專利名稱：甘草活性成分及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療前列腺的中藥活性組分、藥物組合物及其用途。
背景技術：
傳統的中藥由于其較高的安全性也已用于多種癌癥的治療(HoJW，Leung YK7ChanCP.Herbal medicine in the treatment of cancer (治療癌癥的中草藥).Curr Med Chem2002，2，209-214)。已知的此類藥物大多是由幾種或數十種中藥原料配制而成。這類中藥復方的成分復雜，作用機理不清楚，質量監控難度較大。目前很少有單味中藥用于癌癥的治療。而且，研發中藥的有效(活性)成分或部位具有重要的意義。前列腺癌是在亞洲位列第六的導致死亡的癌癥。環境與遺傳因素在前列腺癌的發病中重要作用。研究發現，前列腺癌過度表達α -甲基酰基輔酶A消旋酶(AMACR)有關。目前還缺乏治療前列腺癌的傳統中草藥或從中提取的活性成分。
發明內容
在一實施方案中，提供了甘草(licorice)的活性成分的制備方法，其包括下述步驟，(a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液；(b)將二氯甲烷加入甘草的水提取液中進行提取，收集有機相部分；(c)用水進一步提取步驟(b)得到的有機相部分，收集水相部分；以及(d)將二氯甲烷加入步驟(C)得到的水相部分，進行提取，收集有機相部分。在一實施方案中，提供了一種甘草的活性成分。在一實施方案中，所述甘草的活性成分由包括下述步驟的方法得到:(a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液；(b)將二氯甲烷加入甘草的水提取液中進行提取，收集有機相部分；(C)用水進一步提取步驟(b)得到的有機相部分，收集水相部分；以及(d)將二氯甲烷加入步驟(C)得到的水相部分，進行提取，收集有機相部分。在一實施方案中，所述方法還包括步驟(e)，即將步驟(d)收集的有機相加入水中作進一步提取，收集有機相。在一實施方案中，提供了一種甘草的活性成分，所述甘草的活性成分為圖1所示的質譜圖所鑒定。在一實施方案中，所述甘草的活性成分為鄰苯二甲酸鹽衍生物，其質譜數據有90%與DEHP(鄰苯二甲酸二乙基己基酯)相同或具有90%的與DEHP相同的基團，例如圖2所示的NMR圖譜中鑒定的化合物。在一實施方案中，本文所公開的甘草的活性成分用于治療前列腺癌。在一實施方案中，提供了治療前列腺癌的中藥組合物，該組合物包含本文公開的甘草的活性成分和藥學上可接受的載體。
在一實施方案中，提供了前述的甘草活性成分在制備治療前列腺癌的藥物中的用途。此外，提供了一種治療前列腺癌的方法，該方法通過給予個體治療有效量的甘草活性的成分或其藥物組合物來治療前列腺癌。
圖1顯示了甘草活性成分的ES1-MS圖。圖2顯示了甘草活性成分的NMR圖譜。圖3顯示了用本申請公開的甘草活性成分處理前列腺癌PC-3細胞72后PC-3細胞的活存情況。圖4顯示了用含100 μ M或200 μ M甘草活性成分的培養液處理前列腺癌PC-3細胞24、48和72小時過程中，細胞活存的變化。圖5顯示了用200 μ M甘草活性成分處理PC_3細胞24小時后，前列腺癌細胞中基因表達變化的散點分布。
具體實施例方式在一實施方案中，提供了本文公開的甘草的活性成分的制備方法，其包括下述步驟(a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液；
·
(b)將二氯甲烷加入甘草的水提取液中進行提取，收集有機相部分；(C)用水進一步提取步驟(b)得到的有機相部分，收集水相部分；以及(d)將二氯甲烷加入步驟(C)得到的水相部分，進行提取，收集有機相部分，即為甘草的活性成分。在一實施方案中，所述甘草活性成分的制備方法還包括步驟(e)，即將步驟(d)收集的有機相加入水中作進一步提取，收集有機相。在一實施方案中，提供了一種甘草(licorice)的活性成分。在一實施方案中，所述甘草的活性成分由本文所公開的甘草活性成分的制備方法而制備:在一實施方案中，提供了一種甘草的活性成分，所述甘草的活性成分為圖1所示的質譜圖所鑒定。在另一實施方案中，所述甘草的活性成分進一步由圖2所示的NMR圖譜所鑒定。在一實施方案中，所述甘草的活性成分為鄰苯二甲酸鹽衍生物，其質譜數據有90%與DEHP (鄰苯二甲酸二乙基己基酯)相同或具有90%的與DEHP相同的基團。在一實施方案中，本文所公開的甘草的活性成分用于治療前列腺癌。在一實施方案中，提供了治療前列腺癌的中藥組合物，該組合物包含本文公開的甘草的活性成分和藥學上可接受的載體。在一實施方案中，提供了本文所公開的甘草活性成分在制備治療前列腺癌的藥物中的用途。此外，提供了一種治療前列腺癌的方法，該方法通過給予個體治療有效量的甘草活性的成分或其藥物組合物來治療前列腺癌。在一實施方案中,本文所述甘草(英文名稱為licorice,拉丁名稱為Glycyrrhizaglabra L.,Glycyrrhiza uralensis Fisch 或 Glycyrrhizainflata Bat)又稱舌甘草(中國東北、內蒙古地區)、粉草、烏拉爾甘草、甜草根(中國東北地區)、蜜草(名醫別錄)、國老(名醫別錄)、甜甘草、甜根子，系豆科植物甘草的干燥根和根莖。甘草為中藥處方中常用的一位中藥。在一些實施方案中，用于步驟(a)提取甘草的水的重量為甘草重量的1-20倍、1-10倍或1-5倍，例如，水的重量為甘草重量的1、2、3、4、5倍。在一些實施方案中，實施步驟(a)之前，可常規地將甘草在水中浸泡。看根據需要確定浸泡時間，使得干燥的甘草飲片能夠入水膨脹，例如浸泡15分鐘至6小時、15分鐘至2小時，30分鐘至I小時。在一些實施方案中，所述步驟(a)是在50°C至120°C溫度的水中處理0.5-6小時或1-3小時得到提取物溶液，過濾除去不溶于水的組分或通過離心除去不殘渣后即得到甘草的水提取液。在一實施方案中，步驟(a)中水的溫度可以為80°C至100°C，處理時間為I小時至3小時、I小時或2小時。在一實施方案中，重復實施步驟(a) 2次，即對甘草進行2次水的提取，然后將兩次提取得到的水提取液合并得到所述的水提取液。在一實施方案中，所述離心為4°C，2000Xg或4000rpm，離心10_15min。在一實施方案中，所述步驟(b)中的二氯甲烷與甘草的水提取液的體積比為1:1至5: 1，或者為3: I或5: 2。在另一實施方案中，進行2-3次的所述步驟(b)的提取，合并有機相，從而得到所述有機相部分。在一實施方案中，所述 步驟(C)中水與步驟(b)得到的有機相部分的體積比為
2:1至1: 2或者為1:1。在另一實施方案中，進行1-4次或2-3次的所述步驟(c)的提取，將提取物合并后得到所述水相部分。在一實施方案中，所述步驟(d)中的二氯甲烷與步驟(C)得到的水相部分的體積比為2:1至1: 2或者為1:1。在另一實施方案中，進行2-3次的所述步驟(d)的提取，合并有機相，從而得到所述有機相部分。在一實施方案中，本文公開的甘草活性成分的制備方法還包括用氮氣閃蒸所述步驟(d)得到的有機相部分，從而將所述有機相部分的體積進行濃縮。在一實施方案中，所述氮氣閃蒸的溫度為20-60°C或30-50°C或40°C。在另一實施方案中，所述體積濃縮至原體積的 1/2-1/20，1/3-1/10，或 1/5-1/10。在一實施方案中，本文公開的甘草活性成分的制備方法還包括步驟(e)，即將從步驟(d)的得到的有機相部分進一步與水混合進行提取1-3次或2次，收集并合并有機相部分，即為所述甘草的活性成分。在另一實施方案中，所述步驟(e)是將用氮氣濃縮后的步驟
(d)的得到的有機相部分與水混合進行提取1-3次或2次，收集并合并有機相部分，即為所述甘草的活性成分。本文所用術語“藥學上可接收的載體”指不干擾活性成分的生物活性有效性的載體。本文所述藥學上可接受的載體可以為固體或液體，包括藥學上可接受的賦形劑、緩沖齊U、乳化劑、穩定劑、防腐劑、稀釋劑、封裝劑、填充劑等。例如，藥學上可接受的緩沖劑進一步包括磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽以及碳酸鹽。本文公開的藥物組合物可以呈現為單位劑量形式，并且可以通過任一制藥領域公知的方法制備。該方法包括將本文的活性成分與一種或幾種藥學上可接受的載體結合的步驟。通常，通過將活性成分與液體載體、固體載體或二者結合來制備組合物，隨后根據需要來定型制備的產物。適于口服的本文公開的組合物可以是含有預先確定量的活性成分的諸如膠囊、片齊 、錠劑等劑型。其他劑型包括水性懸浮液或諸如糖漿劑、酏劑或乳劑的非水性懸浮液。適于胃腸外給藥的本文公開的組合物可以是包含活性成分的無菌水性或非水性制劑。可以根據已知的方法，使用合適的分散劑或濕潤劑以及懸浮劑制備上述制劑。在可接受的載體或溶劑中，可以使用水、林 格氏液以及等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌的非揮發油也可以被方便地用做溶劑或懸浮基質。適于經口、皮下、靜脈、肌內等給藥方式的載體配方可參見雷明頓藥物學(Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.,Easton, PA)。本文所述的“前列腺癌”指發生于前列腺的癌癥，包括原發性前列腺癌或轉移性前列腺癌。本文公開的甘草活性成分或包含該甘草活性成分與藥學上可接受的載體的藥物組合物可以通過經口、靜脈內、經腹腔、肌注、經直腸或透皮的方式給藥。在一些實施方案中，甘草活性成分或包含甘草活性成分與藥學上可接受的載體的藥物組合物經口給藥。在本文所公開的實施方案中，甘草活性組分經口給藥的日劑量可以是每千克個體體重 lmg-500mg、5mg-100mg、10mg-50mg 或者是每千克個體體重 5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、40mg 或 50mg。本文中，甘草的活性組分、活性成分、有效成分以及有效部位可以交替使用，除非另有所指。本文所述的“個體”或“患者”可以交替使用，是指包括人的哺乳動物，包括但不限于人、靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓以及諸如大鼠和小鼠的嚙齒類動物。貫穿本說明書的說明書和權利要求書中，詞語“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意圖排除其他部分、添加物、組分、或步驟。應該理解，在本文公開的特定方面、實施方案或實施例中描述的特征、特性、組分、成分或步驟，可適用于本文所描述的任何其他的方面、實施方案或實施例，除非與之矛盾，其根據需要可以任意地替換或組合成為其他的實施方案。上述公開內容總體上描述了實施方案，通過下面的實施例進一步示例所述實施方案。描述這些實施例僅為說明目的，而不是限制所公開的實施方案。盡管本文中使用了特殊的術語和值，這些術語和值同樣被理解為示例性的，并不限定本申請的范圍。實施例實施例1甘草活性成分的提取利用以下方法提取甘草的活性成分:a.將IOOg干燥的甘草(購自香港中草藥店)，在5倍量(即500ml)的水中浸泡
0.5小時后，在80-100°C的溫度下煮沸I小時。將水提取液在4°C，2000 X g，離心10_15min，得到的上清液。重復上述步驟2次，然后將共計三次的離心上清液合并得到水相部分a。b.將上述甘草水提取得到的水相部分a與二氯甲烷混合，水相部分a與二氯甲烷的體積比為5: 2，提取2次，并將每次的提取的有機相合并得到有機相部分b。c.將上述合并的有機相部分b與等體積的水混合，提取2次，并將每次的提取的水相合并得到水相部分C。 d.將上述合并的水相部分c與等體積的二氯甲烷混合，提取2次，并將每次的提取的有機相合并得到有機相部分d。可以濃縮或干燥該有機相部分，從而去除溶劑，即為本申請公開的甘草的活性成分。可以進一步實施以下步驟e和f，來濃縮并進一步洗提上述有機相部分d，從而得到進一步去除雜質的本申請公開的甘草活性成分。e.用氮氣在40°C閃蒸所述步驟(d)得到的有機相部分d，從而將所述有機相部分的體積進行濃縮至50ml濃縮的有機相部分e。f.將有機相部分e與等體積的水混合提取2次，收集并合并有機相部分得到有機相部分f，去除其中的溶劑后即為所述甘草的活性成分。在以下的實施例中，可以使用有機溶劑，例如乙醇，來復溶本申請甘草活性成分。實施例2甘草活性成分鑒定1.ES1-MS/MS 鑒定將干燥的甘草·活性成分復溶在甲醇中，質譜條件為去簇電壓為80，溶劑延遲3min，掃描范圍50_1100amu，掃描間隔0.2s。2.NMR 鑒定將甘草活性成分干燥在加壓條件下去除殘留的甲醇后，檢測樣品獲得IH NMR數據。實施例3甘草提取組分的抗腫瘤實驗_4] 材料與方法1.細胞模型將已經建系的前列腺癌PC-3細胞系置于含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的Ham’ Sf_12K培養基中，在37°C、含5% CO2的飽和濕度的空氣中培養。將5X103的PC-3細胞接種于96孔培養板中，其最終體積為每孔100 μ 1，培養24小時。之后，用新鮮的分別含有0、10、50、100、200、300、400或50(^1的本申請公開的甘
草活性成分(處理組)、或4.25%乙醇(載體對照)的培養基替換培養24小時后的培養基，并繼續培養24、48或72小時。每組實驗重復3次。其中，處理組中的甘草活性成分用乙醇溶解，例如95%乙醇，然后加入培養液中。因此，各個處理組中的乙醇含量與對照一致地為4.25%。2.MTT 分析I).在將細胞培養上述時間后，向每一孔中加入20 μ I的MTT試劑，并將細胞在在37°C、含5% CO2的飽和濕度的空氣中孵育2小時。
2).用150μ I DMSO替換培養液中的MTT試劑，來溶解由代謝活性細胞形成的結晶紫(violet crystal)。3).在540nm處用分光光度計定量檢測所產生的紫色。4).為了節哀能夠不同實驗間的變異降低至最低，將結果表示為相對于陰性對照的細胞增殖百分比。用抑制細胞增殖50%的藥物濃度(IC50)來表示甘草活性成分的細胞毒作用。每個實驗重復3次。3.PCR芯片分析I)將 0.39 X IO6的PC-3細胞接種于每孔的最終體積為4ml培養基的T-25培養皿中，培養24小時。2，用新鮮的分別含有200 μ M的本申請公開的甘草活性成分的4.25%乙醇的培養基、或含4.25 %乙醇的培養基(載體對照)替換培養24小時后的培養基，并繼續培養24小時。每組實驗重復3次。3).用Trizol裂解細胞,再用RNA提取試劑盒(RNAeasy Mini Kit, Qiagen)來提取 RNA。4).取2 μ g提取的RNA來檢測用甘草活性成分處理的細胞中相對基因表達水平，所用芯片為RT2Profiler PCR Array System(信號轉導途徑發現者，SA-Bioscience公司)。5).芯片雜交數據由SA-Bioscience公司提供的基于網絡PCR ArrayData分析程序來分析處理。結果1.ES1-MS/MS質譜結果如圖1所示。該MS圖譜根據質譜數據庫進行檢索，發現與DEHP (鄰苯二甲酸二乙基己基酯)的相似程度達到90%，即可能為DEHP的衍生物。2.NMRIH-NMR的結果如圖2所示。3.MTT如圖3所示，在用本申請公開的甘草活性成分處理前列腺癌PC-3細胞72時，50 μ M的甘草活性成分即能抑制PC-3細胞的活存，并隨劑量的增加成劑量依賴趨勢，其中細胞的IC50為151 μ M0圖4顯示的是，用含100 μ M或200 μ M甘草活性成分的培養液處理前列腺癌PC_3細胞24、48和72小時過程中，細胞活存量的變化。結果表明，在第24小時，用100 μ M或200 μ M甘草活性成分處理的PC-3細胞的活存均有明顯下降，在第48小時，兩組進一步下降，至72小時時，由于含100 μ M甘草活性成分的培養基中甘草活性成分的消耗，使其有效濃度降低，細胞活存的數量不再進一步下降，但是在含200 μ M甘草活性成分培養基的處理組中，由于其中的活性成分并未完全消耗，細胞的活存數量進一步下降。以上結果表明，本申請公開的甘草活性成分能夠抑制前列腺癌細胞的活存，從而能夠治療前列腺癌患者。4.甘草活性成分對前列腺癌細胞基因表達的影響如表I所示，用200 μ M甘草活性成分處理PC-3前列腺癌細胞24小時后，一些基因的表達出現的4倍以上的增加或降低的改變。例如，WNT2、EGRU RBPl和TANK表達增加4倍以上，而CCL2基因的表達出現至少4倍的降低。表權利要求
1.甘草活性成分的制備方法，包括 (a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液a; (b)將二氯甲烷加入甘草的水提取液a進行提取，收集有機相部分b； (C)用水進一步提取步驟(b)得到的有機相部分b，收集水相部分c ;以及 (d)將二氯甲烷加入步驟(C)得到的水相部分C，進行提取，收集有機相部分d。
2.如權利要求1所述的制備方法，還包括步驟(e)，將步驟(d)收集的有機相部分d加入水中作進一步提取，收集有機相e。
3.如權利要求所述I或2的制備方法，其中步驟(a)是在50°C至120°C溫度的水中加熱處理0.5-6小時或1-3小時，過濾除去不溶于水的組分或通過離心除去不殘渣后得到甘草的水提取液a。
4.如權利要求1-3任一項所述的制備方法，其中步驟(b)中的二氯甲烷與甘草的水提取液的體積比為1:1至5: 1，或者為3:1或5: 2。
5.如權利要求1-4任一項所述的制備方法，其中步驟(c)中水與步驟(b)得到的有機相部分b的體積比為2:1至1: 2或者為1:1。
6.如權利要求所述1-5任一項所述的制備方法，其中步驟(d)中的二氯甲烷與步驟(c)得到的水相部分c的體積比為2:1至1: 2或者為1:1。
7.如權利要求1-6任一項所述的制備方法，還包括用氮氣閃蒸所述步驟(d)得到的有機相部分，從而將所述有機相部分的體積進行濃縮。
8.如權利要求1-7任一項所述的制備方法，其中所述體積濃縮至原體積的1/2-1/20，1/3-1/10，或 1/5-1/10。
9.如權利要求1-8任一項所述的制備方法，其中步驟(e)是將用氮氣濃縮后的步驟(d)的得到的有機相部分與水混合進行提取1-3次或2次，收集并合并有機相部分，即為所述甘草的活性成分。
10.甘草活性成分，其由權利要求1-9中任一項所述的方法制備。
11.如權利要求10所述的甘草的活性成分，其由圖1所示的質譜圖所鑒定。
12.如權利要求10或11所述的甘草的活性成分，其中所述甘草的活性成分進一步由圖2所示的NMR圖譜所鑒定。
13.甘草的活性成分，其由圖1所示的質譜圖所鑒定。
14.如權利要求13所述的甘草的活性成分，其中所述甘草的活性成分進一步由圖2所示的NMR圖譜所鑒定。
15.甘草的活性成分，其為鄰苯二甲酸鹽衍生物，質譜數據有90%與DEHP相同或具有90%的與DEHP相同的基團和/或由圖2所示的NMR圖譜所鑒定。
16.治療前列腺癌的中藥組合物，該組合物包含權利要求10-15任一項所述的甘草活性成分和藥學上可接受的載體。
17.權利要求10-15任一項所述的甘草活性成分在制備治療前列腺癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及甘草活性成分，以及包含甘草的活性成分和藥學上可接受的載體的治療前列腺癌的藥物組合物。本發明還涉及所述甘草的活性成分的制備方法以及所述活性成分在制備用于治療前列腺癌的藥物中的用途。
文檔編號A61P35/00GK103239500SQ20121002537
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月6日 優先權日2012年2月6日
發明者梁悅健, 何永成 申請人:香港中文大學