專利名稱：一種可高效高特異滅殺p53基因突變型乳腺癌細胞的藥物脂質體的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及ー種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞T-VISA-miR34a治療載體及其藥物T-VISA_miR34a脂質體。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發病率逐年上升，嚴重危害了人類的身體健康。乳腺癌療效較好，但是仍有一部分患者綜合治療后會出現復發和轉移，對現有藥物療效很 差。microRNAs (miRNAs)是近年來發現的ー類長度為18-24個核苷酸的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶標基因3’ UTR的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調控個體發育、細胞凋亡、増殖及分化等生命活動。miRNA在人類腫瘤的發生和發展中扮演重要角色，發揮著癌基因或抑癌基因的作用，有望成為癌癥治療的作用靶點。因此，迫切需要探索高效靶向殺滅乳腺癌的新藥物。
發明內容
本發明的第一個目的是提供ー種高效靶向乳腺癌BCL-2，⑶44靶點，可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的T-VISA-miR34a治療載體。本發明的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的T-VISA_miR34a治療載體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發明克隆端粒酶啟動子hTERT，長度為418bp，具有腫瘤細胞特異性，但其活性在腫瘤細胞中不到CMV啟動子活性的I %，因此無法廣泛應用，本發明首先將hTERT啟動子控制Gal4-VP2(兩個拷貝的VP16，具有強烈的轉錄激活特性)融合蛋白基因；再將Gal4-VP2融合蛋白與Gal4效應元件G5E4T結合，啟動靶基因或目的基因的大量轉錄 ’然后將WPRE位于目的基因的3-UTR，增強mRNA穩定性的作用，由此構建得到hTERT_VP16_GAL4-WP RE (VP16-GAL4-WPRE Integrated Systemic Amplifier, VISA,整合性系統放大器)調控系統，簡稱為T-VISA(整合性系統放大器)系統，最后，結合miR34a作為治療基因，建立T-VISA-miR34a治療載體，該T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發明的第二個目的是提供一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物T-VISA-miR34a脂質體，其特征在于，包括脂質體和被脂質體包被的T-VISA_miR34a治療載體，所述的T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述的脂質體可以使用按照常規方法制備的脂質體，優選是通過以下方法制備的脂質體按照I摩爾膽固醇對應I. 7摩爾磷脂酰膽堿的比例，秤取磷脂酰膽堿與膽固醇，用磷脂酰膽堿質量1/4的氯仿作為溶劑溶解磷脂酰膽堿與膽固醇，將上述溶液置于旋轉燒瓶中，旋轉燒瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶劑，得到ー層附著在燒瓶壁上的脂膜；然后再用按8. 9/100ml/g磷脂酰膽堿的量加入質量分數為5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋轉真空干燥，然后再加入雙蒸水至上述質量分數為5 %的葡萄糖溶液的體積，在500C的超聲水浴箱中進行超聲處理lmin，再在50°C下收集通過O. I μ m的聚碳酸酯膜濾膜的脂質體。通過該方法制備的脂質體粒徑為ISOnm左右，容許其穿透腫瘤細胞中極細的毛細血管并被細胞攝取。所述的藥物T-VISA_miR34a脂質體優選通過以下方法制備的，將上述脂質體加入到5%的葡萄糖溶液中使脂質體的濃度為8mM，將T-VISA-miR34a治療載體加入到5%的葡萄糖溶液中使T-VISA-miR34a治療載體的濃度為I μ g/ml，然后將脂質體溶液和T-VISA-miR34a治療載體溶液混合靜置20min，由此得到藥物T-VISA_miR34a脂質體。利用該方法制備得到的藥物T-VISA-miR34a脂質體的粒徑200 300nm，穩定性好，在4 8°C，1-2年無降解。本發明還發現，藥物T-VISA_miR34a脂質體與5_氟尿嘧啶脂質體存在協同作用，因此本發明的第三個目的是提供一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物，其特征在于，由藥物T-VISA-miR34a脂質體和5-氟尿嘧啶脂質體組成。本發明的藥物T-VISA-miR34a脂質體在體外能高效殺滅P53基因突變的乳腺癌細 胞系，而對正常細胞無殺滅作用。由此可見，本發明的T-VISA-miR34a治療載體經脂質體包裹輸送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶點，與其3’UTR的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，導致P53基因突變乳腺癌細胞凋亡，而對正常細胞無滅殺作用，可全身給藥，基因表達量高、時間長、效率高，藥效確切，毒副作用低，無肝腎毒性，在治療P53突變型乳腺癌中具有廣闊的前景。
圖I是T-VISA_miR34a治療載體的結構示意圖，它是以pUK_21為基本骨架，卡那霉素抗性的可治療性載體；圖2是動態光散射測量實施例2制得的脂質體(Liposome)和實施例3的T-VISA-miR34a 脂質體(Liposome+T-VISA-miR34a)的粒徑及其分布；圖3是藥物T-VISA_miR34a脂質體在體外殺滅P53突變型乳腺癌細胞系的結果圖，其中Ctrl表示沒有做任何處理的空白對照，T-VISA-miR34a表示藥物T-VISA_miR34a脂質體，P53是指P53基因，M表示突變型，W表示野生型；圖4是藥物T-VISA-miR34a脂質體抑制BCL2，E2F3的mRNA結果圖，其中Ctrl表示沒有做任何處理的空白對照；圖5是藥物T-VISA-miR34a脂質體聯合5-FU殺傷乳腺癌細胞的效果圖，其中Ctrl表示沒有做任何處理的空白對照。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進ー步說明，而不是對本發明的限制。一、T-VISA-miR34a 脂質體的制備實施例I :T-VISA-miR34a治療載體的構建(一)pCRII-TOPO-hTERT 質粒克隆I、常規方法提取乳腺癌MCF-7細胞(從美國ATCC公司購買)的DNA。
2、以該DNA作為模板，設計擴增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(Forward)和下游(Reverse)引物Forward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc~3' (XbaI)Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc agegc-3/ 。3、以乳腺癌 MCF-7 細胞 DNA 為模板，hTERT PCR 引物(Forward :5' -ata tct agaggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc- ' ；Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccgccc acg tgc gca gca gga cgc age gc~3' )、Pfu DNA polymerase、dNTP 和 PCR 反應液，擴增獲得hTERT啟動子(-416 to+Ι)產物，其序列如SEQ ID NO. 2所示。其PCR反應體系10XPCR buffer 5 μ 1，上游(Forward)和下游(Reverse)引物各 I μ I，MCF-7 細胞 DNA 為模板 IOOng DN A, 25mM MgCl2 3 μ I，IOmM dNTPs I μ I,Pfu-Taq(IU/ μ I)，最后補水至 50 μ I。PCR反應條件94°C熱變性5min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共進行3 O次循環；最后72°C延伸lOmin。4、PCR產物用Qiangen公司(美國)PCR DNA回收試劑盒回收，回收約418bp大小片斷。方法參考其說明書。5、將回收的 PCR 產物 2 μ 1，pCRII-TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA) I μ I, DNAligase buffer I μ I,最后補水至 10 μ 1,4°C連接反應 lOmin。6、將2μ I連接產物與50μ I E. coll DH5 α感受態細胞混合后，冰浴30min。42 °C水浴熱激動反應45sec，然后冰上放置3min。加入預熱的LB培養基500 μ 1，在37°C下250rpm 震搖 30min。7、取200 μ I LB培養基細菌液，涂布ampicillin LB培養板上，在37°C下培養16小吋。挑取陽性單克隆，提取質粒。8、酶切質粒鑒定，進行測序分析，證實hTERT啟動子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)已經插入克隆載體pCRII-TOPO中，命名為pCRII-TOPO-hTERT。 (ニ)pGL3-hTERT_Luc 質粒克隆I、用 KpnI/Xho I 酶切 pCRII-TOPO-hTERT 質粒，用 KpnI/Xho I 酶切 pGL-3-basic質粒(Promega公司，麥迪遜，WI),該質粒中含有突光素酶Luciferase基因。酶切體系IOXBuffer A 2 μ I, KpnI/Xho I I μ 1，質粒 5 μ g，補水至 20 μ 1，37°C 水浴 I 小時。2、酶切產物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收hTERT (418bp大小)片斷和pGL-3-Basis(4792bp大小)片斷。3、酶切產物用Qiangen公司(美國)PCRDNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 hTERT 產物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 產物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer Ιμ ，最后補水至10 μ 1，4°C連接反應4小時。5、將2μ I連接產物與50μ I E. coli DH5 α感受態細胞混合后，冰浴30min。42 °C水浴熱激動反應45sec，然后冰上放置3min。加入預熱的LB培養基500μ 1，在37°C下250rpm 震搖 30min。6、取200 μ I LB培養基細菌液，涂布Ampicillin LB培養板上，在37°C下培養16小吋。挑取陽性單克隆，提取質粒。 7、酶切質粒鑒定,進行測序分析，證實hTERT啟動子已經插入載體pGL_3_basic中，命名為pGL3-hTERT-Luc質粒。(三)pGL3-Luc-WPRE質粒克隆I、用 Asp718/Sall 酶切 pGEM_3Z_WPRE 質粒(Promega 公司，麥迪遜，WI)，然后用DNA polymerase 平端；用 Small 酶切 pGL-3-basic 質粒(Promega 公司，麥迪遜,WI)。酶切體系10X Buffer A 2μ 1，Asp718 I μ 1/SalI I μ 1，質粒 5 μ g，補水至 20 μ 1，37°C 水浴 I小吋。2、酶切產物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收WPRE (590bp大小)片斷和pG_L3_Basic (約4800bp大小)片斷。3、酶切產物用Qiangen公司(美國)PCRDNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 WPRE 產物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 產物 2μ 1，DNA ligase I μ I, buffer I μ 1，最后補水至10 μ 1，4°C連接反應4小時。5、2 μ I連接產物與50 μ I E. coli DH5感受態細胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應45sec，然后冰上放置3min。加入預熱的LB培養基500μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。6、取200 μ I LB培養基細菌液，涂布Ampicillin LB培養板上，在37°C下培養16小吋。挑取陽性單克隆，提取質粒。7、酶切質粒鑒定，進行測序分析，證實WPRE插入了 pGL-3-basic中，命名為pGL3-Luc-WPRE 質粒。(四)pGU-hTERT-TSTA-Luc質粒克隆I、用 Hindlll/Notl 酶切 pCRII-TOPO-hTERT質粒(見上)，然后用 DNA polymerase平端；用 MSCI/Nhel 酶切 pGL3_TSTA_Luc 質粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)，然后用 DNApolymerase 平端。酶切體系10X Buffer A 2 μ l,HindIII/NotI or MSCI/Nhell μ I,質粒5 μ g，補水至20μ 1，37°C水浴I小時。2、酶切產物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收hTERT (418bp大小)片斷和pGL3-TSTA-Luc(7300bp大小)片斷。3、酶切產物用Qiangen公司(美國)PCRDNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 hTERT 產物 6 μ 1，回收的 pGL3_TSTA_Luc 產物 2 μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后補水至10 μ 1，4°C連接反應4小時。5、2 μ I連接產物與50 μ I E. coli DH5 α感受態細胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應45sec，然后冰上放置3min。加入預熱的LB培養基500 μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。6、取200 μ I LB培養基細菌液，涂布Ampicillin LB培養板上，在37°C下培養16小吋。挑取陽性單克隆，提取質粒。7、酶切質粒鑒定，進行測序分析，證實hTERT啟動子插入了載體pGL3_TSTA-Luc中，命名為 pGL3-hTERT-TSTA-Luc 質粒。(五)T-VISA-Luc質粒克隆I、用 Notl/Bglll 酶切 pGL3-Luc_WPRE 質粒(見上)；用 Notl/Bglll 酶切pGL3-hTERT-TSTA-Luc 質粒(見上)。酶切體系10X Buffer A 2 μ I, NotI I μ I, BglIII μ 1，質粒5 μ g，補水至20μ 1，37°C水浴I小時。
2、酶切產物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收WPRE (590bp大小)片斷和 pGL3-hTERT-TSTA-Luc(7593bp 大小)片斷。3、酶切產物用Qiangen公司(美國)DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。4、回收的 WPRE 產物 6 μ 1，回收的 pGL3-hTERT-TSTA_Luc 產物 2 μ 1，DNA ligaseI μ 1，buffer I μ 1，最后補水至10 μ 1，4°C連接反應4小時。5、2 μ I連接產物與50 μ I E. coli DH5感受態細胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應45sec，然后冰上放置3min。加入預熱的LB培養基500μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。
6、取200 μ I LB培養基細菌液，涂布Ampicillin LB培養板上，在37°C下培養16小吋。挑取陽性單克隆，提取質粒。7、酶切質粒鑒定，進行測序證實，命名為pGL3-hTERT-TSTA-Luc_WPRE質粒，簡稱pGL3-hTERT-VISA-Luc 質粒，即 T-VISA-Luc 質粒。(六)pGL3-T-VISA_miR34a質粒I、以 miRBase 數據庫公布的人 has-miR_34a (ΜΙ0000268)序列uggcagugucuuagcugguugu,對應的 DNA 序列為TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT,另合成隨機序列(在人緣內無靶點)5' -GACUAACGCAAGUCCACUGAU-3'，依據以上序列設計合成莖環結構的寡核苷酸單鏈，在兩條配對單鏈的5'端分別加入BglII、NheI酶切位點，loop環序列為CTCGAG。寡核苷酸單鏈(英濰捷基(上海)貿易有限公司合成)體外復性成雙鏈(復性緩沖液IOOmmoI/L Tris-HCl，pH 8. O ；IOmmoI/LEDTA, pH 8. O ；lmol/LNaCl 復性程序95°C孵育lOmin，關閉電源緩慢冷卻至室溫)，取5 μ L 500nmol/L的復性產物經5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2、用 Bglll/Nhel 酶切 pGL3_hTERT_VI SA-Luc 質粒粘性末端，酶切體系10XBuffer A2 μ 1，BglII I μ 1，NheI I μ 1，質粒 5 μ g，補水至 20 μ 1，37°C水浴 I 小時。3、pGL3-hTERT-VISA-Luc質粒酶切產物與復性has_miR-34a發夾結構在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收miR_34a shRNA片段(493bp)和pGL3-hTERT-VISA片斷(1650bp)(酶切去除了熒光素酶基因)。4、酶切產物用Qiangen公司(美國)DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。5、回收的 miR-34a shRNA 產物 6 μ 1，回收的 pGL3_hTERT_VISA 產物 2 μ 1，DNAligase I μ 1，buffer I μ 1，最后補水至10 μ 1，室溫連接反應過夜。6、2 μ I連接產物與50 μ I E. coli DH5 α感受態細胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應45sec，然后冰上放置3min。加入預熱的LB培養基500 μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。7、取200 μ I LB培養基細菌液，涂布Ampicillin LB培養板上，在37°C下培養16小吋。挑取陽性單克隆，提取質粒。8、酶切質粒鑒定，進行測序證實，miR-34a shRNA插入到pGL3_hTERT_VISA中，命名為 pGL3-T-VISA-miR34a 質粒。(七)pUK21-T-VISA_miR34a治療載體I、用 Notl/Sall 酶切 pGL3-T-VISA_miR34a 質粒，酶切體系10X Buffer A 2μ 1，NotI I μ I,Sail I μ I，質粒 5 μ g，補水至 20 μ 1，37°C 水浴 I 小時。用 Notl/Sall 酶切 pUK21質粒，酶切體系為10X Buffer A 2 μ I, NotI I μ 1，Sail I μ 1，質粒 5 μ g，補水至 20 μ 1，37°C水浴I小時。2、酶切產物在IXTAE Agarose凝膠中電泳，120v電泳30分鐘，回收T-VISA_miR34a片段(1049bp)和 pUK21 片段(816bp)。3、酶切產物用Qiangen公司(美國)DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
4、回收的 T-VISA-miR34a 產物 6μ 1，回收的 pUK21 產物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后補水至10 μ 1，4°C連接反應4小時。5、2 μ I連接產物與50 μ I E. coli DH5 α感受態細胞混合后，冰浴30min。42°C水浴熱激動反應45sec，然后冰上放置3min。加入預熱的LB培養基500 μ 1，在37°C下250rpm震搖30min。6、取200μ1 LB培養基細菌液，涂布Kanamycin LB培養板上，在37°C下培養16小吋。挑取陽性單克隆，提取質粒。7、酶切質粒鑒定，進行測序證實，T-VISA-miR34a片段插入到pUK21質粒的NotI/SalI位點，命名為pUK21-T-VISA-miR34a治療載體，簡稱T-VISA_miR34a治療載體，經測序其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。pUK21-T-VISA-miR34a治療載體是合成的miR_34a shRNA雙鏈經復性后，miR-34ashRNA 片段插入到 pGL3-hTERT-TSTA-Luc_WPRE 質粒的 Bgl II/Nhe I / 平端位點，產生pGL3-T-VISA-miR34a 質粒。pGL3-T-VISA_miR34a 質粒 Notl/Sall 酶切后，T-VISA_miR34a片段插入到PUK21質粒的Notl/Sall位點，產生pUK21-T-VISA_miR34a治療載體，簡稱為T-VISA-miR34a治療載體，其結構如圖I所示。pUK21-T-VISA-miR34a治療載體主要包括hTERT啟動子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)、WPRE(其序列如SEQ ID NO. 3所示)、G5E4T(其序列如SEQ ID NO. 4所示)和Gal4_VP2基因(其序列如SEQ ID NO. 5所示)和miR-34a shRNA序列(其序列如SEQ ID NO. 6所示)。hTERT啟動子控制Gal4-VP2 (兩個拷貝的VP16，具有強烈的轉錄激活特性)融合蛋白基因；Gal4-VP2融合蛋白與Gal4效應元件G5E4T結合，啟動micro RNA34a的大量轉錄，micro RNA34a與Bcl_2，⑶44等靶標基因3’ UTR的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，從而導致細胞凋亡。實施例2 :脂質體的制備將脂質從冰箱中取出(D0TAP儲存于_20°C、膽固醇儲存于_4°C )，恢復至室溫。水浴加熱2個旋轉蒸發儀分別至30°C，50°C。稱取68. 75mg膽固醇，放入1000ml圓底燒瓶。向圓底燒瓶中加入IOOmg DOTAP和25mg Chloroform。轉動燒瓶，使其充分混合。在30°C的水浴箱中旋轉圓底燒瓶2min，使其混合均勻，在燒瓶壁上形成ー層薄膜。打開真空抽吸器，30で下30min。加入8. 9ml預熱的5%葡萄糖溶液溶解已干燥的薄膜,50で下以105轉/min快速旋轉45min。然后降低溫度至35°C旋轉lOmin。用保鮮膜(或石蠟)封ロ燒瓶，室溫下過夜，避光。測量體積，加雙蒸水至8. 9ml。在50°C的超聲水浴箱中(200W)對燒瓶進行超聲處理 I 分鐘。在 50°C下依次通過 I. O μ m，0. 45 μ m，0. 22 μ m，0. I μ m 的濾膜(I. O μ m，O. 45 μ m為 Whatman 的 polysufone 濾膜，貨號分別為 #6780-1310 和 #6780-1304 ；0. 22μπι，0· Iym為Whatman的Anotop濾膜，貨號分別為#6808-1122和#6809-1112)，最后通過0. I μ m的脂質體放入潔凈的玻璃瓶中。用氮氣填充試管10秒，將脂質體保存于試管中置于4°C避光保存備用(同時防止空氣進入)。實施例3 T-VISA-miR34a脂質體的制備T-VISA-miR34a治療載體溶于5%葡萄糖溶液，使其終濃度為lug/ul，同時將存儲濃度(20mM)的實施例2的脂質體用5%葡萄糖溶液稀釋為工作濃度(8mM)。I μ g DNA/ul的T-VISA-miR34a治療載體緩慢加入8mM的脂質體中(治療載體脂質體=20ug 50ul)，在室溫中靜置20分鐘，反應，形成藥物T-VISA-miR34a脂質體。然后再檢定、生物特性檢測和內毒素等質控，無菌分裝。成品檢定，包裝，4_8°C保存；使用前先放室溫20分鐘，可直接用于體外研究， 也可用于體內研究，也可用5%葡萄糖溶液稀釋后使用。ニ、效果實驗I、T-VISA-miR34a脂質體的生物特性對實施例3獲得的T-VISA_miR34a脂質體進行生物特性測定，其生物特性如下脂質體大小經動態光散射所測的脂質體粒徑在180nm左右，包裹質粒后粒徑約為 200nm-300nm(見圖 2)。脂質體穩定性在4-8度1-2年無降解。濃度4mM。2、T-VISA-miR34a脂質體的抗乳腺癌活性2. I體外實驗將T-VISA_miR34a脂質體共轉染乳腺癌細胞和正常細胞系，48小時后，收集細胞、裂解，計算細胞存活率，以未做任何處理的癌細胞作為空白對照(即圖中的ctrl)，結果如圖3所示，由圖3中可以看出，T-VISA-miR34a脂質體可高效殺滅P53基因突變型乳腺癌細胞，對P53基因野生型乳腺癌細胞和正常細胞沒有明顯殺傷作用。2. 2機制實驗將T-VISA_miR34a脂質體共轉染乳腺癌細胞，48小時后，用Trizol (購自Invitrogen公司)收集細胞，按照Trizol標準操作步驟提取RNA后，Nanodrop (Thermo)定量RNA,后用MMLV (Invitrogen公司)逆轉錄酶以OligdT逆轉錄成cDNA,按照以下反應體系定量PCR檢測BCL2，E2F3，⑶44基因表達(反應體系模版cdnaIuL,IOuM 弓丨物 F/R 各 O. 5uL, SYBRmix IOuL, ddH20 8uL)(檢測引物為BCL2 F 5' -CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3' , R5/ -ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG-3' ；E2F3 F :5 ' -TGCTTTCGGAAATGCCCTTACA-3 ' , R :5 ' -GATGACCGCTTTCTCCTAGCT-3 ' ;CD44 F 5' -TCAGAGGAGTAGGAGAGAGGAAAC-3'，R :5, -GAAAAGTCAAAGTAACAATAACAGTGG-3')，以上反應體系混勻，置于ABI7900HT儀器中，95°C 5min預變性后，95°C 15s — 65°C 35s (熒光檢測)，40cycles。以未做任何處理的癌細胞作為空白對照(即圖中的ctrl)，計算結果如圖4所示，由圖4中可以看出，T-VISA-miR34a脂質體可高效抑制乳腺癌BCL2和E2F3基因的表達，對CD44mRNA的影響不明顯。2. 3 T-VISA-miR34a脂質體聯合5_FU(5_氟尿嘧啶)用藥效果實驗將T-VISA-miR34a 脂質體與 5-FU 混合，終濃度分別為 T-VISA_miR34a 0. 56nM ；5-FU 1. 25ug/mL，然后共轉染乳腺癌細胞，以二者単獨用藥作對照，48小時后，收集細胞、裂解，計算細胞存活率，以二者単獨用藥作陽性對照，未做任何處理的癌細胞作為空白對照(即圖中的ctrl)，結果如圖5 所示，由圖5中可以看出，T-VISA-miR34a可與5-FU協同殺傷乳腺癌細胞。
權利要求
1.ー種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的T-VISA-miR34a治療載體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物T-VISA-miR34a脂質體，其特征在于，包括脂質體和被脂質體包被的T-VISA-miR34a治療載體，所述的T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根據權利要求2所述的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物T-VISA-miR34a脂質體，其特征在于，所述的脂質體是通過以下方法制備的按照I摩爾膽固醇對應I. 7摩爾磷脂酰膽堿的比例，秤取磷脂酰膽堿與膽固醇，用磷脂酰膽堿質量1/4的氯仿作為溶劑溶解磷脂酰膽堿與膽固醇，將上述溶液置于旋轉燒瓶中，旋轉燒瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶劑，得到ー層附著在燒瓶壁上的脂膜；然后再用按8.9/100ml/g磷脂酰膽堿的量加入質量分數為5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋轉、真空干燥，然后再加入雙蒸水至上述質量分數為5 %的葡萄糖溶液的體積，在50°C的超聲水浴箱中進行超聲處理lmin，再在50°C下收集通過O. I μ m的聚碳酸酯膜濾膜的脂質體。
4.根據權利要求3所述的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物T-VISA-miR34a脂質體，其特征在于，所述的藥物T-VISA_miR34a脂質體是通過以下方法制備的將脂質體加入到5%的葡萄糖溶液中使脂質體的濃度為8mM，將T-VISA-miR34a治療載體加入到5%的葡萄糖溶液中使T-VISA_miR34a治療載體的濃度為I μ g/μ 1，然后將脂質體溶液和T-VISA-miR34a治療載體溶液混合靜置20min，由此得到藥物T-VISA_miR34a脂質體。
5.一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物，其特征在干，由權利要求2所述的藥物T-VISA-miR34a脂質體和5-氟尿嘧啶脂質體組成。
全文摘要
本發明公開了一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物T-VISA-miR34a脂質體。可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的T-VISA-miR34a治療載體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細胞的藥物T-VISA-miR34a脂質體，包括脂質體和被脂質體包被的T-VISA-miR34a治療載體，所述的T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明的T-VISA-miR34a治療載體經脂質體包裹輸送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶點，與其3’UTR的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，導致乳腺癌細胞凋亡，而對正常細胞無滅殺作用，可全身給藥，基因表達量高、時間長、效率高，藥效確切，毒副作用低，無肝腎毒性，在治療P53突變型乳腺癌中具有廣闊的前景。
文檔編號A61P35/00GK102716498SQ201210064390
公開日2012年10月10日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者伍民慶, 孔亞楠, 李來勝, 肖祥勝, 謝小明, 謝新華, 郭姣麗, 韋尉東 申請人:中山大學腫瘤防治中心