專利名稱：齊墩果酸在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬中藥領域，涉及齊墩果酸的用途，尤其涉及齊墩果酸在制藥中的應用。
背景技術：
腎臟纖維化，以腎小球硬化和腎小管間質纖維化為特征，是多種慢性腎臟疾病最終結局。本質上，腎纖維化是以細胞外基質的過度積聚和沉積為特征的過程。產生基質的細胞活化是腎纖維化形成的關鍵。生理情況下，成纖維細胞產生適量的膠原基質充填腎單位、血管和腎被膜之間的空隙。隨年齡增長腎臟體積逐漸增大，成纖維細胞主要起腎間質重塑作用。當損傷及炎癥因素持續存在時，成纖維細胞增殖并產生過量的細胞外基質。新合 成的成纖維膠原成分在腎組織沉積。此外，腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞是主要的產生細胞外基質的細胞。腎纖維化早期，系膜細胞和纖維母細胞發生活化，晚期出現腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化。很多細胞因子可以促進腎臟成纖維細胞和系膜細胞的活化，加速腎臟纖維化的進程，其中以轉化生長因子-β I (TGF-β I)作用最強。目前，國外對腎臟纖維化的機制研究較為深入，但是尚無安全有效的治療腎臟纖維化的藥物，而我國在該領域研究活血化瘀中藥的療效取得了一定的成績。牛膝是莧科植物牛膝(懷牛膝)和川牛膝(甜牛膝)的根，性苦、甘、酸，平，具有活血通經、補肝腎、強筋骨、利水通淋、引火(血)下行等功效。齊墩果酸是牛膝的提取物，分子式為C3tlH48O3，分子量是456. 71，不溶于水，可溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。齊墩果酸除具有護胃、強心、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗高血壓的生物活性外，還具有抗炎、抗病毒、免疫調節、抑制血小板聚集和抗過氧化等多種藥理作用。近年來研究發現齊墩果酸還有保護肝細胞的作用。許仄平等研究齊墩果酸預處理對大鼠肝臟缺血再灌注時糖原含量的影響及其意義，結果發現齊墩果酸能抑制糖原磷酸化酶的特性，增加術前肝臟中糖原的儲備，在肝臟缺血再灌注期間有助于增加能量供給，從而起到減輕肝臟的損傷。何明楓等觀察了對大鼠肝臟缺血再灌注損傷過程中IKK/1-κΒ/NF- K B信號轉導通路的影響，結果發現肝臟缺血再灌注能促進胞漿內ΙΚΚ2蛋白的表達，使Ι-κΒ磷酸化水解,NF- K B活化進入細胞核內介導炎癥反應,損傷肝細胞。缺血前使用齊墩果酸可抑制ΙΚΚ/Ι- K B/NF- K B信號傳導通路的激活，從而發揮其對肝細胞保護作用。目前，對齊墩果酸在抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化中的作用、降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白(24h尿蛋白定量、al-MG、NAG、β 2_MG、TRF)、腎功能(Scr、BUN)、減輕腎臟炎癥及膠原沉積中的作用及改善腎纖維化相關基因和蛋白(TGF-β KCTGF,ColIagenIII、LN、Collagen I、FN)的作用尚未見相關報道。
發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供齊墩果酸的新用途，即齊墩果酸在制藥中的新應用。為解決上述技術問題，在本發明的一方面，提供齊墩果酸在制備抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化的藥物中的應用。所述齊墩果酸抑制TGF-β I誘導的腎成纖維細胞和系膜細胞活化的有效濃度為4· 56Χ 10_5g/ml 4· 56X 10_6g/ml。在本發明的另一方面，提供齊墩果酸在制備降低腎纖維化的藥物中的應用。所述齊墩果酸降低腎纖維化的有效劑量為6mg/kg/d或7mg/kg/d。在本發明的另一方面，提供齊墩果酸在制備改善尿蛋白的藥物中的應用。所述改善尿蛋白包括改善24h尿蛋白定量、a I-MG, NAG, 0 2_MG、TRF。在本發明的另一方面，提供齊墩果酸在制備改善腎功能的藥物中的應用。所述改善腎功能包括改善腎功能Scr、BUN。
在本發明的另一方面，提供齊墩果酸在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應用。在本發明的另一方面，提供齊墩果酸在制備改善腎臟纖維化相關基因和蛋白的藥物中的應用。所述改善腎臟纖維化相關基因和蛋白包括改善纖維化相關基因和蛋白TGF-βI、CTGF、Collagen III、LN、Collagen I、FN。本發明以TGF-β I為刺激因子，在體外用MTT法觀察不同濃度梯度的齊墩果酸對TGF-β I刺激下大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的作用，并在體內觀察其對UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白的影響。本發明設計了以TGF-β I誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的篩選平臺，觀察各濃度梯度的齊墩果酸對大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的抑制作用及有效工作濃度。結果顯示濃度為4. 56X l(T5g/ml 4. 56X l(T6g/ml的齊墩果酸可抑制TGF-β I誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化，兩個濃度作用效果之間無統計學差異。此外，本發明設計了齊墩果酸對大鼠腎纖維化作用的體內實驗，觀察齊墩果酸中劑量(6mg/kg/d)及高劑量(7mg/kg/d)對UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白的影響，結果中劑量(6mg/kg/d)及高劑量(7mg/kg/d)的齊墩果酸均能降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白。從而本發明從體內體外實驗驗證了齊墩果酸能抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化，降低腎纖維化大鼠尿蛋白、腎功能以及腎臟纖維化相關基因和蛋白，即本發明驗證了齊墩果酸可用于制備降低腎纖維化的藥物。
圖I-圖6是試驗例2中齊墩果酸在UUO模型大鼠腎臟炎癥及膠原沉積研究中光鏡下腎組織結構示意圖；其中，圖I-圖3為HE染色(100X)，圖I代表A組，圖2代表B組，圖3代表C組；圖4-圖6為Masson染色(100 X )，圖4代表A組，圖5代表B組，圖6代表C組。圖7-圖14是試驗例2中齊墩果酸在Platt模型大鼠腎臟炎癥及膠原沉積研究中光鏡下腎組織結構示意圖；其中，圖7-圖10為HE染色(100X)，圖7代表A組，圖8代表B組，圖9代表C組，圖10代表D組；圖11-圖14為Masson染色(100X)，圖11代表A組，圖12代表B組，圖13代表C組，圖14代表D組。
具體實施例方式以下通過試驗例對本發明齊墩果酸的藥理活性試驗及結果作進一步的闡述
試驗例I :體外實驗一、材料與方法(一 )材料實驗細胞正常大鼠腎臟成纖維細胞株(NRK-49F)和系膜細胞株(HBZY-I)，均購自上海復盟基因生物科技有限公司。齊墩果酸購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號110531 JGF-β I生長因子購自P印roTech公司，產品編號:100_21C。
胎牛血清，產品編號S1840-500 ;DMEM高糖培養基，產品編號LOl 103-500 ；O. 25%胰蛋白酶-O. 02%乙二胺四乙酸，產品編號L0932-500 ;青霉素-鏈霉素產品編號03-050-1B ;以上均購自Biowest公司。MTT粉末，化學名為3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5- 二苯基溴化四唑,購自Amresco公司，產品編號0793。( 二 )方法I.實驗步驟11 MTT 法先用 O. 25%胰蛋白酶-O. 02% 乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25%-O. 02%EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I細胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培養液配成單個細胞懸液，以每孔I X 104/ml個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積100 μ I。待細胞貼壁后，吸去培養板中的培養液，每孔加入無血清的DMEM培養液100 μ 1，置37°C、5%的CO2孵箱中孵育24h，使細胞生長同步化。之后加入TGF- β I生長因子和齊墩果酸，24h后每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 10 μ 1，37°C繼續孵育4h，終止培養，小心吸去孔內培養上清液(盡量洗凈殘留的培養液)。每孔加入IOOyl DMSO (二甲基亞砜)，振蕩lOmin，使針狀結晶充分溶解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值(0D值)。I. 2 ELISA法先用0. 25 %胰蛋白酶-0. 02 %乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25% -0. 02% EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I細胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培養液配成單個細胞懸液，以每孔I X 104/ml個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積100 μ I。待細胞貼壁后，吸去培養板中的培養液，每孔加入無血清的DMEM培養液100 μ 1，置37°C、5%的⑶2孵箱中孵育24h，使細胞生長同步化。之后加入TGF-β I生長因子和齊墩果酸，收集24h細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作。2.實驗分組2. I觀察NRK-49F細胞株分7組，每組設5個復孔，分組如下A 組(空白對照組)、B 組(TGF- β I 2ng/ml 組)、C 組(TGF- β I 5ng/ml 組)、D 組(TGF- β 12ng/ml+ 齊墩果酸 4· 56 X l(T5g/ml 組)、E 組(TGF- β I 2ng/ml+ 齊墩果酸4. 56X IOVml 組)、F 組(TGF- β I 5ng/ml+ 齊墩果酸 4. 56X l(T5g/ml 組)、G 組(TGF- β I5ng/ml+齊墩果酸4. 56 X 10_6g/ml組)。B組和C組為模型組。2. 2觀察HBZY-I細胞株分4組，每組設6個復孔，分組如下A 組(空白對照組)、B 組(TGF- β I 2ng/ml 組)、C 組(TGF- β I 2ng/ml+ 齊墩果酸 4. 56 X 10_5g/ml 組)、D 組(TGF- β I 2ng/ml+ 齊墩果酸 4. 56 X 10_6g/ml 組)。B 組為模型組。3.觀察指標3. I采用MTT法觀察24h齊墩果酸對兩種細胞株的作用。
3. 2采用ELISA法觀察細胞上清液中TGF- ^的分泌情況。二、結果I.齊墩果酸能抑制活化的大鼠成纖維細胞株(NRK-49F)的增殖空白對照組NRK-49F的OD值為0. 355±0. 034，加入TGF-P I生長因子(2ng/ml和5ng/ml)NRK-49F的OD值為0. 508±0. 026和0. 457±0. 042，明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P < 0. 05)。說明TGF- P I生長因子可以促進NRK-49F的活化。齊墩果酸高劑量(4. 56Xl(T5g/ml)及中劑量(4. 56Xl(T6g/ml)組OD值分別為 0. 413±0. 033,0. 391±0. 019和 0. 427±0. 019,0. 393±0. 014，低于模型組(P < 0. 05 0. 01)(見表 I)。表I齊墩果酸對活化的大鼠成纖維細胞株(NRK-49F)的抑制作用(x±s)
權利要求
1.齊墩果酸在制備抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化的藥物中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于，所述齊墩果酸抑制TGF-PI誘導的腎成纖維細胞和系膜細胞活化的有效濃度為4. 56X 10_5g/ml 4. 56X 10_6g/ml。
3.齊墩果酸在制備降低腎纖維化的藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述齊墩果酸降低腎纖維化的有效劑量為6mg/kg/d 或 7mg/kg/d。
5.齊墩果酸在制備改善尿蛋白的藥物中的應用，其特征在于，所述改善尿蛋白包括改善 24h 尿蛋白定量、a I-MG, NAG, P 2-MG、TRF。
6.齊墩果酸在制備改善腎功能的藥物中的應用，其特征在于，所述改善腎功能包括改善腎功能Scr、BUN。
7.齊墩果酸在制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應用。
8.齊墩果酸在制備改善腎臟纖維化相關基因和蛋白的藥物中的應用，其特征在于，所述改善腎臟纖維化相關基因和蛋白包括改善纖維化相關基因和蛋白TGF-P I、CTGF,Collagen III、LN、Collagen I、FN0
全文摘要
本發明公開了齊墩果酸在制藥中的應用。涉及齊墩果酸在制備抑制腎成纖維細胞和系膜細胞活化的藥物中的應用、制備降低腎纖維化的藥物中的應用、制備改善尿蛋白的藥物中的應用、制備改善腎功能的藥物中的應用、制備減輕腎臟炎癥及膠原沉積的藥物中的應用及在制備減輕腎臟纖維化指標相關基因和蛋白的藥物中的應用。本發明設計了以TGF-β1誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞活化的篩選平臺，發現4.56×10-5g/ml～4.56×10-6g/ml的齊墩果酸可抑制TGF-β1誘導的大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞的活化。本發明還設計了齊墩果酸對UUO模型和Platt模型大鼠作用的體內實驗，發現齊墩果酸中劑量(6mg/kg/d)及高劑量(7mg/kg/d)均能降低UUO模型和Platt模型大鼠的尿蛋白、腎功能及腎臟纖維化相關基因和蛋白。
文檔編號A61P13/12GK102631351SQ201210083118
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月27日 優先權日2012年3月27日
發明者何立群, 楊雪軍, 林日陽, 王東, 王琛 申請人:上海中醫藥大學附屬曙光醫院