用于人乳頭狀瘤病毒的疫苗及其使用方法

用于人乳頭狀瘤病毒的疫苗及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開改進(jìn)的抗-HPV免疫原和編碼它們的核酸分子。所公開的免疫原包括具有共有序列HPV6、HPV11、HPV33以及HPV58E6和E7的那些免疫原。本文公開藥物組合物、包含其的重組疫苗和活減毒疫苗，還公開在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答的方法。
【專利說明】用于人乳頭狀瘤病毒的疫苗及其使用方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及改進(jìn)的人乳頭狀瘤病毒(HPV)疫苗、用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的改進(jìn)的方法、以及用于針對(duì)HPV來預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體的改進(jìn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳頭狀瘤病毒是小DNA病毒，其包含至多7個(gè)早期基因和2個(gè)晚期基因。通常，乳頭狀瘤病毒早期基因表示為E1-E7，并且乳頭狀瘤病毒晚期基因表示為LI和L2。若干個(gè)物種的動(dòng)物可被乳頭狀瘤病毒家族的成員感染。
[0003]人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是常見的，并且可發(fā)生性傳播?；贒NA序列的同源性，HPV已經(jīng)分成56種或更多種類型。16和18型HPV(其引起上皮異常增生和其它病變)通常和下列情況有關(guān):癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加，特別是子宮頸、陰道、陰門以及肛管的原位和侵入性癌瘤。在全世界將近88%的子宮頸癌是HPV亞型16、18、45、31、33、52以及58所造成的結(jié)果。此外，各種研究已揭示HPV6和HPVll存在于大多數(shù)發(fā)生的復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤病中。盡管已知了 HPV6和HPVll與生殖器疣的相關(guān)性并且在小百分比的子宮頸癌病例中發(fā)現(xiàn)了它們，但已經(jīng)在2.6%至5.2%的所有情況的低級(jí)子宮頸病變中發(fā)現(xiàn)了 HPV6和HPV11。此外，HPV6和HPVll現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與大約20%的現(xiàn)被視為子宮頸癌先兆的低級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變，包括2級(jí)和3級(jí)子宮頸上皮內(nèi)瘤形成和輕度子宮頸發(fā)育不良有關(guān)。更多的研究已揭示了兩種血清型與各種形式的耳鼻喉科疾病，包括生殖器疣、復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤病、肺癌、扁桃體癌、喉癌、以及頭頸部本來良性腫瘤的其它惡性轉(zhuǎn)化和發(fā)育不良的相關(guān)性。此研究的發(fā)現(xiàn)結(jié)果揭示了使用共有序列DNA疫苗來對(duì)抗HPV6和HPVll的光明前景。
[0004]DNA疫苗相對(duì)于更加傳統(tǒng)的疫苗接種法具有許多概念上的優(yōu)點(diǎn)，如活減毒病毒和重組蛋白基疫苗。DNA疫苗安全、穩(wěn)定、容易生產(chǎn)并且在臨床試驗(yàn)的人中具有良好耐受性，這表明質(zhì)粒整合的跡 象微乎其微[Martin, T.等，Plasmid DNA malaria vaccine: thepotential for genomic integration after intramuscular injection.Hum GeneTher，1999.10 (5):第 759-68 頁；Nichols，W.W.等，Potential DNA vaccine integrationinto host cell genome.Ann N Y Acad Sci，1995.772:第 30-9 頁]。另外，DNA 疫苗非常適于反復(fù)施用，因?yàn)橐呙绲男Ч麑?shí)際上不受到對(duì)于載體預(yù)先存在的抗體滴度的影口向[Chattergoon，M.、J.Boyer 以及 D.B.Weiner，Genetic immunization:a new era invaccines and immune therapeutics.FASEB J，1997.11 (10):第 753-63 頁]。
[0005]然而，在移至較大動(dòng)物時(shí)，臨床釆用DNA疫苗的一個(gè)主要障礙是平臺(tái)免疫原性的降低[Liu，Μ.A.和 J.B.Ulmer，Human clinical trials of plasmid DNA vaccines.AdvGenet, 2005.55:第25-40頁]。DNA疫苗免疫原工程化中的近期技術(shù)進(jìn)展如密碼子優(yōu)化、RNA優(yōu)化和添加免疫球蛋白前導(dǎo)序列已經(jīng)提高了 DNA疫苗的表達(dá)和免疫原性[Andre，S.等，Increased immune response elicited by DNA vaccination with a syntheticgpl20sequence with optimi zed codon usage.J Virol, 1998.72 (2):第 1497-503 頁；Demlj L.等,Multiple effects of codon usage optimization on expression andimmunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiencyvirus typeIGag protein.J Virol,2001.75 (22):第 10991-1001 頁；Laddy, D.J.等,Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avianinfluenza.Vaccine, 2007.25(16):第 2984-9 頁；Frelin, L.等,Codon optimization andmRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitisC virus nonstructural3/4A gene.Gene Ther, 2004.11 (6):第 522-33 頁],以及質(zhì)粒遞送系統(tǒng)方面的近期開發(fā)的技術(shù)如電穿孔[Hirao, L.A.等，Intradermal/subcutaneousimmunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potencyin pigs and rhesus macaques.Vaccine, 2008.26 (3):第 440-8 頁；Luckay, A.等，Effectof plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resultingvaccine-specific immune responses in rhesus macaques.J Virol, 2007.81 (10):第5257-69 頁；Ahlen, G.等，In vivo electroporation enhances the immunogenicity ofhepatitis C virus nonstructural3/4A DNA by increased local DNA uptake, proteinexpression, inflammation, and infiltration of CD3+T cells.J Immunol, 2007.179 (7):第4741-53頁]。另外，研究表明相比于單獨(dú)的天然抗原，共有免疫原的使用能夠增加細(xì)胞免疫應(yīng)答的寬度[Yan.，J.等，Enhanced cellular immune responses elicitedby an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine.Mol Ther, 2007.15 (2):第 4IlH 頁；Rolland，M.等，Reconstruction and functionof ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus typelproteins.JVirol,2007.81(16):第 8507-14]。
[0006]仍存在對(duì)于改進(jìn)的疫苗和預(yù)防與治療HPV感染、尤其是引起子宮頸癌和/或肺癌、扁桃體癌以及喉癌的感染的方法的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明的方面包括核酸分子，所述核酸分子包含編碼HPV抗原的選自由以下各項(xiàng)組成的組的核苷酸序列:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7 ;其具有90%同源性的片段；及其組合。在一些方面，所述核酸分子包括包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的核苷酸序列的核酸分子:編碼SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:8的核苷酸序列；編碼與SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8具有至少90%同源性的氨基酸片段的核苷酸序列；編碼SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6或SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的片段；以及編碼與SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6或SEQ ID N0:8具有至少90%同源性的氨基酸片段的核苷酸序列的片段。
[0009]在一些方面，存在包含本文所述的核酸分子的藥物組合物。
[0010]在其它方面，提供在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用包含本文所述的核酸分子的組合物。
[0011]本發(fā)明還包括包含本文所述的核酸分子的重組疫苗。所述重組疫苗包括重組牛痘疫苗、活減毒疫苗以及DNA質(zhì)粒。
[0012]本發(fā)明的一些方面包括包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列的蛋白質(zhì):SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 8;以及與 SEQ ID NO: 2、SEQ IDNO:4, SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8具有至少90%同源性的序列的片段。
[0013]還提供在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用本文提供的重組疫苗。
[0014]在一些方面，提供包含以下各項(xiàng)的藥物組合物:編碼HPV抗原的核苷酸序列SEQID NO:1和SEQ ID NO: 3 ;或其片段；或其具有90%同源性的片段。還存在在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV亞型6或11的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用前述藥物組合物。
[0015]在一些方面，提供包含以下各項(xiàng)的藥物組合物:編碼HPV抗原的核苷酸序列SEQID N0:5和SEQ ID NO:7 ;或其片段；或其具有90%同源性的片段。還存在在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV亞型33或58的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用前述藥物組合物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1.基于E6和E7比對(duì)的相鄰接合評(píng)估的系統(tǒng)發(fā)生樹(分別為A和B)。星號(hào)指示每個(gè)樹上的共有序列的位置。
[0017]圖2.p6E6E7和pllE6E7的體內(nèi)表達(dá)。從裂解的轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞分離基因產(chǎn)物，穿過SDS-PAGE凝膠，并使用放射自顯影術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。HPV6和HPVl 1E6/E7蛋白皆各自為大約32kDa(A)。人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞也用p6E6E7和pllE6E7轉(zhuǎn)染并且隨后在免疫熒光染色之后固定。FITC熒光確定了 p6E6E7和pllE6E7的表達(dá)(B)。DAPI熒光確定了 Hoescht染色之后的核定位。
[0018]圖3.1FN-yELISpot 測(cè)定示出 p6E6E7 (A)和 pllE6E7(B)在 C57BL/6 小鼠中誘導(dǎo)穩(wěn)固的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。使用在三次兩周一次的免疫之后從各對(duì)應(yīng)的組(每組5只小鼠)的小鼠中分離的脾細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。每次免疫包括每種構(gòu)建體20 μ g。組合組中的小鼠以每種構(gòu)建體20 μ g接受P6E6E7和pllE6E7兩者，每次免疫共計(jì)40 μ g DNA。經(jīng)由頂注射，隨
后進(jìn)行電穿孔來施用DNAO指示P〈0.0001 ; t指示P=0.0001)。
[0019]圖4.使用個(gè)別肽進(jìn)行另外的IFN-YELISpot測(cè)定以表征優(yōu)勢(shì)肽。從疫苗接種的小鼠和陰性對(duì)照中分離的脾細(xì)胞用涵蓋整個(gè)HPV6E6/E7融合蛋白(A)或HPV11E6/E7融合蛋白⑶的重疊肽刺激。
[0020]圖5.由細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色表征的抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。將從接種了 p6E6E7(A)和pllE6E7(B)的小鼠中分離的脾細(xì)胞用RlO生長培養(yǎng)基、PMA或共有基因肽刺激4小時(shí)，隨后進(jìn)行表面標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)染色。以上點(diǎn)圖示出產(chǎn)生IFN-Y、IL-2和TNF-α的總CD4+或CD8+細(xì)胞的減去了背景的百分比的差異。因?yàn)殛幮詫?duì)照組的平均值是零，所以帶有星號(hào)的點(diǎn)的P值不能被確定。
【具體實(shí)施方式】
[0021]如本文所使用的，措詞〃嚴(yán)格雜交條件〃或〃嚴(yán)格條件〃是指這樣的條件:在該條件下核酸分子將雜交另一核酸分子，但不雜交其它序列。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同情況下將是不同的。較長序列在較高溫度下特異性雜交。通常，對(duì)于在限定離子強(qiáng)度和PH下的特定序列，嚴(yán)格條件被選擇為低于熱熔點(diǎn)(Tm)約5°C。Tm是這樣的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下):在該溫度下平衡時(shí)，與靶序列互補(bǔ)的探針中的50%與靶序列雜交。由于靶序列通常過量存在，因此在Tm下平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。通常，嚴(yán)格條件是這樣的條件:其中在PH7.0至8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子，通常約0.01至
1.0M鈉離子(或其它鹽)，并且對(duì)于較短探針、引物或寡核苷酸(例如10至50個(gè)核苷酸)溫度為至少約30°C，且對(duì)于較長探針、引物或寡核苷酸溫度為至少約60°C。嚴(yán)格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。
[0022]核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST (Altschul等，Nuc.Acids Res.，1997，25，3389，其以引用的方式整體并入本文)以及PAUP*4.0blO軟件(D.L.Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)來測(cè)定?！跋嗨菩园俜直取笔褂肞AUP*4.0blO 軟件(D.L.Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)來計(jì)算。共有序列的平均相似性是相較于系統(tǒng)發(fā)生樹中的所有序列來計(jì)算。
[0023]簡(jiǎn)言之，BLAST算法(表示基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool))適用于確定序列相似性(Altschul 等，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410,其以引用的方式整體并入本文)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得(http: //www.ncb1.nlm.nih.rov/)。該算法包括首先通過鑒定在查詢序列中長度W的短字串，該字串與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對(duì)時(shí)匹配或者滿足某些正數(shù)值閾值分值T，從而來鑒定高分序列配對(duì)(HSP)。T被稱為鄰近字串分值閾值(Altschul等，同上)。這些初始鄰近字串命中作為用于起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的HSP的種子。只要累積序列比對(duì)分值可以增加，那么字串命中則在兩個(gè)方向上沿每個(gè)序 列延伸。字串命中在每個(gè)方向上的延伸當(dāng)遇到下述情況時(shí)終止:1)累積序列比對(duì)分值從其獲得的最大值下降了數(shù)量X ;2)累積分值為零或零以下，這是由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分值殘基比對(duì)的累積所致；或者3)到達(dá)任一序列的末端。Blast算法參數(shù)W、T和X決定所述比對(duì)的靈敏度和速度。Blast程序使用如下默認(rèn)值:字長(W)為11，BL0SUM62 評(píng)分矩陣(參見 Henikoff 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1992，89，10915-10919，其以引用的方式整體并入本文)比對(duì)⑶為50，期望值(E)為10，M=5，N=4，以及兩條鏈都比較。BLAST 算法(Karlin 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1993，90，5873-5787，其以引用的方式整體并入本文)和Gapped BLAST進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。BLAST算法提供的一種相似性量度是最小和概率(P(N))，它提供兩個(gè)核苷酸序列可能偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果一個(gè)核酸與另一核酸比較中的最小和概率小于約1、優(yōu)選小于約0.1、更優(yōu)選小于0.01、并且最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為該測(cè)試核酸與另一核酸相似。
[0024]如本文所使用的，術(shù)語“基因構(gòu)建體"是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列包括可操作地連接至調(diào)控元件(包括能夠在核酸分子所施用的個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào))的起始和終止信號(hào)。
[0025]如本文所使用的，術(shù)語〃可表達(dá)的形式〃是指含有可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)的編碼序列的必需調(diào)控元件的基因構(gòu)建體，以使得當(dāng)存在于個(gè)體的細(xì)胞中時(shí)，編碼序列將被表達(dá)。
[0026]公開了改進(jìn)的疫苗，所述疫苗源自用以增強(qiáng)由免疫原誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的多階段戰(zhàn)略。產(chǎn)生修飾的共有序列。還公開了基因修飾，包括密碼子優(yōu)化、RNA優(yōu)化以及高效免疫球蛋白前導(dǎo)序列添加。新的構(gòu)建體已經(jīng)被設(shè)計(jì)來引發(fā)比對(duì)應(yīng)的密碼子優(yōu)化的免疫原更強(qiáng)和更寬的細(xì)胞免疫應(yīng)答。[0027]改進(jìn)的HPV疫苗是基于蛋白質(zhì)和編碼具有使它們作為可用以誘導(dǎo)出抗-HPV的免疫原特別有效的表位的蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體。因此，疫苗可誘導(dǎo)治療或預(yù)防性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，遞送免疫原的方式是DNA疫苗、重組疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗、包含免疫原的組合物、減毒疫苗或滅活疫苗。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的組合:一種或多種DNA疫苗、一種或多種重組疫苗、一種或多種蛋白質(zhì)亞單位疫苗、一種或多種包含免疫原的組合物、一種或多種減毒疫苗以及一種或多種滅活疫苗。
[0028]根據(jù)一些實(shí)施方案，疫苗被遞送至個(gè)體以調(diào)節(jié)個(gè)體的免疫系統(tǒng)的活性并且由此增強(qiáng)針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答。當(dāng)編碼蛋白質(zhì)的核酸分子被個(gè)體細(xì)胞所攝取時(shí)，核苷酸序列在細(xì)胞中表達(dá)并且蛋白質(zhì)由此被遞送至個(gè)體。提供:在核酸分子如質(zhì)粒(作為重組疫苗的一部分和作為減毒疫苗的一部分，作為分離的蛋白質(zhì)或載體的蛋白質(zhì)部分)上遞送蛋白質(zhì)的編碼序列的方法。
[0029]提供針對(duì)HPV預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體的組合物和方法。
[0030]用于遞送包含編碼免疫原的核苷酸序列的核酸分子組合物可操作地連接至調(diào)控元件。組合物可包含:編碼免疫原的質(zhì)粒、包含編碼免疫原的核苷酸序列的重組疫苗、編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活減毒病原體、包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的滅活病原體、或包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的組合物如脂質(zhì)體或亞單位疫苗。本發(fā)明還涉及包含組合物的可注射的藥物組合物。
[0031 ] SEQ ID NO:1包含編碼HPV6E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ ID NO:1包含連接至SEQ ID NO:1的5’末端處的核苷酸序列的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID N0:9。SEQ IDN0:2包含HPV6E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID N0:2包含位于共有免疫原序列的N-末端處的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO: 10。IgE前導(dǎo)序列是SEQ ID NO: 10，并且可由 SEQ ID NO:9 編碼。
[0032]在一些實(shí)施方案 中，疫苗包含SEQ ID NO:2或編碼SEQ ID NO:2的核酸分子。
[0033]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的片段可包含786個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含830個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含856個(gè)或更多個(gè)核苷酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含865個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，SEQ IDNO:1的片段如本文所列出的那些片段可進(jìn)一步包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的片段不包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。
[0034]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO: 2的片段可包含252個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含266個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含275個(gè)或更多個(gè)氨基酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含278個(gè)或更多個(gè)氨基酸。
[0035]SEQ ID NO: 3包含編碼HPVl 1E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO: 3包含連接至SEQ ID NO: 3的5’末端處的核苷酸序列的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID N0:9oSEQID NO:4包含HPVl 1E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:4包含位于共有免疫原序列的N-末端處的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO: 10。IgE前導(dǎo)序列是SEQ ID NO: 10，并且可由SEQ ID NO:9編碼。
[0036]在一些實(shí)施方案中，疫苗包含SEQ ID N0:4或編碼SEQ ID N0:4的核酸分子。
[0037]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:3的片段可包含786個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含830個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含856個(gè)或更多個(gè)核苷酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含865個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，SEQ IDN0:3的片段如本文所列出的那些片段可進(jìn)一步包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:3的片段不包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。
[0038]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO: 4的片段可包含252個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含266個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含275個(gè)或更多個(gè)氨基酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含278個(gè)或更多個(gè)氨基酸。
[0039]SEQ ID N0:5包含編碼HPV33E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO: 5包含連接至SEQ ID NO: 5的5’末端處的核苷酸序列的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID N0:9oSEQID N0:6包含HPV33E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:6包含位于共有免疫原序列的N-末端處的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO: 10。IgE前導(dǎo)序列是SEQ ID NO: 10，并且可由SEQ ID NO:9編碼。
[0040]在一些實(shí)施方案中，疫苗包含SEQ ID NO:6或編碼SEQ ID NO:6的核酸分子。
[0041]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:5的片段可包含746個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含787個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含812個(gè)或更多個(gè)核苷酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含820個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，SEQ IDN0:5的片段如本文所列出的那些片段可進(jìn)一步包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:5的片段不包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。
[0042]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO: 6的片段可包含235個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含248個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含256個(gè)或更多個(gè)氨基酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含259個(gè)或更多個(gè)氨基酸。
[0043]SEQ ID N0:7包含編碼HPV58E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO: 7包含連接至SEQ ID NO: 7的5’末端處的核苷酸序列的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID N0:9oSEQID N0:8包含HPV58E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:8包含位于共有免疫原序列的N-末端處的IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO: 10。IgE前導(dǎo)序列是SEQ ID NO: 10，并且可由SEQ ID NO:9編碼。
[0044]在一些實(shí)施方案中，疫苗包含SEQ ID NO:8或編碼SEQ ID NO:8的核酸分子。
[0045]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:7的片段可包含752個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含794個(gè)或更多個(gè)核苷酸；在一些實(shí)施方案中，可包含819個(gè)或更多個(gè)核苷酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含827個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，SEQ IDN0:7的片段如本文所列出的那些片段可進(jìn)一步包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:7的片段不包含IgE前導(dǎo)序列的編碼序列。
[0046]在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO: 8的片段可包含235個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含249個(gè)或更多個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，可包含257個(gè)或更多個(gè)氨基酸；并且在一些實(shí)施方案中，可包含260個(gè)或更多個(gè)氨基酸。
[0047]根據(jù)一些實(shí)施方案，在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答的方法包括向所述個(gè)體施用選自由以下各項(xiàng)組成的組的共有免疫原的氨基酸序列:HPV6E6和E7、HPV11E6和E7、HPV33E6和E7、HPV58E6和E7、其功能片段、及其可表達(dá)的編碼序列。一些實(shí)施方案包括分離的核酸分子，其編碼選自由以下各項(xiàng)組成的組的共有免疫原的氨基酸序列:HPV6E6和E7、HPVl 1E6和E7、HPV33E6和E7、HPV58E6和E7、及其片段。一些實(shí)施方案包括重組疫苗，其編碼選自由以下各項(xiàng)組成的組的共有免疫原的氨基酸序列:HPV6E6和E7、HPV11E6和E7、HPV33E6和E7、HPV58E6和E7、及其片段。一些實(shí)施方案包括亞單位疫苗，其包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的共有免疫原的氨基酸序列:HPV6E6和E7、HPV11E6和E7、HPV33E6和E7、HPV58E6和E7、及其片段。一些實(shí)施方案包括活減毒疫苗和/或滅活疫苗，其包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的共有免疫原的氨基酸序列:HPV6E6和E7、HPV11E6和E7、HPV33E6和E7、以及 HPV58E6 和 E7。
[0048]一方面，本文的疫苗是引發(fā)針對(duì)主要發(fā)現(xiàn)與多種形式的頭頸部癌和其它形式的耳鼻喉科疾病有關(guān)的HPV亞型的免疫應(yīng)答的那些疫苗，尤其所述疫苗包含HPV6E6和E7以及HPVl 1E6和E7，并且優(yōu)選包含兩者。
[0049]另一方面，本文的疫苗是引發(fā)針對(duì)主要發(fā)現(xiàn)與美國之外的患者并且更具體來說亞洲的患者的多種形式的子宮頸癌有關(guān)的HPV亞型的免疫應(yīng)答的那些疫苗，尤其所述疫苗包含HPV33E6和E7以及HPV58E6和E7，并且優(yōu)選包含兩者。
[0050]改進(jìn)的疫苗包含蛋白質(zhì)和編碼具有使它們作為可用于誘導(dǎo)抗-HPV免疫應(yīng)答的免疫原特別有效的表位的蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體。因此，可提供疫苗以誘導(dǎo)治療或預(yù)防性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，遞送免疫原的方式是DNA疫苗、重組疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗、包含免疫原的組合物、減毒疫苗或滅活疫苗。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的組合:一種或多種DNA疫苗、一種或多種重組疫苗、一種或多種蛋白質(zhì)亞單位疫苗、一種或多種包含免疫原的組合物、一種或多種減毒疫苗以及一種或多種滅活疫苗。
[0051]本發(fā)明的方面提供在核酸分子如質(zhì)粒(作為重組疫苗的一部分和作為減毒疫苗的一部分，作為分離的蛋白質(zhì)或載體 的蛋白質(zhì)部分)上遞送蛋白質(zhì)的編碼序列的方法。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體的組合物和方法。
[0053]DNA 疫苗描述于美國專利號(hào) 5，593，972,5, 739，118,5, 817，637,5, 830，876、5，962，428,5, 981，505,5, 580，859,5, 703，055,5, 676，594 以及本文中引用的優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)中，其均以引用的方式并入本文。除了這些申請(qǐng)中所述的遞送方案之外，遞送DNA的替代性方法還描述于美國專利號(hào)4，945，050和5，036，006中，其都以引用的方式并入本文。
[0054]本發(fā)明涉及改進(jìn)的減毒活疫苗、改進(jìn)的滅活疫苗、和改進(jìn)的使用重組載體以遞送編碼抗原的外源基因的疫苗、以及亞單位疫苗和糖蛋白疫苗。減毒活疫苗、使用重組載體以遞送外源抗原的那些疫苗、亞單位疫苗以及糖蛋白疫苗的實(shí)例描述于美國專利號(hào):4，510，245 ;4，797，368 ;4，722，848 ;4，790，987 ;4，920，209 ;5，017，487 ;5，077，044 ；5，110，587 ;5，112，749 ;5，174，993 ;5，223，424 ;5，225，336 ;5，240，703 ;5，242，829 ；5，294，441 ;5，294，548 ;5，310，668 ;5，387，744 ;5，389，368 ;5，424，065 ;5，451，499 ；5，453，364 ;5，462，734 ;5，470，734 ;5，474，935 ;5，482，713 ;5，591，439 ;5，643，579 ；5，650，309 ;5，698，202 ;5，955，088 ;6，034，298 ;6，042，836 ;6，156，319 以及 6，589，529 中，其均以引用的方式并入本文。
[0055]當(dāng)被細(xì)胞攝取時(shí)，基因構(gòu)建體可保持存在于細(xì)胞中作為功能性染色體外分子和/或整合到細(xì)胞的染色體DNA中。DNA可引入細(xì)胞中，在細(xì)胞中其保持為呈一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒形式的單獨(dú)的遺傳材料。或者，可整合到染色體中的線性DNA可引入到細(xì)胞中。當(dāng)將DNA引入細(xì)胞中時(shí)，可以添加促進(jìn)DNA整合到染色體中的試劑。適用于促進(jìn)整合的DNA序列還可包括在DNA分子中。或者，可對(duì)細(xì)胞施用RNA。還涵蓋提供呈線性微型染色體形式的基因構(gòu)建體，包括著絲粒、端粒以及復(fù)制起點(diǎn)。基因構(gòu)建體可在減毒活微生物或在細(xì)胞中存活的重組微生物載體中保持為遺傳材料的一部分?；驑?gòu)建體可以是重組病毒疫苗的基因組的一部分，其中遺傳材料整合到細(xì)胞的染色體中或保持在染色體外。基因構(gòu)建體包括核酸分子的基因表達(dá)所必需的調(diào)控元件。元件包括:啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子以及聚腺苷酸化信號(hào)。另外，通常需要增強(qiáng)子用于編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的基因表達(dá)。這些元件需要可操作地連接至編碼所需蛋白質(zhì)的序列，并且調(diào)控元件需要在其所施用的個(gè)體中是可操作的。
[0056]起始密碼子和終止密碼子通常被認(rèn)為是編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列的一部分。然而，這些元件需要在基因構(gòu)建體所施用的個(gè)體中有功能。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列同框。
[0057]所使用的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)必須在個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)有功能。
[0058]適用于實(shí)施本發(fā)明，尤其在制造人用基因疫苗中實(shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于:來自猿猴病毒40 (SV40)的啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人類免疫缺陷病毒(MV)如BIV長末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子、莫洛尼氏病毒、ALV、巨細(xì)胞病毒(CMV)如CMV即刻早期啟動(dòng)子、EB病毒(EBV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)以及來自人基因如人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白的啟動(dòng)子。
[0059]適用于實(shí)施本發(fā)明，尤其在制造人用基因疫苗中實(shí)施本發(fā)明的的聚腺苷酸化信號(hào)的實(shí)例包括但不限于:SV40聚腺苷酸化信號(hào)和LTR聚腺苷酸化信號(hào)。具體地說，使用在PCEP4質(zhì)粒(Invitrogen’San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸化信號(hào)，其稱為SV40聚腺苷酸
化信號(hào)。
[0060]除了 DNA表達(dá)所需要的調(diào)控元件之外，其它元件也可包含在DNA分子中。這類另外的元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可選自下組，所述組包括但不限于:人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和病 毒增強(qiáng)子，如來自CMV、RSV和EBV的那些增強(qiáng)子。
[0061]可提供具有哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)的基因構(gòu)建體以便將構(gòu)建體維持在染色體外并且在細(xì)胞中產(chǎn)生構(gòu)建體的多個(gè)拷貝。來自Invitrogen(San Diego, CA)的質(zhì)粒pVAXl、pCEP4和pREP4含有EB病毒復(fù)制起點(diǎn)和核抗原EBNA-1編碼區(qū)，該編碼區(qū)產(chǎn)生高拷貝的附加型復(fù)制而沒有整合。
[0062]在涉及免疫應(yīng)用的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，遞送核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，并且另外包含進(jìn)一步增強(qiáng)針對(duì)這類靶蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的基因。這類基因的實(shí)例是:編碼其它細(xì)胞因子和淋巴因子的那些基因，如α-干擾素、Y-干擾素、血小板源生長因子(H)GF)、TNFa、TNF^、GM-CSF、上皮生長因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86 和 IL-15 (包括信號(hào)序列缺失并且任選地包含來自IgE的信號(hào)肽的IL-15)。可能有用的其它基因包括編碼下列的那些基因:MCP-l、MIP-la、MIP_lp、IL_8、RANTES、L_選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-UMac-1、ρ150.95、PECAM、ICAM-1、I CAM-2,1 CAM-3,CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL_4、IL-18 的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-U DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶 ICE、Fos、c_jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、 MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK,干擾素應(yīng)答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
[0063]可添加另外的元件，如果出于任何原因希望消除接受基因構(gòu)建體的細(xì)胞，則所述元件充當(dāng)用于細(xì)胞破壞的靶?？杀磉_(dá)形式的皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因可包含在基因構(gòu)建體中。藥物更昔洛韋可施用至個(gè)體并且所述藥物將引起任何產(chǎn)生tk的細(xì)胞的選擇性殺死，由此提供選擇性破壞具有基因構(gòu)建體的細(xì)胞的方式。
[0064]為了最大化蛋白質(zhì)制備，可選擇調(diào)控序列，所述調(diào)控序列非常適用于構(gòu)建體所施用的細(xì)胞中的基因表達(dá)。而且，可選擇在細(xì)胞中最高效地轉(zhuǎn)錄的密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備在細(xì)胞中具有功能的DNA構(gòu)建體。
[0065]在一些實(shí)施方案中，可提供基因構(gòu)建體，其中本文所述的蛋白質(zhì)的編碼序列連接至IgE信號(hào)肽。在一些實(shí)施方案中，本文所述的蛋白質(zhì)連接至IgE信號(hào)肽。
[0066]在使用蛋白質(zhì)的一些實(shí)施方案中，例如使用熟知的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用熟知的技術(shù)來制備和分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在使用蛋白質(zhì)的一些實(shí)施方案中，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用熟知的技術(shù)來將編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA分子插入在熟知表達(dá)系統(tǒng)中使用的市售表達(dá)載體中。例如，市售質(zhì)粒pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)可用于在大腸桿菌中制造蛋白質(zhì)。市售質(zhì)粒pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)可例如用于在酵母的釀酒酵母菌株中的制備。市售MAXBAC?完整桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen, San Diego, Calif.)可例如用于在昆蟲細(xì)胞中的制備。市售質(zhì)粒pcDNA I或pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)可例如用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用這些商業(yè)表達(dá)載體和系統(tǒng)或其它載體和系統(tǒng)來通過常規(guī)技術(shù)和可容易獲得的起始材料制備蛋白質(zhì)。(例如參見Sambrook等，Molecular Cloninga Laboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor Press (1989),其以引用的方式并入本文)。因此，所需蛋白質(zhì)可在原核和真核系統(tǒng)中制備，從而產(chǎn)生一系列加工形式的蛋白質(zhì)。
[0067]本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用其它市售表達(dá)載體和系統(tǒng)或使用熟知方法和可容易獲得的起始材料來制備載體。含有需要的控制序列(如啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)、并且優(yōu)選增強(qiáng)子)的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于多種宿主來說是容易獲得的和本領(lǐng)域已知的。例如參見SambiOOk等，Molecular Cloning a Laboratory Manual,第二版 Cold Spring Harbor Press (1989)?；驑?gòu)建體包括可操作地連接至啟動(dòng)子的蛋白質(zhì)編碼序列，所述啟動(dòng)子在構(gòu)建體所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中具有功能。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括來自巨細(xì)胞病毒或SV40的啟動(dòng)子?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子的實(shí)例包括小鼠乳腺白血病病毒或金屬硫蛋白啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可由可容易獲得的起始材料容易地制備適用于使用編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因構(gòu)建體。使用包含編碼蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化相容性宿主，然后培養(yǎng)所述宿主并保持在其中發(fā)生外源DNA表達(dá)的條件下。
[0068]制備的蛋白質(zhì)通過使細(xì)胞裂解來從培養(yǎng)物中回收或者從對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說適當(dāng)和已知的培養(yǎng)基中回收。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用熟知技術(shù)分離使用這類表達(dá)系統(tǒng)制備的蛋白質(zhì)。使用如上所述特異性結(jié)合特定的蛋白質(zhì)的抗體從天然來源純化蛋白質(zhì)的方法可同樣應(yīng)用于通過重組DNA方法制備的蛋白質(zhì)的純化。 [0069]除了通過重組技術(shù)來制備蛋白質(zhì)，還可以使用自動(dòng)肽合成器來制備分離的基本上純的蛋白質(zhì)。這類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且適用于具有DNA-編碼的蛋白質(zhì)制備中未提供的取代的衍生物。
[0070]核酸分子可使用若干種熟知的技術(shù)中的任一種來遞送，所述技術(shù)包括DNA注射(也稱為DNA疫苗接種)、重組載體,如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組牛痘。
[0071]施用途徑包括但不限于肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、眼內(nèi)和口服以及局部、透皮、通過吸入或栓劑施用、或?qū)φ衬そM織施用，如通過灌洗陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組織施用。優(yōu)選的施用途徑包括肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)和皮下注射?；驑?gòu)建體可通過這樣的方式來施用，所述方式包括但不限于電穿孔方法和裝置、傳統(tǒng)注射器、無針注射裝置或〃微彈轟擊基因槍法〃。
[0072]優(yōu)選用于促進(jìn)DNA疫苗的遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法的實(shí)例包括下列專利中描述者:美國專利號(hào)7，245，963 (Draghia-Akli等)、美國專利公布2005/0052630 (由Smith等遞交)，其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。還優(yōu)選的是，于共同待決和共同擁有的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)11/874072中提供的用于促進(jìn)DNA疫苗的遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法，所述美國專利申請(qǐng)?zhí)峤挥?007年10月17日，并且在35USC119(e)下要求下列申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán):2006年10月17日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/852，149和2007年10月10日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/978，982，其均以引用的方式整體并入本文。
[0073]以下是使用電穿孔技術(shù)的實(shí)施方案的實(shí)例，并且在上述專利參考文獻(xiàn)中更詳細(xì)地討論:電穿孔裝置可被配置為遞送產(chǎn)生類似于用戶輸入的預(yù)設(shè)電流的恒定電流的能量脈沖至哺乳動(dòng)物的期望組織。電穿孔裝置包括電穿孔部件和電極組件或手柄組件。電穿孔部件可包括且并有電穿孔裝置的多種元件中的一種或多種，包括:控制器、電流波形產(chǎn)生器、阻抗試驗(yàn)器、波形記錄儀、輸入元件、狀態(tài)報(bào)告元件、通信端口、記憶部件、電源和電源開關(guān)。電穿孔部件可充當(dāng)電穿孔裝置的一個(gè)元件，并且其它元件是與所述電穿孔部件通信的單獨(dú)元件(或部件)。在一些實(shí)施方案中，電穿孔部件可充當(dāng)電穿孔裝置的多于一個(gè)元件，其可與電穿孔裝置的獨(dú)立于所述電穿孔部件的其它元件通信。使用電穿孔技術(shù)遞送改進(jìn)的HPV疫苗不受到現(xiàn)存作為一個(gè)機(jī)電或機(jī)械裝置的部分的電穿孔裝置的元件的限制，因?yàn)樗鲈沙洚?dāng)與彼此通信的一個(gè)裝置或單獨(dú)元件。電穿孔部件能夠遞送在期望組織中產(chǎn)生恒定電流的能量脈沖，并且包括反饋機(jī)制。電極組件包括在空間布置中具有多個(gè)電極的電極陣列，其中電極組件從電穿孔部件接收能量脈沖，并且通過電極將所述能量脈沖遞送至期望組織。多個(gè)電極中的至少一個(gè)在能量脈沖的過程中是中性的，并且測(cè)量期望組織中的電阻和將電阻通知電穿孔部件。反饋機(jī)制可接收所測(cè)量到的電阻，并且可調(diào)整由電穿孔部件遞送的能量脈沖以保持恒定電流。
[0074]在一些實(shí)施方案中，多個(gè)電極可以分散型式來遞送能量脈沖。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)電極可以分散型式通過控制電極在編程序列下遞送能量脈沖，并且編程序列由用戶輸入至電穿孔部件。在一些實(shí)施方案中，編程序列包含依序遞送的多個(gè)脈沖，其中多個(gè)脈沖中的各脈沖通過至少兩個(gè)有效電極(其中有一個(gè)中性電極測(cè)量電阻)來遞送，并且其中多個(gè)脈沖的后續(xù)脈沖通過至少兩個(gè)有效電極(其中有一個(gè)中性電極測(cè)量電阻)中的不同的那個(gè)來遞送。
[0075]在一些實(shí)施方案中， 反饋機(jī)制通過硬件或軟件來執(zhí)行。優(yōu)選地，反饋機(jī)制通過模擬閉環(huán)電路來執(zhí)行。優(yōu)選地，該反饋每隔50 μ s、20 μ S、10 μ s或I μ s發(fā)生，但優(yōu)選是實(shí)時(shí)反饋或瞬時(shí)的(即，如通過用于測(cè)定應(yīng)答時(shí)間的可用技術(shù)所測(cè)定，其基本上是瞬時(shí)的)。在一些實(shí)施方案中，中性電極測(cè)量期望組織中的電阻并將電阻通知反饋機(jī)制，并且反饋機(jī)制回應(yīng)于電阻并調(diào)整能量脈沖以使恒定電流維持在類似于預(yù)設(shè)電流的數(shù)值下。在一些實(shí)施方案中，反饋機(jī)制在能量脈沖遞送的過程中連續(xù)和瞬時(shí)地維持恒定電流。
[0076]在一些實(shí)施方案中，核酸分子是結(jié)合多核苷酸功能增強(qiáng)子或基因疫苗促進(jìn)劑的施用而遞送至細(xì)胞。多核苷酸功能增強(qiáng)子描述于美國序列號(hào)5，593，972,5, 962，428和1994年I月26日提交的國際申請(qǐng)序列號(hào)PCT/US94/00899，其均以引用的方式并入本文。基因疫苗促進(jìn)劑描述于1994年4月I日提交的美國序列號(hào)021，579中，其以引用的方式并入本文。結(jié)合核酸分子施用的輔劑可作為與核酸分子的混合物來施用，或者在核酸分子施用的同時(shí)、之前或之后單獨(dú)施用。另外，可用作轉(zhuǎn)染劑和/或復(fù)制劑和/或炎癥劑并且可與GVF共同施用的其它藥劑包括:生長因子、細(xì)胞因子和淋巴因子，如a-干擾素、Y -干擾素、GM-CSF、血小板源生長因子(PDGF)、TNF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纖維細(xì)胞生長因子、表面活性劑如免疫刺激性復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰基脂質(zhì)A(WL))、胞壁肽、醌類似物和囊泡如三十碳六烯和角鯊烯，并且透明質(zhì)酸也可與基因構(gòu)建體結(jié)合而使用施用。在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可用作GVF。在一些實(shí)施方案中，聯(lián)合提供核酸分子與PLG以增強(qiáng)遞送/攝取。
[0077]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約I納克至約2000微克DNA。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約1000微克DNA。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物含有約10納克至約800微克DNA。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物含有約0.1至約500微克DNA。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物含有約I至約350微克DNA。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物含有約25至約250微克DNA。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物含有約100至約200微克DNA。
[0078]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)所使用的施用方式來進(jìn)行配制。在藥物組合物是可注射的藥物組合物的情況下，它們是無菌、無熱原質(zhì)和無顆粒的。優(yōu)選使用等滲制劑。通常，用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情況下，等滲溶液如磷酸鹽緩沖鹽水是優(yōu)選的。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實(shí)施方案中，將血管收縮劑添加至制劑中。
[0079]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。疫苗可以是基于蛋白質(zhì)的、活減毒疫苗、細(xì)胞疫苗、重組疫苗或核酸或DNA疫苗。在一些實(shí)施方案中,在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答的方法(包括誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答的方法)包括向個(gè)體施用下列中的一種或多種=CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段、或其可表達(dá)的編碼序列，與編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的分離的核酸分子、和/或編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的重組疫苗、和/或包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的亞單位疫苗、和/或活減毒疫苗和/或滅活疫苗的組合。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段中的一種或多種可在下列物質(zhì)施用之前、同時(shí)或之后施用:編碼免疫原的分離的核酸分子、和/或編碼免疫原的重組疫苗、和/或包含免疫原的亞單位疫苗、和/或活減毒疫苗和/或滅活疫苗。在一些實(shí)施方案中，向個(gè)體施用編碼選自由以下各項(xiàng)組成的組的一種或多種蛋白質(zhì)的分離的核酸分子:CTACK、TECK、MEC及其功能片段。
[0080] 在下列實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明。應(yīng)理解，此實(shí)施例盡管指出了本發(fā)明的實(shí)施方案，但是其僅以說明的方式給出。根據(jù)上述討論和此實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特性，并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，除了本文中示出和描述的修改之外，根據(jù)先前的描述，本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這類修改也意在屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0081]本公開通篇中引用的美國專利、美國申請(qǐng)和引用文獻(xiàn)各自均以引用的方式整體并入本文。
[0082]實(shí)施例
[0083]本發(fā)明在下列實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步限定。應(yīng)理解，這些實(shí)施例盡管指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是其僅以說明的方式給出。根據(jù)上述討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特性，并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改，以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，除了本文中示出和描述的那些修改之外，根據(jù)先前的描述，本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這類修改也意在屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。 [0084]實(shí)施例1
[0085]HPV6和HPVl 1E6/E7疫苗設(shè)計(jì)和表達(dá)
[0086]HPV6和11E6/E7共有序列基融合免疫原的構(gòu)建
[0087]從基因庫收集6或11型HPV E6和E7基因序列，并且在進(jìn)行多重比對(duì)之后獲得共有E6和E7核苷酸序列。HPV6E6或E7蛋白質(zhì)的共有序列分別從98或20個(gè)序列產(chǎn)生，而HPV11E6或E7蛋白質(zhì)的共有序列分別從76或13個(gè)序列產(chǎn)生。在系統(tǒng)發(fā)生研究中應(yīng)用的多重比對(duì)程序包括Clustal X(版本2.0)的應(yīng)用。如圖1A和圖1B所示，在其E6和E7蛋白質(zhì)屬于相同類型的HPV病毒株中存在約0-2%的序列分歧。然而，在HPV6和11之間，E6蛋白質(zhì)中的基因距尚聞達(dá)19.3%,而E7蛋白質(zhì)中的基因距尚聞達(dá)16.3%ο基于這些來自系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果，我們開發(fā)出兩種類型特異性的E6/E7共有DNA疫苗。
[0088]在產(chǎn)生共有E6/E7融合序列之后進(jìn)行若干修飾(圖1C)。將高效的前導(dǎo)序列同框融合在起始密碼子上游以促進(jìn)表達(dá)。還如先前所述進(jìn)行密碼子和RNA優(yōu)化(J.Yan等,Cellular immunity induced by a novel HPV18DNA vaccine encoding an E6/E7fusion consensus protein in mice and rhesus macaques, Vaccine.26(2008)5210-5215 ;和 J.Yan 等，Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of anovel HPV-16DNA vaccine encoding an E6/E7fusion antigen, Vaccine.27(2009)431-440)。內(nèi)切蛋白水解裂解位點(diǎn)引入在E6和E7蛋白質(zhì)之間以用于恰當(dāng)?shù)鞍渍郫B和更好的CTL加工。合成的工程化6E6E7基因和11E6E7基因的長度均為840bp。將序列驗(yàn)證的合成基因分別亞克隆至pVAX表達(dá)載體的BamHI和XhoI位點(diǎn)用于進(jìn)一步研究。通過翻譯共有核苷酸序列獲得共有氨基酸序列。
[0089]在獲得HPV6和11共有E6和E7序列之后，如先前所述進(jìn)行密碼子優(yōu)化和RNA優(yōu)化(J.Yan等，Vaccine.26(2008)5210-5215 ;和了.Yan等，Induction, Vaccine.27(2009)431-440)。合成編碼6或11型HPV共有E6/E7融合蛋白(6E6E7或11E6E7)的融合基因并進(jìn)行序列驗(yàn)證。合成的6E6E7或11E6E7用BamHI和XhoI消化,克隆至表達(dá)載體pVAX (Invitrogen)中受巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子控制，并且將這些構(gòu)建體稱為P6E6E7或pllE6E7。
[0090]293-T細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，并且使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche AppliedScience, Indianapolis, IN)用 pVAX、p6E6E7 或 pllE6E7 轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之后兩天，使用改良的RIP A細(xì)胞裂解緩沖液使細(xì)胞裂解并且收集細(xì)胞裂解物。使用抗-HA單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)并且使用ECLTM蛋白質(zhì)印跡分析系統(tǒng)(Amersham, Piscataway, NJ)使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗_小鼠IgG(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)進(jìn)行觀測(cè)。
[0091]使用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD細(xì)胞)進(jìn)行間接免疫熒光測(cè)定以驗(yàn)證P6E6E7和pllE6E7的表達(dá)。在室玻片中培養(yǎng)的RD細(xì)胞使用Turbofectin8.0 (Origene, Rockville，MD)用pVAX、p6E6E7或pllE6E7轉(zhuǎn)染。然后，細(xì)胞用PFA固定并用0.l%Triton_X的PBS溶液進(jìn)行滲透。用一級(jí)抗體和二級(jí)抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1-2小時(shí)的孵育，另外在孵育之間用補(bǔ)充有甘氨酸和BSA的PBS洗滌。所使用的一級(jí)抗體和二級(jí)抗體分別是單克隆小鼠抗-HA (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)和 FITC-偶聯(lián)的抗小鼠 IgG (Abeam, Cambridge, MA)。還進(jìn)行Hoechst染色以鑒定細(xì)胞核并定位RD細(xì)胞。在完成全部孵育之后，將細(xì)胞置于裝有 Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL)的載玻片上。樣品用共聚焦顯微鏡(CDB Microscopy Core, University of Pennsylvania Cell and DevelopmentalBiology, Philadelphia, PA)觀察并成像。
[0092]實(shí)施例2
[0093]小鼠和處理組疫苗接種
[0094]在此實(shí)驗(yàn)中使用6至8周齡之間的C57BL/6雌性小鼠。小鼠是從杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor, ME)獲得。小鼠由賓夕法尼亞大學(xué)(Philadelphia, PA)的UniversityLaboratory Animal Resources在遵守國立衛(wèi)生研究院和賓夕法尼亞大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACTC)的政策下圈養(yǎng)和維持。將用于這些實(shí)驗(yàn)的小鼠分成四組用于免疫。小鼠用p6E6E7、pllE6E7或這兩種構(gòu)建體進(jìn)行免疫并且pVAX組用作陰性對(duì)照。
[0095]DNA疫苗接種和電穿孔
[0096]每個(gè)小鼠以14天的間隔接受三個(gè)劑量的20yg各DNA質(zhì)粒。接受p6E6E7和pllE6E7兩者的組中的小鼠接受20 μ g的兩種質(zhì)粒，每次疫苗接種共計(jì)40 μ g DNA。DNA構(gòu)建體經(jīng)由肌內(nèi)注射右四頭肌來施用，隨后通過CELLECTRA?電穿孔儀(InovioPharmaceuticals, Blue Bell, PA)產(chǎn)生方波脈沖。電穿孔儀被配置用來在0.2Amps下以52ms/脈沖、間隔I秒延遲遞送兩個(gè)電脈沖。如先前所述進(jìn)行電穿孔程序[12、13]。
[0097]IFN-YELISpot 測(cè)定
[0098]處理組和對(duì)照組的小鼠都在第三次免疫I周后處死。從每個(gè)小鼠收集脾臟并將其轉(zhuǎn)移至具有10%FBS和抗生素的RPM1-1640培養(yǎng)基(RlO)中。使用均質(zhì)袋(stomacher)(Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY)將脾臟粉碎并隨后轉(zhuǎn)移通過細(xì)胞濾網(wǎng)并懸浮在ACK裂解緩沖液中。在去除紅細(xì)胞之后，分離脾細(xì)胞并懸浮于RlO培養(yǎng)基中。高蛋白IP96 孔 Multiscreen? 板(Mi I lipore, Bedford, MA)用單克隆小鼠 IFN- Y 捕捉抗體(R&DSystems, Minneapolis, MN)預(yù)涂覆并在4?下孵育過夜。在用IX PBS洗漆三次之后,在環(huán)境溫度下將板用1%BSA和5%蔗糖的IXPBS溶液阻斷2小時(shí)。對(duì)RlO培養(yǎng)基中的分離的脾細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并且以每孔2 X 105個(gè)細(xì)胞一式三份地添加至孔中。涵蓋HPV6和HPVll的共有E6/E7序列的兩組肽在DMSO (G enScript USA, Piscataway, NJ)中復(fù)原。所述肽包含15個(gè)氨基酸的序列，其中8個(gè)殘基與每個(gè)連續(xù)肽重疊。將HPV6和HPVll肽以在DMSO中2 μ g/mL的濃度各自分成兩個(gè)池一一個(gè)池是E6且另一個(gè)池是E7。保留用于陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的孔分別接收刀豆素A(Concavalin A) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)和RlO培養(yǎng)基代替妝。隨后將板放置在5%C02氛圍孵育器中。在37°C下孵育24小時(shí)之后，用IXPBS洗滌孔。將生物素化的抗小鼠IFN-Y檢測(cè)抗體(R&D Systems, Minneapolis, MN)添加至每個(gè)孔中并且接著在4°C下孵育過夜。隨后洗滌板并按照R&D Systems提供的顯色方案使用抗生蛋白鏈菌素-AP 和 BCIP/NBT Plus (R&D Systems, Minneapolis, MN)進(jìn)行處理。將孔風(fēng)干過夜，并
且通過裝有ImmunoSpot?3和ImmunoSpot?4軟件的ELISpot板讀取系統(tǒng)(Cellular
Technology Ltd.，Shaker Heights, OH)對(duì)孔內(nèi)的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描并計(jì)數(shù)。使用算法轉(zhuǎn)換所報(bào)告的斑點(diǎn)形成細(xì)胞計(jì)數(shù)以表示每IX 106個(gè)脾細(xì)胞的斑點(diǎn)形成單位。
[0099]考慮到IFN- Y ELISpot測(cè)定的靈敏度和說明T細(xì)胞活性的能力，使用它們來測(cè)定響應(yīng)于HPV6或11E6和E7肽刺激的抗原特異性IFN- Y分泌細(xì)胞的數(shù)目。
[0100]如圖3A和圖3B所示，接種P6E6E7的小鼠的SFU/106脾細(xì)胞的平均數(shù)是1442.8，而接種P11E6E7的小鼠的SFU/106的平均數(shù)是2845，這都顯著大于陰性對(duì)照組。因此，p6E6E7和pllE6E7都對(duì)在小鼠中引發(fā)穩(wěn)固的類型特異性E6和E7特異性免疫應(yīng)答有效。
[0101]有趣的是，接種P6E6E7或P11E6E7也誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答。在pllE6E7免疫的小鼠中針對(duì)HPV6E6/E7肽的SFU/106個(gè)脾細(xì)胞的加和頻率是552.8SFU/106個(gè)脾細(xì)胞，而P6E6E7免疫的小鼠中的HPV11E6/E7特異性免疫應(yīng)答是888.3SFU/106個(gè)脾細(xì)胞。HPV6或11的E6蛋白共享約80%的同一性，而HPV6或11的E7蛋白共享約84%的同一性。在HPV6或11E6和E7抗原之間可能存在一些共享的免疫表位。從IFN-YELISpot測(cè)定中觀察到的交叉反應(yīng)性表明在HPV6和11E6和E7抗原之間存在共享的免疫表位。
[0102]也使來自接受p6E6E7和pllE6E7兩者的小鼠(組合組)的脾細(xì)胞經(jīng)受以上ELISpot測(cè)定，以便檢驗(yàn)當(dāng)一起接種這兩種構(gòu)建體時(shí)是否存在任何免疫干擾(圖3A和圖3B)。組合組針對(duì)HPV6E6和E7肽展現(xiàn)出平均1670SFU/106個(gè)脾細(xì)胞(σ =55.7，ρ〈0.001)。同一組的脾細(xì)胞針對(duì)HPV11E6和Ε7肽產(chǎn)生2010SFU/106個(gè)脾細(xì)胞(σ =247.8，ρ=0.002)。數(shù)據(jù)表明并行接種所述兩種構(gòu)建體可針對(duì)HPV6和HPVll引發(fā)統(tǒng)計(jì)上顯著的Ε6和Ε7特異性細(xì)胞應(yīng)答，并且這些應(yīng)答互不干擾。
[0103]表位作圖
[0104]進(jìn)行表位作圖研究以確定肽池內(nèi)的優(yōu)勢(shì)表位，以便確定Ε6/Ε7共有抗原內(nèi)的免疫優(yōu)勢(shì)肽(圖4Α和圖4Β)。所述研究與先前提及的IFN- Y ELISpot測(cè)定類似進(jìn)行。使用個(gè)別的肽而非池來刺激脾細(xì)胞。
[0105]用于此單肽分析中的每個(gè)肽代表HPV6或HPVll的Ε6和Ε7抗原的部分重疊的片段。作圖數(shù)據(jù)表明肽7(TAEIYSYAYKQLKVL)SEQ ID NO: 11是HPV6E6和E7免疫原的優(yōu)勢(shì)表位(圖4A)。TAEIYSYAYKQLKVL SEQ ID NO: 11包含8、9、IOner氨基酸表位，所述表位經(jīng)NIH BIMAS提供的HLA-結(jié)合預(yù)測(cè)軟件驗(yàn)證是H2-Kb限制型表位。為了進(jìn)一步描述HPVl 1E6和E7特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖4B)。還用HPVl 1E6和E7的重疊片段進(jìn)行了肽分析。肽作圖顯示HPV11E6和E7抗原的優(yōu)勢(shì)表位是肽7(TAEIYAYAYKNLKVV)SEQ ID NO: 12和27 (HCYEQLEDSSEDEVD) SEQ ID NO: 13。與 HPV6 表位作圖測(cè)定中的肽 7 —樣，BIMAS HLA-結(jié)合預(yù)測(cè)軟件確定TAEIYAYA YKNLKVV SEQ ID NO: 12是H2_Kb限制型表位。另一個(gè)HLA-結(jié)合肽數(shù)據(jù)庫，由NIH NIAID提供的免疫表位數(shù)據(jù)庫和分析資源(Immune Epitope Databaseand Analysis Resource)確定 HCYEQLEDSSEDEVD SEQ ID NO: 13 是 H2_Kb 限制型表位。通過此表位作圖研究鑒定了三種免疫亞優(yōu)勢(shì)肽:第6號(hào)(FCKNALTTAEIYSYA) SEQ ID NO: 14、第9 號(hào)(LFRGGYPYAACACCL) SEQ ID NO: 15 以及第 13 號(hào)(YAGYATTVEEETKQD) SEQ ID NO: 16。
[0106]細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色
[0107]根據(jù)IFN-YELISpot測(cè)定所描繪的高免疫應(yīng)答，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定以提供對(duì)P6E6E7和pllE6E7所誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的更全面的概觀。自疫苗接種小鼠組和未處理小鼠組分離脾細(xì)胞并在37°C下5%C02環(huán)境中用涵蓋HPV6和HPVll的E6和E7區(qū)域的肽刺激4小時(shí)。通過將細(xì)胞分別放置在佛波醇12-肉豆蘧酸酯13-乙酸酯(PMA)和RlO細(xì)胞培養(yǎng)基中在測(cè)定中使用陽性和陰性對(duì)照。在孵育之后，細(xì)胞首先用ViViD染料(Invitrogen, Carlsbad, CA)染色以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞,接著所有的細(xì)胞用下列表面標(biāo)記抗體染色:APC-Cy7倉鼠抗小鼠CD3e、PerCP_Cy5.5大鼠抗小鼠CD4和APC大鼠抗小鼠 CD8a(BD Biosciences, San Diego, CA)。細(xì)胞隨后使用 Cytofix/Cytoperm 試劑盒(BDBiosciences, San Diego, CA)固定。在按照制造商方案固定之后，細(xì)胞用下列細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記抗體染色:AlexaFluor700大鼠抗小鼠IFN- y >PE-Cy7大鼠抗小鼠TNF克隆和PE大鼠抗小鼠IL-2(BD Biosciences, San Diego, CA)。染色之后，細(xì)胞用含2%多聚甲醛的PBS溶液固定。制備的細(xì)胞使用裝有BD FACSDiva軟件的LSR II流式細(xì)胞儀(BD Biosciences, SanJose, CA)來獲取。所獲取的數(shù)據(jù)使用最新版本的FlowJo軟件(Tree Star, Ashland, OR)進(jìn)行分析。使用下列門序列來分離CD4+和CD8+事件:來自FSC-A對(duì)FSC-H的單線態(tài)、來自FSC-A對(duì)SSC-A的所有脾細(xì)胞、來自ViViD染料(Pacific Blue)對(duì)SSC-A的活細(xì)胞、來自CD3(APC-Cy7)對(duì) SSC-A 的 CD3+細(xì)胞以及來自 CD4 (PerCP_Cy5.5:陽性-CD4+，陰性-CD8+)對(duì)SSC-A的CD4+或CD8+。后兩個(gè)群體分別針對(duì)Alexa Fluor700、PE_Cy7和PE進(jìn)行門控以觀察IL-2、IFN-Y和TNF-α產(chǎn)生的變化。
[0108]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行門控以使得細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色數(shù)據(jù)可通過⑶4+和⑶8+細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行區(qū)分。當(dāng)用HPV6E6和Ε7特異性肽刺激時(shí)，接種ρ6Ε6Ε7的小鼠分別展現(xiàn)出0.163% ( σ =0.09) ,0.003% ( σ =0.07)和 0.188%( σ =0.20)的產(chǎn)生 IFN-Y、TNF-α 和IL-2的總CD4+細(xì)胞的平均值(圖5Α)。同一組的小鼠分別具有3.323% ( σ =1.39)、0.838% ( σ =0.32)和 1.172% ( σ =1.81)的產(chǎn)生 IFN- y、TNF- α 和 IL-2 的總 CD8+ 細(xì)胞的平均值。在用HPV11E6和Ε7抗原孵育之后使用接種pllE6E7的小鼠的脾細(xì)胞收集相同的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子數(shù)據(jù)(圖5Β)。在Ρ11Ε6Ε7接種小鼠的所有CD4+細(xì)胞當(dāng)中，平均為
0.051%(σ =0.04)產(chǎn)生 IFN-Y、0.068%(σ =0.09)產(chǎn)生 TNF-α，并且 0.026%( σ =0.037)產(chǎn)生IL-2。另外，在pllE6E7接種小鼠的所有CD8+細(xì)胞當(dāng)中，產(chǎn)生IFN-Y、TNF-a和IL-2的平均值分別為 4.52% ( σ =2.53)、2.08% (σ =1.56)和 0.21%( σ =0.22)。除了少數(shù)組之外，處理組與它們相應(yīng)未處理組相比，產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的百分比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，置信水平為89%或更高。觀察了 CD4+細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的量值的比較，可得到結(jié)論:由ρ6Ε6Ε7和P11Ε6Ε7弓丨發(fā)的免疫應(yīng)答高度趨向于驅(qū)動(dòng)CD8+淋巴細(xì)胞，所述免疫應(yīng)答在所有模型中與它們的細(xì)胞清除率相關(guān)聯(lián)。
[0109]統(tǒng)計(jì)分析
[0110]進(jìn)行學(xué)生t檢驗(yàn)以分析此研究中所產(chǎn)生的所有定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。除非另外指出，否則P值被計(jì)算來確定不同置信水平下的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。[0111]此研究已顯示出有力的證據(jù)證明DNA疫苗能夠?qū)崿F(xiàn)在使用其它流行且傳統(tǒng)的疫苗平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的免疫原性水平。在其它類似的E6和E7特異性HPV DNA疫苗研究中測(cè)量的高水平的細(xì)胞應(yīng)答與表明預(yù)防性和治療性抗瘤功效的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。大多數(shù)HPV相關(guān)性研究和疾病挑戰(zhàn)模型聚焦于子宮頸癌?？紤]到HPV6和HPVll不像其它HPV血清型那樣與子宮頸癌相關(guān)，P6E6E7和pllE6E7的治療功效不能完全使用常規(guī)HPV疾病挑戰(zhàn)模型來評(píng)估?？深A(yù)見在可獲得適當(dāng)?shù)募膊√魬?zhàn)模型時(shí)確定P6E6E7和pllE6E7的保護(hù)和治療潛力。因此，人們只能夠通過觀察由ELISpot測(cè)定和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色定量的IFN-Y和細(xì)胞因子產(chǎn)生的高水平來推斷P6E6E7和pllE6E7的免疫原性功效。然而，發(fā)現(xiàn)這類水平的量值明顯較高并且顯示出兩種構(gòu)建體將引發(fā)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答的前景。由于HPV相關(guān)性惡性腫瘤通常繼發(fā)于多種血清型的并發(fā)感染，所以急需進(jìn)一步研究組合靶向不同病毒血清型的疫苗的可行性。保證研究T細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和疫苗競(jìng)爭(zhēng)的未來研究進(jìn)一步表征兩種質(zhì)粒的并行疫苗接種的效果。
[0112] 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色顯示接種p6E6E7和pllE6E7能夠引發(fā)顯著百分比的產(chǎn)生IFN- Y , TNF- α和IL_2的T細(xì)胞。鑒于IFN-Y當(dāng)前已知的在免疫系統(tǒng)中的功能，在歷史上IFN-Y已被用作細(xì)胞免疫應(yīng)答的指標(biāo)。這些重要作用中的一些包括調(diào)節(jié)和刺激先天性和適應(yīng)性免疫的能力。此外，廣泛公認(rèn)原則上IFN-Y的產(chǎn)生者是T細(xì)胞，使得IFN-Y產(chǎn)生成為測(cè)量給定疫苗抗原暴露后的細(xì)胞免疫原性的可接受的模式。TNF-α是免疫系統(tǒng)的調(diào)控中所涉及的另一種細(xì)胞因子。TNF-α已知的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)控腫瘤增殖的能力使其成為在表征疫苗接種后免疫應(yīng)答時(shí)重要的考慮參數(shù)?？紤]到HPV6和HPVll的潛在腫瘤增殖特性，TNF-α產(chǎn)生可能更受到關(guān)注。IL-2是另一種信號(hào)傳導(dǎo)分子，已觀察到它在T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的增殖和分化中起到中樞作用。結(jié)果是，IL-2經(jīng)常與其它細(xì)胞因子一起檢查以獲得對(duì)特定免疫應(yīng)答的量值和品質(zhì)的進(jìn)一步的總體認(rèn)識(shí)。鑒于上文，接種P6E6E7之后產(chǎn)生IFN- Y、TNF- α和IL-2的⑶4+和⑶8+細(xì)胞的顯著百分比表明疫苗成功誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。除分泌IL-2的⑶4+細(xì)胞之外，相同趨勢(shì)適用于從接種Ρ11Ε6Ε7的小鼠中分離的細(xì)胞。此外，值得注意的是，觀察到CD8+細(xì)胞在疫苗接種小鼠中驅(qū)動(dòng)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，這是在評(píng)估兩種質(zhì)粒的抗瘤功效中重要的特征。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸分子,其包含:編碼HPV抗原的選自由以下各項(xiàng)組成的組的核苷酸序列:SEQ ID NO:1 ；SEQ ID NO: 3 ；SEQ ID NO: 5 ；SEQ ID NO:7 ;其具有90% 同源性的片段；及其組入口 ο
2.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其包含SEQID NO:1 ；SEQ ID NO:3 ；SEQ ID NO: 5 ；SEQ ID NO:7或其組合。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其包含與SEQID NO:1 ；SEQ ID NO: 3 ；SEQ ID NO: 5 ；或SEQ ID NO:7具有至少95%同源性的片段。
4.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其包含與SEQID NO:1 ；SEQ ID NO: 3 ；SEQ ID NO: 5 ；或SEQ ID NO:7具有至少98%同源性的片段。
5.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其包含與選自由以下各項(xiàng)組成的組的核苷酸序列具有至少 99% 同源性的片段:SEQ ID NO:1 ；SEQ ID NO: 3 ；SEQ ID NO: 5 ；SEQ ID NO: 7。
6.—種核酸分子,其包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的核苷酸序列:編碼SEQ ID NO:2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:6;或 SEQ ID NO:8 的核苷酸序列；編碼與 SEQ ID NO:2 ；SEQ IDNO:4 ；SEQ ID NO:6 ;或SEQ ID NO:8具有至少90%同源性的氨基酸片段的核苷酸序列；編碼SEQ ID NO: 2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:6 ;或SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；以及編碼與 SEQ ID NO:2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:6;或 SEQ ID NO:8 具有至少 90% 同源性的氨基酸片段的核苷酸序列的片段。
7.如權(quán)利要求6所述的核酸分子，其包含編碼SEQID NO:2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ IDNO:6 ;或SEQ ID NO:8的核苷 酸序列。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述分子是質(zhì)粒。
9.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
10.一種在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個(gè)體施用包含如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的核酸分子的組合物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述核酸分子通過電穿孔引入至所述個(gè)體體內(nèi)。
12.—種重組疫苗，其包含如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
13.如權(quán)利要求12所述的重組疫苗，其中所述重組疫苗是重組牛痘疫苗。
14.一種活減毒疫苗，其包含如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
15.一種蛋白質(zhì)，其包含選自由以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列:SEQ ID NO:2 ；SEQ IDNO: 4 ；SEQ ID NO: 6;或 SEQ ID NO: 8;以及與 SEQ ID NO: 2 ；SEQ ID NO: 4 ；SEQ ID NO:6 ;或SEQ ID NO:8具有至少90%同源性的序列的片段。
16.如權(quán)利要求15所述的蛋白質(zhì)，其包含SEQID NO:2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:6 ；或 SEQ ID NO:8。
17.如權(quán)利要求15所述的蛋白質(zhì)，其包含與SEQID NO:2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:6 ；或SEQ ID NO:8具有至少95%同源性的片段。
18.如權(quán)利要求15所述的蛋白質(zhì)，其包含與SEQID NO:2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:6 ；或SEQ ID NO:8具有至少98%同源性的片段。
19.如權(quán)利要求15所述的 蛋白質(zhì)，其包含與SEQID NO:2 ；SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:6 ；或SEQ ID NO:8具有至少99%同源性的片段。
20.一種在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個(gè)體施用如權(quán)利要求12至13中任一項(xiàng)所述的重組疫苗。
21.一種在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個(gè)體施用如權(quán)利要求14所述的活減毒疫苗。
22.如權(quán)利要求10至11中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括診斷所述個(gè)體患有HPV感染。
23.一種藥物組合物，其包含編碼HPV抗原的核苷酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3 ；或其具有90%同源性的片段。
24.—種在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV亞型6或11的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個(gè)體施用如權(quán)利要求23所述的藥物組合物。
25.一種藥物組合物，其包含編碼HPV抗原的核苷酸序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7 ；或其具有90%同源性的片段。
26.—種在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)HPV亞型33或58的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述個(gè)體施用如權(quán)利要求25所述的藥物 組合物。
【文檔編號(hào)】A61K39/12GK103889450SQ201180074173
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月12日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·B·韋納, 嚴(yán)健 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞大學(xué)理事會(huì)