專利名稱：表達a型口蹄疫病毒空衣殼重組腺病毒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組腺病毒，尤其涉及表達A型口蹄疫病毒空衣殼的重組復制缺損型腺病毒及其構建方法，本發明進一步涉及該重組復制缺損型腺病毒在制備預防或治療口蹄疫疫苗中的應用，屬于口蹄疫的防治領域。
背景技術：
口蹄疫是豬、牛、羊等主要家畜和其它家養、野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、 高度接觸性傳染病，易感動物達70多種。口蹄疫的臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發生水泡。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內暴發流行，造成巨大的經濟損失。因此世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須申報的動物傳染病。目前，有三分之二的 OIE成員國流行FMD，時刻威脅著無FMD國家和地區的家畜安全和畜產品貿易。口蹄疫病毒 (Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，其最大顆粒直徑為觀納米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七個血清型A、0、C、南非1、南非2、南非3和亞洲1型，以及65個以上亞型。0型口蹄疫為全世界流行最廣的一個血清型，中國流行的口蹄疫主要為0、A、C三種血清型。口蹄疫病毒各血清之間沒有交叉保護，即使是同一血清型的不同亞型之間抗原差異程度也較大，以至于一種亞型的疫苗可能不完全保護同一血清型中其它亞型FMDV的感染，給口蹄疫的防治帶來了極大的困難。疫苗接種是成功預防、控制乃至最終消滅口蹄疫的最有效手段。目前用于防治口蹄疫的疫苗主要有合成肽疫苗滅活疫苗和兩種。合成肽疫苗是基于病毒的主要抗原位點，利用病毒的主要抗原位點的一部份氨基酸序列合成具有一定結構的多肽，用于免疫動物誘導中和抗體而達到保護的目的。但是，如果在病毒的主要抗原位點上發生關鍵氨基酸的突變，就會導致合成肽疫苗免疫保護效力的喪失。FMD滅活疫苗在消滅歐洲的口蹄疫以及控制世界其他國家的口蹄疫過程中發揮了重要作用。但是，滅活疫苗在生產中需要密閉設施來繁殖有毒力的病毒，存在活病毒逃逸的潛在風險，世界上一些地區FMD的暴發似乎與滅活疫苗中殘存的活病毒有關。此外，制備 FMD滅活疫苗的抗原未經提純，含有病毒非結構蛋白，難于進行感染動物和免接種動物的鑒別診斷。如今成為研究熱點的口蹄疫候選疫苗包括減毒活疫苗，蛋白質亞單位疫苗，合成肽疫苗，DNA疫苗和重組病毒疫苗等。到目前為止，證明最有效的FMD新型疫苗是人5型復制缺損型腺病毒(Ad5)表達的口蹄疫病毒空衣殼。Ad5作為一個理想的載體的重要原因是因為其免疫動物后不產生針對Ad5的中和抗體，排除了二次免疫的干擾。鑒于FMD滅活疫苗的上述缺點，國內外研究者都在尋求一種更加安全有效的口蹄疫疫苗。理想的口蹄疫疫苗應具有病毒的完整抗原譜，其免疫原性類似于天然的病毒顆粒， 并且沒有病毒的核酸，不能自主復制等特點。以缺損型腺病毒(Ad5)為載體的口蹄疫病毒空衣殼疫苗完全滿足了上述要求，可被視為病毒減毒活疫苗和亞單位蛋白質疫苗的結合， 這樣既可以避免亞單位疫苗需要佐劑和多次接種注射的缺陷，又可以誘導全面而持久的免疫反應，而且其免疫動物后不產生針對Ad5的中和抗體，排除了二次免疫的干擾。
發明內容
本發明的目的之一是提供編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組P1-2A-3C ；本發明的目的之二是提供一株攜帶所述亞基因組P1-2A-3C并能夠穩定表達A型口蹄疫病毒空衣殼的重組缺損型腺病毒；本發明的目的之三是提供一種構建上述重組缺損型腺病毒的方法；本發明目的之四是將所構建的重組缺損型腺病毒應用于制備成預防或治療A型口蹄疫的疫苗或試劑。為了實現上述之目的，本發明首先提供了編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組 P1-2A-3C，其核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示。構建FMD病毒空衣殼的前提是必須保證得到完整、精確的FMDV基因組結構，在此基礎上才能正確拼接FMDV的P1-2A和3C亞基因組，否則將對口蹄疫病毒空衣殼的形成造成很大的影響。只有口蹄疫P1-2A-3C亞基因組序列的拼接正確，3C蛋白酶才能充分裂解口蹄疫前體蛋白并完成病毒衣殼組裝，這對后期的動物免疫試驗的效果會產生重要甚至決定性影響。此外，本發明在拼接口蹄疫P1-2A-3C亞基因組序列時加入了非結構蛋白2B片段，該片段起到了免疫佐劑作用，能提高口蹄疫病毒空衣殼對本動物尤其是豬的免疫保護效果。還需要說明一點的是，在拼接編碼口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組時，本發明中所用的 A型FMDV序列與國內外在拼接編碼口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組時所用到的FMDV序列不屬同一基因型。Mayr 等(Mayr, G. A. , Chinsangaram, J. , Grubman, M. J. , 1999, Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate. Virology 263,496-506.)構建了含A型FMDV基因組P1-2A-3C的重組腺病毒，并對其中構建的一株重組腺病毒的3C蛋白酶基因進行了突變，從而使3C蛋白酶不能發揮裂解蛋白的作用，在后期的動物免疫試驗中此株重組腺病毒就不能夠誘導動物產生中和抗體。本發明將所拼接的編碼口蹄疫病毒空衣殼的P1-2A-3C亞基因組序列導入到腺病毒中篩選得到穩定表達FMD病毒空衣殼的重組腺病毒，該重組腺病毒免疫的小鼠產生了高水平的口蹄疫病毒中和抗體，這也進一步說明了本發明在體外正確地拼接了編碼口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組P1-2A-3C。篩選獲得穩定、高效表達A型FMDV空衣殼的重組腺病毒是本發明的另一重要之目的。為此，本發明提供了一株攜帶有SEQ ID No. 1所示的編碼A型口蹄疫病毒空衣殼亞基因組的重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)；本發明將所篩選的滴度為7. 9 X 108PFU/ml的第 8代重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)提交專利認可的微生物保藏機構進行保藏，其微生物保藏號是=CGMCC No. 5718 ；分類命名是人血清5型復制缺損型腺病毒；保藏時間是 2012年1月16日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。將本發明重組腺病毒rAdV-A-P12A3C在HEK-293細胞上培養，用FMDV共享表位單克隆抗體4B2進行免疫熒光檢測為陽性，其培養上清用Western blot檢測呈現中等強度的陽性反應，表明重組腺病毒所攜帶的編碼A型口蹄疫病毒空衣殼亞基因組在HEK-293細胞內實現了穩定、高效的表達。本發明采用一步生長曲線測定重組腺病毒rAdV-A-P12A3C在 HEK-293細胞中的復制能力，病毒在接種后60h復制水平達到高峰；本發明重組腺病毒的滴度達7.9X108PFU/ml。重組腺病毒rAdV-A_P12A3C所攜帶的外源基因在病毒傳代過程中穩定表達表達A型口蹄疫病毒的衣殼蛋白并形成口蹄疫病毒空衣殼。將本發明重組腺病毒rAdV-A_P12A3C接種小鼠，在一免后3周出現中和抗體 (1 11)，隨后抗體水平逐漸升高，加強免疫后5周(一免后11周)中和抗體達到高峰 (1 223)，之后抗體水平逐漸下降，到第23周接種鼠的中和抗體水平接近陰性。試驗研究表明，中和試驗預測疫苗效力的精確度大于80. 0%，雖然不同實驗室的測定結果存在一定的差異。例如，預測保護率在73。6% 87%時的中和抗體滴度，一個實驗室為1.31ogl0， 而另一個實驗室的測定值為1.681ogl0 ；Leonard B等在巴西、英國和德國進行試驗，數據來源于765頭豬的攻毒試驗結果，統計分析表明，在95%的置信度，平均中和抗體滴度大于 1. 741ogl0時，動物的保護率大于62. 5%。中和滴度檢測結果表明，本發明所構建的表達A 型口蹄疫病毒空衣殼的缺損腺病毒在小鼠體內可持續誘導高水平的中和抗體，作為預防A 型口蹄疫的疫苗具有重要的開發價值。總之，本發明所構建的重組缺損腺病毒rAdV-A_P12A3C滴度高，在病毒傳代過程中穩定地表達口蹄疫病毒空衣殼，所表達的口蹄疫病毒空衣殼在小鼠體內可持續誘導高水平的中和抗體并可抵抗病毒的攻擊，可作為預防0型口蹄疫的疫苗。本發明重組缺損腺病毒所制備的疫苗不含有口蹄疫病毒遺傳物質，因此不具有感染性；不必加佐劑，安全性更高，副作用更小；本發明疫苗接種動物后，可獲得更持久的免疫反應和較長的免疫保護期； 本發明疫苗以復制缺損型腺病毒作為載體，其在體內不復制，再次接種時不干擾疫苗的免疫效果。本發明還提供了一種構建所述重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)的方法，包括以下步驟將SEQ ID No. 1所示的亞基因組和腺病毒穿梭質粒可操作性的連接，得到重組腺病毒穿梭表達載體；將重組腺病毒穿梭表達載體與腺病毒骨架載體質粒共轉化大腸桿菌， 通過細菌內同源重組獲得了以質粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線型化后轉染細胞，獲得重組缺損型腺病毒(rAdV-A-P12A3C)。其中，所述的腺病毒穿梭質粒選自p-aiuttle，p-Shuttle-CMV, pAdTrack或 pAdTrack-CMV ；所述的病毒骨架載體質粒選自pAdEasy-Ι或pAdEasy-2。
圖1重組腺病毒rAd-A-P12A3C感染HEK-293細胞引起的細胞病變；(A)感染 rAdV-A-P12A3C 的 HEK-293 細胞；(B)正常 HEK-293 細胞。圖 2 重組腺病毒 rAd-A-P12A3C 在 HEK-293 細胞中的 PCR 鑒定；1 :DL10, 000DNA Marker ；2-4 第 4 代，6 代和 8 代 rAdV-A_P12A3C ；5 腺病毒對照 Ad5。圖3間接免疫熒光試驗檢測重組腺病毒rAd-A-P 12A3C感染的HEK-293細胞； A. rAd-A-P 12A3C 感染的 HEK-293 細胞；B. Ad5 感染的 HEK-293 細胞。圖4用Wfestern blot分析FMDV空衣殼在重組腺病毒rAd-A_P12A3C感染細胞中的表達；1 =Marker ；2 人5型缺損型腺病毒感染的HEK-293細胞；3_5 第4代、6代和8代 rAd-A-P12A3C 感染的 HEK-293 細胞；6 :FMDV。圖5重組腺病毒rAdV-A_P12A3C的一步生長曲線。圖6重組腺病毒rAdV-A_P12A3C接種BALB/c小鼠中和抗體的動態變化。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。質粒、載體和生化試劑腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι、腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV、大腸桿菌BJ5183感受態菌以及HEK-293細胞均購自Mratagene公司。大腸桿菌JM109、DH5 α感受態細胞由本發明人試驗室保存。PmeI和PacI均為NEB公司產品。轉染試劑Effectene Transfection Reagent 購自 QIAGEN 公司。口蹄疫病毒 VP2 單克隆抗體 4B2 (Yongzhong Yu, Haiwei Wang, Lei Zhao, Chunyuan Zhang, Zhigang Jiang, Li Yu*. Fine Mapping of a Foot-and—Mouth Disease Virus Epitope Recognized by Serotype-independent Monoclonal Antibody 4B2. The Journal of Microbiology, 2011,49 (1) :94-101.)由本發明人實驗室制備并保存。無外源基因表達的腺病毒(Ad5)由本發明人實驗室構建并保存。實施例1重組腺病毒的構建和鑒定1. A型FMDV亞基因組P1、2A2B和3C基因的合成根據A型FMDV的基因組序列，合成P1-2A2B-3C亞基因組(SEQ ID No. 1)，測序正確的重組質粒命名為P-A-P12A3C。質粒p-A-P12A3C含有kozka序列和起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。2.重組腺病毒穿梭載體的構建將p-A-P 12A3C質粒和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV進行Mil和EcoRV雙酶切， 膠回收純化酶切后的產物，與穿梭載體連接，并轉化至JM109感受態菌，經卡那霉素抗性篩選，挑取菌落接種至5mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，培養過夜，提取質粒，進行PCR、 酶切和測序鑒定。測序正確的質粒命名pShuttle-A-P12A3C。3.重組腺病毒質粒的獲得將pShuttle-A-P12A3C用限制性內切酶RneI線性化，電轉化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-I的BJ5183感受態菌(AdEasy-l-BJ518 中。經卡那霉素抗性篩選，提取質粒， 用I^cI酶切鑒定，將陽性重組腺病毒質粒進行測序，驗證正確的命名為pAdV-A-P12A3C。4.轉染將質粒pAdV-A_P12A3C轉化DH5 α感受態菌，大量增殖重組質粒。用中量質粒提取試劑盒提取重組腺病毒質粒，用I^acI酶切，乙醇沉淀滅菌，超凈工作臺無菌吹干，用無菌超純水溶解沉淀，使質粒的終濃度為l_2g/L。用QIAGEN公司轉染試劑Effectene Transfection Reagent進行轉染，具體操作按說明書進行。5.重組腺病毒的純化與鑒定
將獲得的初代重組腺病毒(命名為rAdV-A_P12A3C)反復凍融后，離心取上清，接種HEK-293細胞，連續傳8代，觀察細胞病變情況；轉染重組腺病毒質粒后10d，HEK-293細胞出現細胞病變特征，細胞變圓、變大、并脫落。當80%的細胞出現CPE時收獲病毒，反復凍融3次后接種HEK-293細胞，連續傳8代。在傳至第5代時，細胞于接種病毒后對-4他開始出現CPE(圖1A)，而對照組(圖1B)細胞單層完整，形態規則。取2代、4代、6代和8代病毒，用蛋白酶K處理后，用PCR檢測目的基因。取第2 代、4代、6代和8代重組腺病毒，用DNA提取試劑盒提取重組病毒DNA，用引物A-U(5’ TTG TCG ACC CAC CAT GGG GGC AGG GCA ATC TAG C 3，)禾PA-L(5'TAG ATA TCT TAC TAT TCA TGG TGT GGC TCA GGG T 3’ )擴增A型口蹄疫病毒P1_2A、2B和3C基因，檢測外源基因在重組腺病毒內的穩定性。由圖2可見，第2代、4代、6代和8代重組腺病毒均能檢出3. 5kb 的目的基因，說明目的基因在重組腺病毒中穩定存在。同時取4代、6代和8代重組腺病毒感染的HEK-293細胞，用口蹄疫病毒非血清型依賴的單抗4B2進行間接免疫熒光試驗及Western blot分析，以檢測目的基因的表達情況。間接免疫熒光試驗將HEK-293細胞鋪于96孔板中，當長到90%單層時，接種15M0I (Multiplicities of infection) rAdV-A_P12A3C，24h 后棄去培養基，用 PBS 洗滌細胞 3 次，將 rAdV-A_P12A3C 感染的HEK-293細胞用預冷的無水乙醇固定15min，加入抗FMDV的單克隆抗體4B2，37°C作用lh，用PBST洗滌后，加入熒光標記羊抗鼠IgG(Sigma)于37°C作用45min，PBST洗滌后自然干燥，加入緩沖甘油，于熒光顯微鏡下觀察。試驗結果表明重組腺病毒rAdV-A_P12A3C感染的細胞在熒光顯微鏡下出現特異的綠色熒光(圖3A)，而對照細胞則檢測不到熒光(圖:3B)，表明重組腺病毒所攜帶的目的基因(SEQ ID No. 1)在HEK-293細胞中得到穩定的表達。試驗例1P12A3C基因在重組腺病毒感染細胞中的表達和穩定性分析1、Western blot用單克隆抗體4B2對第4代、6代、8代的重組腺病毒rAdV-A_P12A3C進行^festern blot分析將感染rAdV-A-P12A3C的HEK-293細胞進行SDS-PAGE分析，同時設立口蹄疫全病毒蛋白作為陽性對照，野生型腺病毒感染的HEK-293細胞作為陰性對照，之后轉印到硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶封閉后，加入抗FMDV的單克隆抗體4B2(1 1000稀釋)，37°C 作用lh，用PBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG (Sigma，1 10，000稀釋)， 37°C作用lh，洗滌后加入DAB溶液顯色。試驗結果表明，與單克隆抗體4B2發生免疫反應的條帶與FMDV空衣殼VP0、VP3、 VPl的分子量大小相當(圖4)，說明rAd-A-P12A3C在感染的HEK-293細胞中復制能產生口蹄疫病毒的結構蛋白VPO、VP1、VP3，并且穩定地表達。2、重組腺病毒增殖滴度的測定分別用10M0I劑量的第8代重組腺病毒(rAdV-A_P12A3C)和野生型腺病毒(Ad5) 接種HEK493細胞，在接種后iai、24h、3Mi、4ai、60h和72h收取病毒并進行毒價測定 (Kleina L G. , Grubman M J. 1992. Antiviral Effects of a Thiol Protease Inhibitor on Foot-and-Mouth Disease Virus. J. Virol. 66 :7168-7175.)，建立重組腺病毒與野生型腺病毒的一步生長曲線。分別用10M0I劑量的第4代、6代、8代和10代重組腺病毒 (rAdV-A-P12A3C)接種HEK-293細胞，在接種后60h收取病毒并進行毒價測定，檢測不同代
次重組病毒的病毒滴度。經病毒滴度測定，繪制出第8代重組腺病毒rAdV-A_P12A3C與其親本病毒的一步生長曲線，即病毒增殖滴度與生長時間的相關性曲線，反映病毒生長繁殖的規律。試驗結果見圖5，結果表明，隨著重組腺病毒感染HEK-293細胞時間的延長，病毒滴度逐漸升高，在 60h時，病毒的滴度達到峰值，隨后開始下降。試驗例2 BALB/c鼠的免疫接種在獲得穩定高效表達A型口蹄疫空衣殼的重組腺病毒后，首先在BALB/c小鼠體內檢測該重組腺病毒的免疫原性。7周齡BALB/c鼠25只，購自于中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心，用免疫熒光方法檢測人腺病毒5型抗體為陰性。實驗動物隨機分成5組，每組5只。 A組接種5X IO7PFU第8代的重組腺病毒rAdV-A-P12A3C，部位為后腿肌肉，用PBS稀釋， 在第一次免疫后第6周以相同劑量加強免疫；B組接種加法國佐劑ISA 206的重組腺病毒rAdV-A-P12A3C，免疫劑量、免疫次數及間隔時間同A組，佐劑與病毒比例為1 1，即 100 μ 1病毒+100 μ 1佐劑/mouse ；C組接種100 μ 1 A型口蹄疫BEI滅活疫苗，在第一次免疫后第6周以相同劑量加強免疫；D組接種100 μ 1 A型口蹄疫商品化滅活疫苗。E組接種 100 μ 1 Ad5腺病毒。免疫1周后采血以后每隔2周采血一次直到23周。1.微量細胞中和試驗(1)病毒毒價的測定將病毒接種于單層細胞，37°C吸附Ih后加入維持液，置溫箱培養；逐日觀察，待細胞病變(CPE)達75%以上，收獲病毒懸液凍融3次，以3000r/min離心 lOmin，取上清液，定量分裝成Iml于1. 5ml EP管置_70°C保存備用，選用的病毒對細胞有較穩定的致病力。從_70°C冰箱取一 EP管保存的病毒，將病毒在96孔培養板上作10系列稀釋，即10^,10^,10"3……，每孔病毒懸液量為50 μ 1，每個稀釋度作8孔，每孔加入100 μ 1 細胞懸液，每塊板的最后一行設8孔細胞對照，制備細胞懸液的濃度可以使細胞在24h內長滿單層為度。把培養板置5% CO2溫箱37°C培養，從48-7 逐日觀察細胞病變，記錄結果。 按Reed和Muench兩氏法計算TCID5(1。(殷震，劉景華，動物病毒學，第2版，北京科學出版社，1997，336 340.)，舉例說明見表1。表1 TCID5tl計算(接種劑量50 μ 1)
權利要求
1.編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的的亞基因組，其特征在于其核苷酸序列為SEQID No. 1所示。
2.權利要求1所述的亞基因組編碼的蛋白。
3.攜帶有權利要求1所述的亞基因組的重組腺病毒。
4.按照權利要求3所述的重組腺病毒rAdV-A-P12A3C，其特征在于，其微生物保藏號是CGMCC No. 5718。
5.一種構建權利要求3或4所述的重組腺病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將SEQ ID No. 1所示的亞基因組和腺病毒穿梭質粒可操作的連接，得到重組腺病毒穿梭表達載體；將重組腺病毒穿梭表達載體與腺病毒骨架載體質粒共轉化大腸桿菌，通過細菌內同源重組獲得了以質粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將克隆化重組腺病毒基因組線型化后轉染細胞，獲得重組缺損型腺病毒。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于所述的腺病毒穿梭質粒選自p-amttle、 p-Shuttle-CMV、pAdTrack 或 pAdTrack-CMV。
7.按照權利要求5所述的方法，其特征在于所述的病毒骨架載體質粒選自pAdEasy-1 或 pAdEasy-2。
8.權利要求1所述亞基因組在制備預防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應用。
9.權利要求2所述蛋白在制備預防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應用。
10.權利要求3或4所述的表達A型口蹄疫病毒空衣殼的重組腺病毒在制備預防或治療口蹄疫的藥物或試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了表達A型口蹄疫病毒空衣殼重組腺病毒及其應用。本發明將SEQIDNo.1所示的編碼A型口蹄疫病毒空衣殼的亞基因組和腺病毒穿梭質粒可操作性連接得到重組腺病毒穿梭表達載體；將該重組腺病毒穿梭表達載體與腺病毒骨架載體質粒共轉化大腸桿菌，獲得了以質粒形式存在的克隆化重組腺病毒基因組；將其線型化后轉染細胞，獲得本發明重組復制缺損型腺病毒。本發明重組復制缺損腺病毒滴度高，在復制過程中能夠形成A型口蹄疫病毒空衣殼并在病毒傳代過程中穩定地表達口蹄疫病毒空衣殼，所表達的口蹄疫病毒空衣殼在小鼠體內可持續誘導高水平的中和抗體并可抵抗口蹄疫病毒的攻擊，可將其制備成預防或治療口蹄疫疫苗。
文檔編號A61P31/14GK102533798SQ20121003011
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者于力 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所