基于來自惡性瘧原蟲的紅細胞前期抗原的瘧疾疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用作瘧疾疫苗的多肽或其片段。其還涉及編碼本發明的多肽的核酸分子。其進一步涉及包含這些多肽或其片段或核酸分子、特別是這些多肽或其片段的組合的組合物，以及這些組合物作為瘧疾疫苗的用途。
【專利說明】基于來自惡性瘧原蟲的紅細胞前期抗原的瘧疾疫苗
[0001]本發明涉及用作瘧疾疫苗的多肽或其片段。其還涉及編碼本發明的多肽的核酸分子。其進一步涉及包含這些多肽或其片段或核酸分子、特別是這些多肽或其片段的組合的組合物，以及這些組合物作為瘧疾疫苗的用途。
[0002]發明背景
瘧疾是感染性疾病，通過來自瘧原蟲寄生蟲的感染性子孢子經由瘧蚊叮咬的接種傳播。全球目前估計每年有5億瘧疾病例，并且在流行地區，如撒哈拉以南的非洲每年在1-3百萬人中感染是致命的。受影響最嚴重的是5歲以下的兒童，其中疾病包括幾種綜合癥，例如急性呼吸疾病，嚴重貧血或腦型瘧疾。導致人類瘧疾最嚴重的形式的寄生蟲，惡性瘧原蟲{Plasmodium falciparum)的生命周期是復雜的和多方面的，具有宿主組織內的局部差異和對應差異的抗原表達的不同形態。子孢子接種后，寄生蟲轉化并在專性、臨床無癥狀和單向階段中在肝臟中擴增(Prudenco等，2006)。膜包裹的裂殖子(merozoite)(稱為裂殖體)的包裝的釋放標志著瘧疾的發生(Sturm等，2006)，盡管典型地通過其發燒和畏寒的循環模式被識別的瘧疾的癥狀和病理學，專門是在紅細胞內瘧原蟲寄生蟲的快速無性繁殖階段期間導致的(Haidar等，2007)。因此，只有靶向紅細胞前期的預防性治療具有預防疾病并提供有效保護的潛力。用伽馬輻射的惡性瘧原蟲子孢子(RAS)對人和嚙齒動物的接種是僅有的賦予基本上完全保護的實驗性疫苗，并且是針對蚊傳播的瘧疾傳播的保護性免疫的金標準(Nussenzweig等，1967 ;Hoffman等,2002)。福射破壞寄生蟲遺傳指令(repertoire)并且寄生蟲停滯在肝臟中，在那里它們感染后持續至多達6個月(Silvie等，2002)。但是，這些寄生蟲在基因上是不明確的，并且直到今天，僅限于實驗研究中。然而，此模型提供下列原理論證(proof-of-principle):基于通過福射獲得的隨機的基因減毒,人類中的無蟲免疫(sterile immunity)是可能的。近期工作在嚙齒動物模型中通過基因減毒的寄生蟲(GAPs)已引發了無蟲免疫(Mueller 等,2005 a/b ；van Di jk 等，2005 ;Tarun 等,2007 ;Aly等，2008 ;Silvie等，2008)。這些GAPs停滯在早期肝臟階段并賦予持續的和階段特異性的免疫(Mueller 等，2007 Jobe `等，2007)。
[0003]基于基因減毒的寄生蟲的瘧疾接種的挑戰取決于將在嚙齒動物瘧疾模型中獲得的結果到人瘧疾的轉化。這已經通過破壞惡性瘧原蟲中的/7公成功進行，所述/7公是嚙齒動物寄生蟲基因A?命的直向同源物，最近已顯示其誘發針對子孢子引起的瘧疾的無蟲免疫(sterilising immunity)(van Schaijk 等，2008 ;van Dijk 等，2005 ;VanBuskirk 等，2009)。賦予對減毒子孢子抗性的免疫機制被認為是依賴于免疫系統的體液和細胞武器兩者。細胞凋亡的RAS感染的肝細胞導致瘧原蟲抗原到樹突細胞的遞呈，有可能引發賦予保護的免疫應答(Leiriao等，2005)。基本上，已認為保護依賴于作為細胞毒性效應細胞的⑶8+ T細胞(White等，1996 ； Bongfen等，2007)和為抗體和最佳記憶⑶8+細胞毒性T淋巴細胞活性提供幫助的⑶4+ T細胞(Carvalho等，2002)。無蟲免疫在不存在⑶8+ T細胞的情況下可以獲得，其僅僅由⑶4+ T細胞和II類效應機制介導(Oliveira等，2008)。有趣的是，已經描述了最近發表的模型，其中磷酸伯氨喹，一種專門靶向瘧原蟲肝臟階段的藥物，不存在對這樣的CD8 + T細胞應答必不可少的持續的代謝活躍肝臟階段的情況下，已經被用于在體內引發針對隨后的子孢子誘導的嚙齒動物瘧疾的疫苗樣保護性免疫(Putrianti等，2009)。并且，野生型寄生蟲連同預防化學治療(例如氯喹)的使用導致對惡性瘧原蟲的保護性免疫(Roestenberg等，2009)。然而，已表明，長期持續的RAS的形式經由MHC I類遞呈寄生蟲抗原，其誘導被感染的肝細胞的基于IFN-Y的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)產生(Klotz等，1995)。環子孢子蛋白(CSP)，子孢子主要的表面蛋白，歷來被認為是與瘧原蟲肝臟階段相關的主要抗原和疫苗候選。到目前已鑒定了幾個CSP衍生的T細胞表位，一些與非常高水平的保護相關，如通過用正常子孢子攻擊免疫的小鼠后肝臟階段載量的減少所測量的。RTS，S/AS02A是基于惡性瘧原蟲CSP的紅細胞前期疫苗候選，由葛蘭素史克(GSK)和健康適用技術組織(PATH)的痕疾疫苗行動(malaria vaccine initiative, MVI)項目之間合作開發。但是，其結果相當令人失望，具有40和60%之間的效力(Alonso等，2004 ；Alonso 等,2005 ；Bejon 等,2008, Epstein 等,2011)。這樣的部分保護表明，CSP 可能不是減毒模型中唯一的保護性抗原。的確，沒有在C57B1/6小鼠中描述的CSP表位，雖然在Balb/c中存在眾所周知并表征的T細胞表位。有趣的是，最近的研究(其采用表達異源惡性瘧原蟲CSP的伯氏瘧原蟲iP.berghei)寄生蟲系)表明，無蟲免疫可以在不存在CSP特異性免疫應答的情況下獲得，并且得出結論，迄今尚未被表征的抗原，而不是CSP，可能被靶向以誘導無蟲免疫(Griiner等等,2007 ;Mauduit等,2010)。
[0004]本發明的一個目的是提供用于有效瘧疾疫苗的手段。更具體地，本發明的一個目的是鑒定新的肝臟階段抗原，其是保護性的(即，對免疫是關鍵的)，并從而可以用于接種。
[0005]發明概述
根據本發明，此目的通過組合物解決，所述組合物包含至少兩種多肽，所述多肽選自包含SEQ ID N0.1-18的氨基酸序列的多肽和與任何上述多肽至少80%相同的多肽，優選進一步選自包含SEQ ID N0.19-23的氨基酸序列的多肽和與任何上述多肽至少80%相同的多肽，或包含上述多肽的至少兩種片段。
[0006]根據本發明，此`目的通過組合物解決，所述組合物包含至少兩種核酸分子，所述核酸分子每種編碼至少一種根據本發明的多肽或其片段，優選具有選自SEQ ID N0.41-63，更優選SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
[0007]根據本發明，此目的通過提供本發明的組合物解決，其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0008]根據本發明，此目的進一步通過包含選自SEQ ID N0.1-23的氨基酸序列的多肽，和與任何上述多肽至少80%相同的多肽，或其片段來解決，其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬痕疾活的減毒生物體的亞單位痕疾疫苗或多成分痕疾疫苗。
[0009]根據本發明，此目的進一步通過上述多肽的片段解決，所述片段包含或具有選自SEQ ID N0.26-36的氨基酸序列，其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0010]根據本發明，此目的進一步通過編碼至少一種根據本發明的多肽或其片段的核酸分子解決，所述核酸分子優選具有選自SEQ ID N0.41-63的核苷酸序列，其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0011]本發明優選實施方案的描述
在下文更詳細的描述本發明之前，應當理解此發明不限于本文所述的特定的方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應當理解本文所用的術語學是僅用于描述特定的實施方案的目的，并且不意圖限制本發明的范圍，其僅被所附的權利要求所限制。除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語與本領域普通技術人員的通常理解具有相同的意思。為了本發明的目的，所有本文引用的參考文獻通過引用整體并入。
[0012]濃度、量、和其它數值數據可以以范圍格式在本文中表達或表示。應當理解僅僅為了方便和簡潔起見使用這樣的范圍格式，并且從而應靈活解釋，以不僅包括作為范圍的限制明確記載的數值，還包括該范圍內包括的所有的單個數值或子范圍，好像每個數值和子范圍都是明確記載的。作為一個例子，“至少2到23”的數值范圍應解釋為不僅包括明確記載為2到23的值，還包括所指示的范圍內的單獨的值和子范圍。因此，包括在此數值范圍內的是單獨的值例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23和子范圍例如2到5，3到10，4到15，2到8，5到15，和6到10等。作為另一個例子，“5到50個氨基酸”的數值范圍應解釋為不僅包括明確記載為5到50個氨基酸的值，還包括所指示的范圍內的單獨的值和子范圍。因此，包括在此數值范圍內的是單獨的值例如5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、......、49 和 50 和子范圍例如 5 到 50,8
到25，8到15，和28到40等。此同樣的原理適用于記載僅一個數值的范圍。并且，無須考慮該范圍的廣度或所描述的特征，這樣的解釋都應當適用。
[0013] 具有瘧疾減毒的肝臟階段(MALS)抗原的組合物
此處我們提出用于疫苗開發的新方法，其利用寄生蟲在肝臟階段，病理學血液階段發病前的臨床無癥狀的孵育狀態的免疫潛力。
[0014]除了在自然感染期間獲得對瘧疾的最終臨床免疫的事實之外，上文所述現有技術的結果表明針對瘧疾的有效的疫苗原則上可以是可生產的。然而，盡管針對瘧疾的自然獲得性免疫被認為是針對感染的紅細胞期，但是直到今天，只有針對紅細胞前期的疫苗已導致針對瘧疾感染的保護。由于輻射的子孢子(減毒的寄生蟲)難以技術性生產，并且鑒于基于惡性瘧原蟲CSP的紅細胞前期疫苗候選已給出有效性令人失望的結果，新的候選疫苗抗原仍然是需要的。
[0015]發明人已發現獨特的策略用于鑒定這些抗原。現在本發明公開了靶向肝臟中寄生蟲的關鍵期的保護性抗原。這些新的有效的抗原分離自誘導保護的減毒的寄生蟲——痕疾疫苗開發中的新穎性一可以進一步轉化成疫苗原型，其通過在此重要的病理學前瓶頸處消除寄生蟲來介導免疫。
[0016]最終，我們的技術可以進一步擴展，其通過組合本發明內所述的最有效的紅細胞前期抗原和紅細胞抗原用于形成多成分(階段)亞單位疫苗，兩者均模擬活的減毒寄生蟲疫苗，并模擬自然獲得性免疫的誘導并從而為下一代疫苗制劑的制備鋪平了道路。
[0017]如上文所述，本發明提供組合物，包含:
-新鑒定的MALS抗原(蛋白，多肽)
或
-其片段 或
-編碼它們的核酸分子。
[0018]根據本發明的組合物包含多肽或編碼它們的核酸分子中的至少2種，至少3種，至少4種，至少5種，至少6種，至多達23種(至少2到23種)，例如2到5種，3到10種，4到15種，2到8種，5到15種，和6到10種。
[0019]根據本發明的組合物包含本發明多肽中的至少2種，至少3種，至少4種，至少5種，至少6種，至多達23種(至少2到23)的片段，例如2到5種，3至Ij 10種，4至Ij 15種，2到8種，5到15種，和6到10種的片段。
[0020]將要選擇用于本發明組合物的蛋白或多肽是包含或具有下列氨基酸序列的蛋白或多肽
MAL13PL13(SEQ ID N0.1), (MALSj)
PFI4_§480(SEQ ID N0.2)， (MALS—B)
MAL13PL258 (SEQ ID N0.3), (MALS_C)
PF14—0435(SEQ ID N0.4), (MALS—F>
ΡΠ4—0390(SEQ ID N0.5),
PF13-0242(SEQ ID N0.6),
PFBJI68(SEQ ID N0.7%
PF11JB42/0421 (SEQ ID N0.8),
PFcOS I Sc(SEQ ID N0.9),
PFcOOSc(SEQ ID N0.10),
PF14J533(SEQ ID N0.11),
ΡΠ3—02.S2(SEQ ID N0.12),
PF10JKJ81(SEQ ID N0.13),
PFF0420c(SEQ 10 NO, 14),
PFI4JB23(SEQ ID N0.15), (MALS_Cal)
PF10J3375(SEQ ID N0.16),
PFIS—0128(SEQ ID N0.1?),
PF14_0548(SEQ ID N0.18), #11
與任何上述多肽至少80%，優選至少85%，更優選至少90%，甚至更優選至少95%相同的多肽。
[0021 ] 它們進一步選自包含或具有下列氨基酸序列的蛋白或多肽
PF08_005 〗(SEQ ID NO, 19),
PFOg J?36{SEQ.1D N0.20),
PF13_0135(SEQ ID N0.21),
PF13^0343(SEQ ID N0.22),
PFEl 2?c{SEQ ID N0.23),獅
與任何上述多肽至少80%，優選至少85%，更優選至少90%，甚至更優選至少95%相同的多肽。[0022]對于細節，參見表1。
[0023]上面的登錄號是PlasmoDB/GeneDB 登錄號(www.plasmodb.0rg, version: 8.1,October 11,201 ；www.genedb.0rg, version: November,2010)。
[0024]如上文所述，本發明還提供與任何上述多肽至少80%、優選至少85%、更優選至少90%、甚至更優選至少95%相同的多肽，或其片段。
[0025]如本文所用，術語“百分比(%)相同的”或“百分比(%)序列同一性”指兩個氨基酸序列之間的序列同一性。同一性可以通過比較兩個序列中的位置確定，所述位置可以進行比對用于比較目的。當在比較的序列中的等同位置被同樣的氨基酸占據時，認為分子在該位置是相同的。
[0026]通常地，本領域技術人員知道下列事實，蛋白或肽的氨基酸序列中的一些氨基酸交換對蛋白或肽的(二級或三級)結構、功能和活性根本不具有任何影響。與本文公開的氨基酸序列相比具有該“中性”氨基酸交換的氨基酸序列落入本發明的范圍。還包括的是在初始氨基酸序列中的突變，其允許或促進在不同于惡性瘧原蟲的生物體，例如大腸桿菌中多肽或其片段的產生。
[0027]優選地，本發明的組合物包含至少兩種多肽，其選自包含或具有SEQ ID N0.1-23的氨基酸序列的多肽或與SEQ ID N0.1-23中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽或其一種或多種片段。
[0028]在優選的實施方案中，本發明的組合物進一步包含 -惡性瘧原蟲Ferlin，
-惡性痕原蟲Ferlin樣蛋白和/或 -另一種惡性瘧原蟲包含C2結構域的蛋白，或 -或其片段。
[0029]惡性瘧原蟲FerlinO0/ FER ；PF14_0530)具有SEQ ID N0.24的氨基酸序列，惡性瘧原蟲Ferlin樣蛋白{Pf FLP ；MAL8P1.134)具有SEQ ID N0.25的氨基酸序列。
[0030]本發明的組合物可以進一步包含一種或多種多肽，所述多肽包含或具有選自下列的氨基酸序列
PF14—0530(SEQ ID N0.24), (MALS—E),
MaWPi J34(SEQ ID N0.25), (MALS_G)} ||1
與SEQ ID N0.24和25的任何氨基 酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
[0031]優選地，本發明的組合物包含至少兩種多肽，所述多肽選自包含或具有SEQ IDN0.1-25的氨基酸序列的多肽或與SEQ ID N0.1_25中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽或其一種或多種片段。
[0032]-優選的組合物
本發明的優選的組合物包含下列中的至少兩種:MAL13P1.13(SEQ ID N0.1),(MALSmA),
PF14 JMM(SEQ ID N0.2),(MALS_B)s
MALI 3P1,258(SEQ ID N0.3),(MALS^C)i
PF14^0435(SEQ ID Nd 4%(MALS—F),
和與SEQ ID N0.1到4中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
[0033]本發明的優選的組合物包含下列中的至少兩種:
MAL13P1.13(SEQ ID NO, I),(MALS_A)f
PF14^0480(SEQ ID N0.2),(MALS_B),
MALI3P1258 (SEQ ID N0.3),(MALS^C)1
ΡΠ.4—0435(SEQ ID N0.4),(MALS_F),
PF14 JJ530(SEQ ID NO, 24),(MALS—E),
Pf 14 JB23(SEQ ID N0.15),(MALS—CM)
和與SEQ ID N0.1到4、15或24中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
[0034]-片段
在本發明的一個實施方案中，組合物包含本發明的多肽的片段。
[0035]優選地，本發明的一種或多種多肽、即包含或具有SEQ ID N0.1_23(或SEQ IDN0.1-25)的氨基酸序列的多肽的片段，包含多肽的至少一個抗原決定簇或表位。
[0036]在一個實施方案中，抗原決定簇或表位的氨基酸序列具有至少8個氨基酸的長度。因此，在優選的實施方案中，片段具有至少8個氨基酸的長度。在一個實施方案中，片段或肽具有在5到50個氨基酸、優選地8到25個氨基酸、更優選地8到15個氨基酸范圍內的長度。在一個實施方案中，片段或肽具有在28到40個氨基酸范圍內的長度。
[0037]在一個實施方案中，抗原決定簇或表位是⑶8+ T細胞表位，⑶4+ T細胞表位或B細胞表位，優選地⑶8+ T細胞表位。優選地，⑶8+ T細胞表位是惡性瘧原蟲特異性的⑶8+T細胞表位，例如HLA-A 0201-限制的CD8+ T細胞表位。本領域技術人員知道在給定的氨基酸序列中如何鑒定/預測CD8+ T細胞表位，例如通過表位預測程序，例如SYFPEITHI(http://www.syfpeith1.de)。
[0038]在優選的(至少兩種片段的)組合物中，片段選自包含或具有下列氨基酸序列的片段SLICGLYLL(SEQ ID NO, 26),|MALS—A 的片段h
ILYSLMINSL(SEQ ID NO, 27},(MALS_A _片段)，
LICGLYLLTL(SEQ ID N0.28), ‘4 的片段
VLLEKI_ I《SEQID N0.29),(MALS^B _ IV段)，
YLSPNFINKI(SEQ ID N0.30),<MALS_B f 段),
ILHGGVYRL(SEQ I:D N0.3-1).(MA LSJ:的 J j.段
ILFLFILSI(SEQ FDN0.32),(MALSJ:的打段)，
LLFINEINKL(SEQ ID N0.33),(>1 ALS^C lWilll),
SLISLYIYYV(SEQ ID N0.34).<MALS^F 的iV 段
FLLLML￥SI(SEQ ID N0.35),(MALS—F ft幻 V段
樹或
FLTLMARKL(SEQ ID NO‘ 36)iMALS^CiI fj J Vlt)。
[0039]它們可以進一步選自包含或具有下列氨基酸序列的片段
NLLDPLVW(SEQ ID N0.37),<MALS—E 的J丨―段},
LLLEGH FYL(SEQ ID NO, 38),《MALS—E 的 f1.段)，
KLIPVNYEL(SEQ ID N0.39), Ml|MALS_E 的.片段卜
推域
1LIPSLPLI(SEQ ID N0.40)(MALSj:的)V段>。
[0040]在優選的(至少兩種片段的)組合物中，片段選自MALS_A (SEQ ID N0.1)、MALS_B (SEQ ID N0.2)、MALS_C (SEQ ID N0.3)、MALS_F (SEQ ID N0.4)和任選地 MALS_Cal(SEQ ID N0.15)和 MALS_E (SEQ ID N0.24)的片段。
[0041]下列片段的混合物/合并物(抗原的肽合并物)是優選的:
MALS_A 的片段SEQ ID N0.26 到 28，
MALS_B 的片段SEQ ID N0.29 和 30，
MALS_C 的片段SEQ ID N0.31 至Ij 33，
MALS_F 的片段SEQ ID N0.34 和 35，
MALS_Cal 的片段SEQ ID N0.36，
MALS_E 的片段SEQ ID N0.37 到 40。
[0042]優選的組合物包含含有或具有下列氨基酸序列的片段 SEQ ID N0.26 到28，和 / 或
SEQ ID N0.29 和 30，和 / 或 SEQ ID N0.31 到 33，和 / 或 SEQ ID N0.34 和 35，和 / 或 優選地進一步 SEQ ID N0.36，和 / 或SEQ ID N0.37 到 40。
[0043]在TO 2011/066995中還公開了 FerliruFerlin樣蛋白和其它包含C2結構域蛋白的抗原片段用于瘧疾疫苗的用途。
[0044]-修飾
在一個實施方案中，本發明的一種或多種多肽或其一種或多種片段包含一種或多種進一步的成分，例如一種或多種標記，一種或多種N-和/或C-末端修飾，一種或多種進一步藥物或試劑。技術人員將能夠選擇合適的進一步的成分。
[0045]-編碼本發明的一種或多種多肽的核酸分子
在本發明的一個實施方案中，組合物包含編碼本發明的多肽的核酸分子。
[0046]優選的核酸分子具有選自SEQ ID N0.41-63或SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
[0047]優選的本發明的組合物包含至少兩種核酸分子，所述核酸分子每個編碼至少一種本發明的多肽或其片段，其優選具有選自SEQ ID N0.41-63，更優選SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
[0048]核酸分子可以是分離的核酸分子、包含它們的質粒、包含它們的表達構建體，例如用于DNA疫苗的表達系統。
[0049]-組合物的進一步成分
根據本發明的組合物可以進一步包含 -載體 和/或 -佐劑。
[0050]在一個實施方案中，載體融合到一種或多種多肽或其一種或多種片段或編碼它們的一種或多種核酸分子(即，如上文所述組合物的成分)上。
[0051]在一個實施方案中，載體是病毒顆粒或其部分，病毒載體或病毒顆粒的包膜蛋白，納米載體。
[0052]在一個實施方案中，病毒顆粒是乙型肝炎病毒顆粒或其部分。
[0053]在這樣的實施方案中，載體，例如乙型肝炎病毒顆粒或其部分，適合用于多肽或其片段的肝臟靶向。
[0054]在一個實施方案中，納米載體是細胞靶向的納米載體，例如可以從RodosBioTarget GmbH, Hannover (www.biotargeting.0rg)獲得的細胞祀向的納米載體，例如TargoSphere?遞送系統。這些納米載體可以與所希望的多肽或其片段組合并且特異性地導向至抗原遞呈免疫細 胞(像APCs，DCs,巨噬細胞等)。
[0055]在一個實施方案中，佐劑通常引發⑶8 T細胞應答。優選地，佐劑是可商購獲得的佐劑系統，例如IC31 (Intercell company, Vienna)，因為佐劑系統引發CD8 T細胞應答而非抗體介導的免疫。
[0056]組合物作為瘧疾疫苗的用途
如上文所述，本發明提供用作瘧疾疫苗的組合物。
[0057]組合物優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
[0058]相比于基于減毒的全生物體的疫苗(活的減毒疫苗)，“亞單位疫苗”由分別的病原體的至少一種成分(蛋白，蛋白片段)組成。[0059]“多成分疫苗”指包含分別的病原體的超過一種成分(蛋白，蛋白片段)的疫苗，其優選地來自不同的發育和疾病誘導的生命周期階段(多成分(_階段)疫苗)。
[0060]“模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位疫苗”指衍生自誘導保護的減毒的瘧疾肝臟階段寄生蟲的免疫原性蛋白成分的最小組合。
[0061]如上文所討論，本發明提出用于疫苗開發的新方法，其利用寄生蟲在肝臟階段，病理學血液階段發病前的臨床無癥狀的孵育狀態的免疫潛力。
[0062]本文公開并新鑒定的保護性抗原靶向肝臟中寄生蟲的關鍵期。這些新的確認的抗原分離自誘導保護的減毒的寄生蟲——瘧疾疫苗開發中的新穎性一可以進一步轉化成疫苗原型，其通過在此重要的病理學前瓶頸處消除寄生蟲來介導免疫。
[0063]本發明可以進一步擴展，其通過組合本發明所述的最有效的紅細胞前期抗原和紅細胞抗原用于形成多成分(階段)亞單位疫苗，兩者均模擬活的減毒寄生蟲疫苗，并模擬自然獲得性免疫的誘導并從而為下一代疫苗制劑的制備鋪平了道路。
[0064]MALS抗原、片段、核酸分子作為用于瘧疾疫苗的目標
如上文所述，本發明進一步`提供多肽，所述多肽包含或具有選自下列的氨基酸序列:
【權利要求】
1.包含至少兩種多肽的組合物，所述多肽選自包含下列氨基酸序列的多肽:
MAL13P1.0(SEQIDN0.1),
PFl4JMTO(SEQ 10 N0.2),
MALI 3P1.258(SEQ ID N0.3),
PF14JM35(SEQ ID NO, 4),
PFMJBW(SEQ ID N0.5),
PF13—0242(SEQ ID N0.6),
PF13_016i(SEQ ID N0.1),
PF11 —0342/0421(SEQ ID NO, 8),
PFc0515c(SEQ [DNa 9), PFcOl 35c(SEQ ID N0.10)T PF 14^0533(SEQ ID NO, 11), PF13—0282(SEQ ID N0.12), PFIOJJCWI(SEQ I—D N0.13)s PFF0420c(SEQ ID N0.14), PFI4 J323(SEQ ID N0.15), PF10JB75(SEQ ID N0.16).PHlJH28(SEQ ID N0.17), PF14_0548(SEQ ID N0.18), Hi 與任何上述多肽至少80%、優選至少85%、更優選至少90%、甚至更優選至少95%相同的多肽， 或包含至少兩種上述多肽的片段的組合物。
2.權利要求1的組合物，進一步選自包含下列氨基酸序列的多肽，或其片段: PFOg J)051(SEQ ID N0.19), PFOS J)036(SEQ IB N0.20), PF BJM 35(SEQ ID N0.21), PFl 3—0343(SEQ 10 NCX 22), PFE1260c(SEQ ID N0.23), fli 與任何上述多肽至少80%、優選至少85%、更優選至少90%、甚至更優選至少95%相同的多肽。
3.權利要求1或2的組合物，進一步包含惡性瘧原蟲Ferlin、惡性瘧原蟲Ferlin樣蛋白和/或另一種惡性瘧原蟲包含C2結構域蛋白，或其片段，如包含選自下列的氨基酸序列的一種或多種多肽: PF 14_0530(SEQ ID N0.24), MaWPLl34(SEQIDN0.25), ill與SEQ ID N0.24和25中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
4.權利要求1-3中任一項的組合物，其中所述至少兩種多肽選自包含SEQIDN0.1-23、優選SEQ ID N0.1-25的氨基酸序列的多肽，或與SEQ ID N0.1-23、優選SEQ IDN0.1-25中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一丨丨生的多肽,或其一種或多種片段。
5.權利要求1-4中任一項的組合物，其包含所述多肽中的至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至多達23種或包含所述多肽中的至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至多達23種的片段。
6.權利要求1-5中任一項的組合物，其包含下列中的至少兩種:MALI3P1.0 (SEQ IDN0.1),PF14 JMgO(SEQ ID N0.2).MAL13P1.258 (SEQ ID N0.3),PF14JM35(SEQ ID N0.4), 和與SEQ ID N0.1到4中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
7.權利要求1-6中任一項的組合物，其包含下列中的至少兩種:MAL13PL13 (SEQ ID N0.1),PFi4JMSO(SEQ ID N0. 2),MALBPL25S (SEQ ID N0.3),PF14—0435(SEQ ID N0.4)TPF14_0530(SEQ ID N0.24),Pfl4_0323(SEQ ID N0.15), 和與SEQ ID N0.1到4、15或24中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一種或多種片段。
8.權利要求1-6中任一項的組合物，其包含所述多肽的片段，其中具有SEQIDN0.1-23的氨基酸序列的多肽的片段包含所述多肽的至少一個抗原決定簇或表位，并且，優選地，具有至少8個氨基酸的長度。
9.權利要求8的組合物，其中所述抗原決定簇或表位是CD8+T細胞表位、CD4+ T細胞表位或B細胞表位，優選CD8+ T細胞表位。
10.權利要求8或9的組合物，其中所述片段選自包含或具有下列氨基酸序列的片段:SLICGLYLL(SEQ ID N0.26),
ILYSLMINSL(SEQ ID N0.27),
LICGLYLLTL(SEQ ID N0.28),
VLLEKINVI(SEQ ID N0.29),
YLSPNFINKI(SEQ ID N0.30),
ILHGGVYRL(SEQ ID N0.31),
ILFLFILSI(SEQ ID N0.32),
LLFIWEINKL(SEQ ID N0.33),
SLISLYIYYV(SEQ ID N0.34),FLLLMLVSI(SEQ ID N0.35),.HI域
FLTLMARKL(SEQ ID N0.36)， 優選地進一步選自包含或具有下列氨基酸序列的片段
NLLDFLWV(SEQ ID N0.3?)?
LLLEGN FYL(SEQ ID N0.38),KLIPVNYEL(SE`Q ID N0.39), Hi/it ILIFSLPL1<SEQ ID N0.40)。
11.權利要求10的組合物，其包含含有或具有下列氨基酸序列的片段: SEQ ID N0.26 到 28，和 / 或 SEQ ID N0.29 和 30，和 / 或 SEQ ID N0.31 到 33，和 / 或 SEQ ID N0.34 和 35，和 / 或 優選地進一步包含含有或具有下列氨基酸序列的片段: SEQ ID N0.36，和 / 或 SEQ ID N0.37 到 40。
12.根據前述權利要求中任一項的組合物，其中所述多肽或其片段包含一種或多種進一步的成分，如一種或多種標記，一種或多種N-和/或C-末端修飾，一種或多種進一步藥物或一種或多種試劑。
13.組合物，包含至少兩種核酸分子，所述核酸分子每種編碼至少一種根據權利要求1-10中任一項的多肽或其片段，優選具有選自SEQ ID N0.41-63、更優選SEQ ID N0.41-65的核苷酸序列。
14.權利要求13的組合物，其包含所述核酸分子中的至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至多達23種。
15.根據前述權利要求中任一項的組合物，進一步包含載體和/或佐劑。
16.權利要求15的組合物，其中所述載體是病毒顆粒或其部分，病毒載體或病毒顆粒的包膜蛋白，納米載體。
17.權利要求16的組合物，其中所述病毒顆粒是乙型肝炎病毒顆粒或其部分。
18.權利要求16的組合物，其中所述納米載體是細胞靶向的納米載體。
19.權利要求15-18中任一項的組合物，其中所述佐劑通常引發⑶8T細胞應答，如IC31。
20.根據前述權利要求中任一項的組合物，其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
21.包含選自SEQID N0.1_23的氨基酸序列的多肽，和與任何上述多肽至少80%、優選地至少85%、更優選地至少90%、甚至更優選地至少95%相同的多肽， 或其片段， 其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
22.權利要求21的多肽的片段，包含或具有選自SEQID N0.26-36的氨基酸序列，其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
23.核酸分子，其編碼至少一種根據權利要求21或22的多肽或其片段，優選具有選自SEQ ID N0.41-63的核苷酸序列， 其用作瘧疾疫苗，優選用作模擬瘧疾活的減毒生物體的亞單位瘧疾疫苗或多成分瘧疾疫苗。
【文檔編號】A61K39/015GK103491979SQ201180066346
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2011年12月6日 優先權日:2010年12月6日
【發明者】J.普法伊爾, K.海斯, A-K.米勒 申請人:馬爾瓦有限責任公司