三維殼聚糖水凝膠及其制備方法

專利名稱：三維殼聚糖水凝膠及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物醫藥工程及組織工程技術領域的三維支架材料及其制備方法，該三維支架材料可用于細胞三維培養以及體外擴增，和生物活性物質的控制釋放。
背景技術：
三維支架材料在組織工程中起關鍵作用，它可作為細胞體外培養及增殖的載體， 細胞隨支架材料植入體內后，在體內環境下繼續激增，并與宿主細胞和組織發生交互作用， 形成新的組織，而材料經降解隨新陳代謝排出體外，以達到組織修復的作用。用于組織工程的三維支架材料包括膠原蛋白、殼聚糖以及聚乙烯醇等。其中，殼聚糖是一種線性多糖，它具有親水性、PH敏感性、生物相容性以及生物降解性，這些特有的性質使其被廣泛應用于組織工程支架材料。近年來，在組織工程領域，多孔殼聚糖水凝膠三維支架的制備方法包括冷凍干燥法、溶劑置換法、以及氣體發泡法。其中，冷凍干燥法大致包括如下的步驟(I)溶解將殼聚糖粉末溶解于酸性溶液如O. 2M醋酸水溶液中，制成殼聚糖水溶液；(2)預凍上述水溶液預凍過夜(至少12小時)，冷凍溫度一般控制在_20°C至_196°C ； (3)冷凍抽干上述冷凍殼聚糖溶液置于冷凍干燥器內抽干，抽干時間12-48小時，抽干溫度-80°C至。C;⑷堿洗抽干結束后，得到殼聚糖多孔支架材料用堿液浸如O. IM NaOH泡清洗三遍，再用去離子水浸泡清洗三遍；(5)清洗后殼聚糖支架材料，重復上述步驟(2)和(3)，得到凍干殼聚糖多孔支架材料。另一種常用的制備多孔殼聚糖水凝膠三維支架的方法為溶劑置換法，其包括(I) 溶解將殼聚糖粉末溶解于酸性溶液如O. 2M醋酸水溶液中，制成殼聚糖水溶液；(2)成膜 將上述水溶液平鋪于培養皿中，37°C烘干成薄膜；(3)溶脹將上述殼聚糖薄膜浸泡于去離子水中，待其溶脹，取出；(4)置換將上述溶脹殼聚糖薄膜按次序在10%、20%、40%、 60%、80%、90%和100% (體積比)有機溶劑中浸泡三次，每次10分鐘，將薄膜中水置換成有機溶劑，有機溶劑包括乙醇，二氯甲燒，丙酮，三氯甲烷和甲醇中得一種或多種；(5)干燥將溶劑置換完畢的殼聚糖置于高溫高壓反應器，進行二氧化碳臨界點干燥一小時，得到殼聚糖多孔支架材料。制備多孔殼聚糖水凝膠三維支架的氣體發泡方法則包括如下步驟(I)溶解將殼聚糖粉末溶解于溶劑中，制成殼聚糖溶液；溶劑包括O. 2M醋酸、冰醋酸、二氯甲烷、甲酸、 丙酮和六氟異丙醇中得一種或多種；(2)交聯反應在上述溶液中，加入交聯劑，交聯劑包括戊二醛、京尼平、I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和六亞甲基二異氰酸酯中得一種或多種；然后，將上述殼聚糖-交聯劑混合物置于高溫高壓反應器，以液體(高溫高壓)二氧化碳為介質，進行反應，反應時間為1-12小時；(3)排氣清洗反應結束后，降壓， 排出二氧化碳，降壓速率為1-50大氣壓每分鐘；然后，用去離子水清洗去除溶劑殘留后，得到殼聚糖多孔支架材料。另外，中國專利申請200910024842. X則公開了一種制備光交聯殼聚糖水凝膠膜的方法，其以生物相容性高分子殼聚糖為起始物，通過對其進行化學修飾，在6-0位和N位分別引入羥丙基和疊氮基團，得到水溶性的光可交聯殼聚糖。中國專利200810059134. 5則采用預處理的具有一定酰化度的殼聚糖直接與堿溶液混合，不添加任何交聯劑，經低溫處理，得到殼聚糖物理水凝膠。在中國專利200510061869. 8所公開的制備可用于組織工程的可注射性殼聚糖水凝膠的方法中，采用碳化二亞胺縮合的方法，依次將甲基丙烯酸和乳酸接枝在殼聚糖分子鏈中，所得的殼聚糖衍生物同時具有可聚合的不飽和碳一碳雙鍵和水溶性。然而，現有的這些方法存在這樣或那樣的缺陷，要么操作時間過長，例如冷凍干燥法；要么制備過程中需要大量使用有毒有機溶劑或交聯劑，進而需要專門的溶劑去除步驟， 并對最終產品的毒性物質殘留量需要嚴格檢測和控制，例如溶劑置換法和氣體發泡法，而這也會增加了制備過程的時間和成本。因此，本領域迫切需要提供一種快速，簡單且無需有機溶劑的支架材料的制備方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種快速、簡單、無需溶劑的制備殼聚糖水凝膠三維支架材料的方法以及所得到的殼聚糖水凝膠三維支架材料。本發明的發明人經過廣泛而深入地研究，發現可以通過改進制備工藝可以制得一種性能優越的三維多孔殼聚糖水凝膠，該水凝膠形狀大小可控，孔的排列、孔徑大小分布均勻。具體地，這種三維殼聚糖水凝膠可以用通過高溫交聯法獲得，在該方法中，用酸性溶液， 使殼聚糖粉末溶解并形成溶液，通過改變殼聚糖溶液濃度、最終溶液pH、和反應溫度等參數，對水凝膠孔徑、力學性能、溶脹性、降解時間等性能進行調控，從而本發明所提供的殼聚糖水凝膠在生物醫藥工程，特別是組織工程中具有很大前景。一方面，為實現本發明的目的，本發明提供了一種三維殼聚糖水凝膠的制備方法， 該制備方法包括以下步驟(a)將殼聚糖粉末分散于去離子水溶液中；(b)調節上述步驟(a)所得到的殼聚糖分散液的pH至微酸性；(c)將步驟(b)所得的溶液在80_125°C的溫度下進行高溫交聯；(d)交聯反應結束后，用后處理液浸泡清洗所得產物，以去除殘留酸液。在本發明的制備方法中，以重量百分比計，步驟(a)所配制的殼聚糖分散液的濃度優選為O. 46-2%，更優選為I. 38-1. 84% ο在本發明的制備方法中，步驟(b)中pH優選被調節至6. 0-7.0，更優選被調節至
6.3-6. 9。調節pH所采用的溶液可以為選自如下一組中的一種或一種以上醋酸鹽緩沖溶液、檸檬酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液醋酸、檸檬酸、磷酸、鹽酸和乙二酸；優選為選自如下一組中的一種或一種以上醋酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液和鹽酸。優選地，在本發明的制備方法中，步驟(C)中高溫交聯的溫度控制在105_121°C之間；步驟(c)中高溫交聯的時間控制在15-60分鐘之間。在本發明的一具體實施方式
中，步驟(b)中的緩沖溶液為醋酸鹽緩沖溶液。在本發明的另一具體實施方式
中，步驟(b)中的溶液為酸性磷酸鹽緩沖溶液。在本發明的再一具體實施方式
中，步驟(b)中的溶液為酸性醋酸鹽緩沖溶液。
在本發明的另一具體實施方式
中，步驟(b)中的最終溶液的pH為6. 3。在本發明的另一具體實施方式
中，步驟(b)中的最終溶液的pH為7. 0。在本發明的另一具體實施方式
中，步驟(c)中的反應溫度為80°C，反應時間為30 分鐘。在本發明的另一具體實施方式
中，步驟(c)中的反應溫度為105°C，反應時間為30 分鐘。在本發明的另一具體實施方式
中，步驟(c)中的反應溫度為121°C，反應時間為30 分鐘。作為本發明制備方法的一種優選具體實施方式
是(a)取將殼聚糖粉末分散于去 離子水溶液中；(b)在上述殼聚糖懸浮液中滴加酸性溶液，調節pH，使殼聚糖溶解形成無色 粘稠溶液；(c)將步驟(b)所得的溶液中放入高溫培養箱內培養，獲得多孔殼聚糖水凝膠； (d)用后處理液處理多孔水凝膠，去除酸性殘留物質。其中，所使用的酸性溶液包括醋酸鹽 緩沖溶液、檸檬酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液、醋酸、檸檬酸、磷酸、鹽酸、乙二酸中的一種 或多種，優選醋酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹽酸；殼聚糖重量份濃度為0. 46-2%，優 選1.38-1. 84% ;高溫交聯溫度為80-125°C，優選105-121 °C ;交聯反應時間15-60分鐘； 去除酸性殘留的后處理液為去離子水、中性磷酸緩沖溶液或中性醋酸緩沖溶液的一種或多 種。另一方面，本發明提供了一種采用上述方法制備的三維殼聚糖水凝膠，其中，以重 量百分比計，該水凝膠含有0. 46-2%的殼聚糖，孔徑范圍主要在10-200 u m之間，而且孔徑 在50-80 u m范圍的孔占全部孔的80%以上。優選地，在本發明的三維殼聚糖水凝膠中，含有1. 38-1. 84%的殼聚糖。在本發明的一具體實施方式
中，所制得的水凝膠的尺寸為1-3厘米直徑，0. 5厘米聞。在本發明的另一具體實施方式
中，水凝膠孔徑范圍為10-200 ym，平均孔徑為 60 u m。在本發明的再一具體實施方式
中，水凝膠孔徑范圍為10-60 ym，平均孔徑為 30 u m。作為本發明三維殼聚糖水凝膠的一種具體實施方式
，其水凝膠含有0. 46-2%重 量份殼聚糖和84-92%重量份水，并且水凝膠具有以下特性結構穩定，且尺寸可控；水 凝膠的孔徑范圍為10-200 ym;孔的排列以及孔徑大小分布均勻，孔間相互連通，孔徑為 50-80 u m范圍的孔占全部孔的80%以上。再一方面，本發明提供了一種用于制備皮膚或軟骨組織工程的支架材料，其中，該 支架材料是采用上述的三維殼聚糖水凝膠制得的。其中，該水凝膠含有0. 46-2%重量份殼 聚糖和84-92%重量份水,孔徑范圍為10-200 u m,而且孔徑為50-80 u m范圍的孔占全部孔 的80%以上。又一方面，本發明還提供了上述三維殼聚糖水凝膠在制備皮膚或軟骨組織工程之 支架材料方面的用途，或者作為藥物控釋載體方面的用途。本發明的三維殼聚糖水凝膠可 作為組織工程的支架材料，適用于軟骨、皮膚、肝等組織或器官的修復和再生。殼聚糖屬天然高分子材料，而本發明提供的三維殼聚糖水凝膠可作為組織工程支架材料，具有組織工程材料的一般特性，有良好的生物相容性和生物降解性，又具有特定形狀和連通的三維多孔結構。本發明提供的三維殼聚糖多孔水凝膠，其具有均一的孔型；且孔徑大小均勻，孔徑范圍為10-200 μ m，優選為50-100 μ m;孔與孔之間的連通性好，其內表面積大，具有良好的
表面活性。本發明提供的三維殼聚糖支架材料可作成多種規則或不規則形狀，易于重復操作，在植入體內一個月后仍能保持原有形狀。本發明提供的三維殼聚糖多孔支架材料的機械強度好，便于前期操作。本發明提供的三維多孔殼聚糖水凝膠的主要優點在于孔結構均勻、連通性好、孔徑范圍大；具有較高的機械強度，容易成型，而且性能可控；高溫交聯法制備工藝簡單，反應時間短，原料無需特殊處理，適合各種規模生產；制備過程不引入交聯劑等較高毒性的化學物質，最終產品無任何化學毒物，非常適合作為皮膚、軟骨等軟組織工程支架材料。下面結合附圖和具體實施方式
，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有百分比和分數按重量計。


圖I是本發明的殼聚糖水凝膠支架材料I的照片(a)塊體照片；(b)掃描電鏡圖片;圖2是本發明的殼聚糖水凝膠支架材料II的掃描電鏡照片；圖3是本發明的殼聚糖水凝膠支架材料III的掃描電鏡照片；圖4是本發明中成纖維細胞接種在殼聚糖水凝膠支架材料I上，培養14天后的掃描電鏡照片；圖5是本發明中成纖維細胞接種在殼聚糖水凝膠支架材料I上后，MTT吸收值隨時間的變化圖。
具體實施方案實施例I制備殼聚糖多孔水減月父I將I. 5g殼聚糖放入90ml去離子水，室溫下磁力攪拌使殼聚糖均勻分散于水中。于分散液中緩慢滴加入IOml醋酸-磷酸鹽緩沖溶液，調節pH至6. 5，并使殼聚糖完全溶解后倒入模具，放入高溫培養箱，80°C下進行高溫交聯30分種，得到多孔殼聚糖水凝膠粗產品。將殼聚糖水凝膠用去離子水浸泡沖洗，去除酸性殘留，得到三維多孔殼聚糖水凝膠支架材料I。見附圖la。所制得的三維殼聚糖水凝膠I形狀為圓盤狀，平均孔徑30 μ m，見附圖lb。實施例2制備冗I聚糖多孔水 規I父11將O. 2g殼聚糖放入9ml去離子水，室溫下磁力攪拌使殼聚糖均勻分散于水中。于分散液中緩慢滴加入Iml鹽酸-磷酸鹽緩沖溶液，調節pH至7，并使殼聚糖完全溶解后倒入模具，放入高溫培養箱，121°C下進行高溫交聯30分種，得到多孔殼聚糖水凝膠粗產品。將殼聚糖水凝膠用去離子水浸泡沖洗，去除酸性殘留，得到三維多孔殼聚糖水凝膠支架材料I。所制得的三維殼聚糖水凝膠II形狀為圓盤狀，平均孔徑ΙΟΟμπι，見附圖2。實施例3制備殼聚糖多孔水凝膠III將O. 2g殼聚糖放入9ml去離子水，室溫下磁力攪拌使殼聚糖均勻分散于水中。于分散液中緩慢滴加入Iml醋酸鹽-磷酸鹽緩沖溶液，調節pH至6. 3，并使殼聚糖完全溶解后倒入模具，放入高溫培養箱，80°C下進行高溫交聯60分鐘，得到多孔殼聚糖水凝膠粗產品。將殼聚糖水凝膠用去離子水浸泡沖洗，去除酸性殘留，得到三維多孔殼聚糖水凝膠支架材料III，平均孔徑20 μ m，見附圖3。實施例4制備組織工程用支架通過高溫交聯的三維殼聚糖多孔水凝膠I經磷酸鹽緩沖溶液PBS)浸泡清洗后用于接種皮膚成纖維細胞。培養并收集的人的成纖維細胞，用含10%小牛血清的DMEM培養液配制成細胞懸液，滴加到三維殼聚糖多孔支架材料上，細胞接種密度為lxl05cellS/cm2， 37°C培養箱中培養14天，每2-3天更換一次培養基。培養結束后，用PBS沖洗，2. 5%的戊二醛水溶液固定，鋨酸后固定，二氧化碳臨界點干燥，掃描電鏡觀察成纖維細胞在三維殼聚糖水凝膠支架材料上得生長情況。見附圖4。另外，培養結束后，用PBS沖洗，并MTT試劑盒檢測細胞增殖率。見附圖5。結果本發明提供的三維殼聚糖多孔水凝膠和成纖維細胞的相容性良好，培養4天后即可見伸展成梭形的成纖維細胞貼附在支架表面和內部，支架的孔結構隱約可見，大部分被細胞所覆蓋。MTT試劑吸光值隨培養時間較剛接種后的有明顯提高，14天后，MTT吸光值增高近6倍。由此可見，成纖維細胞在本發明的三維殼聚糖水凝膠材料上生長良好，該材料對于皮膚或軟骨細胞來講是良好的支架材料，細胞復合殼聚糖支架將可能用于皮膚或軟骨修復和再生。
權利要求
1.一種采用高溫交聯法制備三維殼聚糖水凝膠的方法，該方法包括如下步驟(a)將殼聚糖粉末分散于去離子水溶液中；(b)調節上述步驟(a)所得到的殼聚糖分散液的pH至微酸性；(C)將步驟(b)所得的溶液在80_125°C的溫度下進行高溫交聯；(d)交聯反應結束后，用后處理液浸泡清洗所得產物，以去除殘留酸液。
2.如權利要求I所述的方法，其中，以重量百分比計，步驟(a)中所配制的殼聚糖分散液的濃度為O. 46-2%,更優選為I. 38-1. 84%。
3.如權利要求I所述的方法，其中，步驟(b)中pH調節至6.0-7.0，更優選調節至 6. 3-6. 9 ο
4.如權利要求I所述的方法，其中，步驟(b)中所采用的調節pH的溶液為選自如下一組中的一種或一種以上醋酸鹽緩沖溶液、檸檬酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液醋酸、檸檬酸、磷酸、鹽酸和乙二酸。
5.如權利要求3所述的方法，其中，步驟(c)中的后處理液為為選自如下一組中的一種或一種以上去離子水、中性磷酸緩沖溶液和中性醋酸緩沖溶液。
6.如權利要求I所述的方法，其中，步驟(c)中高溫交聯的溫度控制在105-121°C之間。
7.一種采用如權利要求1-6之一所述的方法制備的三維殼聚糖水凝膠，其中，以重量百分比計，該水凝膠含有O. 46-2%的殼聚糖，孔徑范圍主要在10-200 μ m之間，而且孔徑在 50-80 μ m范圍的孔占全部孔的80%以上。
8.如權利要求7所述的水凝膠，其中，所述的三維殼聚糖水凝膠含有I.38-1. 84%的殼聚糖。
9.一種用于制備皮膚或軟骨組織工程的支架材料，其中，該支架材料是權利要求7或8 所述的三維殼聚糖水凝膠制得的。
10.如權利要求7或8所述的三維殼聚糖水凝膠在制備皮膚或軟骨組織工程之支架材料或作為藥物控釋載體的用途。
全文摘要
本發明公開了一種采用高溫交聯法制備三維殼聚糖水凝膠的方法以及所制得的殼聚糖水凝膠。本發明的方法包括如下步驟(a)將殼聚糖粉末分散于去離子水溶液中；(b)調節上述步驟(a)所得到的殼聚糖分散液的pH至微酸性；(c)將步驟(b)所得的溶液在80-125℃的溫度下進行高溫交聯；(d)交聯反應結束后，用后處理液浸泡清洗所得產物，以去除殘留酸液。本發明的高溫交聯法制備工藝簡單，反應時間短，原料無需特殊處理，制備過程不引入交聯劑等較高毒性的化學物質，最終產品無任何化學毒物殘留，孔結構均勻、連通性好、容易成型，非常適合作為皮膚、軟骨等軟組織工程支架材料。
文檔編號A61L27/52GK102604149SQ20121010685
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者吉承棟 申請人:上海華誼生物技術有限公司