專利名稱：用于b細胞淋巴瘤的聯合療法的制作方法
用于B細胞淋巴瘤的聯合療法背景大多數人白血病和淋巴瘤，包括急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)，起源于B細胞。近年來，基于通過使用單克隆抗體(mAb)靶向B細胞限制性表面抗原的B細胞耗盡的治療方法已經獲得了越來越多的關注。具體而言，抗CD20 mAb利妥昔單抗已經在B細胞惡性腫瘤的治療中顯示出有希望的結果。(羅巴克(Robak)等人，癌癥治療評論(Cancer Treatment Reviews), 2007 ；33:710-728.)利妥昔單抗的活性大部分取決于該mAb通過參與活化效應細胞(如巨噬細胞和NK細胞)表面上的Fe Y受體而介導抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)的能力。(戴斯杰拉斯(Desjarlais)等人，今日藥物發現(Drug Discovery Today), 2007 ；12:898-910.)雖然其他機制，如補體依賴性細胞毒性(CDC)和細胞凋亡的直接誘導也可以產生作用，但ADCC似乎是利妥昔單抗借以在體內介導惡性的以及正常的B細胞的消除的主導機制。(愛德華茲(Edwards)等人，免疫學自然評論(Nat Rev Immunol), 2006 ；6:394-403.)利妥昔單抗與化學療法的組合已經在患有濾泡淋巴瘤(FL)和CLL的患者中引起顯著的改進，并且可以導致持久的緩解。然而，此療法不是對所有的患者群體都有效。因此，仍然急需新穎且改進的治療選項。人分化(⑶)群抗原19是由早期前B細胞從重鏈重排時所表達的一種B細胞特異性表面抗原。CD19屬于跨膜受體的含免疫球蛋白結構域的超家族。當CD19表達被下調時，⑶19在B細胞上從祖B細胞至漿細胞階段的其整個譜系中受到表達。(納德勒(Nadler)等人，免疫學雜志(J Immunol.) 1983 ; 131:244-250.)作為一種B細胞特異性蛋白、和B細胞-受體(BCR)復合物的組分，CD19是調控B細胞活化和體液免疫的閾值的B細胞信號傳導的一種正調控因子。(佐藤(Sato)等人，國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci), 1995 ；92 =11558-62 ;佐藤等人，免疫學雜志1997 ；158:4662-9.) CD19不在造血干細胞上或在祖B細胞階段之前的B細胞上表達。(納德勒(Nadler)等人，免疫學雜志(J Immunol.) 1983 ；131:244-250 ;洛肯(Lok en)等人，血液(Blood)，1987 ；70:1316-1324.)。重要的是，⑶19的表達在B細胞的惡性轉化之后得以維持，并且⑶19在大多數B細胞惡性腫瘤(包括ALL、CLL以及NHL)上表達。(Uckun等人，血液，1988 ;71:13-29 ;D’Arena 等人，美國血液學雜志(Am J of Hematology), 2000 ;64:275-281 ;吉乃爾迪(Ginaldi)等人，臨床病理學雜志(J Clin Pathol)，1998 ；51:364-369 ;安德森(Anderson)等人，血液，1984 ；63:1424-1433.)⑶19在B細胞惡性腫瘤上的廣泛且相對穩定的表達使得此抗原成為基于mAb的療法的有吸引力的靶標。因此需要利用抗⑶19和抗⑶20抗體的優點的聯合療法來治療B細胞惡性腫瘤。發明概述在此提供用于治療B細胞淋巴瘤的方法，這些方法包括對有需要的患者給予一種聯合療法，該聯合療法包括抗CD19抗體和抗CD20抗體。這類聯合療法相比以相當的給藥時程表單獨給予的所述抗CD19抗體或所述抗CD20抗體而言，賦予持續更長的持續時間的抗腫瘤活性。還提供了用于利用減少劑量的抗⑶19和/或抗⑶20抗體來治療B細胞淋巴瘤的方法。具體而言，這類方法包括對有需要的患者給予一種聯合療法，該聯合療法包括抗CD19抗體和抗CD20抗體，其中所述聯合療法的劑量相比劑量是該聯合療法的劑量至少兩倍高的所述抗CD19抗體的劑量而言，具有更大的抗腫瘤活性。附圖簡要說明
圖1顯示了未巖藻糖基化的抗CD19 mAb 16C4 (16C4_afuc)和抗CD20 mAb(利妥昔單抗)針對多種B細胞白血病和淋巴瘤細胞系的ADCC活性。顯示了使用四種細胞系的體外ADCC測定的結果，這些結果是通過一組15種白血病和淋巴瘤細胞系所觀察到的活性概況的代表。包括巖藻糖基化的⑶19 mAb 16C4以用于對比。當針對Karpas-1106P細胞進行測試時，16C4_afuc和利妥昔單抗的ADCC活性是相當的(圖1A);使用細胞系Farage、Raji以及MeC2獲得類似的結果。JVM2(圖1B)是在體外針對其利妥昔單抗比16C4_afuc更有效的細胞系的代表；使用細胞系Granta-519、DB、以及JVM-13獲得類似的結果。0ci_LY19 (圖1C)和Daudi (圖1D)是針對其16C4-afuc比利妥昔單抗更具效力的細胞系的代表；使用Toledo、Karpas-422、Nalm-6、RL、以及Namalwa細胞獲得類似的結果。在測試的所有細胞系的情況下，16C4-afuc比16C4的巖藻糖基化版本更具效力。顯示的結果是三份重復樣品的平均值+/_標準差。圖1F-H顯示了⑶19和⑶20的相對表達(表示為MFI，參見實例2中的表I)，該相對表達 是針對觀察到的％最大細胞殺傷(CD19，圖1F ；CD20,圖1G)并且針對對于16C4-afuc和利妥昔單抗而測定的EC50值(⑶19，圖1H KD20，圖1I)而繪制的。排除其EC50不能被測定的細胞系/mAb組合(也參見實例2中的表I)。遍及細胞系的這個多樣性的組，不能測定到EC50或最大細胞殺傷與抗原表達的顯著相關性。圖2圖解了患者衍生的慢性淋巴細胞性白血病(CLL)細胞在體外對16C4_afuc介導的ADCC敏感的情況。在圖2A中，患者CLL細胞顯示了⑶19和⑶20的可變的細胞表面表達。CLL細胞上的CD19和CD20抗原位點的數目如下文在材料和方法中所描述的來測定。在圖2B-C中，顯示了使用基于FACS的測定、用患者衍生的CLL細胞進行的16C4_afuc和利妥昔單抗的體外ADCC測定結果。使用KC1333NK細胞作為效應細胞，E: T比例是2.5: I。顯示了總共測試的六種樣品中的三個代表性患者樣品的結果。在測試的所有樣品的情況下，在耗盡來自患者PBMC樣品的CLL B細胞方面，16C4-afuc比利妥昔單抗更有效。所有的ADCC測定重復進行三次，并且呈現平均值(+/_標準差)。顯示了抗原表達與16C4-afuc (圖2E)和利妥昔單抗(圖2F)對于測試的所有六種CLL患者樣品的體外ADCC活性的關系。CD19和CD20的抗原位點的數目相比分別使用16C4和利妥昔單抗獲得的最大細胞殺傷百分比進行繪制。圖3顯示，患者衍生的急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞對16C4_afuc介導的ADCC敏感。圖3A圖解了患者ALL細胞上的⑶19和⑶20的表達。對于三種單獨的ALL樣品，測定CD19和CD20的抗原位點的數目。為了對比，顯示來自四位單獨供體的正常人外周血B細胞上的抗原位點的數目。如在圖3B、3C、3D、以及3E中所示，16C4_afuc具有針對原代ALL細胞的有力的體外ADCC活性。顯示了使用來自四位患者的樣品的基于FACS的測定的結果。使用KC1333 NK細胞作為效應細胞，E: T比例是2.5: I ;包括利妥昔單抗用于對比。所有的測量重復進行三次，呈現平均值(+/_標準差)。圖4顯示，16C4-afuc對腫瘤生長的抑制取決于Fe介導的效應子功能。顯示了使用16C4-afuc和效應子減少的Fe突變的mAb 16C4-TM在Daudi (圖4A)和Raji (圖4B)SCID-淋巴瘤異種移植物模型中的體內腫瘤生長抑制。在第O天對SCID小鼠皮下接種淋巴瘤細胞。從第7天開始，動物接受三個每周劑量(2.5mg/kg)的mAb或等體積的媒介物(PBS)。使用人IgGl mAb R347作為同種型對照物。圖5顯示，16C4-afuc對SCID小鼠中的淋巴瘤生長的抑制是劑量依賴的。當與同種型對照物治療的動物相比時，使用一系列mAb濃度和給藥頻率對Raji細胞異種移植物進行的治療引起顯著的腫瘤生長抑制。劑量范圍包括0.3、1、3、以及10mg/kg 16C4-afuc。給藥時程表變化包括1、3、以及5次劑量。第一次劑量在細胞植入后第5天給予。在圖5A中，半周一次給予的16C4-afuc的5次劑量相比每周一次給予的3次劑量(圖5B)產生更強的抗腫瘤活性。使用3mg/kg的治療獲得與使用10mg/kg的治療相當的功效。圖6顯示，CD19mAb 16C4_afuc在多個SCID淋巴瘤模型中是具有活性的。圖6A顯示了在三個皮下淋巴瘤異種移植物模型中使用16C4-afuc和利妥昔單抗的腫瘤生長抑制。顯示了對于Namalwa (圖6A)、Daudi (圖6B)、以及Toledo (圖6C) B淋巴瘤細胞系的結果。在第O天對SCID小鼠皮下植入腫瘤細胞，然后從第5天開始腹膜內注射16C4-afuc、同種型對照物、媒介物或利妥昔單抗，每周兩次，總共5次劑量(3mg/kg)。在圖6D和6E中，CD19 mAb16C4-afuc在患有播散性疾病的小鼠模型中具有活性。顯示了 16C4-afuc與利妥昔單抗在兩個系統性疾病模型中的抗腫瘤活性的對比。顯示的結果是針對注射有Namalwa(圖6A)和Daudi (圖6B)細胞的小鼠。在細胞注射后第7天開始每周兩次腹膜內給予16C4_afuc、利妥昔單抗、或同種型對照物(3mg/kg)，并且持續5次劑量。在該播散性腫瘤模型中，使用生存時間或麻痹時間作為終點。圖7顯示了在SCID淋巴瘤模型中由16C4_afuc和利妥昔單抗的組合產生的延長的腫瘤生長抑制的作用。在SCID-淋巴瘤模型中，根據與16C4-afuc相同的時程表和濃度(3mg/kg,半周一次,總共5次劑量)來給予利妥昔單抗。顯示了來自Raji (圖7A)、Daudi (圖7B)、0c1-LY19(圖7C)以及Ramos (圖7D)異種移植物模型的結果。16C4_afuc與利妥昔單抗的組合對于Raji和Daudi 模型產生了延長的腫瘤生長抑制。在0ci_LY19模型(其對利妥昔單抗應答不佳)和Ramos模型(其對16C4_afuc應答不佳)中觀察到較小的作用。圖8顯示了單獨給予或與利妥昔單抗聯合給予的16C4_afuc，在hu⑶19/⑶20轉基因小鼠中的藥代動力學和藥效動力學。考慮了四種分開的給予:16C4-afUc(lmg/kg) +對照物；16C4_afuc (10mg/kg) + 對照物；16C4_afuc (lmg/kg) + 利妥昔單抗；16C4_afuc (lOmg/kg) +利妥昔單抗。不論是單獨給予或是聯合給予，更高劑量的16C4-afuc(10mg/kg)比更低劑量的16C4-afuc (lmg/kg)在血液中保留的更久。圖9顯示了在給予聯合療法、單獨的利妥昔單抗或單獨的16C4_afuc之后，B細胞耗盡實驗的結果。結果顯示，使用利妥昔單抗(10mg/kg)+16C4-afuc(10mg/kg)的最高劑量的聯合療法導致了持續時間最長的來自血液和脾臟的B細胞耗盡的最大百分比。詳細說明A.使用抗⑶19和抗⑶20抗體的聯合療法在此提供用于治療B細胞惡性腫瘤的方法，這些方法包括給予抗CD19抗體和抗CD20抗體的組合。該聯合療法與單一抗體療法(例如，抗CD19或抗CD20單獨的給予)相t匕，在減少的劑量下提供了延長的抗腫瘤功效和/或有效的治療。還提供了用于通過對有需要的受試者(例如，遭受B細胞惡性腫瘤的受試者)給予抗CD19抗體和抗CD20抗體的組合而延長對該受試者中腫瘤生長的抑制的方法。如在此所使用，“進行治療”或“治療”是指向受試者給予抗CD19抗體或其抗原結合片段，或向來自受試者的分離組織或細胞系給予抗CD19抗體或其片段，并聯合向該受試者、或向來自該受試者的分離組織或細胞系給予抗CD20抗體或其抗原結合片段，其中該受試者具有一種疾病、一種疾病的癥狀、或對一種疾病的易感性，其中目的是治愈、愈合、減輕、緩解、改變、補救、改善、改進、或影響該疾病、該疾病的癥狀、或對該疾病的易感性。通過“進行治療”或“治療”還意指可將這些抗體或其抗原結合片段作為一種單一藥用組合物的一部分、或可替代地作為各自包含該抗CD19抗體(或其抗原結合片段)或抗CD20抗體(或其抗原結合片段)的單獨藥用組合物的一部分而給予該受試者、或來自該受試者的分離組織或細胞系，其中該受試者具有一種疾病、一種疾病的癥狀、或對一種疾病的易感性，其中目的是治愈、愈合、減輕、緩解、改變、補救、改善、改進、或影響該疾病、該疾病的癥狀、或對該疾病的易感性。多種參數可以指示治療功效，例如抗腫瘤活性。這些包括但不限于:腫塊大小的減小；腫瘤轉移性侵襲力的減小；腫瘤生長速率的減小；腫瘤相關后遺癥(如惡病質和腹水廣生)的嚴重度或發病率的降低；腫瘤相關并發癥(如病理骨折、自身免疫性溶血性貧血、幼淋巴細胞轉化、Richter綜合征等)的降低和/或預防；腫瘤對化學療法和其他治療的敏化作用；增加的患者生存率；觀察到的改進的預后如增加的腫瘤浸潤淋巴細胞與降低的腫瘤血管化的臨床相互關聯性的增加；等等。因此，在一些實施例中，給予這兩種類型的抗體的組合將導致經受治療的患者(例如，受試者)中的這些參數中的一個或多個的改進。在其他實施例中，患者中的這些改進關于一些參數是協同性的，而關于其他參數是加和性的。在某些實施例中，使用CD19和CD20抗體的聯合療法的作用可以是加和性的。在其他實施例中，使用CD19和CD20抗體的聯合療法的作用可以是協同性的。術語“協同性”用來描述兩種或更多種活性劑的聯合作用，該聯合作用比每種相應的活性劑的單獨作用的總和大。因此，在兩種或更多種試劑的這種聯合作用導致對活性或過程(例如，腫瘤生長)的“協同抑制”的情況下，意圖是對該活性或過程的抑制大于每種相應的活性劑的抑制作用的總和。術語“協同治療作用”是 指使用兩種或更多種療法的組合所觀察到的一種治療作用，其中該治療作用(如通過多 種參數中的任一種所測量的)比使用相應的單獨療法所觀察到的單獨治療作用的總和大。出于在此的目的，協同作用意思是:在利用以相當的給藥時程表或方案給予的CD19抗體和CD20抗體的組合時所觀察到的作用，(I)大于在單獨地(或單個地)利用這種⑶19抗體或⑶20抗體時所獲得的作用；并且(2)大于這種⑶19抗體和CD20抗體的相加總和(加和性)作用。如在此所使用，相當的給藥時程表是指這樣的給藥時程表或方案:它用于評估或比較至少兩種不同的治療的結果并且因而被設計成在正被比較的這些治療之間是相同的，即，患者正被以相同的方式(例如，天數、給藥之間的時間、抗體試劑的濃度)給藥，但是使用不同的抗體或聯合療法。該給藥時程表的變量將由本領域的技術人員根據正被處理的B細胞惡性腫瘤和治療選擇來確定。這種協同性或協同作用可以通過本領域的技術人員所已知的多種手段來確定。例如，CD19抗體和CD20抗體的協同作用可以使用檢驗腫瘤細胞數目或腫瘤大小的減少的體外或體內測定形式、或通過腫瘤生長的抑制或腫瘤細胞的耗盡來進行觀察。類似地，每個單獨組分的協同有效量可以通過測試一系列各個組分的濃度來確定。
如在此所使用，術語“聯合”以其最廣泛的含義使用并且意思是使用至少兩種治療方案來治療受試者。因此，“聯合抗體療法”或“聯合療法”旨在意指使用至少兩種抗體方案、更具體地說聯合使用至少一種抗⑶20抗體(或其抗原結合片段)與至少一種抗⑶19抗體(或其抗原結合片段)來治療受試者，但給予不同抗體方案的時間安排可以改變，只要獲得這些抗體的組合的有益作用。聯合使用抗CD20抗體(或其抗原結合片段)與抗CD19抗體(或其抗原結合片段)的治療可以是在同一時間(例如，同時地或并存地)、或在不同時間(例如，連續地或依序地)或其組合。出于本披露的目的，在同一時間(例如，同時地)給予是指一起在同一配制品中或在分開配制品中給予這些抗體，其中該給予可以相隔幾分鐘至幾小時，但是不超過一天。如在此所使用，在不同時間(例如，依序地)給予是指相隔幾小時至幾天、幾周并且甚至幾個月地給予該聯合療法的抗體。因此，在某些實施例中，經受聯合抗體療法的受試者可以在同一時間(例如，同時地)或在不同時間(例如，在同一天、或在不同天按任一順序依序地)接受兩種抗體，只要在該經受療法的受試者中產生兩種物質的組合的治療作用。在一些實施例中，將同時給予抗體組合用于一次給藥，但其他給藥將包括在同一天、或在不同天以任一順序進行依序給予。依序給予可以在不管受試者是否應答于第一單克隆抗體給予的情況下進行。在這兩種抗體被同時給予的情況下，它們可以作為各自包含抗CD20抗體(或其抗原結合片段)或抗⑶19抗體(或其抗原結合片段)的分開藥用組合物來給予、或可以作為包含這兩種抗體的一種單一藥用組合物來給予 。本披露的方法包括使用對需要B細胞疾病治療的受試者賦予積極治療應答的聯合療法。關于使用抗CD19和抗CD20抗體的聯合治療而言的積極治療應答旨在意指與這些抗體或其片段的抗腫瘤活性相關聯的在疾病中的改進，和/或在與該疾病相關的癥狀中的改進。也就是說，可以觀察到一種抗增生作用、對進一步腫瘤過度生長的阻止、腫瘤大小的減小、癌細胞數目的減小、和/或由贅生性B細胞介導的一種或多種癥狀的減少。因此，例如，疾病的改進可被表征為完全應答。通過“完全應答”意指臨床上可檢測到的疾病的缺乏，伴有任何先前異常的射線照相研究、骨髓、以及腦脊髓液(CSF)的正常化。這樣一種應答必須持續在根據本披露的方法治療之后至少一個月。可替代地，疾病的改進可被歸類為部分應答。通過“部分應答”意指在不存在新病變的情況下并且持續至少一個月的所有可測量的腫瘤負荷(例如，受試者中存在的腫瘤細胞的數目)的至少約50%的降低。這樣一種應答僅適用于可測量的腫瘤。可以使用篩選技術，如磁共振成像(MRI)掃描、X-射線照相成像、計算機斷層照相(CT)掃描、流式細胞計量術或熒光活化細胞分選儀(FACS)分析；生物發光成像，例如熒光素酶成像、骨掃描成像，以及腫瘤活檢取樣(包括骨髓穿刺(BMA))，針對腫瘤形態學(例如，整體腫瘤負荷、腫瘤大小，等)的變化來評定腫瘤應答。除了這些積極治療應答之外，正經受療法的受試者可以經歷與疾病相關的癥狀的改進的有益效果。因此，對于B細胞腫瘤，受試者可以經歷所謂的B癥狀，例如盜汗、發熱、重量損失和/或蕁麻疹的減少。在此披露的聯合療法以治療有效劑量來給予。術語“治療有效劑量”、“治療有效量”、或“有效量”意指一定量的抗CD19抗體(或其抗原結合片段)，當與一定量的抗CD20抗體(或其抗原結合片段)聯合給予時，帶來在受試者的包括贅生性B細胞的癌癥的治療方面的積極治療應答。在一些實施例中，抗CD20抗體(或其抗原結合片段)或抗CD19抗體(或其抗原結合片段)的治療有效劑量是在從約lmg/kg至約200mg/kg的范圍內。應理解，該治療方法可以包括治療有效劑量的在本方法的實踐中有用的抗體組合的單次給予或治療有效劑量的該抗體組合的多次給予。在某些實施例中，使用抗⑶19抗體和抗⑶20抗體的聯合療法相對于單獨包括抗CD19抗體或單獨包括抗CD20抗體的治療而言,提供了延長的抗腫瘤活性。在某些實施例中，聯合療法可以提供的抗腫瘤活性，與單獨使用抗CD19抗體或單獨使用抗CD20抗體可獲得的抗腫瘤活性相比，持續長至少I周、2周、3周、I個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、I年、或2年。抗腫瘤活性的相對持續時間可以在測試群體的統計分析的基礎上進行確定。例如，如果抗CD19抗體在一個測試群體中展現出持續平均6周的一定水平的抗腫瘤活性，并且抗CD20抗體在一個測試群體中展現出持續平均8周的一定水平的抗腫瘤活性，則該組合展現出比單獨給予的任一抗體療法長至少4周的抗腫瘤活性，前提條件是該聯合療法在一個測試群體中展現出持續平均至少12周的與對于單一抗體療法所見到的至少同等水平的抗 腫瘤活性。抗腫瘤活性的持續時間可以被測量為療法開始的日期到該療法不再提供所希望的水平的抗腫瘤活性(例如，通過防止腫瘤體積的增大的能力、耗盡B細胞的能力等所測量的)的時間點。在某些實施例中，如在此所述的抗腫瘤活性是指防止腫瘤大小增大超過1%、2%、5 %、8 %、10 %、12 %、15 %、20 %、25 %或30 %的能力。如在此所使用，腫瘤大小是指直徑測量值或估算的腫瘤體積測量值。例如，如果一種聯合療法可以在六個月時間段上防止腫瘤的單維或二維測量值增大超過10%，則它展現出在六個月時間段上的抗腫瘤活性。淋巴瘤腫瘤(例如，存在于周圍淋巴結中的腫瘤)的這些二維測量值可以通過使用以上所述的提供了直徑或估算的腫瘤體積測量值的儀器進行身體掃描而獲得(臨床腫瘤學雜志(Journal of Clinical Oncology),2004 ASCO年會論文集(Annual Meeting Proceedings)(會后版).第22卷，第14S號(7月15日增補)，2004:6606)。因此，當在腫瘤的直徑測量值方面或在估算的腫瘤體積測量值方面缺乏增長時，目前披露的聯合療法展現出抗腫瘤活性。在另一個實施例中，抗腫瘤活性可以反映在腫瘤大小的實際減小、或者腫瘤在固定大小下在一段時間上的維持中。在另一個實施例中，抗腫瘤活性可以通過相對于治療前的腫瘤大小，例如直徑測量值或估算的腫瘤體積測量值而言，將腫瘤生長抑制超過I %、2 %、5 %、8%、10%、12%、15%、20%、25%或 30%來確定。在某些實施例中，抗腫瘤活性可以通過確定使用一種給定療法而獲得的B細胞耗盡水平來測量。循環B細胞(包括惡性B細胞)最容易通過流式細胞計量術、或以上所述的并且本領域熟知的其他細胞計數裝置進行測量，從而產生循環B細胞的計數數目。進一步考慮的是，為大量循環B細胞提供的任何方法可以用于確定在使用該聯合療法的治療之后B細胞的耗盡。眾所周知，循環B細胞耗盡是用于組織B細胞耗盡的替代標志物。因此，這樣的B細胞耗盡包括循環B細胞和組織B細胞，這些細胞中的一些可能是惡性的。在某些實施例中，抗腫瘤活性可以通過相對于治療之前的B細胞水平而言為至少50 %、60 %、70 %、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%的B細胞耗盡水平來確定。例如，如果一種療法可以在至少六個月時間段上維持90%的B細胞耗盡水平，則該療法展現出在六個月時間段上的抗腫瘤活性。預測臨床功效的一種方法是在一種合適的模型中測量使用這些抗體的聯合療法的作用；例如，抗CD20抗體和抗CD19抗體的組合在鼠類癌癥模型中的用途。這些模型包括裸小鼠異種移植腫瘤模型，如使用被稱為Namalwa和Daudi的人伯基特淋巴瘤細胞系的那些。在一些實施例中，抗腫瘤活性是在一個分期的裸小鼠異種移植腫瘤模型中使用Daudi人淋巴瘤細胞系進行測定。一個分期的裸小鼠異種移植腫瘤模型細胞系相比未分期的模型而言，在辨別一種給定抗體的治療功效方面通常更有效，因為在該分期的模型中，抗體給藥僅在腫瘤已經達到可測量的大小之后才起始。在該未分期的模型中，抗體給藥通常在腫瘤接種約I天內并且在可觸知的腫瘤出現之前起始。一種抗體在一個分期的模型中展現出增大的抗腫瘤活性的能力是該抗體將是治療有效的一個強有力指示。在其他實施例中，抗⑶19抗體和抗⑶20抗體的組合提供了用于使用這些治療抗體的減少劑量來抑制腫瘤生長或治療具有B細胞惡性腫瘤的患者的方法。具體而言，在此提供的實例顯示，聯合療法(例如，抗CD19抗體和抗CD20抗體的組合)的總劑量比抗CD19抗體的大于該聯合療法的總劑量的劑量更有效。因此，在此披露的方法提供用于增強一種單一抗體療法的功效，從而允許在更低劑量下的有效治療并且潛在地避免與該抗體療法的更高劑量相關聯的不希望的副作用。在某些實施例中，聯合療法在至少2倍、3倍、4倍或5倍低于提供相同抗腫瘤活性(例如，應答于單一劑量的相同程度的抗腫瘤活性、或使用相當的給藥時程表在限定的時間段上的相同程度的抗腫瘤活性)所需的抗CD19抗體或抗CD20抗體任一者的劑量的總劑量下提供相同或更大的抗腫瘤作用。因此，對于賦予了抗腫瘤活性的抗CD19抗體的任何給定的劑量，該聯合療法將在相比該抗CD19抗體的劑量而言更低的濃度下賦予更大的抗腫瘤活性。該更低的濃度可以是抗CD19抗體的濃度的一半，或者可以小于抗CD19抗體的濃度的一半。在某些實施例中，在此所述的聯合療法可以通過不同的給予手段來完成。例如，該抗⑶19抗體和該抗⑶20抗體可以分開地配制并且給予患者。可替代地，該抗⑶19和抗⑶20抗體可以在單一配制品中被配制在一起。當該抗⑶19和抗⑶20抗體是處于分開配制品中時，這些抗體可以按照相同或不同的給藥時程表進行給予。例如，這兩種抗體可以在同一時間并且在相同的頻率下進行給予(例如，兩種抗體一周一次在同一時間進行給予)；它們可以在分開的時間但是以相同的給予頻率進行給予(例如，兩種抗體一周一次、但是在不同時間進行給予)；或者它們可以使用頻率不同的時程表進行給予(例如，一種抗體每周給予一次而另一種抗體每 隔一周進行給予)，等等。在多個示例性實施例中，該抗CD19和抗CD20抗體被配制在一起并且以相同的給藥時程表進行給予。B.抗 CD19 抗體在此所述的聯合療法包括抗⑶19抗體。術語“⑶19”或“⑶19抗原”是指例如由HD237或B4抗體鑒別的為約90kDa的抗原(基澤爾(Kiesel)等人，白血病研究II (LeukemiaResearch II)，12:1119 (1987))。CD19被發現在貫穿B譜系細胞從干細胞階段通過終末分化成為衆細胞的整個分化中的細胞上，這些細胞包括但不限于:前B細胞、B細胞(包括初始B細胞、抗原刺激的B細胞、記憶B細胞、漿細胞、以及B淋巴細胞)以及濾泡性樹突細胞。CD19還被發現在人胎兒組織中的B細胞上。在多個優選實施例中，被在此披露的抗體靶向的⑶19抗原是人⑶19抗原。可以根據在此所述的方法和組合物使用任何合適的抗⑶19抗體。合適的抗⑶19抗體包括，例如，已知的抗CD19抗體、可商購的抗CD19抗體、或使用本領域熟知的方法開發的抗⑶19抗體。如在此所使用，術語“抗體”和“多種抗體”(又稱為免疫球蛋白)包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、由至少兩種不同的表位結合片段形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、人抗體、人源化抗體、駱騎化抗體、嵌合抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、單結構域抗體、結構域抗體、Fab片段、F(ab' ) 2片段、展現出所希望的生物活性的抗體片段(例如，抗原結合部分)、二硫化物連接的Fvs (dsFv)、以及抗獨特型(抗Id)抗體(包括，例如對于在此披露的抗體的抗Id抗體)、胞內抗體、以及上述任何各項的表位結合片段。具體而言，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如含有至少一個抗原結合位點的分子。本披露的⑶19抗體可以是單克隆人、人源化或嵌合抗⑶19抗體。在本披露的組合物和方法中使用的抗CD19抗體可以是裸抗體、免疫偶聯物或融合蛋白。在某些實施例中，本披露的抗CD19抗體可以介導人抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞介導的細胞毒性(CDC)、和/或足以耗盡循環B細胞的量的細胞凋亡。在多個示例性實施例中，本披露的抗CD19抗體是已經被工程化成相對親本抗體而言具有增強的ADCC活性的抗CD19抗體。用于產生具有增強的ADCC活性的抗體變體的方法在下文進行進一步描述。在某些實施例中，本披露的抗CD19抗體是具有增強的ADCC活性的未巖藻糖基化的(afucosylated)抗體。在某些實施例中，在本披露的組合物和方法中使用的抗⑶19抗體可以是具有IgG同種型、特別是IgGU IgG2、IgG3或IgG4人同種型或在人群體中發現的任何IgGUIgG2、IgG3或IgG4等位基因的人、人源化或嵌合抗體。人IgG類別的抗體具有多種功能特征，如在血清中的長半衰期和介導不同的效應子功能的能力(單克隆抗體:原理與應用(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications),威利-利斯公司(ffiley-Liss,Inc.)，第I章(1995))。人IgG類別抗體被進一步分成以下4個子類別:IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4。迄今為止，已經針對作為IgG類別抗體的效應子功能的ADCC和⑶C進行了大量的研究，并且據報道，在該人IgG類別的抗體中，IgGl子類別在人中具有最高的ADCC活性和 CDC 活性(化學免疫學(Chemic`al Immunology), 65,88 (1997))。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體是一種已知的抗⑶19抗體，包括但不限于:HD37(IgGl，ΟΦΑΚ0 北美公司(DAK0 North America, Inc.)，加利福尼亞州(Calif.)卡平特提里亞市(Carpinteria)) ;BU12(卡拉爾(Callard)等人，免疫學雜志，148(10):2983-7(1992)) ;4G7 (IgGl)(米克(Meeker)等人，雜交瘤(Hybridoma)，3 (4):305-20 (1984年冬))；J4.119 (貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)，德國克雷費爾德市(Krefeld)) ;B43 (PharMingen 公司，加利福尼亞州圣地亞哥(San Diego)) ；SJ25C1 (BDPharMingen公司，加利福尼亞州圣地亞哥)；FMC63 (IgG2a)(左拉(Zola)等人，免疫細胞生物學(Immunol.Cell.Biol.) 69 (PT6):411-22(1991);尼科爾森(Nicholson)等人，分子免疫學(Mol.1mmunol.)，34:1157-1165(1997);彼得斯(Pietersz)等人，癌癥免疫學免疫治療(Cancer Immunol.1mmunotherapy)41:53-60(1995)) ；89B(B4) (IgGl)(貝克曼庫爾特公司，佛羅里達州(Fla.)邁阿密(Miami);納德勒(Nadler)等人，免疫學雜志，131 =244-250(1983));和/或HD237 (IgG2b)(關于人白細胞分化抗原的第四次國際研討會(Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens),奧地利(Austria)維也納(Vienna), 1989 ;和皮佐托(Pezzutto)等人,免疫學雜志，138 (9):2793-2799 (1987))。在其他實施例中，本披露的抗CD19抗體是在美國公開號2008/0138336和2009/0142349以及美國專利號7，462，352和7，109, 304中描述的任何抗CD19抗體。在多個示例性實施例中，抗CD19抗體是16C4抗體或其抗原結合片段，如美國公開號2008/0138336和下文所描述的。在某些實施例中，抗⑶19抗體是如以上所述的那些的已知抗⑶19抗體的一種同種型轉換變體(如，轉換成IgGl或IgG3人同種型)。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體可以免疫特異性地結合至人⑶19，并且可以具有如使用本領域的技術人員所已知的方法(例如，BIAcore測定，ELISA) (BiacoreInternational AB公司，瑞典(Sweden)烏普薩拉(Uppsala))所評定的為小于3000pM、小于2500pM、小于 2000pM、小于 1500pM、小于 ΙΟΟΟρΜ、小于 750pM、小于 500pM、小于 250pM、小于200pM、小于150pM、小于ΙΟΟρΜ、小于75pM的解離常數(Kd)。在某些實施例中，本披露的抗CD19抗體可以免疫特異性地結合至人CD19抗原，并且可以具有如使用本領域的技術人員所已知的方法(例如，BIAcore測定，ELISA)所評定的在25至3400pM、25至3000pM、25至2500pM、25 至 2000pM、25 至 1500pM、25 至 1000pM、25 至 750pM、25 至 500pM、25 至 250pM、25至100pM、25至75pM、25至50pM之間的解離常數(Kd)。在某些實施例中，本披露的抗CD19抗體可以免疫特異性地結合至人CD19，并且可以具有如使用本領域的技術人員所已知的方法(例如，BIAcore測定，ELISA)所評定的為500pM、100pM、75pM或50pM的解離常數(Kd)。在某些實施例中，用于在本披露的組合物和方法中使用的抗CD19抗體可能能夠減少或耗盡用其治療的 人中的B細胞。B細胞的耗盡可以是在循環B細胞中、或在特定的組織中，這些組織如但不限于骨髓、脾臟、腸相關淋巴樣組織、和/或淋巴結。在一個實施例中，本披露的抗⑶19抗體可耗盡循環B細胞、血液B細胞、脾B細胞、邊緣區B細胞、濾泡性B細胞、腹膜B細胞和/或骨髓B細胞。在一個實施例中，本披露的抗CD19抗體可以完成以下細胞的耗盡:祖B細胞、早期祖B細胞、晚期祖B細胞、大前B細胞、小前B細胞、未成熟的B細胞、成熟的B細胞、抗原刺激的B細胞、和/或漿細胞。這種耗盡可通過以下不同機制來完成:如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、和/或通過阻斷CD19與其預期配體的相互作用、和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)、B細胞增生的抑制和/或B細胞死亡的誘導(例如，通過細胞凋亡)。通過B細胞的“耗盡”，是指循環B細胞和/或一種或多種特定組織中的B細胞減少了至少約25%、40%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在多個具體實施例中，幾乎所有可檢測到的B細胞從循環和/或一種或多種特定組織中耗盡。在某些實施例中，由本披露的抗⑶19抗體導致的B細胞耗盡可以持續至少I天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、或至少30天。在另一個實施例中，由本披露的抗⑶19抗體導致的B細胞耗盡可以持續至少I周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、或至少10周。在一個進一步的實施例中，由本披露的抗⑶19抗體導致的B細胞耗盡可以持續至少I個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月或至少12個月。
B細胞惡性腫瘤的特征是特異性B細胞亞群的病理性擴張，例如，前體B細胞急性淋巴母細胞白血病的特征是對應于祖B細胞/前B細胞發育階段的B細胞異常擴張。這些惡性B細胞維持正常B細胞標志物如⑶19的細胞表面表達。抗⑶19抗體因此可以耗盡人受試者中的惡性B細胞。在一個具體的實施例中，本披露的抗CD 19抗體可以實現至少20 %、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的人受試者中的惡性B細胞的耗盡。工程化效應子功能在一些實施例中，關于效應子功能對抗CD19抗體進行修飾，例如以便增強該抗體在治療B細胞惡性腫瘤中的有效性。一種示例性效應子功能是抗體依賴性細胞介導的細胞毒性或ADCC，它是這樣一種細胞介導的反應:其中非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上的結合抗體并且隨后導致該靶細胞溶解。這些細胞毒性細胞或效應細胞可以是表達一種或多種FcR的白細胞。效應細胞在小鼠中至少表達Fe Y R1、FC Y RH、Fe Y RIII和/或Fe Y RIV。介導ADCC的一些人白細胞包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和中性粒細胞。這些細胞中，用于介導ADCC的的原代細胞是NK細胞，NK細胞表達FcyRIII。單核細胞表達Fe Y R1、Fe Y RH、Fe Y RIII和/或Fe Y RIV。造血細胞上的FcR表達概述在拉瓦克(Ravetch)和基內特(Kinet),免疫學年度評論(Annu.Rev.1mmunol.)，9:457-92(1991)中。用于增強抗體的效應子功能的一種方法是通過產生工程化的糖型。工程化的糖型可以通過本領域的技術人員已知的任何方法來產生:例如，通過使用工程化的或變體的表達菌株、通過與一種或多種酶(例如，DI N-乙酰葡糖胺轉移酶III(GnTIll))進行共表達、通過在各種生物體或來自各種生物體的細胞系中表達包含Fe區的分子，或通過在該包含Fe區的分子已經被表達之后修飾一種或多種碳水化合物。用于產生工程化的糖型的方法在本領域 中是已知的，并且包括但不限于在以下文獻中描述的那些:烏馬納(Umana)等人，1999,自然生物技術(Nat.Biotechnol) 17:176-180;戴維斯(Davies)等人，20017 生物技術與生物工程(Biotechnol Bioeng) 74 =288-294 ;希爾茲(Shields)等人，2002，生物化學雜志(J Biol Chem) 277:26733-26740 ;新川(Shinkawa)等人，2003，生物化學雜志278 =3466-3473)美國專利號6，602，684 ;美國序列號10/277, 370 ;美國序列號 10/113, 929 ；PCT W000/61739A1 ；PCT W001/292246A1 ；PCT W002/311140A1 ；PCTW002/30954A1 ;Potillegent 技術(Biowa 公司，新澤西州普林斯頓(Princeton, N.J.))；GlycoMAb 糖基化工程化技術(GLYCART生物技術AG公司，蘇黎世(Zurich)，瑞士 )。參見，例如 W000061739 ；EA01229125 ;US20030115614 ;岡崎(Okazaki)等人，2004，JMB, 336:1239-49。還可以進行一個或多個氨基酸置換，氨基酸置換導致存在于Fe區中的糖基化位點(例如，IgG的天冬酰胺297)消除。另外，未糖基化的抗體可以在缺乏必要的糖基化體系的細菌細胞中產生。還可以制備具有改變的糖基化類型的抗體，如具有減小量的巖藻糖殘基的低巖藻糖基化的抗體或具有增加的等分GIcNAc結構的抗體。已證明，這類改變的糖基化模式增大了抗體的ADCC能力。這類碳水化合物修飾可以通過，例如在具有改變的糖基化體系的宿主細胞中表達抗體來完成。具有改變的糖基化體系的細胞已經在本領域中予以描述并且可被用作宿主細胞，在那里以表達本披露的重組抗體，從而產生具有改變的糖基化的抗體。參見，例如希爾茲.R.L(Shields，R.L.)等人(2002)生物化學雜志277:26733-26740 ;烏馬納等人(1999)自然生物技術17:176-1,以及美國專利號6，946，292 ;歐洲專利號EPl, 176，195 ;PCT公開W003/035835 ;W099/54342，這些文獻各自通過引用以其全文結合于此。在一個實施例中，本披露的抗CD19抗體包含一個變體Fe區，該區介導增強的抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)。在一個實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含具有連接至Asn297的多個復雜的N-糖苷連接的糖鏈的一個Fe區，其中巖藻糖未結合至還原端中的N-乙酰葡糖胺，其中所述Fe區介導增強的抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)。在某些實施例中，本披露的抗CD19抗體包含一個Fe變體，其中所述變體Fe結構域具有的對Fe Y受體IIB的親和力是相當的非變體Fe結構域對該受體的親和力的至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在其他實施例中，效應子功能可以通過在抗體的Fe區中引入一個或多個半胱氨酸殘基、從而允許在此區中形成鏈間二硫鍵來改變。由此產生的同型二聚體抗體可以具有改進的內在化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和/或抗體依賴性的細胞毒性(ADCC) ο 參見，卡洛(Caron)等人，實驗醫學雜志(J.Exp Med.) 176:1191-1195 (1992)和肖彭斯.B.J (Shopes, B.，J.)，免疫學雜志，148 =2918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體 抗體還可以使用如在沃爾夫(Wolff)等人,癌癥研究(Cancer Research),53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯劑來制備。具有雙重Fe區的一種抗體也可以被工程化并且因此可以具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見，史蒂文森(Stevenson)等人，抗癌藥物設計(Ant1-Cancer Drug Design)，3:219-230 (1989)。其他工程化抗體的Fe區以便改變效應子功能的方法是本領域中已知的(例如，科尼格(Koenig)等人的美國專利公開號20040185045和PCT公開號W02004/016750，它們描述了改變Fe區以相比對于FC Y RIIA的結合親和力增強對于Fe Y RIIB的結合親和力；還參見，阿莫(Armour)等人的PCT公開號W099/58572、依度斯基(Idusogie)等人的W099/51642、以及迪歐(Deo)等人的美國專利號6，395，272 ;這些文獻的披露內容以其全文結合在此)。修飾Fe區以降低對Fe Y RIIB的結合親和力的方法也是本領域中已知的(例如，拉萬科(Ravetch)等人的美國專利公開號20010036459和PCT公開號W001/79299，這些公開的披露內容以其全文結合在此)。還已經描述了具有多種變體Fe區的修飾的抗體，這些區與野生型Fe區相比具有對于Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIA的增強的結合親和力(例如，斯塔文哈根(Stavenhagen等人)的PCT公開號TO2004/063351，其披露內容以其全文結合在此)。本領域已知的體外測定可以用于確定在本披露的組合物和方法中使用的抗CD19抗體是否能夠介導ADCC。示例性測定描述在美國專利號5，500, 362或5，821，337中。特別地，用于這類測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。可替代地或另外地，相關分子的ADCC活性可以在體內，例如在如克萊因斯(Clynes)等人(國家科學院院刊(美國)，95 =652-656(1998))中披露的那種的動物模型中進行評定。該測定還可以使用一種可商購的試劑盒，例如CytoTox96 (普洛麥格公司(Promega))來進行。
示例性抗CD 19抗體在某些實施例中，在此所述的方法和組合物利用抗⑶19抗體16C4(參見，例如美國公開號2008/0138336)、或其抗原結合片段。16C4是一種⑶19 mAb，它顯示具有有力的ADCC效應子功能。16C4是⑶19 mAb抗⑶19_2的一種未巖藻糖基化的形式，該抗⑶19-2是通過HB12b mAb的人源化和親和力優化而發展的(堪薩斯.GS (Kansas GS)和泰德.TF(Tedder TF).免疫學雜志，1991 ；147 =4094-4102 ;矢沢(Yazawa)等人，國家科學院院刊，2005 ； 102 (42):15178-15183 ;赫布斯特(Herbst)等人，藥理學與實驗治療學雜志(JPharmacol Exp Ther),2010,335(I):213-222)。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含這樣一種重鏈:它包含含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2 ;以及含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的⑶R3。在其他實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含這樣一種重鏈:它包含含有具有與 SEQ ID NO:2 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99%—致性的氨基酸序列的CDRl ;含有具有與SEQ ID NO:3至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的⑶R2 ;以及含有具有與SEQ ID NO:4至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列的⑶R3。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含這樣一種重鏈:它包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一個可變區。在其他實施例中，本披露的抗CD19抗體包含這樣一種重鏈:它包含一個可變區，該可變區含有具有與 SEQ ID NO:1 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含這樣一種輕鏈:它包含含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3。在其他實施例中，本披露的抗CD19抗體包含這樣一種輕鏈:它包含含有具有與 SEQ ID NO:6 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99%—致性的氨基酸序列的CDRl ;含有具 有與SEQ ID NO:7至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的⑶R2 ;以及含有具有與SEQ ID NO:8至少75%、80%、85 %、90 %、95 %、97 %、98 %、或99 % —致性的氨基酸序列的⑶R3。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含這樣一種輕鏈:它包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一個可變區。在其他實施例中，一種抗⑶19抗體包含這樣一種輕鏈:它包含一個可變區，該可變區含有具有與 SEQ ID NO:5 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含:含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重鏈CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重鏈CDR2 ;含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重鏈CDR3 ;含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的輕鏈CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的輕鏈⑶R2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含:含有具有與SEQ ID NO:2至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列的重鏈⑶Rl ;含有具有與SEQ ID NO:3 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99% —致性的氨基酸序列的重鏈 CDR2 ;含有具有與 SEQ ID NO:4 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99%一致性的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ;含有具有與SEQ ID NO:6至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列的輕鏈⑶Rl ;含有具有與SEQ ID NO:7至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的輕鏈CDR2 ;以及含有具有與 SEQ ID NO:8 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%—致性的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在某些實施例中，本披露的抗⑶19抗體包含:包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可變區的重鏈和包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的可變區的輕鏈。在其他實施例中，本披露的抗CD19抗體包含:一個重鏈，該重鏈包含一個可變區，該可變區含有具有與SEQ ID NO:1 至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或 99% —致性的氨基酸序列；和一個輕鏈，該輕鏈包含一個可變區，該可變區含有具有與SEQ ID從):5至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、或99% —致性的氨基酸序列。本披露涵蓋是結合至人⑶19的抗體16C4的衍生物的多種抗體。本領域的普通技術人員所已知的標準技術可以用于在編碼一種抗體的核苷酸序列中引入突變(例如，添力口、缺失和/或置換)，包括例如通常用于產生氨基酸置換的定點誘變和PCR介導的誘變。在一個實施例中，相對于16C4抗⑶19抗體的原始VH和/或VK⑶R，這些VH和/或VK⑶R的衍生物可以包括小于25個氨基酸置換、小于20個氨基酸置換、小于15個氨基酸置換、小于10個氨基酸置換、小于5個氨基酸置換、小于4個氨基酸置換、小于3個氨基酸置換、小于2個氨基酸置換、或小于I個氨基酸置換。在另一個實施例中，這些VH和/或VK⑶R衍生物可以具有在一個或多個預測的非必需的氨基酸殘基(例如，對抗體特異性結合至人CD19不重要的氨基酸殘基)上進行的保守性氨基酸置換。突變還可以例如通過飽和誘變，沿著所有或部分VH和/或VK⑶R編碼 序列來隨機引入，并且可以針對生物活性篩選生成的突變體以鑒別保留活性的突變體。誘變之后，可以表達編碼的抗體并且可以測定該抗體的活性。兩種氨基酸序列的百分比一致性可以通過本領域普通技術人員所已知的任何方法(包括但不限于BLAST蛋白質搜索)來測定。C.抗 CD20 抗體在此所述的聯合療法進一步包括抗⑶20抗體。⑶20抗原(又叫做人B淋巴細胞限制的分化抗原，Bp35)是位于前B和成熟B淋巴細胞上的具有的分子量為約35kD的一種疏水性跨膜蛋白(瓦倫丁 (Valentine)等人生物化學雜志264(19):11282-11287(1989)；愛因菲爾德(Einfeld)等人EMBO雜志7(3):711-717(1988);克拉克(Clark)和萊德貝特(Ledbetter),癌癥研究進展(Adv.Can.Res.) 52:81-149 (1989)；以及瓦倫丁等人生物化學雜志264(19):11282-11287(1989))。CD20在早期前B細胞發育的過程中表達并且保持到漿細胞分化為止；它未被發現在人干細胞、淋巴樣祖細胞或正常漿細胞上。CD20存在于正常B細胞以及惡性B細胞，例如B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的細胞上，其中⑶20在多于90%的NHL上表達(安德森等人，血液，63(6): 1424-1433 (1984))。CD20未被發現在造血干細胞、祖B細胞、正常漿細胞或其他正常組織上(泰德等人，免疫學雜志135(2):973-979(1985))。CD20調控用于細胞周期起始和分化的活化過程中的一個或多個早期步驟(泰德等人，上文)，并且可能用作鈣離子通道(泰德等人細胞生物化學雜志(J.Cell.Biochem.)14D:195(1990))。可以根據在此所述的方法和組合物使用任何合適的抗⑶20抗體。合適的抗⑶20抗體包括，例如，已知的抗CD20抗體、可商購的抗CD20抗體、或使用本領域熟知的方法開發的抗⑶20抗體。本披露的⑶20抗體可以是單克隆人、人源化或嵌合抗⑶20抗體。在本披露的組合物和方法中使用的抗CD20抗體可以是裸抗體、免疫偶聯物或融合蛋白。在某些實施例中，本披露的抗CD20抗體可以介導人抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞介導的細胞毒性(CDC)、和/或足以耗盡循環B細胞的量的細胞凋亡。在多個示例性實施例中，本披露的抗CD20抗體是已經被工程化成相對親本抗體而言具有增強的ADCC活性的抗CD20抗體。用于產生具有增強的ADCC活性的抗體變體的方法在上文予以描述。在某些實施例中，本披露的抗CD20抗體是具有增強的ADCC活性的非巖藻糖基化的抗體。在某些實施例中，在本披露的組合物和方法中使用的抗⑶20抗體可以是具有IgG同種型、特別是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4人同種型或在人群體中發現的任何IgGl、IgG2、IgG3或IgG4等位基因的人、人源化或嵌合抗體。結合⑶20抗原的抗體的實例包括:“C2B8”，現在叫做“利妥昔單抗” (“RITUXAN ，，)；釔-[90]標記的2B8鼠類抗體，命名為“Y2B8”或“替伊莫單抗”(ZEVALIN )(美國專利號5，736，137，通過引用明確結合在此);鼠類IgG2a “BI”，又叫做“托西莫單抗”(貝克曼庫爾特公司)，任選地用mI標記，以生成抗體(碘Im托西莫單抗，BEXXAR )(美國專利號5，595，721，通過引用明確結合在此);鼠類單克隆抗體“1F5”(普萊斯(Press)等人，血液69(2):584-591(1987))及其變體，包括“框架修補的(framework patched) ” 或人源化的 1F5 (W003/002607,梁.S (Leung, S.))；ATCC保藏物HB-96450 ;鼠類2H7和嵌合2H7抗體(美國專利號5，677，180，通過引用明確結合在此)；人源化的2H7 ;huMax-CD20 (Genmab公司，丹麥)；AME_133 (應用分子進化(Applied Molecular Evolution)) ;A20抗體或其變體,如嵌合或人源化A20抗體(分別為cA20、hA20) (US2003/0219433，免疫醫學(Immunomedics));以及單克隆抗體 L27、G28-2、93-1B3、B-CI或NU-B2,它們可獲得自國際白細胞分型研討會(International LeukocyteTyping Workshop)(瓦倫 丁等人,見:白細胞分型 III (Leukocyte Typing 111)(麥克邁克爾(McMichael)編，第440頁，牛津大學出版社(1987))。在一個示例性實施例中，本披露的方法和組合物中聯合利用利妥昔單抗或其抗原結合片段與抗CD19抗體或其片段。利妥昔單抗(RITUXAN )是在1998年4月7日授權的美國專利號5，736，137 (安德森等人)中稱為“C2B8”的抗體。RITUXAN 被指出用于治療患有復發性或難治性低級或濾泡性、⑶20陽性、B細胞非霍奇金淋巴瘤的患者。體外作用機制研究已經表明，RITUXAN 結合人補體并且通過補體依賴性細胞毒性(OTC)溶解淋巴樣B細胞系(雷夫(RefT)等人，血液83(2):435-445 (1994))。此外，它在用于抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)的測定中具有顯著的活性。最近，RITUXAN 顯示在氚標記的胸苷摻入測定中具有抗增生作用并且直接誘導細胞凋亡(馬隆尼(Maloney)等人，血液88 (10):637a (1996))。體內臨床前研究已經顯示，RITUXAN 可能是通過補體和細胞介導的過程，而耗盡來自食蟹猴的外周血、淋巴結以及骨髓的B細胞(雷夫等人，血液83 (2):435-445 (1994))。利妥昔單抗于1997年11月在美國被批準用于以每周375mg/m2的劑量、用四次劑量治療患有復發性或難治性低級或濾泡性⑶20+B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者。術語“利妥昔單抗”或“RITUXAN ”在此是指基因工程化的嵌合鼠類/人單克隆抗體，它是針對⑶20抗原并且在美國專利號5，736，137中命名為“C2B8”，該專利通過引用明確結合在此。用于利妥昔單抗的輕鏈可變區和重鏈可變區的完整核酸和氨基酸序列披露在美國專利號5，736，137中。具體而言，用于利妥昔單抗的輕鏈可變區的核酸和氨基酸序列披露在美國專利號5，736，137的圖4和SEQ ID NO:6中。用于利妥昔單抗的重鏈可變區的核酸和氨基酸序列披露在美國專利號5，736，137的圖5和SEQ ID N0:9中。美國專利號5，736，137的SEQ ID NO:6和9以及圖4和5的核酸和氨基酸序列通過引用明確結合在此。利妥昔單抗還可以由包含存在于大腸桿菌宿主細胞中的載體DNA的CHO細胞轉染瘤制成，該轉染瘤存放于美國典型培養物保藏中心(ATCC)，登錄號為69119。利妥昔單抗還可以從雜交瘤2B8中產生，該雜交瘤存放于ATCC，登錄號為HB11388。D.B細胞惡性腫瘤在此所述的包括抗⑶19抗體和抗⑶20抗體的聯合療法可以用于治療B細胞疾病，包括B細胞惡性腫瘤。術語“B細胞惡性腫瘤”包括從B細胞譜系的細胞衍生的任何惡性腫瘤。示例性的B細胞惡性腫瘤包括但不限于:B細胞亞型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低級/濾泡性NHL、小淋巴細胞(SL) NHL、中間級/濾泡性NHL、中間級彌漫性NHL、高級免疫母細胞NHL、高級淋巴母細胞NHL、高級小無裂細胞NHL、套細胞淋巴瘤、以及大塊疾病NHL ;伯基特淋巴瘤；多發性骨髓瘤；前B急性淋巴母細胞白血病以及從早期B細胞前體衍生的其他惡性腫瘤；常見的急性淋巴細胞性白血病(ALL);慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突變的CLL和免疫球蛋白未突變的CLL ;毛細胞白血病；Null型急性淋巴母細胞白血病；瓦氏巨球蛋白血癥；彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生發中心B細胞樣(GCB)DLBCL、活化的B細胞樣(ABC)DLBCL、以及3型DLBCL ;幼淋巴細胞白血病(pro-lymphocyticleukemia);輕鏈病；漿細胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；漿細胞白血病；意義不明的單克隆丙種球蛋白病(MGUS);燜燃性多發性骨髓瘤(SMM);惰性多發性骨髓瘤(IMM);霍奇金淋巴瘤，包括經典和結節性淋巴細胞主導型；淋巴漿細胞性淋巴瘤(LPL);以及邊緣區淋巴瘤，包括胃黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤。
還涵蓋對這些癌癥的復發的治療。LPHD是霍奇金病的一個類型，不管是放射治療還是化學療法治療它都趨于頻繁復發并且其特征是CD20陽性惡性細胞。CLL是白血病的四種主要類型中的一種。一種成熟B細胞(叫做淋巴細胞)的癌癥-CLL體現為血液、骨髓以及淋巴組織中的細胞的漸進性累積。惰性淋巴瘤是一種生長緩慢的、不可治愈的疾病，其中患者在多個周期的緩解和復發之后平均生存6與10年之間。B細胞耗盡的所希望的水平將取決于疾病。為了治療B細胞惡性腫瘤，可能希望的是最大化B細胞的耗盡，這些B細胞是本披露的抗⑶19和抗⑶20抗體的靶標。因此，為了治療B細胞瘤，希望的是B細胞耗盡足以至少阻止疾病的進展，這可以由本領域中熟練的醫師，例如通過監測具體癌癥的腫瘤生長(大小)、癌細胞類型的增生、轉移、其他病征和癥狀來評定。優選地，B細胞耗盡足以阻止疾病進展，持續至少2個月、更優選3個月、甚至更優選4個月、更優選5個月、甚至更優選6或更多個月。在多個甚至更優選的實施例中，B細胞耗盡足以將緩解時間增加至少6個月、更優選9個月、更優選1、更優選2年、更優選3年、甚至更優選5或更多年。在一個最優選的實施例中，B細胞耗盡足以治愈該疾病。在多個優選實施例中，癌癥患者的B細胞耗盡是治療前基線水平的至少約75%并且更優選是80%、85%、90%、95%、99% 并且甚至是 100%。如果與治療前相比，在給予本披露的組合物之后在癥狀或其他適用指標中存在可測量的改進，則本披露的這些方法減輕或成功治療了患者的B細胞瘤。治療作用可能在給予本披露的組合物之后3-10周內是明顯的。每種疾病的適用指標是適當領域中熟練的醫師所熟知的。例如，該醫師可以監測所治療的患者的疾病的臨床或血清學證據，如疾病的血清學標志物、全血計數(包括B細胞計數)、以及血清免疫球蛋白水平。患者可以表現出在以下各項中的一種或多種方面的可觀察的和/或可測量的減少或不存在:癌細胞數目的減小或癌細胞的不存在；腫瘤大小的減小；對癌細胞侵潤到器官中的抑制(例如，某種程度的減緩并且優選停止)；對腫瘤轉移的抑制(例如，某種程度的減緩并且優選停止)；對腫瘤生長某種程度的抑制；和/或對與具體癌癥相關的一種或多種癥狀的某種程度的減輕；減小的發病率和死亡率、以及活組織質量的改進。優選地，在給予本披露的組合物之后，相比在通過本披露的方法進行治療之前所取得的具體癥狀或指標的基線而言，改進是至少20%、更優選25% -30%、甚至更優選30% -35%、最優選40%及以上。用于評定對瘤的治療的功效或成功的參數將是適當疾病中熟練的醫師所已知的。總體而言，熟練的醫師將尋求具體疾病的病征和癥狀的減少。參數可以包括疾病進展的中位時間、緩解時間以及穩定疾病時間。對于B細胞瘤，可測量的指標可以包括，例如疾病進展的時間、總體和/或無進展生存期的持續時間的增加。在白血病的情況下，可以進行骨髓活檢以確定緩解的程度。完全緩解可被定義為，在治療之后30天，白細胞組成了在患者骨髓中發現的所有細胞的不到5%。以下參考文獻描述了淋巴瘤和CLL、它們的診斷、治療以及用于測量治療功效的標準醫學程序。卡內羅斯.G.P(Canellos G P),李斯特.T.A(Lister, T A),斯克拉.J.L (Sklar J L):淋巴瘤(The Lymphomas).ff.B.桑德斯公司(W.B.SaundersCompany),費城(Philadelphia), 1998 ;范蔣思.K(van Besien K)和卡布尼拉期1.F (Cabani I las, F):臨床表現(Clinical Manifestations),非霍奇金淋巴瘤的分期和治療(Staging and Treatment of Non-Hodgkin，s Lymphoma),第 70 章，第 1293-1338 頁，見:血液學，基本原理和實踐(Hematology, Basic Principles and Practice),第 3 版.霍夫曼(Hoffman)等人(編輯).丘吉爾利文斯通出版社(Churchill Livingstone),費城，2000 ;以及拉埃.K(Rai, K)和 帕特爾.D(Patel, D):慢性淋巴細胞性白血病(ChronicLymphocytic Leukemia),第72章，第1350-1362頁，見:血液學，基本原理和實踐，第3版.霍夫曼等人(編輯).丘吉爾利文斯通出版社，費城，2000。E.藥用配制品在某些方面，本發明提供了包含抗⑶19抗體、抗⑶20抗體、或其組合以及一種藥學上可接受的賦形劑的藥用組合物。在某些實施例中，本披露的藥用組合物被用作藥物。在某些實施例中，抗⑶19抗體、抗⑶20抗體、或其組合可以與一種藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑一起配制作為藥用(治療)組合物，并且可以通過本領域已知的多種方法來給予。如將為熟練的業內人士所理解，給予途經和/或方式將隨所希望的結果而改變。術語“藥學上可接受的載體”是指一種或多種不干擾活性成分的生物活性的有效性的無毒性材料。這類制劑通常可含有鹽、緩沖劑、防腐劑、兼容的載體、以及任選地其他治療齊U。這類藥學上可接受的制劑通常還可含有適合給予人的兼容的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質。可在在此所述的配制品中利用的其他設想的載體、賦形劑、和/或添加劑包括:例如，調味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、脂質類、蛋白質賦形劑(如血清白蛋白、明膠、酪蛋白)、成鹽平衡離子(如鈉)，等等。適合在在此所述的配制品中使用的這些和另外已知的藥用載體、賦形劑和/或添加劑是本領域中已知的，例如，如在“雷氏:藥學的理論與實踐(Remington:The Science and Practice of Pharmacy) ”,第 21 版，利平科特.威廉斯&威爾金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins), (2005),并且在“醫師案頭參考(Physician，s Desk Reference) ”,第 60 版，醫學經濟學(Medical Economics),新澤西州蒙特威爾(Montvale) (2005)中所列舉的。通常可以選擇如本領域技術人員所熟知的或者如在此所述的適合于該聯合療法的抗體的給予方式、溶解度和/或穩定性的藥學上可接受的載體。在此所述的配制品包含處于產生適用于所希望的劑量的w/v的濃度的抗⑶19抗體、抗⑶20抗體、或其組合。在某些實施例中，抗⑶19抗體或抗⑶20抗體在配制品中以約lmg/ml 至約 200mg/ml、約 lmg/ml 至約 100mg/ml、約 lmg/ml 至約 50mg/ml、或 lmg/ml 與約25mg/ml的濃度存在。在某些實施例中，配制品中抗CD19或抗CD20抗體的濃度可以從約0.1至約100重量％變化。在某些實施例中，抗⑶19或抗⑶20抗體的濃度的范圍是0.003至1.0摩爾濃度。在某些實施例中，抗⑶19抗體和抗⑶20抗體被配制在一起，并且每種抗體在配置品中以約 lmg/ml 至約 200mg/ml、約 lmg/ml 至約 100mg/ml、約 lmg/ml 至約 50mg/ml、或 Img/ml與約25mg/ml的濃度存在。在某些實施例中，配制品中每種抗體的濃度可以從約0.1至約100重量％變化。在某些 實施例中，每種抗體的濃度的范圍是0.003至1.0摩爾濃度。在某些實施例中，抗⑶19抗體是根據W02010102276中的任何配制品來配制。在一個實施例中，本披露的配制品是基本上不含有內毒素和/或相關熱原物質的無熱原配制品。內毒素包括被局限在微生物內部并且只有當微生物分解或死亡時才被釋放的毒素。熱原物質還包括來自細菌和其他微生物的外膜的誘導發熱的、熱穩定性物質(糖蛋白)。如果給予人類，這些物質均可以引起發熱、低血壓以及休克。由于潛在的毒性作用，即使是小量的內毒素也必須從靜脈內給予的藥用藥物溶液中去除。食品與藥物管理局(“FDA”)已經為靜脈內藥物應用設置了為在單個一小時時間段內每千克體重每劑量5個內毒素單位(EU)的上限(美國藥典公約(The United States Pharmacopeial Convention),藥典論壇(Pharmacopeial Forum) 26 (I):223(2000))。在某些具體實施例中，組合物中的內毒性和熱原水平是小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于lEU/mg、或小于0.lEU/mg、或小于 0.01EU/mg、或小于 0.00 lEU/mg ο當用于體內給予時，本披露的配制品應是無菌的。本披露的配制品可以通過各種殺菌方法，包括無菌過濾、放射等進行殺菌。在一個實施例中，該配制品是用預先殺菌的0.22微米的過濾器進行過濾殺菌。用于注射的無菌組合物可以根據如在“雷氏:藥學的理論與實踐”，第21版，利平科特.威廉斯&威爾金斯出版公司，(2005)中所述的常規藥學實踐來配制。本披露的治療組合物可以配制以用于特定的給予途經，如口服、經鼻、經肺、局部(包括經頰和舌下)、經直腸、經陰道和/或腸胃外給藥。如在此所使用的短語“腸胃外給藥”和“腸胃外給予的”是指非腸內和局部給藥的、通常是通過注射的給予方式，并且包括但不限于靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外以及胸骨內注射和輸注。本披露的適合于局部或經皮給藥的配制品包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳劑、洗劑、凝膠劑、溶液、貼劑和吸入劑。這種或這些抗體可以在無菌條件下與藥學上可接受的載體混合、并且與可能需要的任何防腐劑、緩沖劑、或推進劑混合(美國專利號7，378，110 ;7，258，873 ;7，135，180 ;美國公開號2004-0042972 ;以及 2004-0042971)。這些配制品可以按照單位劑型呈現并且可以通過藥學領域已知的任何方法來制備。本披露的藥用組合物中的活性成分的實際劑量水平可以改變，以便獲得針對具體患者、組合物、以及給予方式而有效達到所希望的治療應答，而不對該患者產生毒性的活性成分量(例如，“治療有效量”)。選擇的劑量水平將取決于各種藥代動力學因素，包括所采用的本披露的具體組合物的活性、給予途徑、給予時間、所采用的具體化合物的排泄率、治療的持續時間、與所采用的具體組合物聯合使用的其他藥物、化合物和/或材料、正被治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和先前病史、以及在醫學領域中熟知的類似因素。合適劑量的范圍可以是從約0.0001至約100mg/kg體重或更大，例如約0.1、1、10、或50mg/kg體重,其中約I至約10mg/kg體重是優選的。在某些實施例中，該方法包括聯合給予多劑量的抗CD20抗體(或其抗原結合片段)與多劑量的抗CD19抗體(或其抗原結合片段)。該方法可以包括給予1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多個治療上有效劑量的一種藥用組合物，該組合物包含抗CD20抗體(或其抗原結合片段)或抗CD19抗體(或其抗原結合片段)中的一者、或兩者。給予多劑量的藥用組合物的頻率和持續時間可以由本領域的技術人員容易地確定而無需過多的實驗。此外，使用治療有效量的抗體組合對受試者進行的治療可以包括一種單一治療、或優選地可以包括一系列治療。例如，受試者可以使用抗CD20抗體(或其抗原結合片段)和抗CD19抗體(或其抗原結合片段)的組合來治療，其中兩種抗體被給予的劑量范圍是在約I至約100mg/kg體重之間，一周一次，持續在約I至約10周之間、優選在約2至約8周之間、更優選在約3至約7周之間、并且甚至更優選持續約4、5、或6周。可以每年進行治療以預防復發，或在出現復發跡象時進行治療。還將理解的是為用于治療所使用的抗體或其抗原結合片段的有效劑量可以在具體治療的過程中增大或減小。劑量`改變可以是由如在此所述的診斷測定的結果所引起并且因其變得明顯。因此，在一個實施例中，給藥方案包括聯合給予治療有效劑量的抗CD20抗體(或其抗原結合片段)與治療有效劑量的抗CD19抗體(或其抗原結合片段)，其中該組合在一個治療期的第1、8、15以及22天進行給予。在另一個實施例中，該給藥方案包括聯合給予治療有效劑量的抗CD20抗體(或其抗原結合片段)與治療有效劑量的抗CD19抗體(或其抗原結合片段)，其中該組合在一個治療期中的一周的第1、2、3、4、5、6以及7天進行給予。多個進一步的實施例包括:一個給藥方案，其中治療有效劑量的抗CD20抗體(或其抗原結合片段)與治療有效劑量的抗CD19抗體(或其抗原結合片段)聯合給予，其中該組合在一個治療期中的一周的第1、3、5、以及7天進行給予；一個給藥方案，該方案包括聯合給予治療有效劑量的抗CD20抗體(或其抗原結合片段)與治療有效劑量的抗CD19抗體(或其抗原結合片段)，其中抗體組合在一個治療期中的一周的第I和3天進行給予；以及一個優選給藥方案，該方案包括在一個治療期中的任一給定周的第I天聯合給予治療有效劑量的抗CD20抗體(或其抗原結合片段)與抗CD19抗體(或其抗原結合片段)。該治療期可以包括I周、2周、3周、一個月、3個月、6個月、或一年。多個治療期可以彼此相繼或相隔I天、一周、2周、一個月、3個月、6個月、或一年。使用抗CD19抗體(或其抗原結合片段)和抗CD20抗體(或其抗原結合片段)的組合的治療可以包括同時或并存地給予一種或兩種抗體，只要該治療在治療過程中的某一點包括抗CD20抗體(或其抗原結合片段)和抗CD19抗體(或其抗原結合片段)的組合。該聯合療法的作用還可以通過改變給予抗CD20抗體和/或抗CD19抗體治療的時間安排進行優化。聯合使用抗CD20抗體或其抗原結合片段與抗CD19抗體或其抗原結合片段的治療可以是同時的(并存的)、連續的(依序的)、或其組合。因此，經受聯合抗體療法的受試者可以在同一時間(例如，同時地)或在不同時間(例如，在同一天、或在不同天按任一順序依序地)接受抗CD20抗體(或其抗原結合片段)和抗CD19(或其抗原結合片段)。因此，在一些實施例中，將抗CD20抗體(如利妥昔單抗)(或其抗原結合片段)與抗CD19抗體(如16C4)(或其抗原結合片段)同時給予。在其他實施例中，首先給予抗CD20抗體(如利妥昔單抗)(或其抗原結合片段)，并且然后給予抗CD19抗體(如16C4)(或其抗原結合片段)。在仍然其他實施例中，首先給予抗CD19抗體(如16C4)(或其抗原結合片段)，并且然后給予抗CD20抗體(如利妥昔單抗)(或其抗原結合片段)。在一些實施例中，并存地給予抗CD20抗體和抗CD19抗體(如利妥昔單抗和16C4)的組合用于一次給藥，但其他給藥包括在同一天、或在不同天按任一順序進行依序給予。在該抗CD20抗體(如利妥昔單抗)和該抗CD19抗體(如16C4)被同時給予的情況下，它們可以作為各自包含抗CD20抗體(或其抗原結合片段)或抗CD19抗體(或其抗原結合片段)的分開的藥用組合物來給予、或可以作為包含這兩種抗癌劑的一種單一藥用組合物來給予。實例雖然現在大體上描述了本發明，通過參考以下實例將會更容易理解，這些實例僅出于說明某些實施例和本披露的實施例的目的而包括在內，并且不旨在限制本發明。實例1:抗⑶19 mAb 16C4_afuc具有針對多種B白血病和淋巴瘤細胞系的有力的體外ADCC活性
16C4_afuc是mAb 16C4的未巖藻糖基化的形式，該抗體是通過小鼠IgGl mAbHB12B的人源化和親和力成熟而產生的。(堪薩斯GS和泰德TF.免疫學雜志，1991 ; 147:4094-4102 ;矢沢等人，國家科學院院刊，2005 ； 102 (42):15178-15183 ;赫布斯特等人，藥理學與實驗治療學雜志，2010，335 (I) =213-222) ο相比于巖藻糖基化的16C4 mAb, 16C4-afuc具有約9倍增大的對于活化的人Fe YRIIIA和小鼠Fe y RIV的親和力以及增強的ADCC效應子功能。相比于利妥昔單抗，16C4不介導CDC。(赫布斯特等人，藥理學與實驗治療學雜志，2010，335 (I):213-222.)在一大組B白血病和淋巴瘤細胞系中，將16C4_afuc的ADCC活性與巖藻糖基化的前體mAb 16C4的ADCC活性進行對比。將CD20 mAb利妥昔單抗包括在所有測定中作為陽性對照。在測試的所有細胞系下，16C4-afuc在介導ADCC方面顯著比親本mAb抗⑶19 mAb更具效力(圖1A-1E)。當對比16C4-afuc與利妥昔單抗針對全組15種惡性B細胞系的活性時，觀察到三種不同的活性概況:一、16C4-afuc和利妥昔單抗針對其的能力是大約均等的細胞系，由Karpas-1106P細胞示例(圖1A)，它們表達中度至高度量的⑶19 (表I) ;二、針對其利妥昔單抗比16C4-afuc更有效的細胞系，如CLL細胞系JVM2 (圖1B);三、針對其16C4-afuc比利妥昔單抗更有效的細胞系，如0c1-LY19細胞(圖1C)和Daudi細胞(圖1D和表I)。還分別分析這些細胞系對⑶19和⑶20的相對表達以確定這兩種抗原的表面水平是否決定了它們對CD19和CD20 mAb的體外敏感性(表I)。在圖1B中，使用16C4_afuc和利妥昔單抗所觀察到的ADCC活性(細胞毒性最大百分比，圖1E針對CD19 mAb并且圖1F針對⑶20 mAb ；EC50值，圖1G針對⑶19 mAb并且圖1H針對⑶20 mAb)針對⑶19和⑶20的相對表面表達而進行繪制，如通過流式細胞計量術使用mAb 16C4-afuc和利妥昔單抗作為初級抗體用于檢測而測定的。對某些細胞系而言，對抗CD19和抗CD20 mAb的敏感性似乎匹配它們的相對抗原表達。例如，0c1-LY19細胞具有對⑶20的低水平但對⑶19的高表達，并且只應答于16C4治療(表I)。對于Granta-519細胞，觀察到相反的情況，這些細胞高水平表達⑶20并且被利妥昔單抗而不被16C4-afuc有效殺傷。然而，對所有細胞系的一個對比并沒有顯示出抗原表達與對由任一 mAb介導的ADCC的敏感性的顯著相關性。這一相關性的缺乏由Karpas-422細胞展示，這些細胞表達低水平的CD19和CD20，并且被16C4_afuc而不被利妥昔單抗有效殺傷。總之，這些結果證明16C4_afuc具有針對多種細胞系的有力的體外ADCC活性。在測試的15種細胞系中的11種的情況下，16C4-afuc的ADCC活性比⑶20mAb優越。然而，使用這不同組的惡性B細胞系，不存在抗原表達與對⑶19或⑶20 mAb介導的ADCC的敏感性
的顯著相關性。實例2: 16C4-afuc有效針對患者衍生的體外CLL和ALL細胞給定16C4_afuc針對B細胞系的活性，還檢驗了⑶19 mAb針對原代白血病細胞的作用。從診斷患有CLL的患者中獲得六種PBMC樣品，并且測定對于⑶19和⑶20的表面抗原密度。如圖2A所示，這些樣品中的B細胞不同程度地表達CD19和CD20。在這些樣品的一些樣品中，CD20抗原位點的數目比CD19位點的數目大。使用體外基于FACS的細胞毒性測定來評估16C4-afuc殺傷這些CLL樣品中的B細胞的能力，使用利妥昔單抗作為陽性對照。圖2B-2D顯示了對16C4-afuc和利妥昔單抗進行的針對三種代表性CLL樣品的ADCC測定的結果(CLL#106,圖 2B ；CLL#104,圖 2C ；CLL#107,圖 2D)。16C4_afuc 的 EC5tl 值的范圍是從0.007nM至0.063nM。相比之下，利妥昔單抗的EC50值的范圍是從0.639nM至0.682nM。分別將CLL細胞對由16C4-afuc和利妥昔單抗介導的ADCC的敏感性與它們對⑶19和⑶20的表面表達進行對比(分別是圖2E和2F)。此分析的結果顯示出一個明顯的趨勢:對于CD19和⑶20，隨著抗原密度增加，細胞殺傷更有效。使用這些原代CLL樣品的結果還顯示，與利妥昔單抗相比，16C4-afuc在相對低水平的表面抗原表達下在介導體外耗盡方面更有效。還在基于FACS的ADCC測定中使用來自四位患有ALL的患者的PBMC樣品測試了16C4-afuc的活性。對于這些測定中的三個，相比于來自四位健康供體的B細胞，存在足夠的細胞數目來測定⑶19和⑶20的抗原密度(圖3A)。對于正常的外周血B細胞，⑶19和⑶20的平均密度經測定分別是每細胞約20，000和約200，000個抗原位點。相比于正常的B細胞，⑶19表達稍微少一半，而在第三ALL樣品中增大到約兩倍(圖3A)。然而，⑶20抗原位點的數目變化更廣泛。在對于來自患有ALL的供體的樣品的ADCC B細胞耗盡測定中(圖3B-3E)，使用16C4-afuc的EC50值的范圍是從0.002nM至0.131nM。這些值是使用利妥昔單抗獲得的EC5tl值的1/6至小于1/1 00。總之，這些結果顯示16C4_afuc有效地介導針對來自患有CLL和ALL的患者的原代白血病細胞的ADCC。在這些體外測定中，⑶19 mAb比⑶20 mAb利妥昔單抗更有效。在其中⑶20表達水平顯著高于細胞表面⑶19的水平的樣品中，情況也是如此。以上實驗的結果概述在表I中:
權利要求
1.一種用于治療B細胞淋巴瘤的方法，該方法包括對有需要的患者給予一種聯合療法，該聯合療法包括抗CD19抗體和抗CD20抗體，其中所述聯合療法相比以相當的給藥時程表單獨給予的所述抗CD19抗體或所述抗CD20抗體而言，提供了持續更長的持續時間的抗腫瘤活性。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述B細胞淋巴瘤是選自急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
3.如權利要求1所述的方法，其中該聯合療法提供協同治療作用。
4.如權利要求1所述的方法，其中該抗CD19抗體和該抗CD20抗體被同時地給予。
5.如權利要求1所述的方法，其中該抗CD19抗體和該抗CD20抗體被依序地給予。
6.如權利要求1所述的方法，其中該抗腫瘤活性是腫瘤生長的抑制。
7.如權利要求1所述的方法，其中該抗腫瘤活性是惡性B細胞的耗盡。
8.如權利要求1所述的方法，其中該聯合療法相比以相當的給藥時程表單獨給予的所述抗CD19抗體或所述抗CD20抗體而言，賦予持續長了至少一個月的抗腫瘤活性。
9.如權利要求1所述的方法，其中該聯合療法相比以相當的給藥時程表單獨給予的所述抗CD19抗體或所述抗CD20抗體而言，賦予持續長了至少六個月的抗腫瘤活性。
10.如權利要求1所述的方法，其中該聯合療法賦予持續至少六個月的抗腫瘤活性。
11.如權利要求1所述的方法，其中該患者的腫瘤體積在使用該聯合療法的六個月時間段的治療過程中增大了小于10%。
12.如權利要求1所 述的方法，其中該抗CD19抗體具有如在體外所測量的增強的抗體依賴性的、細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
13.如權利要求1所述的方法，其中該抗CD19抗體是未巖藻糖基化的。
14.如權利要求1所述的方法，其中該抗CD19抗體是人或人源化抗體。
15.如權利要求1所述的方法，其中該抗⑶19抗體包含:含有SEQID NO:2的氨基酸序列的重鏈CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重鏈CDR2 ;含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重鏈CDR3 ;含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的輕鏈CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的輕鏈⑶R2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
16.如權利要求1所述的方法，其中該抗CD19抗體包含一個VH結構域，該結構域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
17.如權利要求1所述的方法，其中該抗CD19抗體包含一個VL結構域，該結構域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
18.如權利要求1所述的方法,其中該抗⑶19抗體包含一個VH結構域和一個VL結構域，該VH結構域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，該VL結構域包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
19.如權利要求1所述的方法，其中該抗CD20抗體是利妥昔單抗。
20.一種用于治療B細胞淋巴瘤的方法，該方法包括對有需要的患者給予一種聯合療法，該聯合療法包括抗CD19抗體和抗CD20抗體，其中所述聯合療法的劑量相比是該聯合療法的該劑量至少兩倍高的所述抗CD19抗體的劑量而言，具有更大的抗腫瘤活性。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述B細胞淋巴瘤是選自急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
22.如權利要求20所述的方法，其中該聯合療法提供協同治療作用。
23.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD19抗體和該抗CD20抗體被同時地給予。
24.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD19抗體和該抗CD20抗體被依序地給予。
25.如權利要求20所述的方法，其中該抗腫瘤活性是腫瘤生長的抑制。
26.如權利要求20所述的方法，其中該抗腫瘤活性是惡性B細胞的耗盡。
27.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD19抗體具有如在體外所測量的增強的抗體依賴性的、細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
28.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD19抗體是未巖藻糖基化的。
29.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD19抗體是人或人源化抗體。
30.如權利要求20所述的方法，其中該抗⑶19抗體包含:含有SEQID NO:2的氨基酸序列的重鏈CDRl ;含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重鏈CDR2 ;含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重鏈CDR3 ;含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的輕鏈CDRl ;含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的輕鏈⑶R2 ;以及含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
31.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD19抗體包含一個VH結構域，該結構域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
32.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD19抗體包含一個VL結構域，該結構域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。`
33.如權利要求20所述的方法，其中該抗⑶19抗體包含一個VH結構域和一個VL結構域，該VH結構域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，該VL結構域包含SEQID NO:5的氨基酸序列。
34.如權利要求20所述的方法，其中該抗CD20抗體是利妥昔單抗。
全文摘要
本披露提供了用于使用抗CD19和抗CD20抗體的組合來治療B細胞淋巴瘤的方法。這類方法相比單一抗體療法提供了治療優點，包括延長的抗腫瘤活性和/或減少的劑量。
文檔編號A61K39/00GK103228291SQ201180054813
公開日2013年7月31日 申請日期2011年11月14日 優先權日2010年11月15日
發明者R·赫伯斯特, E·K·沃德, K·P·麥基弗 申請人:米迪繆尼有限公司