專利名稱：志賀樣毒素Stx1B口服疫苗的制備方法及其產品的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，特別涉及志賀樣毒素StxlB 口服疫苗的制備方法及制得的StxlB 口服疫苗。
背景技術：
大腸桿菌co7i)0157 :H7是腸出血性大腸埃希菌的一個血清型,大腸桿菌0157 :H7感染后能產生毒素使veix)細胞死亡，產生的毒素志賀樣毒素(Stx)，主要作用于豬或者人的結腸和回腸細胞，感染豬后的主要癥狀是豬水腫病。Stx包含有I個 A亞單位和5個B亞單位，組成了 A-5B結構的復合毒素。其中A亞單位是Stx的毒力單位，它具有RNA-N端糖苷酶的活性，能夠干擾細胞內蛋白質的合成，導致細胞損傷死亡。 而B亞單位是無毒性的，但能與具有特定受體(Gb3)的細胞結合，產生特異性抗體，再與 A亞單位結合發揮作用。由于志賀樣毒素B亞基(簡稱為StxlB)不具有致病性，又能有效的誘導免疫應答，因此StxlB可以作為理想的疫苗，用于預防大腸桿菌0157 H7感染。大腸桿菌0157 H7主要入侵途徑是消化道，因此注射免疫途徑的疫苗往往不能有效誘導腸道內的特異免疫反應，但是使用沒有經過特殊的處理口服疫苗抗原而直接進行口服免疫時，能夠有效到達腸道并激起腸道內淋巴系統特異反應的抗原量太低，也不能有效誘導腸道內的免疫反應。因此，急需一種口服疫苗的制備方法，制得的疫苗能夠到達腸道并能激起腸道特異免疫反應的，可以用于預防大腸桿菌0157 H7感染。
發明內容
本發明目的之一在于提供志賀樣毒素StxlB 口服疫苗的制備方法，其制備方法簡單，成本低。為實現上述目的，技術方案為
志賀樣毒素StxlB 口服疫苗的制備方法，具體步驟如下
(1)克隆志賀樣毒素StxlB基因
根據大腸桿菌0157 H7志賀樣毒素StxlB基因序列設計上游引物和下游引物，再提取大腸桿菌0157 :H7基因組DNA，并以提取的基因組DNA為模板，用設計的上游引物和下游引物進行PCR擴增，得志賀樣毒素StxlB基因；
(2)構建含StxlB基因的重組表達載體
將步驟(I)所得的志賀樣毒素StxlB基因進行酶切，并將志賀樣毒素StxlB基因連入經同樣酶切的雙元表達載體，得含StxlB基因的重組表達載體；
(3)制備志賀樣毒素StxlB口服疫苗
將步驟(2)所得重組表達載體轉化農桿菌，得含重組表達載體的農桿菌，將制得的含重組表達載體的農桿菌用于轉化植物細胞，經誘導，篩選，鑒定，得轉基植株，收集轉基因植株，干燥，粉碎，得志賀樣毒素StxlB 口服疫苗。進一步，所述步驟(I)中，所述上游引物核酸序列如SEQ ID NO. I所示，所述下游引物核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。進一步,所述步驟(2)是用限制性內切酶BamH I和Sac I酶切步驟(I)所得志賀樣毒素StxlB基因，同時用BamH I和Sac I酶切雙元表達載體，將回收的StxlB基因與酶切后的雙元表達載體連接。進一步，所述雙元載體為改良pCAMBA1301載體。進一步，所述步驟(3)中，所述農桿菌為EHA105。進一步，所述植物細胞為煙草細胞。本發明目的之二在于提供制得的志賀樣毒素StxlB 口服疫苗，
由所述制備方法制得的志賀樣毒素StxlB 口服疫苗。本發明的有益效果在于本發明公開的志賀樣毒素StxlB 口服疫苗的制備方法， 方法簡單，通過常規的植物轉基因方法即能制得，可以通過轉基因植物的繁殖獲得大量的志賀樣毒素StxlB 口服疫苗，煙草還具有生長快，產量高的特點，因此生產成本低，產量高； 制得的志賀樣毒素StxlB位于植物細胞內，植物細胞的細胞壁具有與“膠囊”相似功能，對表達的志賀樣毒素StxlB蛋白在胃中具有保護作用，因此本發明公開的志賀樣毒素StxlB 口服疫苗不需要經過特殊處理，可以直接添加到飼料中進行口服免疫；口服免疫后志賀樣毒素StxlB在細胞壁的保護下在胃中進行初步消化，然后進入小腸，與小腸中具有特定受體(Gb3)的細胞結合，進而作為抗原誘導免疫應答，產生抗體，達到預防大腸桿菌0157 H7 感染的效果；使用口服疫苗具有免疫成本低，免疫途徑簡單，免疫效果可靠的特點，便于疫苗的推廣；經志賀樣毒素StxlB 口服疫苗免疫后能夠有效預防大腸桿菌0157 H7感染，降低豬水腫病的發病率，同時降低死亡效率。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖I為本發明StXlB基因的PCR電泳圖2為本發明轉基因煙草Western blot鑒定圖(I為非轉基因煙草；2、3為轉基因煙草)。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發明使用的植物材料為煙草(Nicotiana tabacum L. var. W38)由本室保存； 大腸桿菌DH5a、質粒pET-30a(+)、根癌農桿EHA105均由本實驗室保存；改良pCAMBA1301 載體由pCAMBIA1301載體與pCHFl載體改造而來，即采用限制性內切酶EcoR I和Hind III 將pCHFl載體中包括CaMV35S啟動子及多克隆位點Sac I,Kpn I,Smal I.BamH I、Sal I和 Pst I的片段切下，再連接至同樣經EcoR I和Hind III雙酶切的pCAMBIA1301載體上(申請號為201010177056. 6中國專利，申請日為2010年5月19日公開了改良pCAMBA1301載體及其具體制備方法)；質粒PMD19-T，PremixEX TaqDNA聚合酶，T4 DNA連接酶，Sac I、 BamH I限制性內切酶，DNA Maker、質粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司；大腸桿菌0157:H7 購買自北京流行病研究所；小鼠抗StxlB單克隆抗體購自Vir ostat公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；膠回收試劑盒購自QIAGEN公司。實施例I、志賀樣毒素StxlB基因的克隆
根據報道的大腸桿菌0157:H7 StxlB基因序列(GenBank NC_002655. 2)，設計StxlB基因特異引物，上游引物為 StxlB-F :5’_ cgagctcgatgaaaaaaacat—3’ (SEQ ID No. I),下劃線為 Sac I 酶切位點，下游引物為 StxlB_R:5’ - cgcggatccgcgtcaacgaaaaataac _3’ (SEQ ID No. 2)，下劃線為BamH I酶切位點；同時提取大腸桿菌0157 :H7基因組DNA，以提取的大腸桿菌0157:H7基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR程序如下95°C預變性10分鐘循環I次；再951變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸50秒，循環35次，最后72°C后延伸 8分鐘，得StxlB基因。PCR反應產物使用質量體積分數為1%的瓊脂凝膠電泳，結果如圖 I所示。結果顯示，在靠近200bp處有特異條帶，即StxlB基因，回收StxlB基因片段，將回收的StxlB基因片段連接pMD19-T載體，在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，得pMD19_ StxlB載體。將pMD19- StxlB載體轉化大腸桿菌DH5a感受態菌，篩選陽性克隆進行測序， 經側序表明StxlB基因長度為270bp，核酸序列如SEQ ID No. 3所示。實施例2、志賀樣毒素StxlB重組表達載體的構建
用限制性內切酶BamH I和Sac I酶切所得的pMD19_ StxlB載體，回收StxlB基因(此處也可以直接用實施例I中PCR擴增所得StxlB基因直接用BamH I和Sac I進行雙酶切)； 同時用BamH I和Sac I酶切改良pCAMBA1301載體，回收改良pCAMBA1301載體大片段，將回收的StxlB基因與改良pCAMBA1301載體大片段連接，在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，得改良pCAMBA1301-StxlB載體。將所得改良pCAMBA1301-StxlB載體采用凍融法轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞，獲得含有改良pCAMBA1301-StxlB載體根癌農桿菌(EHA105)，命名為StxlB_EHA105。實施例3、轉基因煙草的制備
用獲得的StxlB- EHA105農桿菌采用葉盤法轉化煙草，在含有1.0mg/L 6_BA、50mg/L 卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的MS固體培養基上誘導再生煙草，并將生長2-3cm高的再生煙草轉移至含有50mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的1/2 MS培養基上生根培養，培養期間取少許煙草葉片用CTAB法提取再生煙草基因組DNA，并用StxlB基因特異引物 StxlB-F (SEQ ID No. I)和 StxlB-R (SEQ ID No. 2)進行 PCR 檢測，篩選轉 StxlB 基因煙草，并將生根后的轉基因煙草轉移至土中生長。取轉基因煙草葉片約2g，在冰上加入預冷的Iml Tris-HCl緩沖液(25mmol/L, pH8. O)冰浴研磨后,再加入3 ml提取液(7 mol/ L尿素、2 mo I/L硫脲、O. 4% CHAPSUO mmol /L DTT)，研磨至勻漿后，轉移至離心管中在 40C,12 000轉/分鐘，離心30分鐘，收集上清液，即制得可溶性蛋白。將提取的蛋白進行 SDS-PAGE，然后轉移至硝酸纖維素膜轉移好的硝酸纖維素膜用含5%脫脂奶粉的PBS進行封閉，然后分別與鼠抗StxlB單克隆抗體和HRP標記的兔抗小鼠IgG進行孵育。用PBST緩沖液洗滌后，經DAB顯色，觀察條帶，結果如圖2所示。結果顯示在轉基因煙草中能夠檢測到志賀樣毒素StxlB蛋白，而非轉基因煙草中不能檢測到志賀樣毒素StxlB蛋白，表明了志賀樣毒素StxlB蛋白能夠在轉基因煙草中成功表達。
實施例4、志賀樣毒素StxlB疫苗的預防豬水腫病效果
取轉基因煙草葉片，在25°C條件下，避光干燥處理，粉碎，得志賀樣毒素StxlB 口服疫苗，備用。豬水腫病發生又名大腸桿菌毒血癥，大腸桿菌0157:H7為豬水腫病的病原菌之一。分別在重慶市合川區、長壽區和江津區豬水腫病發生率較高的農戶和養殖場進行了預防試驗，實驗以16日齡斷奶豬為對象，每個實驗點分別設置實驗組和對照組，實驗組飼喂預防飼料，預防飼料為在普通飼料中加入相當于普通飼料重量O. I倍的志賀樣毒素StxlB 疫苗；對照組飼喂與對照組相同量的普通飼料(普通飼料組份重量百分比為，玉米67%、豆柏16. 5%、血球蛋白3%、魚粉3%、麥麩6%、油脂O. 5%、磷酸氫鈣I. 5%、預混料I. 5%、食鹽O. 3%、 賴氨酸O. 16%和華芬HF- II復合酶O. 1%，余量為水)。賀樣毒素StxlB疫苗的預防豬水腫病效果如表I所示
表I.志賀樣毒素StxlB疫苗的預防豬水腫病效果
權利要求
1.志賀樣毒素StXlB口服疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下(1)克隆志賀樣毒素StxlB基因根據大腸桿菌0157 :H7志賀樣毒素StxlB基因序列設計上游引物和下游引物，再提取大腸桿菌0157 :H7基因組DNA，并以提取的基因組DNA為模板，用設計的上游引物和下游引物進行PCR擴增，得志賀樣毒素StxlB基因；(2)構建含StxlB基因的重組表達載體將步驟(I)所得的志賀樣毒素StxlB基因進行酶切，并將志賀樣毒素StxlB基因連入經同樣酶切的雙元表達載體，得含StxlB基因的重組表達載體；(3)制備志賀樣毒素StxlB口服疫苗將步驟(2)所得重組表達載體轉化農桿菌，得含重組表達載體的農桿菌，將制得的含重組表達載體的農桿菌用于轉化植物細胞，經誘導，篩選，鑒定，得轉基植株，收集轉基因植株，干燥，粉碎，得志賀樣毒素StxlB 口服疫苗。
2.根據權利要求I所述的志賀樣毒素StxlB口服疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述上游引物核酸序列如SEQ ID NO. I所示，所述下游引物核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根據權利要求I所述的志賀樣毒素StxlB口服疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(2)是用限制性內切酶BamH I和Sac I酶切步驟(I)所得志賀樣毒素StxlB基因，同時用BamH I和Sac I酶切雙元表達載體，將回收的StxlB基因與酶切后的雙元表達載體連接。
4.根據權利要求3所述的志賀樣毒素StxlB口服疫苗的制備方法，其特征在于所述雙元載體為改良PCAMBA1301載體。
5.根據權利要求1-4任一項所述的志賀樣毒素StxlB口服疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述農桿菌為EHA105。
6.根據權利要求5所述的志賀樣毒素StxlB口服疫苗的制備方法，其特征在于所述植物細胞為煙草細胞。
7.由權利要求1-6任一項所述制備方法制得的志賀樣毒素StxlB口服疫苗。
全文摘要
本發明公開了志賀樣毒素Stx1B口服疫苗的制備方法，具體包括克隆志賀樣毒素Stx1B基因，構建含Stx1B基因的重組表達載體；然后制備轉基因植株；最后制備志賀樣毒素Stx1B口服疫苗，制得的志賀樣毒素Stx1B口服疫苗，能夠直接口服免疫，有效預防大腸桿菌O157H7感染，降低豬水腫病的發病率，同時降低死亡效率。
文檔編號A61P31/04GK102580118SQ20121004324
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者張筱娟, 文文乙豪, 王貴學, 臧廣超, 黃俊麗 申請人:重慶大學