專利名稱：美洲凌霄花多糖在制備抗凝血藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及美洲凌霄花多糖的應用，具體涉及美洲凌霄花多糖在制備抗凝血藥物中的應用。
背景技術：
人體內凝血系統和抗凝系統處于一個動態平衡的狀態，過度凝血會導致心肌梗死、腦血栓等嚴重疾病。在血栓形成過程中，血小板活化與凝血系統激活具有重要作用，兩者在體內緊密聯系，凝血系統激活后產生的凝血酶，是一個強有力的血小板活化因子，血小板活化后又將促進凝血過程。抗血栓治療主要針對凝血系統和血小板兩個環節，分別稱為抗凝治療和抗血小板治療。目前臨床上常用的抗凝血藥主要包括肝素類和香豆素類等，抗血小板藥物最常用的是阿司匹林。肝素類藥物通過促進抗凝血酶III對含有絲氨酸殘基的已經活化的凝血因子Ila、IXa, Xa, XIa, XIIa的滅活，產生強大的抗凝血作用，但肝素類藥物不能口服給藥，不便于患者用藥。香豆素類藥物與維生素K結構相似，通過拮抗維生素K 的利用，抑制凝血因子II、VII、IX、X在體內的合成，產生抗凝血作用，香豆素類藥物可以口服給藥，但起效慢，且在體外沒有抗凝血活血。阿司匹林可抑制環氧酶活性，抑制血小板花生四烯酸代謝產生血栓素A2，產生抗血小板活性。此外，阿司匹林還抑制凝血酶原在肝內的合成，具有抗凝血作用(參見李素燕等，抗血栓藥物的研究進展，國外醫學藥學分冊，2006， 33 (6) :428)。血液凝固有內源性和外源性兩條凝血途徑，研究藥物的抗凝血作用通常測定藥物對小鼠毛細管凝血時間和尾尖出血時間，以及凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血激酶時間(APTT)、血漿復鈣時間(PRT)的影響。APTT和PT是臨床凝血功能檢測中最常用的兩個參數，其中APTT主要用于檢測機體的內源性凝血系統，其延長或縮短分別反映凝血因子II、V、VIII、X、XI和XII的血漿活性降低或增加，PT則主要用于檢測機體的外源性凝血系統，其延長或縮短分別反映凝血因子I、II、V、VII和X的血漿活性降低或增加(參見王曉鋒等，抗血小板聚集藥物的機制研究進展，中國康復理論與實踐，2010，16 (10) :954)。紫葳科植物凌霄或美洲凌霄的干燥花作為凌霄花入藥，凌霄花水煎液能加快老齡大鼠的血流速度，增加毛細血管網交叉點，擴張小血管管徑，抑制紅細胞聚集，降低血液粘度。小劑量的凌霄花粗提物能顯著抑制血小板聚集，一定程度上具有較好的改善微循環、活血化瘀的功效。凌霄花甲醇提取物對卵白溶菌酶致敏小鼠血流量降低有顯著的改善作用。 凌霄花水煎液對大鼠的血栓形成有抑制作用(參見楊陽等，凌霄花的化學成分及藥理作用綜述，中國藥師，2008,11(1 :1521)。該文獻同時指出美洲凌霄花多糖不具有抑制血栓形成的作用。同時，現有技術中未見關于美洲凌霄花多糖是否具有抗凝血作用的報道。 發明內容
本發明的發明目的是提供美洲凌霄花多糖的一種新的應用，即美洲凌霄花多糖在制備抗凝血藥物中的應用。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是美洲凌霄花多糖在制備抗凝血藥物中的應用。上述技術方案中，概念“多糖”為本領域技術人員公知的概念，例如，現有技術中有 “黃芪多糖”、“紫錐菊多糖提取物”等多糖，多糖是極性大分子化合物，常用的提取方法有 熱水浸提法、稀堿浸提法、酸浸提法和酶法。前三種為化學方法，酶法為生物方法。稀酸提取時，時間宜短、溫度不宜超過50°C。一般植物多糖提取多采取熱水浸提法。優選的技術方案中，上述美洲凌霄花多糖是粗多糖，是混合物，其制備方法包括以下步驟
(1)取美洲凌霄花，先用水回流提取至少1次，然后將提取液過濾后合并，然后濃縮， 得到濃縮濾液；
(2)向濃縮濾液中加入沉淀劑無水乙醇，獲取沉淀；將沉淀加入水中溶解，再加入三氯乙酸除去蛋白，離心，棄去沉淀，上清液用氫氧化鈉中和多余的三氯乙酸；然后采用透析法分離得到多糖，即位供美洲凌霄花多糖。人體內凝血系統和抗凝系統處于一個動態平衡的狀態，過度凝血會導致心肌梗死、腦血栓等嚴重疾病。血液凝固有內源性和外源性兩條凝血途徑，研究藥物的抗凝血作用通常測定藥物對小鼠毛細管凝血時間和尾尖出血時間，以及凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血激酶時間(APTT)、血漿復鈣時間(PRT)的影響。APTT和PT是臨床凝血功能檢測中最常用的兩個參數，其中APTT主要用于檢測機體的內源性凝血系統，其延長或縮短分別反映凝血因子II、V、VIII、X、XI和XII的血漿活性降低或增加，PT則主要用于檢測機體的外源性凝血系統，其延長或縮短分別反映凝血因子I、II、V、VII和X的血漿活性降低或增加。本發明通過體內給藥測定美洲凌霄花多糖對小鼠毛細管凝血時間和尾尖出血時間的作用；測定美洲凌霄花多糖對小鼠凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血激酶時間(APTT)、血漿復鈣時間(PRT)的影響。抗凝血實驗結果表明，美洲凌霄花多糖能顯著延長小鼠毛細管凝血時間和尾尖出血時間，并顯著延長小鼠凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)和血漿復鈣時間(PRT)，顯示其主要通過抑制外源性凝血因子活性，使纖維蛋白的生成受到抑制，凝血酶時間顯著延長。實驗結果確定，美洲凌霄花多糖具有顯著的抗凝血作用。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
1.本發明提供了美洲凌霄花多糖的新用途，即制備抗凝血藥物中的應用，采用該抗凝血藥物能顯著延長小鼠毛細管凝血時間和尾尖出血時間，并顯著延長小鼠凝血酶時間 (TT)、凝血酶原時間(PT)和血漿復鈣時間(PRT)，顯示其主要通過抑制外源性凝血因子活性，使纖維蛋白的生成受到抑制，凝血酶時間顯著延長。
圖1為實施例中得到的標準曲線。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和實施例對本發明作進一步描述 實施例一
本實施例所使用的藥品與試劑包括美洲凌霄花多糖(含量> 50%，紫外分光光度法測定)蘇州大學提供，動物給藥用0.5% CMC-Na配制。阿司匹林腸溶片(批號H32026500)， 南京白敬宇制藥有限責任公司，動物給藥用0.5% CMC-Na配制。凝血酶原時間(PT)試劑盒(編號-XW滬0556-40-2009)、活化部分凝血激酶時間(APTT)試劑盒(編號-XW滬 0555-40-2009 )和凝血酶時間(TT )試劑盒(編號AZB/滬0558-40-2009 )，上海太陽生物制品有限公司。(一)美洲凌霄花多糖制備
IOOg美洲凌霄花，水回流提取兩次，第一次用水1500ml，回流提取兩小時；第二次用水 1000ml,回流提取一小時，提取液過濾合并。將濾液濃縮至100ml，加入300ml無水乙醇放置12h，離心取沉淀。沉淀加入IOOml水溶解，溶液加入60%三氯乙酸33ml，40°C靜置4h，離心，棄去沉淀，上清液用NaOH中和。透析17小時。將透析液蒸干得粗多糖5. 91g。(二)美洲凌霄花多糖含量測定 (1)標準曲線繪制
準確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖標準品IOOmg置100 ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度搖均。準確吸取0. 2ml, 0. 4ml, 0. 6ml, 0. 8ml, 1. 0ml，分別置具塞試管中，分別加水至 2ml，各精密加入5%苯酚溶液Iml，搖勻，迅速精密加入硫酸5 ml，搖勻放置10分鐘，置40°C 水浴15分鐘，取出，冷卻至室溫，以蒸餾水做空白，與490nm處測定吸光度，得標準曲線如圖 1 所示。回歸方程:y=36. 2x+0. 661 ；R2=O. 9937。(2)多糖含量測定
精密稱取粗多糖lOOmg，置100 m 1容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度搖均。精密吸取1 ml置具塞試管，加水至anl，其余按上述操作，計算含量。結果為所得美洲凌霄花多糖含量 508mg · g-1。(三)體外實驗
本實施例中所述實驗對象為ICR小鼠，體重18 22g，揚州大學動物繁殖中心提供，實驗動物生產許可證SCXK (蘇)2007-0001。1.研究美洲凌霄花多糖對小鼠凝血時間的影響取雄性ICR小鼠，選基礎生理凝血時間在40 160s者用于實驗，根據基礎凝血時間隨機分為5組，每組10只，空白組按 0. lml/10g灌胃生理鹽水，其余各組均按等體積灌胃相應的藥液，分別給美洲凌霄花多糖低劑量50mg/kg、中劑量100mg/kg、高劑量200mg/kg和阿司匹林50mg/kg，每天給藥1次，連續給藥7d。小鼠于末次給藥前禁食不禁水12h，于末次給藥后Ih按毛細管法測小鼠凝血時間(末次給藥后lh，用長10cm、內徑Imm的玻璃毛細管插入小鼠眼內眥后靜脈叢中，深約 4 5mm，輕輕轉動，自血液注滿開始計時，取出毛細管平放于桌上，每隔約1 折斷一端約 0. 5cm，并緩慢向左右拉開，觀察折斷處出現凝血絲所需時間)。結果見表1，與空白組比較，美洲凌霄花多糖能顯著延長小鼠凝血時間，陽性藥阿司匹林也能顯著延長小鼠凝血時間。表1美洲凌霄花多糖對小鼠凝血時間的影響(Mean 士 SD，η = 10)
權利要求
1.美洲凌霄花多糖在制備抗凝血藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及美洲凌霄花多糖的應用，特別涉及美洲凌霄花多糖在制備抗凝血藥物中的應用。體內給藥測定美洲凌霄花多糖對小鼠毛細管凝血時間和尾尖出血時間的作用；測定美洲凌霄花多糖對小鼠凝血酶時間、凝血酶原時間、活化部分凝血激酶時間、血漿復鈣時間的影響。抗凝血實驗結果表明，美洲凌霄花多糖能顯著延長小鼠毛細管凝血時間和尾尖出血時間，并顯著延長小鼠凝血酶時間、凝血酶原時間和血漿復鈣時間，顯示其主要通過抑制外源性凝血因子活性，使纖維蛋白的生成受到抑制，凝血酶時間顯著延長。實驗結果確定，美洲凌霄花多糖具有顯著的抗凝血作用。
文檔編號A61K31/715GK102552308SQ201210070300
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者吳雙慶, 姚士, 孫群, 張健, 褚純雋, 韓海燕 申請人:蘇州大學