專利名稱：禽嗜鸚鵡熱衣原體外膜蛋白N-PmpD及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種禽嗜鸚鵡熱衣原體(Chlamydophilapsittaci)外膜蛋白N-PmpD,及該蛋白的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽衣原體病(Avian Chlamydiosis, AC)是由嬰I踏熱嗜性衣原體(Chlamydophilapsittaci)感染禽類的而引起不同癥候群的的一種接觸性人畜共患傳染病,在臨床上主要是以肺炎、心包炎、氣囊炎、結(jié)膜炎為特征。感染發(fā)病禽群，可以長期向外排出衣原體，嚴(yán)重威脅人類健康。本病的流行已經(jīng)嚴(yán)重威脅到我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類健康，探討禽鸚鵡熱嗜性衣原體新的保護(hù)性抗原和免疫機(jī)制。誘導(dǎo)高水平的體液和細(xì)胞免疫有望消除鸚鵡熱衣原體的持續(xù)性感染的難題。目前正在研制的衣原體候選疫苗的成分有主要外膜蛋白復(fù)合物、主要外膜蛋白的可變區(qū)IV和Gp8的嵌和肽、Capl, PorB等，還有疫苗來源于骨髓瘤的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)疫苗,研究結(jié)果顯示，DC能通過胞飲作用吞曬衣原體,進(jìn)而殺滅衣原體病原。但是SuH用重組的外膜主要蛋白(Major outer membrance protein, Μ0ΜΡ)作為靶抗原來刺激DC，結(jié)果表明DC疫苗無效。國內(nèi)外研究做廣泛的是有免疫原性的保護(hù)性抗原Μ0ΜΡ，它是衣原體外膜的主要成分，占整個(gè)外膜成分的50% -60%。衣原體外膜蛋白在感染的過程中起著非常重要的作用，如衣原體粘附于宿主細(xì)胞上、進(jìn)而進(jìn)入宿主細(xì)胞、在細(xì)胞內(nèi)阻止溶酶體和包涵體的融合等。研究表明，用MOMP疫苗接種嚙齒類動物或注射MOMP特異性單抗僅有部分免疫保護(hù)作用，臨床效果也不好。最近，又有人報(bào)道以天然的MOMP免疫小鼠引起的生殖道免疫保護(hù)水平與自然感染引起的一致，然而，MOMP可能不是最了令人滿意的疫苗候選者，因此有必要利用細(xì)菌表面的其他的中和抗體的靶位研發(fā)出一種更加有效地疫苗。衣原體全基因組序列分析研究發(fā)現(xiàn)編碼多形態(tài)膜蛋白(Polymorphic membranceproteins, Pmps)。Cps至少有6個(gè)基因編碼Pmp90和Pmp98蛋白家族，Cpn有21個(gè)基因編碼Pmpl-Pmp21，Ct有9個(gè)基因編碼PmpA-PmpH，其中PmpD引起人們的廣泛關(guān)注。2007年美國Patrick Bavoil教授為首的TIGER組率先完成了嗜性鸚鵡熱衣原體6BC株的全基因組測序(I 179253bp)，繪制了基因圖譜，發(fā)現(xiàn)家禽衣原體也存在PmpD蛋白的基因序列。免疫熒光、免疫電鏡和免疫印跡等實(shí)驗(yàn)顯示，PmpD易位到細(xì)菌的表面后，與外膜蛋白的其他成分以非共價(jià)鍵結(jié)合，其結(jié)合程度十分緊密，不被加熱處理、高濃度的離子或pH值的改變所打斷，是EB表面上表露的抗原。衣原體PmpD的粘附素功能被證實(shí)，PmpD抗原是否是中和抗體靶位很重要，是決定PmpD能否作為候選疫苗的前提。因此PmpD蛋白被認(rèn)為是極具有潛力的保護(hù)性抗原。文獻(xiàn)報(bào)道稱Pmp家族成員具有共同的特征即含有GGAI/L/V和FXXN 4個(gè)氨基酸的高度重復(fù)序列，其中GGA I/L/V重復(fù)2 12次，F(xiàn)XXN重復(fù)4 23次。目前認(rèn)為，所有蛋白只要含有I個(gè)以上GGAI/L/V重復(fù)序列即就與黏附素有關(guān)，按照這一定義可以說PmpD是、黏附蛋白。另外，實(shí)驗(yàn)也證明了 PmpD具有黏附素功能，將抗PmpD抗體與衣原體共同孵育后感染上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞不被感染，說明抗PmpD抗體對衣原體感染有封閉作用，即封閉了衣原體PmpD的黏附素功能。種種跡象都表明PmpD蛋白可能是潛在的具有免疫保護(hù)性抗原的成分之一。
但禽嗜性衣原體PmpD蛋白在家禽衣原體感染的過程中的作用如何，是否具有和衣原體MOMP蛋白相同的免疫學(xué)價(jià)值還有待進(jìn)一步的研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種禽嗜鸚鵡熱衣原體(ChlamydophiIapsittaci)外膜蛋白 N-PmpD。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述蛋白的制備方法；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供N-PmpD蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種禽嗜嬰鳥踏熱衣原體(Chlamydophila psittaci)外膜蛋白N-PmpD，其為I)由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的N-PmpD蛋白的氨基酸序列(SEQID No. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第2位的G替換為N，將第446位的G替換為N，或是將第I位的G缺失，或是在第2位增加N，不影響其免疫原性。因此，本發(fā)明N-PmpD蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有與N-PmpD蛋白同等活性的由N-PmpD蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。本發(fā)明提供編碼上述N-PmpD蛋白的基因。N-PmpD蛋白的編碼基因是如下a)或b):a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. I所示；或b)由SEQ ID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸,得到編碼N-PmpD蛋白的核苷酸序列。應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。因而，本發(fā)明N-PmpD基因還包括由SEQ IDNo. I所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼N-PmpD蛋白的核苷酸序列?？蓪⒈景l(fā)明N-PmpD基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，N-PmpD蛋白重組表達(dá)載體的獲得是通過將N-PmpD基因插入到表達(dá)載體pET-32a(+)上構(gòu)建得到的。本發(fā)明提供了含有N-PmpD蛋白編碼基因的載體。本發(fā)明還提供了含有上述載體的細(xì)胞系。
本發(fā)明提供一種制備蛋白N-PmpD的方法，包括如下步驟a) PCR方法擴(kuò)增Ν-PmpD基因；b)將N-PmpD基因?qū)氡磉_(dá)載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，最后分離純化獲得；
其中步驟a) PCR方法所用的弓丨物序列為上游引物5’-GGCgtcgacGTTGCGGCGGTGCGATTTATT-3，，
其5’端下劃線部分為SalI酶切位點(diǎn)；下游引物5’-AATAgcggccgcCAAAACAGCCCCACCTGTAGGAGCA-3’，其5’端下劃線部分為NotI酶切位點(diǎn)。用Ni-NTA親和層析純化蛋白，然后進(jìn)行蛋白的復(fù)性，使蛋白具有生物學(xué)活性。將純化后的N-PmpD融合蛋白通過Western-blot分析顯示與禽嬰I踏熱嗜性衣原體陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，表明具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。將本發(fā)明的N-PmpD蛋白與弗氏佐劑混合乳化，制備免疫原免疫動物，然后進(jìn)行抗體水平和細(xì)胞因子水平檢測，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的N-PmpD蛋白具有免疫原性，能產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫水平，具有免疫保護(hù)作用。由此可見，本發(fā)明重組蛋白N-PmpD能夠作為免疫原應(yīng)用于制備禽鸚鵡熱嗜性衣原體疫苗和診斷試劑盒和/或診斷試劑中。本發(fā)明提供了含有N-PmpD蛋白的疫苗。本發(fā)明提供了含有N-PmpD蛋白的診斷試劑盒和/或診斷試劑。本發(fā)明提供了 N-PmpD蛋白的特異性抗體。本發(fā)明的禽嗜鸚鵡熱衣原體外膜蛋白N-PmpD具有良好的免疫原性，特異性強(qiáng)，通過免疫SPF雞的攻毒保護(hù)試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白具有免疫保護(hù)性，可用于制備疫苗。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)分析該嗜鸚鵡熱衣原體多型外膜蛋白具有種間保守性，利用建立的ELISA方法，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多型外膜蛋白N-PmpD具有較好的臨床診斷價(jià)值，可以開發(fā)其應(yīng)用于制備禽嗜鸚鵡熱衣原體診斷試劑盒或診斷試劑。本發(fā)明的禽嗜鸚鵡熱衣原體外膜蛋白N-PmpD是有潛力的疫苗候選和診斷分子，在預(yù)防和控制禽類衣原體感染方面有良好的應(yīng)用價(jià)值和市場前景。
圖I.為N-PmpD基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M :DNA Ladder 2000 ; I :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;
2:陰性對照。圖2.為 N-PmpD 基因 T/A 克隆鑒定結(jié)果，Ml DNA marker KB ；M2 λ DNA ；Μ3 DNAmarker VIII ；1 :雙酶切產(chǎn)物，2 :雙酶切產(chǎn)物的重復(fù)對照。圖3為誘導(dǎo)后重組蛋白N-PmpD的SDS-PAGE結(jié)果，M :蛋白marker ;1、2 :IPTG誘導(dǎo)后的重組菌；3 :IPTG誘導(dǎo)前的重組菌。圖4為重組蛋白N-PmpD與鸚鵡熱衣原體陽性血清、陰性血清的免疫印跡結(jié)果，M 蛋白；marker ；1 :陽性血清；2、3 :陰性血清。圖5為N-PmpD蛋白純化結(jié)果，M :低分子量蛋白Marker ；1 :PET_32a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)對照；2 :N-PmpD重組質(zhì)粒誘導(dǎo)；3，4 :N_PmpD重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)；5，6 :N_PmpD重組蛋白純化后。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，若未特別指明，實(shí)施例中所用的試劑為市售。實(shí)施例I禽嗜鸚鵡熱衣原體外膜蛋白N-PmpD基因的克隆表達(dá)與N-PmpD蛋白的制備I主要材料與試劑 I. I菌株和質(zhì)粒禽鸚鵡熱嗜性衣原體Cal-IO株，美國馬里蘭大學(xué)Patrick教授饋贈，本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌T0P-10、BL21(DH3)，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，表達(dá)載體pET-32a(+)為Novagen公司產(chǎn)品本實(shí)驗(yàn)室保存，DNA Ladder 2000，購自北京中科瑞泰生物科技有限公司。Ml DNA marker KB ；M2 λ DNA ；Μ3 DNA markerVIII,均購自大連TAKaLa生物技術(shù)有限公司。I. 2試劑PCR-Mix反應(yīng)液(含反應(yīng)緩沖液、dNTP混合液)，PBS-T II Vector, Sal
I、Not I等限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶及DNALadder1500、λ DNA/HindIII購自大連寶生物工程有限公司；IPTG(異丙基-β-D-半乳糖苷)、蛋白酶K購自Merk公司(北京)；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化(北京)科技有限公司；ΝΙ-ΝΤΑ親和柱購自GE公司產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒、HRP標(biāo)記的兔抗雞的抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；弗氏完全佐劑和不完全弗氏佐劑購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞鸚鵡熱衣原體標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清本實(shí)驗(yàn)室自備，用鸚鵡熱衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株SI株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)對SPF雞進(jìn)行攻毒，然后采集分離雞的血清，用IHA方法鑒定陽性和陰性血清。I. 3引物的設(shè)計(jì)及N-PmpD蛋白核酸序列和蛋白序列根據(jù)所要擴(kuò)增的片段，設(shè)計(jì)一對引物Ρ1/Ρ2，引物兩端分別添加NotI和SalI酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，引物和擴(kuò)增Cal-IO菌株N-PmpD基因N端的全長。其引物序列分別為上游引物Pl :5' -GGCgtcgacGTTGCGGCGGTGCGATTTATT-3;，其 5’端下劃線部分為SalI酶切位點(diǎn)下游引物P2 :5' -AATAgcggccgcCAAAACAGCCCCACCTGTAGGAGCA-3 '，其5’端下劃線部分為NotI酶切位點(diǎn)。。I. 4PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按下面進(jìn)行表I 25 μ L PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.禽嗜嬰鳥踏熱衣原體(Chlamydophilapsittaci)外膜蛋白N-PmpD,其為1)由SEQID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或 2)在SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述的蛋白的N-PmpD基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的N-PmpD基因，其是如下a)或b) a)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. I所示；或 b)由SEQID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸,得到編碼N-PmpD蛋白的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的細(xì)胞系。
6.一種制備權(quán)利要求I所述蛋白N-PmpD的方法,其特征在于包括如下步驟 a)PCR方法擴(kuò)增N-PmpD基因； b)將N-PmpD基因?qū)氡磉_(dá)載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，最后分離純化獲得； 其中步驟a) PCR方法所用的引物序列為 上游引物5’ -GGCgtcgacGTTGCGGCGGTGCGATTTATT-3’，其 5’ 端下劃線部分為 SalI 酶切位點(diǎn)； 下游引物5’ -AATAgcggccgcCAAAACAGCCCCACCTGTAGG AGCA-3’，其5’端下劃線部分為NotI酶切位點(diǎn)。
7.含有權(quán)利要求I所述N-PmpD蛋白的疫苗。
8.含有權(quán)利要求I所述N-PmpD蛋白的診斷試劑盒和/或診斷試劑。
9.權(quán)利要求I所述N-PmpD蛋白的特異性抗體。
10.權(quán)利要求I所述N-PmpD蛋白在制備預(yù)防禽嗜鸚鵡熱衣原體疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種禽嗜鸚鵡熱衣原體(Chlamydophila psittaci)外膜蛋白N-PmpD及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的N-PmpD蛋白其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了編碼上述蛋白的基因。實(shí)驗(yàn)表明該N-PmpD蛋白具有良好的免疫原性，可作為免疫原提高禽類對禽嗜鸚鵡熱衣原體感染的抵抗力，且免疫效果良好。
文檔編號A61P31/00GK102643336SQ20121012520
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者何誠, 凌勇, 楊君敬, 袁吉磊 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)