專利名稱：Nalp3-asc炎癥復合體及其激活抑制劑在制備朊病毒病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及NALP3-ASC炎癥復合體及其激活抑制劑的制藥用途，具體地，涉及NALP3-ASC炎癥復合體及其激活抑制劑在制備朊病毒相關疾病的藥物中的用途。
背景技術：
朊病毒(Prion)病，又稱為傳染性海綿狀腦病(TSEs)，是ー種致死性神經退行性疾病，以腦空泡化、神經元死亡和神經小膠質細胞增生為主要特征。該病是由于細胞朊蛋白 (PrPc)構象發生了變化，轉為病理型(PrPse)而引起的。PrPse具有蛋白酶抗性，含有更多的β折疊，而替代了正常的α螺旋結構。現已證實異常形態朊蛋白(PrPse)的累積是引起該病的主要原因。近年來，國內外學者針對Prion疾病靶向藥物的篩選做了許多研究。如，有研究報道，阿司匹林和ERK抑制劑PR98059可以抑制PrP106_126誘導的PrPG和ERK1/2的表達，進而減輕了其對神經元的損傷作用；還有報道，根據PrP序列人工合成的ー些單克隆抗體，如anti-PrP219-232、Fab D18等，通過體內外試驗發現有抑制PrPG與PrPse結合及轉變的作用，進而降低PrPse的聚集；另有研究報道，由于缺乏脯氨酸的蛋白質易于形成β折疊，因此，人工合成了ー個含有3個脯氨酸殘基的13肽(iPrP13)，用于細胞和小鼠試驗后發現，不僅可抑制PrPG的折疊，還可阻止PrPG變成PrPse,該13肽被稱為“ β折疊破壞剤”，有一定的治療前景。還有很多Prion疾病治療方面的研究，但探尋更有效的靶向位點與治療手段一直是Prion疾病研究的熱點與方向。在Prion感染的腦內，PrPse聚集的周圍常出現激活的神經小膠質細胞，而且神經小膠質細胞的激活在朊病毒病的發病機制中起著關鍵性的作用。大量研究表明，PrPse積聚可導致神經小膠質細胞活化，多種細胞因子和趨化因子的表達上調，包括白介素1β (IL-Ιβ)、腫瘤壞死因子(TNF)和趨化因子(C-C motif)配體3 (CCL3)等。其中IL-1 β在免疫調控和炎性反應中發揮著重要作用。IL-I β是由胞質中無生物活性的IL-I β前體產生的，而多種刺激可以導致pro-IL-Ιβ更高水平的表達。無活性的IL-Ιβ前體可通過蛋白酶caspase-Ι的催化,轉變為成熟而有活性的IL-I β。ー些研究表明，體外合成的朊蛋白神經毒性片段可激活鼠神經小膠質細胞，并導致IL-I β的生成増加。IL-I β已經證明在prion疾病中起著重要作用，盡管PrPse可以導致小膠質細胞產生IL-1 β，但是目前PrP106-126誘導釋放IL-I β的機制還不清楚。炎癥復合體是存在于細胞質基質中的多蛋白復合體，作為通過caspase-Ι催化激活促炎因子IL-I β和IL-18的平臺。炎癥復合體在天然免疫途徑中發揮著重要作用，并在炎癥疾病中發揮激活作用。到目前為止，確定了ー些炎癥復合體，其中研究最多的是NALP3炎癥復合體(NACHT，LRR和PYD結構域-含蛋白3)或者CIASl (家族性冷致的炎癥綜合征
I)。復合體包括Nod樣受體(NLR)NALP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和pro-caspase-Ι，病原相關分子模型和內源性的危險信號可以激活復合體。
雖然有大量文獻報道了 Prion誘導神經小膠質細胞釋放IL-I β，但是沒有闡明朊病毒使神經小膠質細胞呈激活狀態，并釋放IL-I β的機制。若能探明朊病毒誘導釋放IL-I β的機制，則有助于調節朊病毒感染神經細胞后釋放IL-I β的過程，篩選prion或其它神經退行性疾病中的藥物治療靶位點，為進一步制備預防或控制朊病毒病或其它神經退行性疾病的藥物提供指導。
發明內容
本發明的目的在闡明朊病毒誘導釋放IL-I β的機制，提供NALP3-ASC炎癥復合體及其抑制劑的制藥用途。
本發明的另一目的在于提供一種篩選抗Prion疾病藥物的方法。本發明通過以下實驗方案闡明朊病毒誘導小鼠神經小膠質細胞(BV2)釋放IL-I β的機制。技術路線見圖I。(I)無菌分離小鼠原代或傳代小膠質細胞進行培養。(2)朊病毒攻毒小鼠原代小膠質細胞以及傳代細胞，分別于3h、6h、12h、24h取細胞上清，然后用ELISA的方法檢測不同時間段上清中的IL-I β的含量。(3)朊病毒攻毒細胞后提取細胞胞漿蛋白，用Western blot的方法檢測有無pro-caspasel的活化產物caspaselp20片段產生。(4)用熒光定量PCR的方法檢測朊病毒攻毒小膠質后，不同時間點細胞內NALP3蛋白和ASC蛋白表達量的變化。(5)分別設計針對NALP3和ASC蛋白的特異性siRNA，摸索最佳的干擾條件，以及最佳的干擾條件下NALP3基因和ASC基因的干擾效率，分別采用熒光定量PCR和westernblot的方法。(6)分別在兩種SiRNA干擾效果最佳的情況下用朊病毒攻毒干擾后的細胞，然后在特定的時間點提取細胞上清進行IL-I β的ELISA檢測，確定干擾這兩種蛋白以后是否會引起細胞分泌IL-I β的變化。(7)干擾Nalp3和ASC蛋白后，用朊病毒攻毒，然后用熒光定量的方法檢測細胞內TNF- α以及趨化因子CCL3和CXCLlO的變化情況。(8)綜合以上數據，闡明NALP3-ASC炎癥復合體在朊病毒引起小鼠microglia產生IL-I β中的作用，并證明NALP3-ASC炎癥復合體與其它促炎因子以及趨化因子的關系。IL-I β是由caspasel活化pro-IL-l β產生的活性片段，caspasel是一種半胱氨酸蛋白酶，正常情況下以pro-caspasel的無活性形式存在于細胞質中，激活時，pro-caspasel會活化為兩個活性片段ρ10和p20。IL-I β的產生需要由pro-IL-l β的存在，而pro-IL-Ιβ的產生需要另外一個通過NF-κ B的途徑來產生。實驗結果表明，NALP3-ASC炎癥復合體能夠導致pro-caspasel活化產生caspasel,活化的caspasel進而催化pro-IL-Ιβ產生IL-I β釋放到細胞外，引起一系列的炎性反應。NALP3-ASC炎癥復合體在prion疾病中作為一個調控因素可以影響機體炎癥的發生，其在PrP106-126誘導釋放IL-I β的過程中發揮促進作用，當PrP106-126刺激神經小膠質細胞時，NALP3-ASC炎癥復合體促進了 caspase-Ι和IL-I β的激活。本發明利用SiRNA技術分別沉默NALP3和ASC蛋白后，發現IL-I β的產生顯著降低。雖然基因沉默后仍有可檢測到IL-I β存在，但是這可能是由于沉默不能代表完全不表達，或者是另外有別的途徑導致IL-I β的產生。本發明還發現抑制NF-K B的激活可以抑制PrP106-126引起的NALP3和ASC表達量上升，這也證實了 NF-κ B可能作為NALP3炎癥復合體的上游調節環節，對該過程起著控制性作用。在prion疾病中，已經證明感染的腦組織中促炎因子表達量增多，并不斷向淀粉樣物質沉積處聚集，引起局部的免疫反應。本發明利用siRNA技術沉默NALP3和ASC蛋白后，可以顯著降低由PrP106-126引起的TNF和CCL3兩種細胞因子的表達水平。進ー步地，本發明提供了 NALP3-ASC炎癥復合體在制備調節朊病毒神經毒性片段PrP106-126誘導神經小膠質細胞釋放IL-I β過程的藥物中的用途。進ー步地，本發明提供了 NALP3-ASC炎癥復合體在制備激活caspase-Ι和IL-1 β過程的藥物中的用途。 進ー步地，本發明提供了 NALP3-ASC炎癥復合體在制備引起BV2細胞激活過程的藥物中的用途。本發明提供了 NALP3-ASC炎癥復合體激活抑制劑在制備預防和/或治療朊病毒病藥物中的應用。其中，所述的NALP3-ASC炎癥復合體激活抑制劑通過如下機制來實現其治療和預防功效，朊病毒感染引起神經小膠質細胞激活，進而通過形成NALP3-ASC炎癥復合體，增強了 caspase-Ι和IL-I β的激活，所述NALP3炎癥復合體激活抑制劑阻斷或抑制了NALP3-ASC炎癥復合體的形成，從而起到預防、治療或控制朊病毒疾病的作用。其中，所述的NALP3-ASC炎癥復合體激活抑制劑選自NF- κ B激活抑制劑、鉀離子溶液和/或N-こ酰半胱氨酸(NAC)。所述的NF-K B激活抑制劑為Bay 11-7082。本發明還提供了 NALP3-ASC炎癥復合體在篩選抗Prion疾病藥物中的應用。本發明提供了ー種篩選抗Prion疾病藥物的方法，是將待測樣品與朊病毒共刺激神經細胞，提取處理后細胞總RNA，用qPCR方法檢測NALP3-ASC炎癥復合體，根據PCR擴增結果判斷樣品對NALP3和ASC的mRNA表達抑制情況，篩選能夠抑制NALP3和ASC表達即抑制NALP3-ASC炎癥復合體的待測樣品，即為抗Prion疾病藥物。上述方法，還包括在待測樣品與朊病毒共刺激細胞前處理神經細胞的步驟，具體為用300ng/ml的脂多糖(LPS)預刺激細胞3h,然后再進行攻毒實驗。在本發明的一個實施例中，使用的朊病毒為朊病毒神經毒性片段PrP106_126，攻毒用終濃度為100 μ M ;使用的神經細胞為BV2細胞。上述篩選抗Prion疾病藥物的方法所述的qPCR方法檢測NALP3和ASC所使用的引物為NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5，-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3，；ASC，上游5 ’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3 ’，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，。反應體系為熒光定量dNTP Mix，10 μ 1，上下游引物各0.5 μ 1，模板I μ 1，加水補充到20 μ I。
在本發明的一個實施例中，所用的待測樣品為KCL溶液和NAC溶液，經過篩選發現130mM的KCL和IOmM的NAC能夠抑制NALP3和ASC的表達。本發明闡明了朊病毒誘導釋放IL-I β的機制，指出NALP3-ASC炎癥復合體在調節朊病毒感染神經細胞后釋放IL-I β的過程中發揮重要促進作用。NALP3-ASC炎癥復合體在朊病毒病中作為ー個調控因素影響機體炎癥的發生，當朊病毒刺激神經小膠質細胞吋，NALP3-ASC炎癥復合體促進了 caspase-Ι和IL-1 β的激活。通過篩選能夠抑制NALP3-ASC炎癥復合體激活的靶位點，為進一歩制備預防或控制朊病毒病或其它神經退行性疾病的藥物提供指導。本發明方法通過考察樣品對NALP3-ASC炎癥復合體的抑制作用來篩選獲得抗朊病毒病的藥物。結果表明，利用本發明方法篩選得到的3種化合物均對NALP3-ASC炎癥 復合體的激活具有抑制作用的物質。
圖I為本發明研究NALP3-ASC炎癥復合體對朊病毒誘導IL-I β釋放作用的技術路線圖。圖2顯示PrP106_126攻毒可以導致小鼠小膠質細胞IL-Ιβ的釋放。細胞先用300ng/ml 的 LPS 預刺激 3h，然后用 PrP106-126 或 Scr-PrP(100 μ Μ)刺激 6h, IL-I β 的釋放濃度用ELISA方法進行檢測；a代表原代小鼠小膠質細胞，b代表BV2傳代細胞系，*P< O. 05，代表差異顯著。圖3顯示PrP106_126攻毒可以導致caspasel的激活。細胞先用300ng/ml的LPS預刺激3h，然后用PrP106-126或Scr-PrP (100 μ Μ)刺激6h，caspasel的活化片段(p20)采用western blot的方法檢測，a代表BV2傳代細胞系，b代表小鼠腹腔巨噬細胞系ANAl。圖4為PrP106-126刺激BV2細胞導致NALP3和ASC的表達量升高。PrP106_126刺激細胞后，于不同的時間段收集細胞總RNA，用qPCR的方法檢測NALP3和ASC兩種蛋白mRNA水平的變化，*P < O. 05，代表差異顯著。圖5為PrP106-126引起BV2細胞產生IL-Ιβ的過程需要NALP3炎癥復合體的參與。BV2細胞分別用si_NALP3和si_ASC進行沉默，a代表沉默后qPCR的檢測結果，b代表沉默后western blot的檢測結果；c代表分別沉默后，用PrP106_126進行攻毒,然后用ELISA的方法檢測上清中IL-I β的含量，*P < O. 05，代表差異顯著。WT :正常細胞；N_i :陰性感染對照；NALP3-i NALP3干擾；ASC_i :ASC干擾。圖6為NALP3炎癥復合體對TNF和CCL3的表達變化起著調控作用。NALP3和ASC沉默后，用PrP106-126攻毒，然后收集細胞總RNA，檢測促炎因子TNF和趨化因子CCL3的mRNA變化，*P < O. 05,代表差異顯著。圖7表明PrP106_126弓丨起NALP3炎癥復合體的激活需要NF- κ B的參與。a，PrP106-126刺激BV2細胞，然后分別于6h、12h和24h取細胞質和細胞漿蛋白，用westernblot的方法檢測活化的NF- κ B p65片段。b，BV2細胞先用不同濃度的NF- κ B的特異性抑制劑Bayl 1-7082預處理lh，然后用PrP106_126攻毒，6h后取細胞總RNA，用qPCR的方法檢測NALP3和ASC蛋白mRNA水平的變化情況，*P < O. 05，代表差異顯著。圖8為130mM的K+和10 μ M的NAC可以抑制PrP106_126引起的IL-1 β分泌。LPS預刺激的BV2分別與KCL和NAC共刺激細胞，6h后取細胞上清和總RNA分別檢測IL-I β (a)和NALP3炎癥復合體的表達(b)，*P < O. 05，代表差異顯著。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I NALP3-ASC炎癥復合體在朊病毒誘導細胞釋放IL-I β中的作用I、材料與方法I. I 試劑兔抗鼠caspasel、NALP3 和 ASC 抗體分別購于 BioVision, Abcam 和 Santa Cruz 公司；兔抗鼠NF-kappaB p65抗體，β actin和Max抗體購自碧云天公司；LPS和N-乙酰半胱氨酸(NAC)購自Sigma, IL-I β檢測試劑盒和蛋白快速沉淀濃縮試劑盒購自武漢博士德公司；羊抗兔二抗、Bay 11-7082購自碧云天生物公司。I. 2小膠質細胞的分離與培養原代細胞的分離參照已有的文獻(Kingham PJ, Cuzner ML, Pocock JM. 1999.Apoptotic pathways mobi-lized in microglia and neurones as a consequence ofchromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem73 :538-547)進行操作。BV2細胞系和小鼠腹腔巨噬細胞系(ANA1細胞系)購自協和醫科大學，細胞用DMEM-F12培養基在37°C含5% CO2的溫箱中培養。I. 3Prion 多肽PrP106-126 氨基酸序列為 KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG (SEQ ID NO. I)。Scr-PrP 序列為AVGMHAGKGLANTAKAGAMVG (SEQ ID NO. 2)，由上海生工合成，多肽的純度達到95%。多肽在O. IM的PBS中溶解成ImM濃度，然后再37°C放置12h，實驗用終濃度為100 μ M。I. 4多肽處理小膠質細胞先用300ng/ml濃度的LPS刺激3h，之后棄去細胞上清，用PrP106_126進行攻毒，Scr-PrP作為陰性對照每個實驗做3次重復。K離子抑制和NAC抑制實驗中，細胞先用LPS處理3h，然后用終濃度為130mM的KCL和PrP或者15mM的NAC和PrP進行共處理。1.5SiRNA 干擾NALP3和ASC采用siRNA的方法進行沉默，干擾序列以及試劑購自QIAGEN。細胞在12孔板中鋪入O. 8 X IO5個細胞，過夜培養。干擾時的siRNA終濃度為ΙΟηΜ，干擾方法按照QIAGEN公司的操作說明進行。NALP3和ASC的干擾效率分別用熒光定量PCR和Westernblot的方法檢測。I. 6細胞上清中IL-I β的檢測細胞攻毒后的上清用ELISA的方法檢測上清中IL-I β的含量。I. 7RNA的提取、cDNA的合成和定量PCR細胞總RNA的提取使用Promega公司的RNA提取試劑盒,使用Fermentas公司的反轉錄試劑盒合成cDNA，熒光定量PCR采用SYBERGreen I的方法，實驗所涉及到的引物包括NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5’-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3’ ；ASC，上游5 ’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3 ’，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，；β -actin，上游5，-GCTTCTTTGCAGCTCCTTCG-3，，下游5，-CCTTCTGACCCATTCCCACC-3，； CCL3，上游 5，-TCCCAGCCAGGTGTCATTT-3，，下游5，-GGCATTCAGTTCCAGGTCAG-3，；TNF，上游5，-CCCTTCCTCCGATGGCTAC-3，，下游5，-CGCCTCCTTCTTG TTCTGG-3，。反應體系為dNTP Μ χ，10μ 1，上下游引物各O. 5μ 1，模板1μ 1，加水補充到20 μ 1，最后結果處理采用2_“ct的方法。I. 8細胞核與細胞質蛋白的提取及western blot細胞處理過以后，棄去上清，收集細胞分別提取細胞質和細胞核內的蛋白，然后用所提取的蛋白做western blot。2、結果2. lPrP106_126 可以激活 caspasel 并導致 IL-1 β 的釋放為了研究PrP106_126在誘導小膠質細胞產生炎癥反應方面的作用，用PrP106-126和Scr分別處理原代小膠質細胞和BV2。由于IL-I β的前體需要不同的途徑進行刺激，因此在攻毒前用LPS(300ng/ml)處理3h，使得pro-IL-1 β能夠足夠產生。結果表明，PrP106-126可以刺激原代及BV2膠質細胞產生IL-I β，與對照組相比，PrP106_126引起IL-I β的釋放有著顯著性升高(圖2);同吋，PrP106-126也能導致細胞內caspasel的激活，產生活化的caspasel p20片段(圖3)，而Scr處理組和PBS處理組并沒有出現活化的P20片段。說明PrP106-126能夠引起IL-I β的釋放和caspasel的激活。2. 2PrP106-126刺激細胞可以導致細胞內NALP3和ASC基因mRNA水平上調為了研究NALP3和ASC蛋白是否參與到PrP106_126引起小膠質細胞激活的過程，本發明用PrP106-126刺激BV2細胞，于不同的時間段提取細胞總RNA，然后進行反轉錄PCR,之后用qPCR的方法對NALP3和ASC的mRNA表達水平進行檢測。結果表明，NALP3在所有檢測時間段都有著顯著的升高，而ASC的表達在PrP106-126刺激后24h和36h表達量增加最為明顯(圖4)。結果說明NALP3和ASC兩個蛋白均參與到PrP106_126引起BV2細胞激活的過程中。2. 3PrP106-126弓丨起IL-I β的釋放需要NALP3炎癥復合體的激活NALP3炎癥復合體是由NALP3、ASC蛋白組成復合體，為了研究NALP3復合體是否在PrP 106-126引起BV2產生IL-I β的過程中起作用，本發明設計了針對NALP3和ASC兩種蛋白的基因沉默，利用siRNA的方法對兩種蛋白的表達量分別進行沉默，然后檢測沉默前后IL-I β的變化情況。NALP3和ASC的干擾效率用qPCR和western blot進行檢測，結果顯示，NALP3和ASC的干擾效率分別達到76%和80%。基因沉默后，細胞先用300ng/ml的LPS刺激3h，然后用PrP106-126攻毒，6h后取細胞上清進行IL-I β的ELISA檢測，結果顯示，NALP3和ASC分別干擾后，IL-I β的產生均有顯著地下降(圖5)，說明NALP3炎癥復合體在PrP106_126引起小膠質細胞產生IL-I β的過程中起著重要的作用。2. 4NALP3炎癥復合體的激活能夠促進TNF和CCL3的表達研究表明，prion干擾的小鼠腦勻漿中，可見許多趨化因子以及炎性因子的大量表達，為了驗證促炎因子和趨化因子的表達變化是否和NALP3炎癥復合體有關，本發明對NALP3和ASC沉默的細胞進行攻毒，然后檢測TNF和CCL3兩種典型的促炎因子和趨化因子。結果表明，NALP3和ASC沉默之后，與未沉默組相比，PrP106-126攻毒后TNF和CCL3的表達量均有顯著下降(圖6)，而且TNF的下降程度比CCL3的下降程度更為明顯。這些結果說明NALP3炎癥復合體在調控促炎因子和趨化因子方面起著重要作用。2. 5NF- κ B對于NALP3和ASC的表達起著調控作用細胞在攻毒之前，先用15 μ M NF- κ B的特異性抑制劑Bay 11-7082預處理lh，然后再用100 μ M ΡΓΡ106-126攻毒，收集細胞總RNA，用qPCR的方法檢測NALP3和ASC基因mRNA水平的表達量變化。結果表明，抑制NF- κ B的活性以后，PrP106_126攻毒的細胞NALP3和ASC的表達量有了明顯的下降(圖7)，這說明NF- κ B可能是NALP3和ASC的上游調控因素。實施例2 K+溶液和活性氧簇(ROS)抑制劑NAC通過抑制NALP3和ASC的表達減少IL-I β的分泌用高濃度(130mM)的KCL，和ROS的抑制劑NAC、濃度為10 μ Μ，分別作用于細胞，檢測BV2細胞分別在這兩種試劑的作用下，PrP106-126攻毒后對NALP3炎癥復合體的影響。100 μ M的PrP106-126分別與130mM的KCL和10 μ M的NAC共刺激細胞，6h后取細胞上清檢測IL-I β，ELISA結果顯示KCL和NAC均可以明顯抑制IL-I β的產生(圖8)，另外取處理后的細胞總RNA，用qPCR的方法檢測NALP3和ASC的變化。所用的引物為NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5，-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3，；ASC，上游5 ’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3 ’，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，；熒光定量PCR反應條件為95°C預變性30sec ;95°C變性5sec，53°C退火20sec，72°C延伸30sec，共40個循環；72°C延伸IOmin ;70°C到90°C每O. 2°C讀取溶解曲線，讀取時間 Isec。結果顯示，KCL可以顯著抑制NALP3和ASC的mRNA表達，NAC可以顯著抑制NALP3的mRNA表達，而對ASC的表達量沒有影響，說明NAC是通過對NALP3的抑制來減少IL-I β的釋放。實施例3 NALP3-ASC炎癥復合體激活抑制劑的篩選I、待測樣品處理取KCL和NAC化學分析純級粉末，用PBS稀釋至工作濃度，分別為130mM和10 μ Μ。2、篩選方法建立 將待測樣品與朊病毒神經毒性片段PrP106-126共同刺激BV2細胞，提取處理后細胞總RNA，用qPCR方法檢測NALP3-ASC炎癥復合體，根據PCR擴增結果判斷樣品對NALP3和ASC的mRNA表達抑制情況，篩選能夠抑制NALP3和ASC表達的待測樣品，即為抗Prion疾病藥物。qPCR方法檢測NALP3和ASC所使用的引物為NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5’-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3’ ；ASC，上游5，-GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3，，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，。取130mM 的 KCL 和 10 μ M 的 NAC 與 100 μ M 的 PrP106_126 共刺激 BV2 細胞，6h 后提取處理后的細胞總RNA，用qPCR的方法檢測NALP3和ASC的變化，見圖8b和圖8c。結果顯示，KCL可以顯著抑制NALP3和ASC的mRNA表達，NAC可以顯著抑制NALP3的mRNA表達，而對ASC的表達量沒有影響，說明NAC可能是通過對NALP3的抑制來減少IL-I β的釋放。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.NALP3-ASC炎癥復合體在制備調節朊病毒神經毒性片段PrP106_126誘導神經小膠質細胞釋放IL-I β過程的藥物中的用途。
2.NALP3-ASC炎癥復合體在制備激活caspase-Ι和IL-I β過程的藥物中的用途。
3.NALP3-ASC炎癥復合體在制備引起BV2細胞激活過程的藥物中的用途。
4.NALP3-ASC炎癥復合體激活抑制劑在制備預防和/或治療朊病毒病藥物中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的NALP3-ASC炎癥復合體激活抑制劑通過如下機制來實現其治療和預防功效，朊病毒感染引起神經小膠質細胞激活，進而通過形成NALP3-ASC炎癥復合體，增強了 caspase-Ι和IL-1 β的激活，所述NALP3炎癥復合體激活抑制劑阻斷或抑制了 NALP3-ASC炎癥復合體的形成，從而起到預防、治療或控制朊病毒疾病的作用。
6.如權利要求4或5所述的應用，其特征在于，所述的NALP3-ASC炎癥復合體激活抑制劑選自NF- K B激活抑制劑、鉀離子溶液和/或N-乙酰半胱氨酸。
7.NALP3-ASC炎癥復合體在篩選抗Prion疾病藥物中的應用。
8.一種篩選抗Prion疾病藥物的方法，其特征在于，將待測樣品與朊病毒共刺激細胞，提取處理后細胞總RNA，用qPCR方法檢測NALP3-ASC炎癥復合體，根據PCR擴增結果判斷樣品對NALP3和ASC的mRNA表達抑制情況，篩選能夠抑制NALP3和ASC表達的待測樣品，即為抗Prion疾病藥物。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述朊病毒為朊病毒神經毒性片段PrP106-126，所述細胞為BV2細胞。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述qPCR方法檢測NALP3和ASC所使用的引物為NALP3，上游5’ -ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3’，下游5’ -TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3’ ；ASC，上游5’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3’，下游5’ -CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3’。
全文摘要
本發明公開了NALP3-ASC炎癥復合體及其激活抑制劑在制備朊病毒病藥物中的應用。實驗表明，朊病毒感染神經小膠質細胞，形成NALP3-ASC炎癥復合體增強caspase-1和IL-1β的激活。炎癥復合體NALP3抑制劑能夠抑制NALP3和ASC表達，進而抑制caspase-1和IL-1β的激活和釋放。本發明提供了NALP3-ASC炎癥復合體抑制劑在篩選朊病毒病藥物中的應用，通過將待測樣品與朊病毒共刺激細胞，提取處理后細胞總RNA，用qPCR方法檢測NALP3和ASC，根據PCR擴增結果判斷樣品對NALP3和ASC的mRNA表達抑制情況，從而篩選出抗Prion疾病的藥物，起到預防、治療或控制朊病毒疾病的作用。
文檔編號A61K45/00GK102641501SQ20121011972
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者周向梅, 姚皓, 尹曉敏, 師福山, 楊利峰, 王繼紅, 趙化粉, 趙德明 申請人:中國農業大學