢測(cè)器=FID ;氣化室溫度2600C ;氮?dú)怏w積流量30mL/min ；氫氣體積流量40mL/min ;空氣體積流量400mL/min ;進(jìn)樣量1 y L。圖4繁縷多糖組合物對(duì)乙肝病毒表面(HBsAg)的抑制率圖5繁縷多糖組合物對(duì)乙肝病毒e抗原(HBeAg)的抑制率圖6繁縷多糖組合物對(duì)HBV DNA的抑制率
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明常見(jiàn)的植物多糖的提取常常采用水、鹽、酸、堿和酶來(lái)提取，得到的提取液通過(guò)高濃度的乙醇沉淀回收，該過(guò)程可去除部分雜質(zhì)，再經(jīng)脫色、脫蛋白、不同材料柱層析分離得到純度較高的精制多糖。本發(fā)明采用新鮮繁縷榨汁或溫水浸提等獲得水提液，按照一定的處理方式結(jié)合經(jīng)典的多糖分離方法最終獲得繁縷精制多糖，其按特定的比例混合獲得繁縷多糖組合物。實(shí)施例I繁縷多糖組合物體外抗乙肝病毒研究本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的體外抗乙肝病毒藥物篩選模型H印G2. 2. 15細(xì)胞模型，不同濃度的繁縷多糖組合物給藥H印G2. 2. 15細(xì)胞數(shù)天，取其細(xì)胞上清液，分別測(cè)定其乙肝表面抗原(HBsAg)，e抗原(HBeAg)和HBV DNA分泌情況，來(lái)判斷藥物是否有效，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用MTT法測(cè)定不同繁縷多糖組合物的細(xì)胞毒性。綜合以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)繁縷多糖組合物進(jìn)行體外抗乙肝病毒的藥效學(xué)研究，并以臨床上應(yīng)用得到證實(shí)的拉米夫定(3TC)作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，以此評(píng)價(jià)繁縷組合物的抗乙肝病毒效果。細(xì)胞毒性當(dāng)IfepG2. 2. 15細(xì)胞增殖到一定程度且抗原分泌穩(wěn)定后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后配制5 X IO4的細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔IOOii L，培養(yǎng)24h后，吸除細(xì)胞上清，加入不同濃度的繁縷多糖組合物進(jìn)行培養(yǎng)6d或9d，每3天更換一次含藥培養(yǎng)基，收集細(xì)胞上清于_70°C冰箱中備存，用于抗原及HBVDNA的檢測(cè)。收集上清后用MTT染色，每孔加lmg/mL的MTT無(wú)血清培養(yǎng)液100 u L，于培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，棄上清，加入100 u L，振蕩IOmin,用550nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繁縷多糖組合物對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的影響采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的分泌情況，取陽(yáng)性藥3TC和繁縷多糖組合物不同濃度給藥的H印G2. 2. 15細(xì)胞上清，按照試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定各樣品細(xì)胞上清的OD值，計(jì)算其對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率。繁縷多糖組合物對(duì)HBV DNA的抑制作用為進(jìn)一步說(shuō)明繁縷多糖組合物具有一定的抗乙肝病毒的作用，采用FQ-PCR法測(cè)定H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌HBV DNA的水平。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門安普利生物工程有限公司。HBV DNA的提取、擴(kuò)增等所有操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析MTT細(xì)胞毒性分析對(duì)于繁縷多糖組合物抗乙肝病毒的分析，實(shí)驗(yàn)采用多個(gè)濃度進(jìn)行分析，取3、10、30、60、100、200、400 u g/mL的繁縷多糖組合物作用于H印G2. 2. 15細(xì)胞，每3天收集細(xì)胞上清并換新鮮含藥培養(yǎng)基，于6d或9d收集所有細(xì)胞上清，采用MTT法分析樣品不同濃度對(duì)細(xì)胞毒性的影響。MTT的結(jié)果顯示，繁縷多糖組合物的濃度小于等于200 u g/mL時(shí)，細(xì)胞存活率> 95%。3TC陽(yáng)性對(duì)照是通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)篩選的抗乙肝病毒較佳的濃度，數(shù)據(jù)分析只采用IOOy g/mL 3TC與繁縷多糖組合物對(duì)比分析。不同濃度的繁縷多糖組合物及3TC的細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表I。繁縷多糖組合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用不同濃度的繁縷多糖組合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用見(jiàn)表2和表3。隨著濃度的增加，繁縷多糖組合物對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率增加，當(dāng)濃度為200 u g/mL時(shí)，第6天其對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率分別為24. 28%和28. 94% ;而第9天，抑制率分別達(dá)到了25. 56%和30. 25% (見(jiàn)附圖4和圖5)，由此分析，繁縷組合物對(duì)HBsAg和HBeAg有抑制作用，且隨著濃度的增大，抑制率增加；同一濃度下隨著時(shí)間的增加，抑制率也增加。6d或9d對(duì)兩種抗原的抑制在同等濃度下與拉米夫定無(wú)顯著性差異(P > 0. 05)。 表I繁縷多糖組合物對(duì)H印G2. 2. 15細(xì)胞毒性
權(quán)利要求
1.一種繁縷多糖組合物，其特征在于該組合物是由1<% 95%繁縷多糖4、5(% 90(%繁縷多糖B、11 % 54%繁縷多糖C和D、I % 30 %繁縷多糖E均勻混合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的繁縷多糖組合物，其特征在于其中所述的繁縷多糖A重均分子量分布在15000 30000Da之間，分布指數(shù)D在I I. 5之間；繁縷多糖B、C、D重均分子量分布在6000 20000Da之間，分布指數(shù)D在I 2之間；繁縷多糖E重均分子量分布在5000 lOOOODa，分布指數(shù)D為I. 5 2之間，5種多糖分子量分布指數(shù)均小于2。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的繁縷多糖組合物，其特征在于其中所述的繁縷多糖A、B、C、D、E是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6種單糖殘基組成，比例分別為(I 5 I 9 I 8 17 3 68 11 95)、(I 10 4 6 I 17 96 5 13 24 64)、(6 33 7 25 I 12 I 11 45 20 73)、(I 5 I O O. 5 I 9 2 15 I 66)、(I 14 25 64 O I : I 18 I 26 40)。
4.一種繁縷多糖組合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其用途在于制備抗病毒制劑及保健品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述的病毒包括こ肝病毒、艾滋病病毒、皰疫病毒、流感病毒、腸道病毒和腺病毒等。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述的皰疹病毒包括單純性皰疹病毒-1(HSV-I)、單純性皰疹病毒_2 (HSV-2)和水痘-帯狀皰疹病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述組合物的的應(yīng)用，其特征在于利用制劑學(xué)允許的輔料制備制劑領(lǐng)域相應(yīng)的藥物劑型，如針劑、粉針劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、ロ服液、微丸、噴霧劑、乳劑坐寸ο
全文摘要
本發(fā)明涉及繁縷多糖組合物及其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)的繁縷多糖組合物是由5種繁縷多糖(A、B、C、D、E)按一定比例混合而成，其特征在于該組合物為棕色絮狀物，易溶于水，不溶于高濃度的乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、異丙醇；多糖組合物中含有5種分子量分布在5000～30000之間的繁縷多糖，是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按一定的摩爾比組成。5種多糖按特定配比混合均勻后，利用其相互協(xié)同作用，可增強(qiáng)其抗病毒的活性。本發(fā)明還公開(kāi)繁縷多糖組合物用于制備抗病毒藥物的用途如乙肝病毒、艾滋病病毒、皰疹病毒、流感病毒、腸道病毒和腺病毒等，并可制成多種藥物制劑。該組合物治療療效好，且未見(jiàn)毒性，在抗病毒新藥開(kāi)發(fā)方面具有廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61P31/12GK102697800SQ201210125239
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者賈曉斌, 馬利華 申請(qǐng)人:賈曉斌