Smad7的治療應用的制作方法

Smad7的治療應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用于治療炎性和/或組織損傷病癥的方法和組合物。特別地，描述了局部地或全身地遞送到炎癥和/或組織損傷部位的Smad7組合物的用途。另一些具體的實施方案涉及由放射和/或化學治療引起的副作用(包括但不限于粘膜炎)的治療或預防。
【專利說明】SMAD7的治療應用
[0001]本申請要求2010年9月22日提交的美國臨時申請序列號61/385，445的優先權，其全部內容通過引用并入本文。
[0002]1.聯邦資助研究
[0003]本發明的實施方案的一部分由美國國立衛生研究院授予的資助號GM70966支持。美國政府享有本發明的某些權利。
I1.【技術領域】
[0004]本發明一般地涉及腫瘤和癌癥治療、炎性疾病及慢性傷口愈合領域。更特別地，本發明涉及用于治療炎性疾病、慢性傷口愈合/潰瘍和由化學治療和放射治療以及軍人/工人/安全員/救援人員過度暴露于放射所引起的副作用的方法和組合物。在某些實施方案中，副作用可包括口腔粘膜炎、腸粘膜炎和骨髓衰竭。在一些具體的實施方案中，提供了Smad7 (mothers against decapentaplegic-7)蛋白組合物預防或治療上述適應癥的用途。
N1.【背景技術】
[0005]炎癥是生物體去除損傷性刺激和起始愈合過程的保護性嘗試。沒有炎癥,傷口和感染永遠不會愈合。類似地，組織的進展性破壞將危害生物體的存活。但是，慢性炎癥也可引起多種疾病，例如花粉熱、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、銀屑病甚至癌癥(例如，膽囊癌)，而急性炎癥可通過對急性刺激的過度應答而引起損傷。因此，炎癥通常受到機體的密切調節。
[0006]如上所述，炎癥可分為急性或慢性。急性炎癥是機體對有害刺激的初始應答，并且是通過血漿和白細胞(特別是粒細胞)從血液到受損組織增加的移動實現的。一系列生物化學事件傳播炎性應答并使其成熟,涉及局部血管系統、免疫系統和受損組織內的多種細胞。持久的炎癥(稱為慢性炎癥)引起存在于炎癥部位的細胞類型的進展性改變，并且特征在于組織在炎性過程中同時破壞和愈合。
[0007]急性炎癥在組織損傷后數秒至數分鐘之內開始。損傷可以是純物理損傷，或者其可涉及免疫應答的活化。發生3個主要過程:(a)由血管(小動脈)擴張引起增加的血流供應該區；(b)毛細血管增加的滲透性使得流體和血液蛋白質移動進入間質空間；以及(C)嗜中性粒細胞(以及可能少許巨噬細胞)遷移出小靜脈并進入間質空間。
[0008]一種特定類型的炎性損傷源于治療劑的使用，許多治療劑旨在于患病組織或器官中產生炎癥，但不幸的是，它們很少能夠特異性地靶向那些區域。例如，超過80%的口腔癌患者采用放射治療來治療，而這些個體中的至少75%將發生口腔粘膜炎。口腔粘膜炎還發生于接受造血干細胞移植的患者和需要放射治療和/或化學治療的其它癌癥患者中，并且通常是放射治療最嚴重的并發癥。嚴重的口腔粘膜炎極其疼痛，并且不利于經口攝取。患有口腔粘膜炎的對象通常需要長期疼痛藥物治療以緩解該病癥的癥狀。除炎癥之外，化學和放射誘導的DNA損傷和細胞死亡二者也引起骨髓衰竭，導致死亡。這只是兩個實例，如果更好地調節，不僅可以顯著節省醫療保健花費，還可以在相當大程度上防止痛苦、患者的功能喪失、死亡。
[0009]發明概沭
[0010]因此，根據本發明，提供了用于在對象中治療炎性病癥和/或組織損傷病癥的方法，其包括向所述對象提供治療有效量的Smad7(mothers against decapentaplegichomolog7)。Smad7可作為蛋白質、編碼Smad7蛋白的表達載體(例如病毒載體或非病毒載體)提供。組合物可包含與蛋白質轉導結構域(PTD)融合的Smad7蛋白，并且所述Smad7蛋白融合物還可包含防止Smad7在不存在活化劑時發揮功能的調節結構域,所述方法還包括提供所述活化劑。Smad7可于貼劑(patch)上的制劑中、凝膠狀組合物中、在微球中、在微珠中或在其組合中提供。所述貼劑可包括生物可降解貼劑，例如藻酸聚合物(alginate)。
[0011]Smad7可局部提供到受影響的區域或者全身提供。所述方法還可包括向所述對象施用第二粘膜炎治療，例如粘性2%利多卡因、小蘇打溶液(baking soda solution)、鹽水溶液、BAX溶液(利多卡因、苯海拉明、山梨醇和胃能達(Mylanta))、β胡蘿卜素、生育酚、激光照射、硝酸銀、米索前列醇(misoprostol)、甲酰四氫葉酸(Ieucovorin)、全身性角質形成細胞生長因子、己酮可可堿(pentoxifylline)、別嘌呤醇、全身性硫糖鋁、葡萄糖酸氯己定或冷凍治療。所述組合物可包含可檢測標志物。所述炎性病癥選自:粘膜炎、銀屑病、自身免疫病、慢性傷口、創傷(trauma)、化學治療、放射治療或細胞因子治療。所述方法還可包括再次向所述對象施用所述組合物。
[0012]在另一實施方案中，提供了用于在進行放射治療和/或化學治療的對象中治療或預防口腔粘膜炎的方法，其包括向所述對象提供治療有效量的Smad7 (mothers againstdecapentaplegic homolog7)。Smad7可作為蛋白質、編碼Smad7蛋白的表達載體(例如病毒載體或非病毒載體)提供。組合物可包含與蛋白質轉導結構域(PTD)融合的Smad7蛋白，并且所述Smad7蛋白融合物還可包含防止Smad7在不存在活化劑時發揮功能的調節結構域，所述方法還包括提供所述活化劑。Smad7可于貼劑上的制劑中、在凝膠組合物中、在微球中、在微珠中或在其組合中提供。貼劑可包括生物可降解貼劑，例如藻酸聚合物。
[0013]Smad7可局部提供到受影響的區域或者全身提供。所述方法還可包括向所述對象施用第二粘膜炎治療，例如粘性2 %利多卡因、小蘇打溶液、鹽水溶液、BAX溶液(利多卡因、苯海拉明、山梨醇和胃能達)、β胡蘿卜素、生育酚、激光照射、硝酸銀、米索前列醇、甲酰四氫葉酸、全身性角質形成細胞生長因子、己酮可可堿、別嘌呤醇、全身性硫糖鋁、葡萄糖酸氯己定或冷凍治療。所述對象可包括具有移植物的對象、患癌癥的對象或患需要放射治療之病癥的對象，所述對象患癌癥時所述癌癥選自:口腔癌、結腸癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌和用上半身放射或重復的化學治療周期治療的其它癌癥。所述對象可以已接受上半身放射。該方法還可包括再次向所述對象施用所述組合物。
[0014]在又一實施方案中，提供了用于在對象中治療口腔粘膜炎的藥盒，其包含:(a)Smad7試劑組合物；和(b)遞送系統。所述試劑可包括Smad7蛋白，其任選地與蛋白質轉導結構域(PTD)融合，和/或任選地與防止Smad7在不存在活化劑時發揮功能的調節結構域融合，并且所述藥盒還包含所述活化劑。所述試劑可以是Smad7表達載體，例如病毒表達載體或非病毒表達載體。所述遞送系統可包括凝膠、油膏或貼劑遞送系統。所述組合物可以是凍干的。所述藥盒還可包含可藥用緩沖劑、溶劑或稀釋劑。
[0015]一些實施方案涉及在患有或被懷疑發生口腔粘膜炎或銀屑病的對象中上調TGF- β和/或NF- κ B抑制分子。在某些實施方案中，本文的組合物和方法涉及對對象誘導Smad7 (mothers against decapentaplegic homolog7)基因或蛋白水平或者引入 Smad7 組合物以治療患有本文所公開之病癥的對象。另一些實施方案涉及在有此治療需要的對象中過表達 Smad7 (mothers against decapentaplegic homolog7)基因和 / 或誘導 Smad7 蛋白水平。一些實施方案涉及使用Smad7重組形式的組合物在對象中表達Smad7。
[0016]本文的另一些實施方案涉及在接受或將接受放射治療或化學治療的對象中治療或預防口腔粘膜炎。在某些實施方案中，這些對象正接受癌癥治療，所述癌癥包括但不限于口腔癌、頭頸癌和使用重復的化學治療周期治療的其它癌癥，包括但不限于結腸癌、乳腺癌、胰腺癌和其它癌癥。
[0017]附圖簡沭
[0018]以下附圖構成本說明書的一部分并且用來進一步說明本發明的某些實施方案。通過參考這些附圖中的一個或更多個并聯合本文給出的一些具體實施方案的詳細描述可以更好的理解實施方案。
[0019]圖1.Smad7轉基因小鼠對放射誘導的口腔粘膜炎的抗性。H&E中的虛線突出上皮-基質邊界。Smad7小鼠有完整的口腔上皮層，但野生型(wt)小鼠有口腔潰瘍。pH2AX (DNA損傷的標志物(綠色))在口腔粘膜炎的wt上皮(K14，紅色)中明顯，但在Smad7轉基因病變中顯著減少。針對總白細胞(棕色)染色的CD45在野生型病變中示出嚴重炎癥，但在Smad7轉基因病變中顯著減少。CD45免疫染色在角質層中具有非特異性染色。就免疫染色而言，取鄰近潰瘍的野生型上皮圖像，并且從大多數白細胞接近基膜的區域取Smad7圖像。
[0020]圖2.Smad7轉基因表達逆轉K5.TGFP 小鼠的銀屑病。上圖:3周齡K5.TGFP Iwt/K5.Smad7小鼠(光滑皮膚)及其K5.TGF^ Iwt同胞小鼠(發炎的皮膚，眼睛和耳朵)的總體外觀。下圖:K5.TGFβ皮膚示出表皮增生和皮膚炎癥，但Κ5.Smad7皮膚和K5.Smad7/TGF1wtβ皮膚與正常野生型(WT)皮膚類似。
[0021]圖3.Tat_Smad7蛋白轉導入角質形成細胞。左圖和中圖:經轉導細胞的Tat_Smad7染色(綠色)，由角蛋白K14抗體(紅色)復染。右:pSmad2 (綠色)對經載劑處理的(對照)角質形成細胞有染色，但對轉導有Tat-Smad7的細胞沒有。使用V5抗體的Tat_Smad7染色示出經轉導細胞的核和/或胞質染色，但對照細胞并非如此。
[0022]圖4.Tat-Smad7蛋白到口腔粘膜的局部遞送。左:經PBS緩沖劑處理的頰粘膜。右:經口 Tat-Smad7處理后24小時的頰粘膜。使用V5抗體對Tat_Smad7進行染色(由K14抗體復染)。
[0023]圖5.由Tat_Smad7蛋白引起的皮膚的炎癥消除。上:處理前，K5.TGF^ I小鼠的總體照片及其皮膚活檢的切片，由于嚴重炎癥而具有加厚(起皺)的皮膚和皮疹。下:相同的小鼠處理后27天示出顯著的改善，具有減少的pSmad2和NF κ B ρ50。經載劑處理的小鼠顯示效果(未顯示)。虛線突出了表皮。
[0024]圖6.20Gy照射后，由Tat_Smad7蛋白的經口處理引起的加速的體重恢復。在照射后第5天開始每日的Tat-Smad7處理。用16Gy照射給出類似的結果(未示出)。*:p< 0.05。
[0025]圖7.經口 Tat_Smad7處理加速口腔粘膜炎的愈合。上圖中的黑色虛線突出受損區域的中心，白色虛線突出上皮-基質邊界。注意在20Gy照射后第9天(D9)，經載劑對照處理的口腔粘膜發生口腔粘膜炎，上皮層完全損失，而經Tat-Smad7處理的粘膜保留了口腔上皮薄層和大量浸潤白細胞。到第14天，對照粘膜完成了再上皮化，基質中具有薄的未分化上皮和大量白細胞，而經Tat_Smad7處理的粘膜具有幾乎完全恢復的形態和分化。用16Gy照射在第9天誘導對照小鼠的口腔上皮變薄，但經Tat-Smad7處理的口腔上皮并非如此。
[0026]圖8.Tat-Smad7消除了放射誘導的口腔粘膜炎的損傷。所有切片來自緊鄰20Gy照射后第14天的受損區域中心的口腔粘膜，CD45染色除外，其選自照射后第9天損傷最嚴重的區域。使用K14抗體來復染上皮層(除了在Tunel測定中)。
[0027]說明性實施方案詳述
[0028]如上所述，超過80%的口腔癌患者使用放射來治療，并且這些個體中的至少80%發生口腔粘膜炎。此外，使用標準化學治療方案或上半身放射來治療的個體中至少40%和多至70%發生口腔粘膜炎。例如，由于反復化學治療，約70%的結腸癌患者發生嚴重的口腔粘膜炎。因此，口腔粘膜炎的治療僅在美國就與數百萬患者相關。目前，仍然沒有用于癌癥患者口腔粘膜炎的真正有效的療法。其它炎性疾病狀態對改良療法有類似的需要。
[0029]在下文中公開的Smad7療法將對口腔粘膜炎及其它慢性、急性或周期性/間歇性炎性狀態具有顯著的治療作用。因為與現有療法(例如，Kepivance?)相比，該蛋白質對炎癥具有強得多的作用，并且更好地促進傷口愈合，因為局部治療可以是使用者友好的(例如，由患者施用口服溶液、凝膠或貼劑)，所以這些療法代表了相當大的進步。的確，因為嚴重口腔粘膜炎患者通常需要延長的住院時間以應付進食管、脫水和施用阿片類以控制疼痛感，所以本文所述的實施方案代表改善患者的生活質量并顯著減輕醫療花費負擔的重大機會。
[0030]使用Smad7作為口腔粘膜炎治療劑的該方法是完全獨特的。特別地，本發明人提出Smad7蛋白可容易地重組產生并直接使用或者包封進轉導靶細胞的遞送載劑(例如貼劑、溶液和凝膠)中使用并發揮生物活性。此外，該類型的Smad7遞送因而應示出有幾乎沒有副作用的治療效力。但是，也涵蓋Smad7的病毒載體遞送以及體內誘導和活化。
[0031]根據本發明的多種實施方案，可以采用本領域技術中的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技術。在文獻中充分地解釋了這些技術。參見，例如，Sambrook等(1990)。
[0032]A.Smad7 組合物
[0033]mothers against decapentaplegic homolog7 (Smad7)在之前被鑒定為通過若干機制拮抗TGF-β信號轉導的拮抗劑，所述機制包括:(a)阻斷TGF-β受體介導的磷酸化和Smad信號的核易位；(b)通過特異性泛素-蛋白酶體通路增加TGF-β受體和Smad信號的降解，以及(c)抑制Smad信號與Smad結合元件(SBE)的結合。Smad7還拮抗其它信號通路，例如NF-K B通路。
[0034]Smad7蛋白由SMAD7基因(SEQ ID NO:1和2)編碼。如同許多其它TGF-β家族成員，Smad7參與細胞信號轉導。它是TGF-β I型受體拮抗劑。它阻斷TGF-β I和與受體相關的激活因子，阻斷對Smad2接近。它是抑制性Smad(1-SMAD)，并且由SMURF2增強。Smad7還增強肌分化。
[0035]在一個實施方案中，本發明涉及Smad蛋白質組合物。除完整Smad7分子之外,本發明還涉及保持抗炎性活性的多肽片段。片段可以通過對編碼區(下文中討論)內的翻譯終止位點的基因改造來產生。或者，用蛋白水解酶(稱為蛋白酶)處理Smad7分子可產生多種N端、C端和內部片段。可以根據已知方法來純化這些片段，例如沉淀(例如，硫酸銨)、HPLC、離子交換色譜、親和色譜(包括免疫親和色譜)或多種大小分離(沉降、凝膠電泳、凝膠過濾)。[0036]還涵蓋Smad7的變體-它們可以是替換、插入或缺失變體。缺失變體缺少對于活性而言非必需的天然蛋白質的一個或更多個殘基，包括上述截短突變體。替換變體通常包含蛋白質一個或更多個位點處的一個氨基酸替換為另一氨基酸，并且可以設計為調節多肽的一個或更多個特性(例如對抗蛋白質水解切割的穩定性)，而不損失其它功能或特性。該類替換優選為保守的，即一個氨基酸被一個具有類似形狀和電荷的氨基酸所替換。保守替換在本領域中是公知的，并且包括例如，每個氨基酸可以被不同的氨基酸改變或替換。在產生替換變體時，通常考慮親疏水指數、親水性、電荷和大小。[0037] —種特定類型的變體是融合蛋白。一般而言，該分子為天然分子的全部或大部分在N或C端與第二多肽的全部或一部分相連。例如，融合可采用來自其它物種的前導序列從而允許蛋白質在異種宿主中重組表達。另一有用的融合包括添加功能活性結構域例如抗體表位，以有助于融合蛋白的純化。另一類型的融合包括連接可充當活化或失活配體之靶標的結構域，從而使得一旦遞送到對象即控制融合蛋白的功能。這樣的結構域包括，例如，類固醇配體結合結構域(例如，ER、PR、GR)，其可被能夠獨有地活化這些類固醇配體結合結構域和/或天然不存在的小分子(例如，4-羥基他莫西芬或RU486)活化，因此將使得能夠通過這些小分子的存在來完全控制Smad7的功能。[0038]在本發明中特別有用的另一特定形式的融合蛋白是包含蛋白質轉導結構域(PTD)的融合蛋白，所述蛋白質轉導結構域也稱為細胞遞送結構域或細胞轉導結構域。在本領域中已描述了這樣的結構域，并且其一般表征為短的兩性肽或陽離子肽和肽衍生物，其通常包含多個賴氨酸和精氨酸殘基(Fischer，2007)。可能最為周知的PTD是HIV的TAT蛋白，及HSVVP16。另一些實例示于下表1中。
[0039]
【權利要求】
1.用于在對象中治療炎性病癥的方法，其包括向所述對象提供治療有效量的Smad7(mothers against decapentaplegic homolog7)。
2.根據權利要求1所述的方法，其中Smad7作為蛋白質、編碼Smad7蛋白的表達載體提供。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述組合物包含與蛋白質轉導結構域(PTD)融合的Smad7蛋白。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述Smad7蛋白融合物還包含防止Smad7在不存在活化劑時發揮功能的調節結構域，并且所述方法還包括提供所述活化劑。
5.根據權利要求2所述的方法，其中所述表達載體是病毒載體。
6.根據權利要求2所述的方法，其中所述表達載體是非病毒載體。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述Smad7在貼劑上的制劑中、在凝膠組合物中、在微球中、在微珠中或在其組合中提供。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述貼劑包括生物可降解貼劑。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述生物可降解貼劑包含藻酸聚合物。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述Smad7局部提供到受影響區域。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述Smad7全身地提供。 10.根據權利要求1所述的方法，其還包括向所述對象施用第二粘膜炎治療。 11.根據權利要求10所述的方法，其中所述第二粘膜炎治療是粘性2%利多卡因、小蘇打溶液、鹽水溶液、BAX溶液(利多卡因、苯海拉明、山梨醇和胃能達)、β胡蘿卜素、生育酚、激光照射、硝酸銀、米索前列醇、甲酰四氫葉酸、全身性角質形成細胞生長因子、己酮可可堿、別嘌呤醇、全身性硫糖鋁、葡萄糖酸氯己定或冷凍治療。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含可檢測標志物。
13.根據權利要求1所述的方法，其中急性炎性病癥選自粘膜炎、銀屑病、自身免疫病、慢性傷口、創傷、化學治療、放射治療或細胞因子治療。
14.用于在進行放射治療和/或化學治療的對象中治療或預防口腔粘膜炎的方法，其包括向所述對象提供治療有效量的Smad7 (mothers against decapentap legichomolog7)。
15.根據權利要求14所述的方法,其中Smad7作為蛋白質、編碼Smad7蛋白的表達載體提供。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述組合物包含與蛋白質轉導結構域(PTD)融合的Smad7蛋白。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述Smad7蛋白融合物還包含防止Smad7在不存在活化劑時發揮功能的調節結構域，并且所述方法還包括提供所述活化劑。
18.根據權利要求15所述的方法，其中所述表達載體是病毒載體。
19.根據權利要求15所述的方法，其中所述表達載體是非病毒載體。
20.根據權利要求14所述的方法，其中所述Smad7在貼劑上的制劑中、在凝膠組合物中、在微球中、在微珠中或在其組合中提供。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述貼劑包括生物可降解貼劑。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述生物可降解貼劑包含藻酸聚合物。
23.根據權利要求14所述的方法，其中所述Smad7局部提供到受影響區域。
24.根據權利要求14所述的方法，其中所述Smad7全身地提供。
25.根據權利要求14所述的方法，其還包括向所述對象施用第二粘膜炎治療。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述第二粘膜炎治療是粘性2%利多卡因、小蘇打溶液、鹽水溶液、BAX溶液(利多卡因、苯海拉明、山梨醇和胃能達)、β胡蘿卜素、生育酚、激光照射、硝酸銀、米索前列醇、甲酰四氫葉酸、全身性角質形成細胞生長因子、己酮可可堿、別嘌呤醇、全身性硫糖鋁、葡萄糖酸氯己定或冷凍治療。
27.根據權利要求14所述的方法，其中所述對象包括具有移植物的對象、患癌癥的對象或患需要放射治療之病癥的對象。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述對象患有癌癥，并且所述癌癥選自口腔癌、結腸癌、乳腺癌、頭頸癌、胰腺癌，以及使用上半身放射或重復的化學治療周期來治療的其它癌癥。
29.根據權利要求14所述的方法，其中所述對象已接受上半身放射。
30.根據權利要求11所述的方法，其還包括再次向所述對象施用組合物。
31.用于在對象中治療口腔粘膜炎的藥盒，其包含: (a)Smad7試劑組合物；和 (b)遞送系統。
32.根據權利要求31所述的`藥盒，其中所述試劑包含Smad7蛋白。
33.根據權利要求32所述的藥盒，其中所述Smad7蛋白與蛋白質轉導結構域(PTD)融八口 ο
34.根據權利要求33所述的藥盒,其中所述Smad7蛋白融合物還包含防止Smad7在不存在活化劑時發揮功能的調節結構域，并且所述藥盒還包含所述活化劑。
35.根據權利要求26所述的藥盒，其中所述試劑是Smad7表達載體。
36.根據權利要求35所述的藥盒，其中所述表達載體是病毒表達載體。
37.根據權利要求35所述的藥盒，其中所述表達載體是非病毒表達載體。
38.根據權利要求31所述的藥盒，其中所述遞送系統包含凝膠、油膏或貼劑遞送系統。
39.根據權利要求31所述的藥盒，其中所述組合物是凍干的。
40.根據權利要求31所述的藥盒，其還包含可藥用緩沖劑、溶劑或稀釋劑。
【文檔編號】A61K38/17GK103501803SQ201180051033
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2011年9月21日 優先權日:2010年9月22日
【發明者】王曉京, 優素福·里法利, 張慶紅 申請人:科羅拉多大學董事會