專利名稱：一種適用于肺癌分子影像診斷的小分子肽探針及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學技術領域，具體涉及適用于肺癌分子影像診斷的特異性小分子肽探針及其制備方法，以及其在制備肺癌影像診斷試劑中的應用。
背景技術：
肺癌已成為我國人群特別是城市居民中發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，目前肺癌高死亡率的主要原因是因為80%以上的肺癌就診時已屬晚期，失去了最佳的治療時機，而I期肺癌患者的5年生存率可達80%以上。肺癌的早期診斷將有助于提高肺癌患者生存率和降低死亡率。臨床肺癌診斷的主要手段目前仍是影像技術，隨著現代影像檢查設備和技術的不斷改進和發展，明顯提高了肺癌早期診斷的陽性率，但無論CT、PET，還是MRI技術，對于肺癌早期診斷的特異性和敏感性均有待于提高。分子影像學的創建為肺癌高特異性和敏感性診斷方法的建立提供了一個非常重要的研究平臺，分子探針是分子影像技術的關鍵因素，也是分子影像學研究的先決條件。目前研究最為廣泛的分子探針根據所用影像學技術的不同，可分為(1)核醫學探針。同位素標記ανβ3整合素和VEGF的分子探針在動物模型中顯示了令人滿意的腫瘤血管成像。(2) MRI探針。Gd-DTPA標記ανβ3整合素單克隆抗體或小分子肽RGD，MRI顯示兔或裸鼠動物模型腫瘤血管，發現標記α νβ 3整合素單克隆抗體能顯著提高MRI的敏感性。(3)光學探針。由于光學成像技術的穿透力有限，光學探針僅用于小動物模型的研究。小分子探針相對于大分子抗體探針，具有分子量小，組織穿透性好，更易到達靶細胞，無免疫源性，可大批量合成，制作成本低及易于標記等特點，因此，小分子探針較大分子探針有更好的臨床應用前景。目前已應用于臨床影像研究的小分子探針有(I)生長抑素探針適用用于胃腸道和支氣管神經內分泌癌、垂體腺瘤、副神經節瘤等診斷；(2) CCK探針用于甲狀腺髓樣癌診斷；(3)蛙皮素探針適用于乳腺癌和前列腺癌的診斷；(4) RGD探針適用于各種實體腫瘤的血管顯像。迄今為止國內外尚未見有關肺癌特異性分子探針的成功研究報道。
發明內容
針對現有技術中所存在的不足，本發明的一個目的是提供一種能與肺癌細胞特異性結合的小分子肽。本發明的另一個目的是提供一種適用于肺癌分子影像診斷的特異性小分子肽探針及其制備方法。本發明的另一個目的是提供上述小分子肽探針在制備肺癌影像診斷試劑中的應用。
本發明所采用的技術方案是
一種小分子肽，其為含有XGXG結構的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個氨基酸中的任一種。所述的小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。一種小分子肽探針，由放射性同位素標記小分子肽后所得，所述小分子肽為含有XGXG結構的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個氨基酸中的任一種。所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨 酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。所述放射性同位素為99mTc、mIn、18F-FDG、68Ga、64Cu中的任一種。一種小分子肽探針的制備方法，包括如下步驟
(1)將小分子肽與螯合劑S-acetyI-MAG3(巰基乙酰三甘氨酰_N_羥基丁二酰亞胺酯)偶聯后得到小分子肽-MAG3復合物；
(2)用放射性同位素標記小分子肽-MAG3復合物得到小分子肽探針；
所述小分子肽為含有XGXG結構的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個氨基酸中的任一種；
所述放射性同位素為99mTc。所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。以上所述的小分子肽探針在制備肺癌分子影像診斷試劑中的應用。本發明的有益效果在于
(1)本發明的小分子肽能與肺癌細胞特異性結合，為肺癌的特異性診斷及治療提供了新的方法；
(2)本發明利用放射性核素標記小分子肽制備的小分子探針，可在體內對肺癌細胞示蹤成像，適用于肺癌患者的分子影像診斷及鑒別診斷，可增加肺癌成像的敏感性和特異性，對提高肺癌的早期陽性診斷率有重要的臨床意義。
圖I是小分子肽cNGEGQQc_MAG3的質譜分析圖。圖2小分子肽cNGEGQQc_MAG3的HPLC分析圖。圖3采用紙層析法分析小分子肽探針99mTC-CNGEGQQC的體外穩定性實驗結果圖(A是丙酮系統是氨水/乙醇/水混合物系統)。圖4小分子肽探針99mTc-cNGEGQQc在小鼠體內的分布情況圖。圖5 "mTc-cNGEGQQc在兔體內的SPECT動態顯像圖(I幀/秒，采集Imin )。圖6 "mTc-cNGEGQQc在兔體內的SPECT動態顯像圖(I幀/min，采集5min)。圖7 "mTc-cNGEGQQc在兔體內的SPECT動態顯像圖(I幀/5min，采集30min)。圖8利用ROI感興趣區分析技術獲取心臟、肝脾、腎臟和膀胱的時間-放射性曲線圖(I為兔動態顯像圖各臟器ROI感興趣區勾畫；2為心臟的時間-放射性曲線圖；3為脾臟的時間-放射性曲線圖；4為肝臟的時間-放射性曲線圖；5為腎臟的時間-放射性曲線圖；6為膀胱的時間-放射性曲線圖)。圖9靜脈注射99mTC-CNGEGQQC后I. 5h兔前位及后位全身SPECT顯像。
圖10肺癌裸鼠模型(L78細胞)小分子肽探針99mTC-cNGEGQQc SPECT顯像圖(箭頭所示為移植瘤部位放射性濃聚情況)。圖11肺癌裸鼠模型(H1975細胞)小分子肽探針SPECT顯像圖(A圖為尾靜脈注射"mTc-cNGEGQQc后2h的顯像圖；B圖為尾靜脈注射99mTC-cNAQAEQc后2h的顯像圖)(箭頭所示為移植瘤部位放射性濃聚情況)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。實施例I
I、利用固相合成方法制備小分子肽cNGEGQQc (SEQ ID NO. I)
(1)稱取Ig表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，用二甲基酰胺洗滌3次，然后在二甲基 酰胺浸泡至珠子充分腫脹；
(2)加入半胱氨酸和N，N’- 二異丙基碳二亞胺，室溫下反應2小時后，用DMF洗滌珠子5次，接著加入20% (v/v)的哌啶，在室溫下反應5 min，再加入20% (v/v)的DMF，反應15min,完全脫去Fmoc保護基；
(3)按步驟(2)方法依次偶聯L型天冬酰胺-L型甘氨酸-L型谷氨酸-L型甘氨酸-L型谷氨酰胺-L型谷氨酰胺-D型半胱氨酸；
(4)將連接完最后一個氨基酸的珠子經25%(v/v)的三氟乙酸洗滌一次，蒸餾水洗滌3
次；
(5)用無水氟化氫將小分子肽從樹脂珠子上切下，同時脫除所有側鏈保護基。還原產物在30% (v/v)乙酸高度稀釋下用碘作氧化劑，使分子內2個半胱氨酸氧化形成二硫鍵。經Sephadex-G-15柱層析,透析和高效液相層析分離純化，獲得在反相高效液相層析(分析柱)為單一峰的高純度產物。2、小分子肽探針99niTc-cNGEGQQc的制備
(I)小分子肽與螯合劑S-acetyl-MAG3 (巰基乙酰三甘氨酰_N_羥基丁二酰亞胺酯)偶聯后得到復合物cNGEGQQc-MAG3 [乙酰化巰基乙醇-GGG (D-Cys) cNGEGQQc (D-Cys)]，理論分子量為1125. 05，質譜測量其分子量為1146. 84(見附圖I)，HPLC法監測其純度為96%(見附圖2)。螯合劑小分子肽的偶聯采用下列技術路線①SATA (s-乙酰基巰基乙酰-N-羥基丁二酰亞胺)的合成巰基乙酸和乙酸酐(二者摩爾比為1:1. I)在室溫下反應4d，反應產物以減壓蒸餾(115 125°C、2 3mmHg)純化，得到高純度的乙酰化巰基乙酸。75mmol乙酰化巰基乙酸與75mmol羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)溶解于150ml 二氧雜環乙烷中，在4°C條件下與75mmol 二環己基碳二亞胺(DCC)反應16h，過濾去除二環已脲，溶劑經真空凍干后用異丙醇2次重結晶而得到SATA。②小分子短肽cNGEGQQc-MAG3復合物的合成按照上述I的方法，采用自動多肽合成儀常規固相法合成目標多肽cNGEGQQc，并在合成過程中直接在其N端連接3個甘氣酸，且在最后Iv甘氣Ife接完后，去保護，加入I倍摩爾量的SATA、7倍摩爾量的3mDIEA ( 二異丙基乙胺)及3倍摩爾量的HBTU (I-羥基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸鹽)和3倍摩爾量的HOBT (I-羥基苯并三唑)反應60min，茚三酮反應檢測為黃色即可。然后用NMP (N-甲基吡咯烷酮)、DCM (二氯甲烷)交替洗6次抽干。把切割液(Iml乙二硫醇，Iml苯甲硫醚,0. 5g苯酹,0. 4ml H2O, O. Iml三異丙基娃燒)倒入樹脂中，反應7h左右后抽濾，用乙醚沉淀、離心4次，最后晾干，純化得cNGEGQQc-MAG3，產物經HPLC鑒定。即在合成cNGEGQQc過程中直接完成與MAG3的偶聯。(2)采用間接標記法實現99mTc標記復合物cNGEGQQc_MAG3，具體方法參照文獻進行(Winnard P, et al. Nucl Med Biol, 1997，24 :425_432)，并略作改進。標記緩沖液為O. 25 mol/L的NaHC03、0· 18 mol/L氨水、O. 125 mol/L醋酸銨混合液，反應總體積125 μ 1，小分子肽(cNGEGQQc-MAG3)含量為20 μ g，新鮮淋洗的99mTc04_淋洗液的放射性活度為3. 7 X IO7Bq,搖勾后水浴箱中反應完成標記。對影響標記結果的5個重要因素分別選取4種不同水平酒石酸亞錫用量分別為O. 25U>5U0yg/ul ;反應體系最終pH值分別為2、4、7. 6、10. O ;反應溫度分別為25、37、75UOO0C ;反應時間分別為10、20、30、60min (反應過程中氮氣密封)；轉鰲合劑酒石酸鉀鈉的終濃度分別為O. 5、1、3. 5、10μ g/μ 1，采用正交設計進行分析，以尋找最佳標記條件。因素與水平設計見表1，正交表及實驗結果見表2。
權利要求
1.一種小分子肽，其為含有XGXG結構的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個氨基酸中的任一種。
2.根據權利要求I所述的小分子肽，其氨基酸序列為cNGEGQQc(SEQ ID NO. 1)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。
3.一種小分子肽探針，由放射性同位素標記小分子肽后所得，所述小分子肽為含有XGXG結構的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個氨基酸中的任一種。
4.根據權利要求3所述的小分子肽探針，其特征在于，所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. I)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。
5.根據權利要求3所述的小分子肽探針，其特征在于，所述放射性同位素為99mTc、111In, 18F-FDG,68Ga,64Cu 中的任一種。
6.一種小分子肽探針的制備方法，包括如下步驟 (1)將小分子肽與螯合劑S-acetyI-MAG3(巰基乙酰三甘氨酰_N_羥基丁二酰亞胺酯)偶聯后得到小分子肽-MAG3復合物； (2)用放射性同位素標記小分子肽-MAG3復合物得到小分子肽探針； 所述小分子肽為含有XGXG結構的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個氨基酸中的任一種； 所述放射性同位素為99mTc。
7.根據權利要求6所述的小分子肽探針的制備方法，其特征在于，所述小分子肽的氨基酸序列為cNGEGQQc (SEQ ID NO. I)，其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。
8.權利要求3 5任一項所述的小分子肽探針在制備肺癌分子影像診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種適用于肺癌分子影像診斷的小分子肽探針及其制備方法。所述小分子肽探針由放射性同位素99mTc標記小分子肽后所得，所述小分子肽為含有XGXG結構的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X為20個氨基酸中的任一種，該小分子肽能與肺癌細胞特異性結合。本發明的小分子肽探針可在體內對肺癌細胞示蹤成像，適用于肺癌患者的分子影像診斷及鑒別診斷，可增加肺癌成像的敏感性和特異性，對提高肺癌的早期陽性診斷率有重要的臨床意義。
文檔編號A61K103/10GK102643331SQ20121012360
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月25日 優先權日2012年4月25日
發明者劉亞杰, 李貴平, 郭琳瑯, 陳珍珠 申請人:南方醫科大學珠江醫院