專利名稱：白花檵木提取物在制備愈傷藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及白花檣木提取物在制備愈傷藥物中的應用。
背景技術：
皮膚創傷是人類常見的健康問題，大致分為開放式和封閉式兩類，其中開放式創傷包括擦傷，撕裂傷，射傷，割傷，切除傷和手術傷等，封閉式創傷包括挫傷、擠壓傷、扭傷、 震蕩傷、關節脫位和半脫位、閉合性骨折、閉合性內臟傷等。皮膚最主要功能是作為天然屏障，防止機體外液流失，保護機體免受外界環境干擾和侵害。皮膚創傷是一種常見的健康問題，自古有之，并且發生率較高，如處理不當，會引起嚴重問題甚至死亡。因此，尋找促進傷口愈合的藥物，是藥物研發領域最古老，也是最重要的挑戰之一。白花檣木(Loropetalum chinens)又稱白花檣木，是檣木的一種，是金縷梅科 (Hamamelidaceae)檣木屬的常青灌木植物,具有重要的藥用價值。白花檣木始載于《植物名實圖考》，具有“愈合止血、澀腸止瀉、生肌、消炎、鎮痛”之功效，應用于治療創傷出血。盡管白花檣木的歷史記載、民間用藥及相關研究報道均顯示白花檣木止血愈合、促進傷口愈合效果顯著，但其功效的物質基礎和作用機制尚不清楚。未見有報道用白花檣木的提取物制備促進傷口愈合的藥物。因此，對白花檣木進行促皮膚愈合研究，尋找有效成分，對于尋找皮膚創傷治療藥物有重要意義。
發明內容
本發明的目的是開發一種用白花檣木提取物為原料制備具有促進傷口愈合的作用的藥物。所述白花檣木包括白花檣木植物的花、莖、葉、枝。所述白花檣木的提取物，是用藥物可接受的溶劑對白花檣木進行浸提所得的粗提物。所述白花檣木提取物優選的提取方法是將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產物，采用動態溫浸法提取16小時，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除綠素等脂溶性雜質，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質，得到白花檣木粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。所述生物組合菌(名稱代號D424)，為景德板雞(ZL92108674. I)制作時的發酵粉， 來源于江西景德板雞實業公司保存的原菌種荷蘭株芽孢。本發明人以白花檣木及其分離產物為研究對象，采取國際常用的呋喃西林作為陽性對照，以大鼠皮膚割傷和切除傷作為研究模型展開實驗，觀察白花檣木促大鼠皮膚傷口愈合作用，并對有效組分進行促愈合作用篩選，為白花檣木促皮膚愈合物質基礎研究奠定工作基礎。
本發明采用的研究方法是I、采用液質聯用對白花檣木可能的化學成分進行初步分析；2、對白花檣木粗提物采用大鼠皮膚割傷模型(incision wound model)和切除傷模型(excision wound model)兩種國際常用體內模型研究其促愈合作用。割傷模型，是指用銳利刀片將皮膚或其他組織割開，能以最小的并行損傷快速破壞組織完整性。割傷后傷口大小與多種因素有關，如皮下脂肪，傷口處張力大小以及動物種屬等。通過機械方式使傷口閉合，傷口恢復迅速，并且疤塊組織生成最少。處理傷口時無論是用繃帶，縫合還是夾住的方法，主要目的均是為了將組織間縫隙縮小至最小，使傷口邊緣能通過肉芽組織和表皮再生而迅速愈合。因此，這種創傷模型最適合于分析傷口愈合強度； 由于受到傷口愈合時體積或面積的限制，該模型不適合用于組織學檢測或生化及表皮再生的評估。切除傷模型，這種傷口指的是目標區域中有較大體積的組織被移除掉，根據嚴重程度，切除傷又可細分為膠帶粘除傷，起泡，撕裂傷，全切除傷等。全切除模型指將表皮和真皮全部切除，直達皮下脂肪層，出血及體液流失更為嚴重，而且更易被感染。這種模型具有多種優勢，如傷口體積較大，真皮組分均參與愈合過程，只在傷口邊緣開始表皮再生，以及可以對傷口位置進行生化、組織學及細胞增殖研究等。在這一模型中，以初始傷口面積或體積為基礎的傷口愈合速率也是經常被研究的指標。3、對白花檣木粗提取進行進一步提取將上述白花檣木粗提物用乙醇提取，將乙醇提取物用水分散，再分別用選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇的有機溶劑萃取。并采用大鼠皮膚割傷模型對不同溶劑萃取后所得的提取物進行促愈合作用的篩選結果I、白花檣木提取物可顯著促進大鼠皮膚愈合速度，縮短傷口愈合時間，增加傷口愈合強度，促進傷口處細胞及血管新生；2、白花檣木分離提取組分中，石油醚層，乙酸乙酯層和正丁醇層促皮膚愈合作用較強，提示白花檣木的促愈合作用物質極性較小。結論白花檣木具有明顯促愈合作用，促愈合作用物質極性較小，主要分布在石油醚層，乙酸乙酯層和正丁醇層。
圖I是白花檣木提取物紫外檢測色譜圖，其中Red 254nm, Blue 285nm, Green 360nm.；圖2是白花檣木提取物的離子色譜圖Black :m/z 191 (奎尼酸的母核)；Blue :m/ z 285 (山萘酹/木犀草素的母核)；Red:m/z 301(槲皮黃酮的母核)；Green :m/z 316(楊梅酮的母核).;圖3ELC增加切割傷模型恢復第10日的創面皮膚牽拉張力，*P < 0. 05，***P < 0. 001，與空白對照組比較;#P < 0. 05，與陽性藥組比較.數據表示為均值土標準差.η =5 ；圖4ELC縮短切除傷模型的創面完全愈合時間，*Ρ < 0. 05，< 0. 001，與空白對照組比較;#Ρ < 0. 05，與陽性藥組比較.數據表示為均值土標準差.η = 5 ;
圖5大鼠切除傷創面恢復過程圖像記錄；圖6大鼠切除傷模型的新生皮膚組織染色切片，模型組(A)，ECL組(B) (40X)；圖7大鼠切除傷模型的新生皮膚組織⑶34免疫組化染色結果，模型組(A)，ECL組 ⑶(40X)；圖8切割傷模型恢復第10天的創面皮膚的牽拉張力，*P < O. 05，< O. 001， 與空白對照組比較.數據表示為均值土標準差.η = 5 ;圖9切割傷模型恢復第8日的創面皮膚牽拉張力，*Ρ < O. 05，***Ρ < O. 001，與空白對照組比較.數據表示為均值土標準差.η = 5。
具體實施例方式實施例I白花檣木粗提物的提取及化學成分分析I、白花檣木粗提物的提取將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產物，采用動態溫浸法提取16小時，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除葉綠素等脂溶性雜質，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質，對白花檣木的粗提物初步分離純化，得到粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。所述組合菌酶解所用菌種是荷蘭株芽孢，來源于景德板雞發酵粉，由江西景德板雞實業公司生產。原菌種荷蘭株芽孢是唯一不產生腸毒素的菌種，經培養，在二次代謝中分離出 D429，過程是肉湯斜面培養。石臘封存2個月后再次分離菌體，并組擴大培養，然后再分離， 最后經擴群，提取其浮生藻，凍干成活性菌體粉。(菌種培養基為肉湯瓊脂等)。具體方法按中國專利200910242020. 9和200910242037. 4的方法操作。
2、白花檣木化學成分分析
一、樣品制備
精稱粗提粉末I. 06mg, lmL50%甲醇溶解，過O. 45 μ m微孔濾膜，即得。
~■、色譜條件
高效液相色譜儀=Agilent 1200系列高效液相色譜儀(美國AgilentTechnologies公司)，包括二極管陣列檢測器，四元梯度泵，在線脫氣機，自動進樣器。
色譜柱YMC-Pack Pro C18(150mmX3. Omm ID,5ym)；
流動相:A (甲醇)，B (O. I %甲酸H20)
梯度洗脫(O — 35min, A :10%— 98% ;35min_40m
in, A :98%— 98% ；)；
流速 0. 3mL/min ；
紫外掃描范圍200-400nm ；
檢測波長200-400nm ;柱溫40°C。
三、質譜條件
I、質譜儀Q TRAPTM型四極桿-線性離子講串聯質譜儀(AppliedBiosystems/MDSSCIEX，USA)，離子源采用負離子檢測模式的ESI源。
2、LC-MS測定條件
Scan TypeEnhanced MS (EMS)PolarityNegativeScan ModeProfileIon SourceTurbo sprayScan Rate:4000 Da/sLIT fill time80.00 msecQ3 Entry Barrier8.00VCurtain Gas(CUR)25.00CADHighIonspray Voltage (IS)-4.5kVTEM350.00Nebulizer Gas (GSl)70Source Gas 2 (GS2)60ihe:ONDeclustering Potential(DP)-80 VEntrance Potential (EP)-10VCollision Energy (Experiment I)-10VCollision Energy (Experiment 2)-40 eV液質聯用對白花檣木樣品進行檢測。白花檣木化學成分初步分析根據白花檣木樣品的紫外色譜圖和提取子離子色譜圖，白花檣木可能含有的化學成分推測如下表I白花檣木主要化學成分
權利要求
1.白花檣木提取物在制備促進傷口愈合藥物中的用途，所述白花檣木提取物，是將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產物，采用動態溫浸法提取16小時，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除葉綠素等脂溶性雜質，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質，得到白花檣木粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。
2.權利要求I所述的用途，所述白花檣木提取物是將權利要求I所得到的白花檣木粗提物用乙醇提取，將乙醇提取物用水分散，分別用選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇萃取所得到的提取物。
3.權利要求I所述的用途，所述白花檣木選自白花檣木的花、莖、葉、枝。
4.一種促進傷口愈合的藥物，其活性成分是白花檣木提取物；所述白花檣木提取物， 是將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產物，采用動態溫浸法提取16小時，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除葉綠素等脂溶性雜質，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質，對白花檣木的粗提物初步分離純化，得到粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。
5.權利要求I所述的藥物，所述白花檣木提取物是將權利要求I所得到的白花檣木粗提物用乙醇提取，將乙醇提取物用水分散，分別用選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇萃取所得到的提取物。
6.權利要求I所述的藥物，所述白花檣木選自白花檣木的花、莖、葉、枝。
全文摘要
本發明涉及白花檵木提取物在制備促進傷口愈合藥物中的用途。本發明采用大鼠皮膚割傷模型(incision wound model)和切除傷模型(excision wound model)兩種國際常用體內模型研究白花檵木粗提物的促愈合作用，實驗證實可顯著促進大鼠皮膚愈合速度，縮短傷口愈合時間，增加傷口愈合強度，促進傷口處細胞及血管新生；本發明還發現將白花檵木粗提物進一步分離提取的組分中，石油醚層，乙酸乙酯層和正丁醇層促進傷口愈合作用較強。
文檔編號A61P17/02GK102579524SQ20121008548
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者劉浩元, 曲淑娟, 李曉濱 申請人:江西徳宇集團