專利名稱：Ggpps拮抗劑在制備治療ii型糖尿病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及GGPPS在II型糖尿病藥物治療中的應用，尤其涉及GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病藥物中的用途。
背景技術：
II型糖尿病又稱非胰島素依賴糖尿病、成年型糖尿病，是一種多病因的代謝疾病。 其發病因素很多，除內在的遺傳因素外，還與人們生活環境、生活方式及行為有很大的關系，尤其是過度肥胖引起的一些代謝紊亂易導致II型糖尿病。另外，90%患者于在35 40歲之后發病。II型糖尿病主要表現為患者肌肉和脂肪組織能夠對胰島素產生抗性，而作為補償，胰島β細胞則分泌更多的胰島素，但依舊不能把血糖維持在正常范圍內。而過量的胰島素分泌使胰島β細胞功能受到損傷，導致胰島素分泌不足。II型糖尿病在世界各地均有很高的發病率，尤其在過去的50年中II型糖尿病發病率伴隨肥胖率顯著增長，直至2010年全球患者數已超過II億8千萬。而在我國，II型糖尿病已經成為發病率增長最快的疾病。最新資料表明，我國糖尿病患者已超過6000萬，約占全球糖尿病患者的五分之一。預計截止到2025年我國糖尿病患者總數將接近1億。胰島素抵抗是指機體靶組織對胰島素的反應性低于正常的一種病理生理狀態，經常與肥胖，II型糖尿病早期階段等臨床疾病相伴隨，是這些疾病的一個重要的特征，也是導致這些疾病發生的重要因素。但是造成胰島素抵抗以及由此導致的肥胖，II型糖尿病等相關疾病的分子機制并不是很清楚。這就導致了其防治的困難。胰島素抵抗細胞模型的構建主要分為兩個部分將3T3-L1前脂細胞誘導為脂肪細胞以及將后者誘導為胰島素抵抗脂肪細胞。構建胰島素抵抗細胞模型是進行頂相關疾病(如II型糖尿病)的病理機制探索及藥物研發的重要途徑。根據英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS) II型糖尿病患者的胰島β細胞由于出現功能的漸進惡化，隨著II型糖尿病病程的進展，多數II型糖尿病患者最終都需要胰島素治療以達到良好的血糖控制。 ggpps基因即香葉基香葉基二磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase l，ggppsl)基因。在蛋白質異戊二烯化修飾過程中起到關鍵作用， ggpps的底物GGPP是小G蛋白發生香葉基化的重要前體。香葉基化是蛋白質的翻譯后修飾之一，一般發生在蛋白質C末端保守的半胱氨酸。發生香葉基化的蛋白質包括Ras和 Ras相關的小G蛋白如I h0，Rab，Rac，以及三聚體G蛋白的γ亞基，這些受調控的蛋白質都是信號傳遞通路中重要的分子開關調節蛋白。有研究報道，以GGPPS為藥物靶點對于成骨細胞分化與骨骼構建有改善作用(Weivoda and Hohl 2011)，也有研究闡述了 GGPPS可作為香煙煙霧引發的肺部疾病的治療靶點(Shen，G0ng et al. 2011)，但就GGPPS用于治療 II型糖尿病之間的靶點藥物并沒有任何報道。
發明內容
3
有鑒于此，本發明的目的在于通過考察GGPPS基因在II型糖尿病模型中表達與功能活性，確認GGPPS能否作為II型糖尿病治療的藥物靶點以及增效藥物，從而提高II型糖尿病患者的治療效果及生命質量。為達上述目的，發明人考察了 GGPPS在胰島素抵抗細胞模型與胰島素長期刺激胰島素抵抗細胞模型以及II型糖尿病患者組織檢測表達變化，同時進行了干擾GGPPS對胰島素抵抗的緩解，糖耐量實驗以及胰島素信號通路IRS檢測。結果發現通過胰島素的刺激在胰島素抵抗細胞模型中GGPPS顯著增長；降低了胰島素信號通路敏感性同樣在II型糖尿病患者的脂肪組織中檢測發現GGPPS蛋白與mRNA水平均高于對照組；根據糖耐量實驗結果顯示GGPPS+雄性小鼠對于葡萄糖耐受量較GGPPS+/-雄性小鼠更高且對胰島素敏感性更強； 胰島素通路IRS檢測結果顯示GGPPS+小鼠的^S ser612磷酸化程度顯著降低使胰島素敏感性得到恢復，胰島素抵抗癥狀得到緩解。本發明治療II型糖尿病的藥物施用方式可以是口服、特定組織器官施用、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內、靜脈內或皮下)。本發明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規方法進行制備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。本發明中，所述小干擾RNA為對應標靶序列為序列表中SEQ ID NO: 1或2的DNA 序列的小干擾RNA。根據本發明的記載和本領域的公知常識，抑制GGPPS對于治療II型糖尿病有增敏作用。GGPPS基因重組表達載體例如本申請中構建的Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒可以單獨或與其他有功能活性基因重組表達載體聯合，再輔以藥學上可接受的載體，用以制備治療II型糖尿病的增敏藥物。進一步，根據本發明的記載和本領域的公知常識可知，任何在轉錄和/或翻譯水平上抑制GGPPS基因的拮抗劑均可單獨或與其他具有功能活性的多肽、蛋白質、融合蛋白等聯合，再輔以藥學上可接受的載體，用于制備治療II型糖尿病的增敏藥物。本發明的有益效果在于本發明首次公開了 GGPPS基因和蛋白的拮抗劑可以用于制備治療II型糖尿病的增敏藥物，有助于提高胰島素把組織對于胰島素的敏感性，增強胰島素的療效，提高II型糖尿病患者的生命質量，在II型糖尿病治療領域具有潛在、良好的應用前景。
圖1為胰島素抵抗細胞模型的建立。在用TNF-α細胞因子誘導脂肪細胞3天后， 采用免疫印跡的方法檢測胰島素信號通路中IRS的酪氨酸磷酸化水平的變化。胰島素抵抗細胞在胰島素刺激后葡萄糖攝取的程度顯著下降。圖2顯示了 GGPPS在胰島素抵抗細胞模型中的變化。圖3顯示干擾GGPPS恢復胰島素抵抗細胞對胰島素的敏感性。圖4顯示GGPPS在II型糖尿病人中呈特異性高表達。**表示兩者相比具有統計學顯著差異。圖5顯示敲除GGPPS提高小鼠糖耐量。
圖6顯示敲除GGPPS提高小鼠的胰島素敏感性。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗指南New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件
一般材料和方法 1材料
3T3-L1細胞系購自上海細胞所，胰島素(諾和靈R)，地塞米松購自鼓樓醫院， [3H]-D-Glucose購自中國同位素總公司，IBMX購自Sigma公司，anti-p-IRS (Tyr)抗體，anti-IRS抗體，胎牛血清購自PAA公司，Anti-p-ERK抗體，anti-ERK抗體購自 (上海康城生物技術公司)反轉錄試劑盒Traverse-Ace以及熒光定量PCR試劑盒購自 TOYOBO公司。TNF-α細胞因子購自Sigma公司，油紅染料購自南京生興生物技術公司。 anti-p-IRS(Ser308)，anti-p-IRS(Ser612)均購自 Cell signaling 公司，野生型及db/db 小鼠(Bks)購自南京大學模式動物研究所，羅氏血糖儀，glucose購自Sigma公司。II型糖尿病病人組織標本由江蘇省中醫院提供。細胞培養
前脂細胞(3T3-L1)培養于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM 培養基中，于37° C、5% C02濃度條件下的細胞培養箱中培養。脂肪細胞以及胰島素抵抗細胞的誘導
前脂細胞(3T3-L1)接種并長滿后培養基換為含有10%胎牛血清，150nmol/L胰島素， 250nmol/L 地塞米松以及 0. 5mmol/L 3-isobutyl-l-methylxanthine 的刺激液 1，培養 2天后，換為含有10%胎牛血清和150nmol/L胰島素的培養基，再培養2天后，細胞換回正常的含10%胎牛血清的DMEM培養基，6天后即出現大量含有脂滴的脂肪細胞。3T3-L1 前脂細胞在誘導為脂肪細胞后，用含有終濃度為5ng/ml的TNF-α細胞因子的DMEM培養基誘導3天，每24小時換液，3天后即為胰島素抵抗脂肪細胞。油紅染色
將誘導好的脂肪細胞用PBS洗3遍，加入油紅染料，吸干，10倍顯微鏡鏡檢。葡萄糖攝取實驗
每個細胞樣本加入[3H]-D-Gluc0se使終濃度為200uCi/mmol/L，同時加入終濃度為 IOnm的胰島素，3小時后，用冰預冷的PBS洗3遍，加入IOM KOH裂解細胞，用等體積無水乙醇沉淀葡萄糖過夜，IOOOOg離心10分鐘，用無菌水200ul重懸沉淀，用閃爍計數器檢測。免疫印跡分析
細胞培養至可以進行蛋白抽提時，吸去培養基，用冰預冷的PBS洗兩遍，加入300ul 裂解緩沖液(50.0 mmol/L Tris, 150.0 mmol/L NaCl, 0.1% SDS, 1.0% NP-40, 1.0 mmol/L Na3VO4, 2. 0 mmol/L NaF, 100. 0 μ g/ml PMSF, 1. 0 μ g/ml Ieup印tin, and 1.0 μ g/ml aprotinin )，冰浴30 min，期間每隔5分鐘混勻一次，刮取細胞，12 000 g離心10分鐘，收集上清。(或取自動物組織，提取蛋白)采用Bradford法測定蛋白質濃度。 取50 μ g的總蛋白進行SDS-PAGE膠電泳分離，按常規方法轉印至PVDF膜上，一抗4°C孵育過夜，anti-p-IRS (Tyr) (1 500)，anti-IRS (1 500)，用 AP標記的二抗與NBT 和 BCIP顯色或者采用 BM chemiluminescence Western Blotting Kit(購自 Roche 公司)檢測結果。提取組織標本RNA
取Img組織標本，懸浮于Iml Trizol Gnvitrogen)，用組織勻漿器勻漿3-5分鐘， 加1/5體積酚氯仿抽提蛋白，12000rpm，離心10分鐘，抽取上清，加等體積的異丙醇，-20 度，20分鐘沉淀RNA，12000rpm，離心10分鐘，棄上清，沉淀溶于20ul DEPC(焦碳酸二乙脂)溶液，測定濃度。反轉錄PCR
通過Tranverse-Ace反轉錄試劑盒(Τ0Υ0Β0)，采用oligo-dT進行逆轉錄。取800ng 總RNA反轉錄合成單鏈cDNA，流程如下800ng總RNA，加入Iul mol/L Oligo dT引物 lul，補DEPC水至10ul。65° C，反應5 min后，迅速置于冰上，再加入反應緩沖液如1， IOmmol/L dNTP 2ul，20 U/ul 的 RNA酶抑制劑 lul。在 37° C 反應5 min 后，加入 Iul 10 U/ul逆轉錄酶，42° C反應1 h后在90° C處理10 min。實時熒光定量PCR
采用實時熒光定量PCR試劑盒(Τ0Υ0Β0)，具體體系如下
20 μ 1 體系，STOR(2*) :10μ 1，引物(上游)(10*) :2 μ 1，引物(下游)(10*) :2μ 1， cDNA模板2μ 1，加雙蒸水至20 μ 1。ggpps實時定量PCR引物序列
ggpsl(鼠)正向5，- TTTTGCATACACTCGACACACT-3’ (SEQ ID N0:3) ggpsl (鼠)反向5，- GGCCTCAATTTGTTTGTAGGCTT-3，(SEQ ID N0:4) ggpsl (人)正向5，-CCAGGTAAACAAGTGAGAACCAA-3，(SEQ ID N0:5) ggpsl (人)反向5，-CGTCGGAGTTTTGAGTTGTCT-3’ (SEQ ID N0:6) 擴增條件
95°C預變性5分鐘，95°C變性15秒，60°C退火15秒，72°C延伸，收集熒光信號45 秒，共40個循環，數據分析。構建
根據siRNA設計的一般原則設計選取靶序列。本實驗選取的靶序列是5’-G⑶⑶CCCAUCU⑶CAUUA-3，(PI, GGPPS 小干擾 RNA 靴向序列)(SEQ ID N0:1)/ 5'-⑶CCCACUGAAGAAGAAUA-3，(P2 有義鏈，GGPPS 小干擾 RNA 靶向序列)(SEQ ID N0:2) 將上述序列交由上海生工生物技術有限公司合成。寡核苷酸退火將合成的寡核苷酸溶解在ddH20中，終濃度為lyg/ Ul。依次按以下步驟操作寡核苷酸Pl，P2各取1. 5 μ 1加入47 μ 1的退火緩沖液(100 mmol/L乙酸鉀，30 mmol/L HEPES-K0H pH 7.4，2mmol/L 乙酸鎂),94°C 孵育 4 min, 70°C 孵育 10 min，緩慢冷卻至4°C。寡核苷酸磷酸化取Iul退火的寡核苷酸，加1 μ 1 Τ4 PNK緩沖液、1 ul 1 mmol/L AT P (儲存液 IOmM)、lul T4 ΡΝΚ、6 μ IH2O,在 37°C 孵育 30 min，70°C孵育 10 min(滅活 PNK)。
質粒酶切、去磷酸化與純化
按如下體系以Bgl II和Hind III雙酶切穿梭質粒，37 0C孵育4 h。85°C，加熱15 min以終止反應。直接向反應體系中加入0. 1 μ 1的小牛腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化反應1 h。用1%的瓊脂糖凝膠電泳。在長波紫外燈照射下，割取目的片段，用DNA膠回收試劑盒(Qiagen公司)回收。Bgl II和Hind III雙酶切穿梭質粒反應體系 IOXbuffer1.0 μ 1
穿梭質粒8. 0 μ 1 ( 2. 0μ g)
Bgl II0. 2 μ KlOU/ μ 1)
Hind III0. 2 μ 1 (IOU/ μ 1)
H2O0. 6 μ 1
連接與轉化連接反應體系
IOXLigase buffer1. 0 μ 1
Τ4 DNA Ligase0. 5 μ 1
酶切過的載體5.0μ1
P10. 5 μ 1
P20. 5 μ 1
H2O2· 5 μ 1
將5.0 μι的酶切過的載體轉移到無菌微量離心管中，加Ρ1、Ρ2各0.5 μι，加水至 8.5 μ ，于45° C加溫5 min以使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻至0°C，再分別加入連接酶緩沖液1.0 μ 1, Τ4 DNA連接酶0.5 μ ，混勻，于16°C孵育過夜。次日取5.0 μ 1轉化大腸桿菌感受態細胞。重組質粒的鑒定
挑克隆，小量提取質粒，以EcoR I酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。預期陽性克隆酶切產物會釋放一個300 bp的條帶，而陰性對照相應條帶只有MO bp。為了進一步從序列的準確性上得到驗證，選取EcoR I酶切后電泳出現300bp條帶的陽性重組質粒送至上海生工有限公司測序。重組穿梭質粒基因沉默效率檢測
在重組包裝病毒之前，我們用磷酸鈣沉淀法將重組穿梭質粒瞬時轉染細胞對其基因沉默效率進行了檢測。重組腺病毒的構建
重組質粒pATC-GGPPS/siRNA經Riie I酶切線性化后，用電穿孔法將其與質粒 pAdEasy-Ι共同轉化感受態菌BJ5183 (條件電脈沖25 μ F，電壓2.5 kV,電阻200 Ω )， 進行同源重組。用he I酶切鑒定同源重組的質粒，以電穿孔法將重組子轉化入大腸桿菌 DHlOa內，大量制備重組腺病毒質粒DNA備用轉染。重組腺病毒的包裝和收獲將重組質粒用磷酸鈣法轉染ΗΕΚ493Α細胞。轉染后 7-10天，出現細胞病變效應(cytopathic effects, CPE)，表現為貼壁細胞變圓、核濃縮、 脫落，出現病毒空斑。收集細胞，反復凍融3次，離心，收集上清于-70 0C保存備用。
病毒顆粒濃度的測定在對孔細胞培養皿中，待培養的4孔四3細胞生長至90% 匯合時，吸去培養液，加入0.5 mL無血清DMEM培養液，分別滴加入5、10、30及40 ul的病毒稀釋液(稀釋約500倍)，小心混勻，置于含5%C02培養箱中培養。Ih后，小心加入0.5 mL含100 mL/L小牛血清的DMEM培養液，混勻、培養，觀察CPE ;3 d后，待加入5ul病毒稀釋液的孔完全出現CPE現象時，計數細胞并計算病毒顆粒的濃度。病毒顆粒的濃度=(細胞數X 20/病毒稀釋液的體積)X病毒稀釋倍數。免疫沉淀
取含相同蛋白量(150 μδ)的細胞裂解液，加入相關抗體2 μδ,4 ° C輕搖1小時后，再加入Protein G-agrose珠子30 μ ，在4 ° C，孵育過夜。離心，棄上清，用洗滌緩沖液(50. 0 mmol/L Tris, 150. 0 0. 1% SDS, 1. 0% NP-40, 1. 0 mmol/L Na3V04, 2.0 mmol/L NaF, 100.0 μ g/ml PMSF, 1.0 μ g/ml Ieup印tin，and 1.0 μ g/ ml aprotinin )洗滌沉淀1次，提高至NaCl濃度至400 mmol/L洗滌第二次，第三次采用原緩沖液洗滌，棄上清。加入等體積2XSDS樣品緩沖液，95° C加熱樣品5 min，通過 SDS-PAGE膠電泳分離，進行免疫印跡分析。小鼠禁食12小時后，腹腔注射葡萄糖(1. 8mg/g)，分別在不同時間點尾部取血，用血糖儀檢測小鼠血液中葡萄糖含量。小鼠禁食12小時后，再喂食12小時，尾部取血，檢測小鼠血液中葡萄糖含量。 實施例1
胰島素抵抗細胞模型的建立
根據前面“一般材料與方法”一節的方法，我們誘導建立了胰島素抵抗細胞模型。在用 TNF-α細胞因子誘導脂肪細胞3天后，采用免疫印跡的方法檢測胰島素信號通路中IRS 的酪氨酸磷酸化水平的變化。如圖IA所示。TNF-α細胞因子誘導后，IRS的酪氨酸磷酸化水平顯著下降。我們檢測了胰島素抵抗細胞葡萄糖攝取的程度。如圖IB所示，胰島素抵抗細胞在胰島素刺激后葡萄糖攝取的程度顯著下降。上述結果都表明胰島素抵抗細胞模型得以成功建立。實施例2
GGPPS在胰島素抵抗模型中的變化
我們通過免疫沉淀法檢測了通過胰島素刺激后，胰島素抵抗細胞模型中GGPPS的水平變化。如圖2所示，通過胰島素的刺激在胰島素抵抗細胞模型中GGPPS顯著增長。實施例3
干擾GGPPS恢復胰島素抵抗細胞對胰島素的敏感性
我們使用上節“一般材料和方法”中構建的Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒干擾胰島素抵抗細胞中GGPPS的表達。在胰島素刺激后的不同時間點，我們檢測了 p-Erkl/2的水平。 如圖3所示，與對照相比，在干擾了 GGPPS表達的胰島素抵抗細胞中的p-ErklA水平顯著降低。這表明干擾GGPPS恢復了胰島素抵抗細胞對胰島素的敏感性。實施例4
GGPPS在II型糖尿病人中呈特異性高表達
我們分別在蛋白質水平(圖4A)和mRNA水平(圖4B)上檢測了 II型糖尿病患者脂肪組織中GGPPS的表達。如圖4所示，II型糖尿病人中GGPPS的表達水平顯著高于正常對照。實施例5
敲除GGPPS提高了小鼠糖耐量
我們按照上節“一般材料與方法”中的GTT法及ITT法檢測了 GGPPS-/-雄性小鼠和 GGPPS-/-雄性小鼠的耐糖量。如圖5所示，根據糖耐量實驗結果顯示GGPPS-/-雄性小鼠對于葡萄糖耐受量較GGPPS+/-雄性小鼠更高且對胰島素敏感性更強。實施例6
敲除GGPPS提高了小鼠的胰島素敏感性
我們進一步檢測了 GGPPS-/-雄性小鼠和GGPPS-/-雄性小鼠中胰島素通路IRS的磷酸化水平。如圖6所示，檢測結果顯示GGPPS-/-小鼠的^S ser612磷酸化程度顯著降低使胰島素敏感性得到恢復，胰島素抵抗癥狀得到緩解。
9
權利要求
1.GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述GGPPS拮抗劑增加胰島素敏感性。
3.GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病的增敏藥物中用途。
4.權利要求1-3任一項的用途，其中所述的GGPPS拮抗劑抑制GGPPS基因轉錄和/或翻譯。
5.權利要求4的用途，其中所述GGPPS拮抗劑包括針對GGPPS的小干擾RNA。
6.權利要求5的用途，其中所述小干擾RNA靶向以下序列5’-G⑶⑶CCCAUC腳CAUUA-3，(SEQ ID N0:1)或 5，-⑶CCCACUGAAGAAGAAUA-3，(SEQ ID NO:2)。
7.權利要求6的用途，其中所述小干擾RNA的編碼序列為 5，-G⑶⑶CCCAUCU⑶CAUUA-3，(SEQ ID N0:1)。
8.權利要求7的用途，其中所述GGPPS拮抗劑為表達所述小干擾RNA的真核表達載體。
9.權利要求8的用途，其中所述真核表達載體是Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒。
全文摘要
本發明公開了GGPPS在II型糖尿病藥物治療中的應用，尤其提供了GGPPS拮抗劑在制備治療II型糖尿病藥物中的用途。本發明首次公開了GGPPS基因和蛋白的拮抗劑可以用于制備治療Ⅱ型糖尿病的增敏藥物，有助于提高胰島素把組織對于胰島素的敏感性，增強胰島素的療效，提高Ⅱ型糖尿病患者的生命質量，在Ⅱ型糖尿病治療領域具有潛在、良好的應用前景。
文檔編號A61P3/10GK102526763SQ20121007910
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者李朝軍, 沈寧, 薛斌, 郁曉, 陸克 申請人:南京大學