專利名稱：一種鼻咽癌相關易感基因yh1蛋白的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鼻咽癌相關易感基因YHl的蛋白制備方法及該蛋白在微生物識別和抑菌方面的應用，可用于細菌引起的炎性相關的疾病。
背景技術：
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是多因素(EB病毒感染、環境因素和遺傳易感性等)參與的多基因遺傳性疾病，在已知的癌基因中，ra>s、C- _Fc和bcl-2等分子在大多數鼻咽癌中表達水平增高，但沒有發現基因結構的重排、突變或基因擴增，這說明其蛋白產物可能參與鼻咽癌發生發展的某個階段，它們在鼻咽癌的發生發展中可能不起主要作用。在已知的抑瘤基因中，在鼻咽癌中的作用尚不確定，基因在鼻咽癌中突變率極，但P53蛋白有高水平的表達，推測其與EB病毒的瘤蛋白和(或)細胞瘤蛋白有關。 /7彬基因在鼻咽癌中沒有點突變，但是存在表達下調，認為可能與/776基因的異常甲基化有關。這些結果提示鼻咽癌的遺傳不穩定性很可能與鼻咽癌基因組中尚未發現的易感/抑瘤基因有關。1 /基因(GenBank收錄號為AF158745，該基因全長為1084bp，編碼256個氨基酸，蛋白分子量26. 7kDa,該基因與現在公認的SPLUNC1基因僅有一個堿基的差別)，是我們研究所何志巍教授最早發現的在正常鼻咽上皮組織中高表達而在鼻咽癌組織中低或無表達的鼻咽癌易感基因。他們首次應用cDNA表達微陣列技術篩選了成人正常鼻咽和鼻咽癌組織5184個基因或表達序列標簽(ESTs)的表達差異，篩選到來源于脊椎動物嗅上皮且在小鼠鼻腔側部表達的基因/^d同源的ESTN27741，RT-PCR及Northern blot雜交檢測發現，該EST確實在鼻咽癌組織中很低表達而在正常鼻咽組織中高表達。根據該EST進而克隆到全長為1084bp的cDNA序列，在GenBank，EMBL等數據庫中比較表明，該cDNA序列所代表的是一個新基因，含有完整的閱讀框架，編碼256個氨基酸，名17//基因。β//基因的表達下調有助于鼻咽癌的發生，為一個新的鼻咽癌相關基因候選者。雖然在鼻咽癌組織中存在多個已知及未知功能的新基因，而對于一個鼻咽相對特異基因YHl在鼻咽癌發生發展過程中功能的深入研究，無疑具有明顯的針對性和必要性。我們最近的免疫組織化學實驗結果也證實了 YHl分子在慢性鼻咽炎等組織中表達明顯高于在鼻咽癌組織中的表達量。
腭、肺及鼻咽上皮克隆(PLUNC)家族蛋白是一個組織特異性的分泌性蛋白，該家族蛋白在N端有一保守的信號肽。PLUNC可以劃分為短的PLUNC (SPLUNC)和長的PLUNC (LPLUNC)蛋白，按照結構上來劃分，β//辭SPLUNC1家族成員。它可能參與人類的抗微生物、上呼吸道抗炎等宿主免疫防御反應和腫瘤的發生、發展及轉移等多個過程。PLUNC家族的三維結構與殺菌/滲透性增強蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)和脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein, LBP)家族，膽脂轉移蛋白(cholesterol ester transfer protein, CETP)及憐月旨轉移蛋白(phospholipid transfer protein, PLTP)家族具有相似性。研究表明SPLUNC1蛋白在阻止呼吸道細菌、病毒、支原體、真菌等病原微生物入侵，抵抗理化因素刺激，參與機體炎癥反應中發揮重要作用。近年來的研究也顯示，鼻咽癌、非小細胞性肺癌、唾液腺癌及胃癌可能與PLUNC蛋白有關，但具體的作用機制尚不清楚。為了觀察PLUNC蛋白對EB病毒作用，周后德等用PLUNC 蛋白處理三株轉化有EB病毒的B型淋巴細胞，發現PLUNC蛋白能夠促進轉化有EB病毒的 B型淋巴細胞的破裂及凋亡，使EB病毒潛在膜蛋白1的表達減少，卻使EB病毒包裝膜蛋白 GP350/220表達增加。說明PLUNC蛋白能抑制EB病毒對呼吸道上皮的潛在致瘤性。Hong Wei Chu等研究肺炎支原體和白介素一 13 (7Z-7J)對/^ftVC基因的表達調節作用。結果發現=PLUNC蛋白能夠減少肺炎支原體的水平，抑制肺炎支原體衍生脂蛋白誘導的上皮細胞分泌白介素一 8。雖然肺炎支原體感染促使PLUNC蛋白表達增加，但白介素一 13顯著減弱PLUNC蛋白的表達和清除肺炎支原體的能力。Simg等發現摘除嗅球后，小鼠鼻黏膜上皮和腺上皮高表達PLUNC蛋白，這可能是鼻黏膜受到損傷后出現防御性機制。所有這些表明， PLUNC蛋白能阻止呼吸道細菌，病毒，支原體、真菌等病原微生物入侵，抵抗理化因素刺激， 參與機體炎癥發應，是呼吸道一道宿主防御的天然屏障。
PLUNC蛋白家族成員與鼻咽癌的關系研究正在成為新的熱點，國內外已有文獻報道了 PLUNC基因家族成員與鼻咽癌的關系。何等通過篩選/^ftVC基因的SWs確定它們為中國鼻咽癌的敏感性標記物，提示/^ftVC可能影響鼻咽癌的易感性并探討了/^ftVC基因編碼區多態位點G14595T在鼻咽癌患者中的作用。周等探討了參與主體上呼吸道防御系統的機制，%元、飛LPUNCl基因對鼻咽癌細胞系HNEl的影響；最近又運用抑制性消減雜交技術以確定差異表達的人鼻咽癌基因和選擇分子標記物，提示/ ^私CDC37L1基因可能為鼻咽癌的分子標記物，表明切以雙7和NPC兩者關系密切；同時李等論述基因的表達下調是鼻咽癌早期預警的分子診斷標志物，從而證實了以作為抗鼻咽癌藥物開發新靶標的可行性。
研究表明，環境因素和遺傳易感性可能在鼻咽癌的發生發展中起重要作用。鼻咽癌發生發展中的致癌微生物除了 EB病毒以外，還有一類不可忽視的生物致癌因素一細菌。由于細菌感染導致上皮細胞由炎性增生轉化成癌性增生的模式已有多家報道。最近有報道發現，一種與鼻咽癌發生密切相關的致癌微生物一納米細菌是鼻咽癌病因發病機制的因素之一。研究發現它們的編碼蛋白是一種分泌性的具有抗微生物作用的固有免疫分子， 它能與鼻咽癌組織中納米細菌結合，從而將納米細菌阻止于鼻咽上皮細胞之外，以便機體免疫系統監視和清除，從而保護鼻咽上皮免遭惡性攻擊。以往的研究側重于尋找癌基因(如)的分子機制研究，但是忽視了機體本身的天然免疫防御系統所起的作用。特別是當這些天然免疫防線出現嚴重“漏洞”時，由各種因素引發的炎癥必然對鼻咽上皮造成損傷，很可能誘導鼻咽上皮惡性轉化。1 /發揮天然免疫分子的作用，可能介導腫瘤微環境中炎癥細胞與腫瘤細胞之間的對話，調節組織的抗炎反應，因此1 /在鼻咽上皮的表達下調或缺失， 使得鼻咽上皮失去了這一重要的天然免疫分子所介導的抗炎功能，很可能是鼻咽癌的重要易感因素。
但是關于YHl蛋白與外源病原微生物的關系還沒有系統的研究。由于該蛋白分泌在細胞外，它對于外源微生物的結合，或者殺菌作用也未見系統報道。因此，對于GST-YHl 融合蛋白和YHl非融合蛋白的制備及與病原微生物關系的探索研究，對于推動我國鼻咽癌科學的發展，促進以YHl為靶點的藥物開發，防治炎性疾病都具有不容忽視的理論價值和應用價值。發明內容
本發明的目的在于提供一種鼻咽癌相關蛋白YHl的新應用。
實現上述目的的具體技術方案如下鼻咽癌相關蛋白YHl在與病原微生物結合和凝集中的應用。
鼻咽癌相關蛋白YHl在制備由細菌感染引起的炎癥相關疾病中的藥物的應用。
本發明的另一目的是提供鼻咽癌相關蛋白YHl的制備方法 實現上述目的的具體技術方案如下一種鼻咽癌相關蛋白YHl的制備方法，包括以下步驟(1)構建表達載體構建提取總RNA，反轉錄出cDNA；用帶有BglIIAhol雙酶切位點的YHl特異性引物進行PCR擴增獲得YHl基因，回收產物進行BglIIAhol酶切；同時PGEX-4T-1載體用BglIIAhol進行雙酶切；純化、回收；回收的YHl基因的雙酶切產物連接到pGEX-4T-l載體；連接液轉化Dffia大腸桿菌，陽性克隆篩選，得到pGEX-4T-l_YHl表達質粒；(2)表達工程菌的構建及誘導表達將PGEX-4T-1-YH1表達質粒加到冰預冷的E.coli BL21 ( DE3 )感受態細胞中，輕輕混勻，在冰上孵育25 — 35 min，40 — 45°C熱激85 —95S，立即置冰上2. 5 — 3. 5min，加入在37°C預熱的500ul無抗LB液體培養基，37°C，200 rpm搖45 — 55min ；取100-200 μ 1菌液涂布在含有Amp抗性LB平板上，放入37°C培養過夜；取單個菌落接種于Amp抗性LB液體培養基中，37°C震搖培養池至對數生長期，加入 IPTG (異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至終濃度為ImM后，37°C震搖培養池，收集培養菌液，離心取上清即得所述YHl融合蛋白。
(3)將離心后的上清重懸于超聲緩沖液中(PBS, l%Triton X-100, ImM EDTA, pH7. 4)，在冰上以400W的功率超聲180 — 220次，每超聲3秒，間隔5秒，然后離心取上清； 于 Glutathione FF 層析柱進行親和層析，以 l%Triton X-100, ImM EDTA，ρΗ7. 4 PBS 緩沖液洗脫，純化得到GST-YHl融合蛋白。
(4)將GST-YHl融合蛋白脫鹽至ρΗ7· 4,PBS緩沖液中，按照4. 5 — 5. 5 unit酶量消化ImgGST-YHl融合蛋白的比例加入Thrombin凝血酶，室溫消化2小時；Q Sepharose FF 陰離子交換柱進行親和層析，IOmM GSH (谷胱甘肽(glutathione))，pH8. 0 PBS緩沖液GST 洗脫下來，再用pH8.0，20mM Tris緩沖液將YHl蛋白洗脫下來，得到非融合YHl蛋白。
本發明提供一種新的YHl蛋白融合蛋白和非融合蛋白的表達。用RT-PCR的方法從慢性鼻咽炎患者的鼻咽組織總RNA中分離得到的YHl基因，該蛋白在N端有一信號肽，是一分泌性蛋白。本發明通過設計一對引物，將編碼1 /基因克隆到原核表達載體PGEX-4T-1 上，并轉化大腸桿菌見力構建成工程菌株PGEX-4T-1-YH1。 此表達載體有凝血酶切割位點，通過對培養時間，誘導時間，誘導濃度等條件的摸索和優化，重組蛋白的表達量可達到 lmg/L0
本發明摸索和優化了融合GST-YHl的純化條件，上清經GST親和柱純化，可得到純度在>85%以上的成熟重組融合YHl蛋白。本發明還摸索和優化了非融合YHl蛋白的純化條件，融合蛋白經過凝血酶酶切后經過陰離子交換，疏水層析可得到純度在85%以上的成熟重組非融合YHl蛋白。
本發明還提供該蛋白在病原微生物結合，凝集，及抑菌方面的應用。本發明獲得的CN 102526703 A重組YHl蛋白具有生物活性。該重組YHl蛋白能結合和凝集病原微生物，具有殺滅革藍氏陰性細菌的作用，可用于防治由細菌感染引起的炎癥。
圖1是目的基因YHl的PCR擴增。
圖2是含目的基因YHl的陽性克隆鑒定。
圖3是目的基因YHl的測序序列比對分析。
圖4是含YHl基因的表達質粒pGEX-4T-l-YHl構建圖。
圖5是含基因YHl的誘導表達SDS-PAGE電泳圖。其中，漏’蛋白分子marker ； A，沒有誘導的菌體；B，IPTG誘導的菌體。
圖6是融合蛋白GST-YHl的純化。其中，1:含GST-YHl蛋白的沉淀；2:含 GST-YHl蛋白的上清；3:流出產物；4-6:含GST-YH1蛋白的洗脫產物(15ml，IOml and 5ml) ο
圖7是融合蛋白GST-YHl的酶切。其中，A:沒有切割的樣品；B:切割1小時的樣品(還原)；C:切割1小時的樣品(非還原)；D:切割池的樣品(還原)；E:切割池的樣品(非還原)。
圖8是非融合YHl的分離純化圖。其中，1:沒切割的樣品；2:用10U/mg的凝血酶室溫消化2小時；3-4:非融合蛋白π Ι/SPLUNCl的洗脫；5:伴體GST的洗脫。
圖9是融合蛋白GST-YHl與不同病原微生物的結合的western blot圖，其中，1， 副溶血弧菌(G-) ；2，副溶血弧菌對照；3，氣單胞菌(G-) ； 4，氣單胞菌對照；5，腐生葡萄球菌(G+) ； 6，腐生葡萄球菌對照；7，不動桿菌(G-) ； 8，不動桿菌對照。
圖10是融合蛋白GST-YHl與其他不同病原微生物的結合的western blot圖。其中，1，糞腸球菌(G+) ；2，糞腸球菌對照；3，大腸桿菌(G-) ； 4，大腸桿菌對照；5，金黃色葡萄球菌(G+) ； 6，金黃色葡萄球菌對照；7，枯草桿菌(G+) ； 8，枯草桿菌對照。
圖11是YHl蛋白與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌凝集圖。
圖12是YHl能直接殺死革藍氏陰性菌大腸桿菌和溶血不動桿菌的示意圖。其中， A,大腸桿菌，GST為陰性對照，AMP為陽性對照；B，溶血不動桿菌，GST為陰性對照，AMP 為陽性對照。
具體實施方式
以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。
實施例1 目的基因YHl的獲得，陽性克隆鑒定及表達載體構建YHl蛋白的序列如下所示，其中斜體加粗的1-19氨基酸為信號肽，根據我們的表達純化經驗，在構建表達載體時去掉信號肽。提取慢性鼻咽炎患者的鼻咽組織總RNA，以隨機引物反轉錄出cDNA，用帶有BglIIAhol雙酶切位點的YHl特異性引物進行PCR擴增獲得YHl 基因(圖1)，引物序列如下(斜體為酶切位點，加粗為保護堿基):NPCRP-BGL2-F: 5，— CC GAGArmTGCAGTTTGGAGGCCTGCCCGTG - 3' (SEQ ID NO. 1);NPCRP_XH0-R: 5，一 CCGCTCGA 0TAGACCTTGATGACAAACTGTAG — 3，(SEQ ID NO. 2)。回收產物進行 Bglll/Xhol 酶切。同時PGEX-4T-1載體用相同的酶進行雙酶切，切膠純化試劑盒回收。回收的雙酶切產物連接到 PGEX-4T-1載體。連接液轉化Dffia大腸桿菌，挑取10個克隆進行PCR鑒定(圖2)。陽性克隆送測序。測序比對結果見圖3，10號測序正確(圖3)，其pGEX-4T-l-YHl表達質粒構建流程如圖4所示。
1 MFQTGGLIVF YGLLAQTMA^ FGGLPVPLDQ TLPLNVNPAL PLSPTGLAGS LTNALSNGLL 61 SGGLLGILEN LPLLDILKPG GGTSGGLLGG LLGKVTSVIP GLNNIIDIKV TDPQLLELGL121 VQSPDGHRLY VTIPLGIKLQ VNTPLVGASL LRLAVKLDIT AEILAVRDKQ ERIHLVL⑶C 181 THSPGSLQIS LLDGLGPLPI QGLLDSLTGI LNKVLPELVQ GNVCPLVNEV LRGLDITLVH 241 DIVNMLIHGL QFVIKV (SEQ ID NO. 3)。
實施例2 表達工程菌的構建及誘導表達抽提測序正確的質粒，溶于適量的TE溶液中備用。將質粒轉入BL21(DE!3)表達菌株中。具體方法取出在_80°C凍存的E. coli BL21 ( DE3 )感受態細胞，立即放置于冰上， 待解凍后轉化；取Iul質粒加到IOOuL感受態細胞中，輕輕混勻，在冰上孵育30 min, 42°C 熱激90S，立即置冰上;3min ；加入在37°C預熱的500ul LB液體無抗培養基，37°C，200 rpm 搖50min ；取100-200 μ 1菌液涂布在含有Amp (50 μ g/ml)的LB平板上，放入37°C培養箱培養過夜。
取單個菌落接種于anl LB液體培養基(含50 μ g/ml Amp)中，37°C 200r/min震搖培養池至對數生長期，取200ul培養菌液作對照(未誘導)，剩余的培養基中加入IPTG至終濃度為ImM后，37°C震搖培養池，收集培養菌液于離心管，各取200 μ 菌液于離心管中， 離心取上清，分別取40 μ H2O重懸(誘后全菌)，誘導前全菌樣同樣處理，加入10 μ 5 X loading Buffer(還原)，混勻，煮沸5分鐘，12000g離心5 min，取10 μ 上清進行SDS-PAGE 電泳(圖5)。
重組蛋白的表達量達到lmg/L。
實施例3 融合蛋白GST-YHl的純化培養上清以5000g在4 ！離心收集，然后重懸于超聲緩沖液中(PBS，l%Triton X-100, ImM EDTA, pH7. 4)，裂解物在冰上以400W的功率超聲200次(每超聲3秒，間隔5 秒)，然后15000g離心30分鐘后取上清。
親和層析GlutathioneFF 層析柱用 buffer (PBS, l%Triton X-100, ImM EDTA ，ρΗ7. 4)平衡10個柱體積后將破菌上清加載到層析柱，然后用buffer ( PBS, ImM EDTA ，ρΗ7· 4)沖洗 20 個柱體積，接著用 buffer (PBS, IOmM GSH, ImM EDTA，ρΗ8· 0)將 GST-YHl 洗脫下來。分別取誘導后上清，沉淀及洗脫液進行SDS-PAGE電泳分析(圖6)。純化獲得的 GST-YHl融合蛋白保存于 80 °C。
實施例4 融合蛋白GST-YHl的酶切及非融合蛋白 11的獲得將親和層析洗脫樣品脫鹽至buffer (PBS, pH7. 4)，按照5imit酶量消化Img樣品的比例加入凝血酶(Thrombin)，室溫消化2小時(圖7)。用buffer (PBS, pH7.4)平衡10個陰離子交換柱體積后將Thrombin酶切后樣品加載到層析柱，然后用buffer (PBS, pH7. 4)沖洗5個柱體積，接著用buffer (PBS, IOmM GSH，pH8. 0)將GST洗脫下來。流穿樣品透析到 bufferC PBS, ρΗ7· 4)中。Phenyl HP層析柱用 buffer (20mM Tris, 0. 2M (NH4)2SO4, pH8. 0) 平衡10個柱體積后將親和層析洗脫樣品補加(NH4)2SO4至200!111后加載到層析柱，然后用 buffer (2OmM Tris, 0. 2M (NH4)2SO4, pH8· 0)沖洗 10 個柱體積，接著用 buffer (2OmM Tris, pH8. 0)將YHl洗脫下來。分別取不同階段的產物進行SDS-PAGE電泳分析(圖8)，由圖可見，泳道5所跑出來的是目的蛋白，與預期的分子量相一致，蛋白產物保存于 80 V。
以下實驗中的YHl蛋白可以上述方法制備得到，也可以由購買得到。
實施例5 =YHl蛋白與不同病原微生物結合分析++糞腸球黨(Mnterococcus faecium ；G+),腐生葡萄球 {Staphylococcus saprophyticus ； G+)。畐Ij 溶血弧 ( Vibrio parahaemolyticus ； G_)，氣單胞菌 iAeromonas sobria ； G_)，才古草桿 lif {Bacillus subtil is ；G+),金黃色葡萄秋菌 {Staphylococcus aureus ；G+),溶血不動桿菌(A Aaefflo斤iiws ;G_)禾口大腸桿菌(五 coli DH5a ；G-)都是臨床菌株，由中山大學生物防治重點實驗室惠贈。副溶血弧菌在TCBS中 C培養，其他的菌株都是在LB培養基370° C培養。所有的微生物菌株均以3500g離心 10 min并以恰當的濃度重懸，大約5 X IO7個微生物與Sygg的蛋白GST-YHl在PBS溶液反應，于4° C搖床中振蕩過夜。次日反應復合物用PBS洗5次，然后用還原buffer重懸并迅速于100° C變性10分鐘。蛋白質用BCA試劑盒進行定量分析，然后用Western blot進行微生物結合分析，具體步驟如下以每個泳道50 μ g的量進行蛋白質電泳(U%SDS-PAGE)， 電泳后的蛋白質轉移到硝酸nitrocellulose膜上(Pall Corporation)。膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉2小時然后用PBST洗3次。用抗GST單克隆抗體4° C振蕩雜交過夜，次日用PBST洗膜3次后用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的二抗室溫雜交2小時。用ODYSSEY Infrared Imaging Systems (LI-COR )掃描分析 11蛋白與微生物的結合情況(圖9圖10)， 可見YHl與我們所檢測的病原微生物都能結合，相應的GST作為陰性對照。
實施例6 =YHl對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的凝集實驗方法金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養如實施例5，6，000 rpm收集這兩種細菌用TBS (pH7. 5)清洗2次。加入50 μ 1 FITC溶液(溶于DMS0，終濃度為10 mg/ml)后，用TBS (PH7.5)補平至總體積1 ml，避光搖晃1 h。用TBS (pH7. 5)清洗7_8遍至溶液無色，最后懸浮在1 ml TBS (pH7.5)溶液中備用。在96孔平板上進行，每孔加入10 μ 1的各種微生物懸浮液(終濃度大約1 Χ107 CFU/ml的細菌，10 Ug 的融合蛋白或非融合蛋白，用 TBS (pH7.5)補平至100 μ 1，混勻后避光靜置廣2 h后在熒光顯微鏡下檢測凝集活性(圖11)。我們發現融合蛋白和非融合蛋白YHl均能使金葡菌和大腸桿菌發生凝集，且相對于金葡菌，YHl蛋白對大腸桿菌具有更強的凝集效果，TBS作為陰性對照。
實施例7 打孔法研究抗菌活性將不同菌株種子菌于平板畫線，培養過夜，得到單克隆；次日挑單克隆于5 ml對應的培養液，培養過夜；5，000 rpm、4°C離心，去上清后用50 mM Tris, 150 mM NaCl重懸。測細菌OD值。同時準備配LB培養基，加入的瓊脂糖。高壓滅菌20 min，待溫度降至45°C 左右時，按1 :1000的體積比加入培養至0D600=0.3的菌液，搖勻倒板。用滅菌后的打孔器在活性篩選板上打孔(直徑4-5 mm)。空白對照孔加100 μ 1 GST ；測試孔加100 μ 1含有非融合蛋白100 μ g的TBS (pH7. 5)；陽性對照加100 μ 1終含量為100 μ g 的氨芐青霉素 (Amp)0各溶液0.22 ym細菌過濾器過濾除菌。培養過夜。次日觀察有無抑菌圈形成(圖12)。由圖可見，與GST陰性對照和Amp陽性對照相比較，加入YHl蛋白的孔周圍出現了明顯的抑菌斑，證明其具有抑制革藍氏陰性細菌的作用。
以上是針對本發明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發明的專利范圍，凡未脫離本發明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含于本發明的專利范圍中。
權利要求
1.鼻咽癌相關蛋白YHl在與細菌結合和凝集中的應用。
2.鼻咽癌相關蛋白YHl在制備由細菌感染引起的炎癥相關疾病中的藥物的應用。
3.根據權利要求1或2所述的應用，所述鼻咽癌相關蛋白YHl是非融合YHl蛋白。
4.一種鼻咽癌相關蛋白YHl制備方法，其特征是，包括一下步驟(1)構建表達載體構建提取鼻咽組織總RNA，反轉錄出cDNA；用帶有BglIlAhol雙酶切位點的YHl特異性引物進行PCR擴增獲得YHl基因，回收產物進行BglIIAhol酶切；同時PGEX-4T-1載體用BglIIAhol酶進行雙酶切、純化、回收；回收的1 /基因的雙酶切產物連接到PGEX-4T-1載體；連接液轉化Dffia大腸桿菌，陽性克隆篩選，得到pGEX-4T-l_YHl表達質粒；(2)表達工程菌的構建及誘導表達將PGEX-4T-1-YH1表達質粒加到冰預冷的E.coli BL21 ( DE3 )感受態細胞中，輕輕混勻，在冰上孵育25 — 35 min，40 — 45°C熱激85 — 95S， 立即置冰上2. 5 — 3. 5min，加入在37°C預熱的500ul無抗LB液體培養基，37°C，震搖45 — 55min ；取菌液涂布在含有Amp抗性LB平板上，放入37°C培養過夜；取單個菌落接種于Amp 抗性LB液體培養基中，37°C震搖培養2. 5 — 3. 5h至對數生長期，加入異丙基-β _D_硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為ImM后，37°C震搖培養2 — 4h，收集培養菌液，離心取上清液，即得所述鼻咽癌相關蛋白YHl。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征是，還包括純化和酶切(3)將離心后的上清液重懸于PBS緩沖液中，在冰上以400W的功率超聲180— 220次， 每超聲3秒，間隔5秒，然后離心取上清；于Glutathione FF層析柱上進行親和層析，以 l%Triton X-100, ImM EDTA，ρΗ7· 4 PBS緩沖液洗脫，純化得到GST-YHl融合蛋白；(4)將GST-YHl融合蛋白脫鹽至ρΗ7·4,PBS緩沖液中，按照4. 5 — 5. 5 unit酶量消化 ImgGST-YHl融合蛋白的比例加入Thrombin凝血酶，室溫消化1. 5 — 2. 5小時；Q Sepharose FF陰離子交換柱進行親和層析，IOmM GSH, pH8. O PBS緩沖液GST洗脫下來，再用pH8. 0， 20mM Tris緩沖液將 11蛋白洗脫下來，得到非融合 11蛋白。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征是，步驟(1)中所述帶有BglIIAhol雙酶切位點的YHl特異性引物為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。
全文摘要
本發明提供了一種YH1蛋白在與病原微生物結合和凝集中的應用，還提供了YH1蛋白在制備由細菌感染引起的炎癥相關疾病中的藥物的應用，以及公開所述YH1蛋白制備方法，包括構建表達載體構建、表達工程菌的構建及誘導表達、純化和酶切。本發明獲得的重組YH1蛋白具有生物活性。該重組YH1蛋白能結合和凝集病原微生物，具有殺滅革藍氏陰性細菌的作用，可用于防治由細菌感染引起的炎癥。
文檔編號A61K38/17GK102526703SQ201210015278
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者何志巍, 劉輝 申請人:廣東醫學院司法鑒定中心