產生羅伊氏菌素的短乳桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明涉及產生羅伊氏菌素的短乳桿菌(Lactobacillus?brevis)的菌株。這些菌株可用于，特別是幽門螺桿菌(Helicobacter?pylori)感染導致的病癥的治療或預防。
【專利說明】產生羅伊氏菌素的短乳桿菌
[0001]本發明涉及產生羅伊氏菌素(reuterin)的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的菌株及其用途，特別是用于治療或預防幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染及其導致的病癥。
[0002]羅伊氏菌素(3-羥基丙醛，3-HPA)是一種抗菌化合物，其最初被鑒定為在存在甘油的厭氧條件下培養時，由羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的一些菌株產生(TALARIC0&D0BR0G0SZ, Antimicrob Agents Chemother, 33，674-9，1989)。甘油向羅伊斯菌素的轉化由鈷胺素依賴性甘油脫水酶(Gld ；EC4.2.1.30)催化，該酶包含三個亞基(分別為C、D和E,或α、β和y ) 0在除了例如丘狀乳桿菌(Lactobacillus collinoides)、短乳桿菌和希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)之外的乳桿菌菌種中也報道存在甘油脫水酶(GDA)通路。對于所有菌種，根據編碼甘油脫水酶或二醇脫水酶的基因的存在，該通路的存在似乎隨菌株而不同(CADIEUX 等，Appl Environ Microb1l, 74，4645-9，2008 ；SAUVAGE0T等，FEMS Microb1logy Letters, 209，69-74，，2002 ；CLAISSE 和 LONVAUD-FUNEL, Journalof Food Protect1n, 64，833-837，2001)。在大多數通過GDA通路代謝甘油的細菌中，羅伊氏菌素通常是代謝中間體，其隨后在細胞內還原成1，3-丙二醇(1，3-PD)，分泌到胞外基質中。只有一些具有甘油或二醇脫水酶的菌株能夠在培養基質中積累羅伊氏菌素。這些積累羅伊氏菌素的菌株大多數屬于羅伊氏乳桿菌。但是，已經報道在其它乳桿菌菌種中也有一些菌株能夠胞外積累羅伊氏菌素，且程度通常低于羅伊氏乳桿菌，所述乳桿菌菌種為:棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis) (MARTIN 等,Int J FoodMicrob1l, 104, 267-77，2005)，丘狀乳桿菌(Gara1-1babe 等,Internat1nal Journal ofFood Microb1logyl21, 253-261，2008 ；Sauvageot 等,Internat1nal Journal of FoodMicrob1logy, 55, 167-170，2000)和希氏乳桿菌(Pasteris 和 Strasser de Saad, J.Agric.Food Chem.，57 (9)，3853 - 3858，2009)。最近，發現了短乳桿菌的一個菌株和戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus )的一個菌株能夠胞外積累羅伊氏菌素(但其濃度比羅伊氏乳桿菌低 10 倍)(Bauer 等，Internat1nal Journal of Food Microb1logy, 137, 28-31，2010)。
[0003]羅伊氏菌素對潛在有害的微生物具有廣譜的抗微生物活性。羅伊氏菌素能夠抑制酵母、真菌、原生動物和多種有害細菌的生長，其所需濃度比抑制乳酸細菌生長所需濃度低四到五倍。由于羅伊氏菌素的這種選擇性抗微生物活性使得它能夠破壞多種病原性微生物而同時對腸道菌群的有益乳酸細菌無害，它已被提議用于治療各種消化系統疾病。
[0004]一些羅伊氏乳桿菌菌株已被視為候選益生菌，原因尤其在于它們對抗病原體如沙門氏菌(Salmonella enterica)、大腸桿菌(Escherichia coli)、難辨梭菌(Clostridiumdifficile)和幽門螺桿菌的保護作用(CLEUSIX 等，BMC Microb1l, 7，101，2007 ；SPINLER等,Anaerobe, 14，166-71，2008 ；FRANCAVILLA 等,Helicobacter, 13，127-34，2008 ；PCTW02004/031368)。這些作用至少部分地與羅伊氏菌素的產生有關。
[0005]在胃腸道的病原微生物中，幽門螺桿菌在過去數年已經成為關注日益增加的焦點。它是一種革蘭氏陰性螺旋形細菌，定殖于世界人口的50%以上的人的胃黏液層中。雖然感染幽門螺桿菌的大部分個體是無癥狀的，但他們的胃上皮顯示炎癥跡象，15%至20%的幽門螺桿菌感染者會發展成疾病。幽門螺桿菌是消化性潰瘍、慢性活動性胃炎、萎縮癥、組織轉化、發育異常、胃癌和胃黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤的主要致病因子(綜述參見(FOX&WANG, J Clin Invest, 117，60-9, 2007 ；POLK&PEEK, Nat Rev Cancer, 10，403-14))。
[0006]感染幽門螺桿菌的患者的標準治療是兩種抗生素加上PPI (質子泵抑制劑)治療，即所謂的三聯療法。然而，因為抗生素耐藥性或依從性差，三聯療法的幽門螺桿菌根除率在下降。此外，除了一些測試，目前市場上還沒有有效的疫苗。
[0007]已經提議使用益生菌去替代或補充用于治療或預防幽門螺桿菌的三聯療法。正如上文所指出的，這些益生菌尤其包括羅伊氏乳桿菌，原因特別是由于羅伊氏乳桿菌的抗微生物性質。其它乳桿菌菌種中的一些菌株也被提議可能用于幽門螺桿菌感染的處理。例如，SMOVA 等(JAppl Microb1l, 106，692-701，2009)公開了德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)菌株(BB18)，其產生抑制性肽(細菌素)并強烈抑制幽門螺桿菌。LINSALATA等(Helicobacter，9，165-72，2004)研究了具有高精氨酸脫亞氨酶活性的一個短乳桿菌具體菌株(CD2)對幽門螺桿菌在人胃黏膜中存活的影響。他們發現胃內幽門螺桿菌的量降低，并認為這可能是由于升高的精氨酸脫亞氨酶活性，其奪去幽門螺桿菌的精氨酸，并抑制它們的生長和增殖。
[0008]發明人現已分離出了短乳桿菌的菌株，該菌株能夠產生羅伊氏菌素并以足以對多種幽門螺桿菌菌株產生抗微生物活性的量積累羅伊氏菌素。
[0009]本發明所定義的“能夠積累羅伊氏菌素”的菌株或“積累羅伊氏菌素”的菌株是指能夠產生羅伊氏菌素并將其分泌至胞外的菌株。
[0010]因此，本發明的一個目的是短乳桿菌的這個菌株，其已根據布達佩斯條約于2011年2月3日保藏于CNCM(法國國家微生物保藏中心，25rue du Docteur Roux,巴黎)，保藏編號為 CNCM 1-4431。
[0011]除了具有產生并積累羅伊氏菌素的能力外，該菌株還具有如下特點:
[0012]-形態學:桿狀細菌，均色，以小鏈分組；
[0013]-代謝:異型發酵；
[0014]-以下列糖發酵(在Api50CHstrip-API MRS培養基上37°C、48h獲得的結果):L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-麥芽糖、D-蜜二糖、葡萄糖酸鉀、5-酮基葡糖酸鉀。
[0015]本發明還包括通過CNCM 1-4431菌株的誘變或基因轉化而衍生的積累羅伊氏菌素的短乳桿菌菌株，條件是它們保留了母本菌株的抗微生物性質和產生羅伊氏菌素的能力。它們可以是，例如CNCM 1-4431菌株的一個或多個內源性基因已被突變的菌株，從而改變它的一些代謝性質(例如該菌株的糖代謝能力、對腸道轉運的抗性、耐酸性或后酸化)。它們還可以是利用一個或多個感興趣的基因經過基因轉化CNCM 1-4431菌株而得到的菌株，通過轉化使得以下成為可能:例如，賦予了所述菌株額外的生理特性，或使其表達治療或疫苗目的的蛋白，其通過所述菌株進行施用。
[0016]這些菌株可通過乳桿菌的隨機或定點誘變和基因轉化的常規技術從CNCM 14431菌株獲得，如 GURY 等(Arch Microb1l.，182，337-45，2004)或 VELEZ 等(Appl EnvironMicrob1l.，73，3595 - 3604，2007)的描述，或由已知的“基因組重排”技術(Patnaik等，Nat B1technol, 20，707-12，2002 ；ffang Y.等，JB1technol.，129，510-15，2007)獲得。
[0017]本發明目的還在于獲得積累羅伊氏菌素的短乳桿菌菌株的方法，所述方法包括菌株CNCM 1-4431的誘變或基因轉化步驟。
[0018]本發明的短乳桿菌菌株可用于生產羅伊氏菌素。因此，本發明的又一個目的是生產羅伊氏菌素的方法，所述方法包括以下步驟:
[0019]-在甘油存在下，培養如上所定義的本發明的短乳桿菌菌株，優選菌株CNCM1-4431，以及
[0020]-回收培養物所生產的羅伊氏菌素。
[0021]本發明的目的還在于含有本發明的短乳桿菌菌株，優選菌株CNCM 1-4431的組合物。
[0022]在本發明的組合物中，所述菌株可以采用全菌的形式，優選活細菌的形式。
[0023]本發明的組合物可以是適于施用，特別是口服施用的任何形式。這包括例如固體、半固體、液體和粉末形式。液體組合物由于易于施用而是通常優選，例如作為飲料。
[0024]所述組合物可以每克干重含有至少15Cfu,優選至少16Cfu的本發明的短乳桿菌菌株。
[0025]所述組合物可以進一步含有其它細菌菌株，特別是益生菌菌株，例如乳桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、鏈球菌(Streptococcus)或乳球菌(Lactococcus)的菌株。
[0026]典型地，所述組合物以每克組合物干重可以含有15至113菌落形成單位(Cfu)，優選至少106cfu,更優選至少107cfu,還更優選至少108cfu,最優選至少19Cfu的本發明的短乳桿菌菌株。在液體組合物的情況下，這通常相當于14至112菌落形成單位(cfu)，優選至少105cfu,更優選至少106cfu,還更優選至少107cfu,最優選至少108cfu/ml。
[0027]組合物可以是營養組合物,包括食品、食品補充品(food supplement)和功能食品。“食品補充品”是指通常用在食物中的化合物制得的產品，但其形式為片劑、粉劑、膠囊劑、藥水(pot1n)或通常不與養料(aliment)相關的其它形式，并且其對人的健康有益。“功能食品”是也對人的健康有益的養料。特別地，食品補充品和功能食品可以具有生理作用-針對疾病的，例如針對慢性疾病的預防或治療性作用。
[0028]根據本發明的營養組合物還包括嬰兒食品、嬰兒配方奶或嬰兒后續配方奶(infant follow-on formula)。優選本發明的組合物是營養產品或藥物產品，營養補充品或醫療食物。
[0029]所述組合物可以是乳制品，優選發酵乳制品。發酵產品可以以液體形式存在或以通過干燥發酵液體獲得的干粉的形式存在。乳制品的例子包括凝結的(set)、攪拌的或可飲用的形式的發酵乳和/或發酵乳清，奶酪和酸奶。
[0030]發酵產品還可以是發酵植物，例如發酵大豆、谷物和/或水果，形式為凝結的(set)、攪拌的或可飲用的形式。
[0031]在優選的實施方案中，發酵產品是新鮮產品。新鮮產品沒有經歷嚴格的熱處理步驟，優勢是細菌菌株以活的形式存在。
[0032]本發明的目的還在于本發明的短乳桿菌菌株，優選菌株CNCM 1-4431，或本發明的組合物，用作藥物。本發明的短乳桿菌菌株和組合物尤其可用于治療或預防幽門螺桿菌感染。
[0033]本發明的目的還在于本發明的短乳桿菌菌株，優選菌株CNCM 1-4431，或本發明的組合物，用作藥物或在制備藥物中的用途，所述藥物優選用于治療或預防幽門螺桿菌感染。
[0034]本發明的目的還在于治療或預防有此需要的受試者中的幽門螺桿菌感染的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的本發明的短乳桿菌菌株，優選菌株CNCM1-4431，或本發明的組合物。
[0035]本發明還包括用于生產藥物，優選治療或預防幽門螺桿菌感染的藥物的方法，所述方法包括將如上所定義的短乳桿菌菌株，優選菌株CNCM 1-4431，加入到至少一種藥物學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑中。
[0036]用于診斷幽門螺桿菌感染的方法是本領域已知的。通過舉例的方式，幽門螺桿菌感染的診斷可通過血液抗體檢測、糞便抗原檢測或碳尿素呼吸實驗的檢查進行。也可以通過內窺鏡下活檢和隨后的尿素酶檢測、組織學檢查或微生物培養進行。
[0037]特別的，與幽門螺桿菌感染有關的癥狀或疾病有胃痛、燒心、反酸、腹痛、反胃，嘔吐、打嗝、脹氣、惡心、食管炎、胃炎例如慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、萎縮癥、組織轉化、發育異常、胃癌和胃黏膜相關的淋巴組織(MALT)淋巴瘤。
[0038]從以下進一步的描述可以更清楚的理解本發明，所述表述包括示例CNCM 1-4431菌株的抗微生物免疫調節和抗感染特性的實施例和附圖。
[0039]圖1顯示短乳桿菌菌株的gldC序列的PCR反應結果。位于728bp的較高的條帶表示采用gldc基因特異性引物的預期產物。位于201bp的較低的條帶表示采用16S rRNA基因特異性引物的預期產物(陽性PCR對照)；Smart:DNA SMART梯(Eurogentec) ；C+:從陽性gldC菌株羅伊氏乳桿菌ATCC55730的DNA對照獲得的PCR結果；1-4431:從短乳桿菌菌株CNCM 1-4431的DNA獲得的PCR結果；L.brevis80:從短乳桿菌80的DNA獲得的PCR結果；C-:從gldC陰性菌株嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的DNA對照獲得的PCR結果；H20:從無菌水獲得的PCR結果。
[0040]圖2顯示單獨攝入幽門螺桿菌后秀麗隱桿線蟲中幽門螺桿菌(菌株NTCTC11637)(黑色條)、MRS中生長的幽門螺桿菌+短乳桿菌菌株(暗灰色條)、含有甘油的MRS中生長的幽門螺桿菌+短乳桿菌菌株(白色條)或幽門螺桿菌+含有甘油的MRS的定量結果。[0041 ] 實施例1:短乳桿菌菌株CNCM 1-4431對幽門螺桿菌生長的體外抑制
[0042]材料與方法
[0043]短乳桿菌菌株:
[0044]-短乳桿菌CNCM 1-4431
[0045]-短乳桿菌80:短乳桿菌的常規菌株
[0046]幽門螺桿菌菌株:
[0047]采用了三株幽門螺桿菌參考菌株和五株臨床分離物。
[0048]參考菌株:
[0049]-26695:描述于 TOMBS 等(Nature388, 539 - 547，1997)；
[0050]-HPAGl:描述于 OH 等(Proc Natl Acad Sci USA., 103，9999-10004，2006)；
[0051]-TN2GF4:分離自日本的胃潰瘍患者并適應于蒙古沙鼠(Mongolian gerbil)(菌株描述于 WATANABE 等，Gastroenterol 1998 ；volll5, pp642-648)
[0052]臨床分離物:
[0053]-CRl 13和CR114:菌株分離自人胃癌前病變活檢；
[0054]-Axcan342和Axcan374:菌株分別分離自胃炎患者和食管炎患者，所述患者參與測試四聯療法根除幽門螺桿菌的臨床研究(Malfertheiner等，Lancet, 377, 905-913,2011)。
[0055]-GC3C:菌株分離自胃癌患者。
[0056]方法:
[0057]短乳桿菌在MRS肉湯(pH6.2)中生長17h。細菌懸液用KOH溶液中和至pH6.8。
[0058]幽門螺桿菌菌株在布氏肉湯中生長48h直到獲得相當于麥克法蘭(Mac Farland)4標準的渾池度。將細菌懸液鋪到補充有10% (v/v)羊血、富集有1% (v/v)Polyvitex補充物(B1merieux)且在同一介質中含有終濃度10mM甘油的Mueller Hinton瓊脂平板的表面，以產生羅伊氏菌素。
[0059]將無菌紙圓片加到平板表面。然后，將5μ L中和的短乳桿菌懸液加到每個紙圓片上。平板于37°C在微需氧氣氛(Ruskin微需氧氣體分揀機，產生5% 02、10% CO2和85%N2)中孵育72h至96h。
[0060]為了評估短乳桿菌懸液對幽門螺桿菌菌株生長的影響，測量了紙圓片周圍生長抑制環的寬度。
[0061]結果
[0062]結果顯示于下表1。
[0063]
【權利要求】
1.積累羅伊氏菌素的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)菌株,所述菌株選自: -短乳桿菌菌株CNCM 1-4431 ； -通過菌株CNCM 1-4431的誘變或基因轉化而衍生的短乳桿菌菌株。
2.權利要求1的短乳桿菌菌株用于產生羅伊氏菌素的用途。
3.含有權利要求1的短乳桿菌菌株的組合物。
4.根據權利要求3的組合物，其特征在于，所述組合物每克干重含有至少15Cfu,優選至少16Cfu的所述短乳桿菌菌株。
5.根據權利要求3或4的組合物，其特征在于，所述組合物是營養組合物。
6.根據權利要求5的組合物，其特征在于，所述組合物是乳制品。
7.用作藥物的權利要求1的短乳桿菌菌株或權利要求3-6任一項的組合物。
8.根據權利要求7的用作藥物的短乳桿菌菌株或組合物，其特征在于，所述藥物用于治療或預防幽門螺桿菌 感染。
【文檔編號】A61K35/74GK104053766SQ201180075190
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2011年11月30日 優先權日:2011年11月30日
【發明者】佩吉·加羅, 加埃勒·凱雷, R·布拉特-錫卡爾 申請人:熱爾韋·達諾尼公司