專利名稱：抑制水牛TREM1基因表達的shRNA、慢病毒表達載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及水牛髓樣觸發受體1基因(TREMl)，尤其是一種抑制水牛TREMl基因表達的shRNA、慢病毒表達載體及其構建方法和應用。
背景技術：
水牛是我國南方重要的農業生物資源，它具有適應性強、耐高溫高濕、易飼養、使用年限長和乳品營養價值高等特性，如今已成為極具開發價值的家畜品種。然而，水牛的低繁殖力、較高的疾病發生率卻嚴重制約了我國水牛產業的發展。其中，布氏桿菌病引起的母牛流產、不育在實際生產中極其常見，這不僅給畜牧業造成重大的經濟損失，而且嚴重威脅人類健康。長期以來，對布氏桿菌病的治療手段主要是使用抗菌素和疫苗，前者容易產生耐藥性，后者免疫效果不穩定、持續時間短。因此，如何有效控制布氏桿菌病仍是一項重大挑戰，亟需尋求一種新的防治途徑。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種抑制水牛TREMl基因表達的shRNA、慢病毒表達載體及其構建方法和應用。為解決上述技術問題本發明采用如下技術方案抑制水牛TREMl 基因表達的 shRNA，該 shRNA 為 shRNA_TREM194 或 shRNA_TREM294， 它們都包含19nt的siRNA正義鏈，9nt的loop環，19nt的siRNA反義鏈和終止信號；loop環的堿基序列為TTCAAGAGA ；終止信號的堿基序列為TTTTTTT ；shRNA-TREM194的正義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 3的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 4的堿基序列；shRNA-TREM294的正義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 5的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 6的堿基序列。上述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體，該載體是pSicoR-GFP-shTREM-194 或 pSicoR-GFP-shTREM-294。上述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體的構建方法，該慢病毒表達載體由合成的shRNA-TREM194或shRNA_TREM294分別克隆入慢病毒表達載體 pSicoR-GFP 中而得。上述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA在抑制水牛TREMl基因表達方面的應用。上述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體在抑制水牛TREMl基因表達方面的應用。上述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA在制備防治水牛布氏桿菌病藥物方面的應用。
上述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體在制備防治水牛布氏桿菌病藥物方面的應用。發明人通過了解布氏桿菌病發生的分子機制，研究其信號轉導通路為其防治提供新的思路和方向。髓樣觸發受體1 (TREMl)是專一表達于中性粒細胞、CD14單核/巨噬細胞等髓樣細胞表面的跨膜糖蛋白，由其介導的信號通路在炎癥反應和級聯放大中起重要作用，它還與Toll樣受體-4(TLR-4)在LPS所致炎癥反應中存在協同效應。因此，作為革蘭氏陰性菌脂多糖LPS誘導的免疫反應信號路徑中一個重要的靶基因，抑制TREMl基因的表達有可能改變一些其他相關因子的表達。為此，發明人利用分子和細胞生物學技術，首先克隆得到水牛髓樣觸發受體 1 (TREMl)全長編碼區，構建了水牛TREMl基因融合蛋白表達載體，設計并構建水牛TREMl基因shRNA慢病毒表達載體；然后，采用脂質體轉染方法將水牛TREMl基因融合蛋白表達質粒和其shRNA慢病毒表達載體共轉入293細胞，收集細胞檢測水牛TREMl基因在293細胞中的表達，快速篩選獲得高效抑制水牛TREMl基因的shRNA干擾序列。本發明研究工作包括以下基本步驟<1>水牛TREMl基因的克隆、融合蛋白表達載體的構建及其表達檢測克隆得到水牛TREMl基因mRNA的ORF全長序列，經過測序驗證序列正確后，將其定向插入PDsRed-Nl載體中，構建水牛TREMl基因的融合蛋白表達載體，酶切驗證陽性重組質粒pDsRed-Nl-TREMl ；重組質粒pDsRed-Nl_TREMl經脂質體轉染方法導入293細胞，細胞培養4 后，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況；收集細胞，采用RT-PCR方法檢測水牛 TREMl基因在293細胞中的表達。<2>shRNA的設計及其慢病毒表達載體的構建、細胞檢測針對黃牛TREMl基因[GenBank :NM_206970. l]CDs序列，參照siRNA設計原理，選擇 5 個 siRNA 序列作為靴位點(96-104bp，194_213bp，294-312bp, 578_596bp，643_661bp)， BLAST比對確認以上序列與其他基因序列無同源性。將其設計為shRNA結構，shRNA結構包含19nt的siRNA正義鏈，9nt的loop環(TTCAAGAGA)，19nt的siRNA反義鏈和終止信號(TTTTTTT)，shRNA 兩端引入酶切位點 XhoI、NotI。分別命名為 shTREM_96，shTREM-194, shTREM294, shTREM578, shTREM643。同時選擇一個無關序列 shTREM_1864(N. C)作為陰性對照。合成shRNA序列并克隆到慢病毒表達載體pSicoR-GFP中，酶切和測序驗證。shRNA 慢病毒表達載體(pSicoR-GFP-shTREM-96/194/^94/578/643/N. C)經脂質體轉染方法導入 293細胞，轉染4 后，熒光顯微鏡下觀察細胞水平上各shRNA片段表達情況。<3>抑制水牛TREMl基因表達shRNA序列的篩選采用共轉染的方法，將目的基因水牛TREMl基因表達載體(靶質粒)與shRNA表達載體(干擾質粒)分別以不同劑量比例經脂質體共轉染入293細胞，轉染4 后，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況。通過實時定量PCR(Real-Time RT-PCR)方法在mRNA水平檢測 TREMl基因的表達，計算各shRNA片段抑制效率。通過上述步驟，發明人快速獲得了本發明的高效穩定抑制水牛TREMl基因表達的 shRNA序列shTREM-194和shTREM494。實驗顯示，當靶質粒(pDsRed-Nl-TREMl)與干擾質粒(shTR-96/194/294/578/643)以 1 3 比例轉染時，shTR-194 和 shTR-294 對 TREMl 的抑制效率分別為36. 93%和20. 76% ；以1 1的比例共轉染時，shTR-194和shTR-294的抑制效率分別為46. 14%和50. 73%。這展示了其在布氏桿菌病防治中的一定的應用前景， 也為下一步在巨噬細胞系中，研究TREMl基因的抑制對脂多糖LPS誘導的免疫反應信號轉導路徑中其他相關因子的影響奠定了重要的實驗基礎。
圖1是水牛TREMl基因融合蛋白表達載體pDsRed-Nl_TREMl結構示意圖。圖2是抑制水牛TREMl基因表達的shRNA慢病毒表達載體結構示意圖。圖3是靶質粒和干擾質粒共轉染(劑量比1 3) 293細胞實時熒光定量PCR檢測圖。圖4是靶質粒和干擾質粒共轉染(劑量比1 1)293細胞實時熒光定量PCR檢測圖。
具體實施例方式一、相關表達載體的構建1.水牛TREMl基因表達載體的構建根據GenBank中收錄的牛TREMl基因CDs序列[GenBank :NM_206970. 1]設計弓丨物，并在上下游引物的5，端(CTCGAG和GGTACC)分別引入XhoI.Kpnl酶切位點，引物為TREMl-上游 5，CTCGAGAGAACAGTTGGAGTCAGTGC-3，(序列表 SEQ. ID. No. 13)，TREMl-下游 5，GGTACCGACCTATGCGTGACAGCAAA-3，(序列表 SEQ. ID. No. 14)。從屠宰場取水牛新鮮脾臟組織，放入預先加有Iml RNA保護劑的^iil EP管中。用 Trizol裂解法提取總的RNA，反轉錄為cDNA。以水牛脾臟cDNA為模板，擴增得到水牛TREMl 基因的ORF全長序列(序列表SEQ. ID. No. 21)，擴增長度為7Mbp，將PCR產物回收后插入 PMD18-T載體，命名為pMD18-T-TREMl，用BioI和KpnI酶切鑒定，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳可看到長度分別為2. 7kp和715bp的條帶，證明已成功插入。將重組質粒pMD18-T-TREMl 送上海生工測序，測序結果經Blast比對，與NCBI中黃牛TREMl基因同源性為97.2%。用BioI和KpnI雙酶切pMD18_T_TREMl，膠回收7Mbp的片段。用同樣的酶線性化 pDsRed-ΝΙ載體。將TREMl基因片段定向插入載體pDsRed-Nl中，重組質粒用XhoI和KpnI 進行酶切鑒定正確。水牛TREMl融合蛋白表達載體pDsRed-Nl-TREMl結構如圖1所示。2. shRNA慢病毒表達載體的構建采用siRNA設計軟件，針對TREMl基因ORF序列，選擇5個不同的靶位點作為靶序列(96-104bp，194-213bpJ94-312bp，578-596bp，643-661bp)，并將其設計為包含 19nt 的 siRNA正義鏈、9nt的loop環(TTCAAGAGA)和19nt的siRNA反義鏈的shRNA結構，分別命名為 shTREM-96，shTREM-194，shTREM294, shTREM578, shTREM643 ；同時選擇一個無關序列 shTREM-1864(N. C)作為陰性對照(見表1)。合成5條shRNA序列和1條陰性對照序列，并克隆入慢病毒表達載體PSicoR-GFP中，測序驗證，并用BioI和NotI雙酶切驗證。構建的 shRNA表達載體結構如圖2所示。表IshRNA序列結構
權利要求
1.一種抑制水牛TREMl基因表達的shRNA，其特征在于該shRNA為shRNA_TREM194或 shRNA-TREI\C94，它們都包含19nt的siRNA正義鏈，9nt的loop環，19nt的siRNA反義鏈和終止信號；所述loop環的堿基序列為TTCAAGAGA ；所述終止信號的堿基序列為TTTTTTT ；所述shRNA-TREM194的正義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 3的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 4的堿基序列；所述shRNA-TREiC94的正義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 5的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ. ID. No. 6的堿基序列。
2.根據權利要求1所述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體，其特征在于該載體是pSicoR-GFP-shTREM-194 或 pSicoR-GFP-shTREM-294。
3.根據權利要求2所述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體的構建方法，其特征在于所述慢病毒表達載體由合成的所述shRNA-TREM194或shRNA_TREM294分別克隆入慢病毒表達載體PSicoR-GFP中而得。
4.根據權利要求1所述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA在抑制水牛TREMl基因表達方面的應用。
5.根據權利要求2所述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體在抑制水牛TREMl基因表達方面的應用。
6.根據權利要求1所述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA在制備防治水牛布氏桿菌病藥物方面的應用。
7.根據權利要求2所述抑制水牛TREMl基因表達的shRNA的慢病毒表達載體在制備防治水牛布氏桿菌病藥物方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑制水牛TREM1基因表達的shRNA，該shRNA為shRNA-TREM194、或shRNA-TREM294，它們都包含19nt的siRNA正義鏈，9nt的loop環，19nt的siRNA反義鏈和終止信號。該shRNA能高效抑制水牛TREM1基因的表達。本發明還公開了上述shRNA的慢病毒表達載體及其構建方法。實驗證實，應用本發明的shRNA可有效穩定地抑制水牛TREM1基因表達，展示了在布氏桿菌病防治中的一定的應用前景，也為進一步了解TREM1在LPS誘導的革蘭氏陰性菌跨膜機制和信號轉導中的作用奠定了基礎。
文檔編號A61K48/00GK102517287SQ20121000652
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者喬樹葉, 李湘萍, 李美青, 石德順, 路新梅 申請人:廣西大學