包含乳香的酸性提取物的組合物的制作方法

專利名稱：包含乳香的酸性提取物的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及來自乳香的分離的酸性級分的組合物，及其應用。
背景技術：
對來自植物和植物產物、用于多種治療應用的新型藥物實體的追尋源于古代并持續至今。一種這樣的來源是乳香(mastic),也被稱為乳香(gum mastic)或乳香(masticgum),其是作為漆樹科(Anacardiaceae)的成員乳香黃連木(Pistacia lentiscus L.)的滲出物獲得的樹脂。乳香在古地中海世界用于胃腸功能疾患，比如胃痛、消化不良和消化性潰瘍。已公開向患有十二指腸潰瘍的人類患者和患有誘發性胃潰瘍和十二指腸潰瘍的實驗大鼠口服施用乳香具有治療作用(Al-Habbal等人(1984) Clin Exp Pharmacop Physio11(5):541-4 ;Said 等人(1986) J Ethnopharmacol 15 (3):271-8)。雖然已公開乳香對引起消化性潰瘍病的病原體幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)具有體外殺菌作用(Marone等(2001) J Chemother 13:611-614)，但其他報道公開了在將乳香施用于幽門螺桿菌陽性的人類患者(Bebb等(2003 ) J Antimicrob Chemother 52:522-23)或施用于實驗感染的小鼠(Loughlin 等(2003) J Antimicrob Chemother 51:367-371)時未發揮抗細菌活性。希臘專利第GR 1，003，541號公開了提取自乳香黃連木Chia品種(Pistacialentiscus var Chia)的葉、枝和果實的希俄斯乳香油的抗微生物和抗真菌作用。希臘專利第GR I, 003，868號公開了來自乳香黃連木Chia品種的產物作為抗氧化齊U、作為傷口(wound)愈合誘導劑和作為細胞生長抑制劑的應用。美國專利申請公布第2005/0238740涉及乳香和其組分用于控制微生物感染的應用。Paraschos等人(2007),由上述專利申請的發明人中的一些所著，公開了不含聚合物的總乳香提取物(TMEWP)的制備，其通過對粗乳香進行極性溶劑萃取并從其中去除不溶性的聚合物聚_β -月桂烯以及從TMEWP中分離酸性級分和中性級分而制備(Paraschos等(2007)Antimicrob Agents Chemother 51 (2):551-559)。根據該公開，向幽門螺桿菌感染的小鼠施用TMEWP 3個月時間導致細菌定殖的30倍減少，很大程度上歸因于從酸性級分純化的特定化合物。作者指出，由于推測在先前研究中所用的粗乳香制品中高百分比的聚-β -月桂烯阻礙在口服施用過程中潛在的體內活性，因此制備了 TMEWP。作者還公開了去除聚-β -月桂烯可產生具有抗幽門螺桿菌活性的增強的治療部分。EP專利申請第1520585號涉及利用來自某些黃連木屬物種的天然植物產物或精油或組分的癌癥治療。國際專利申請公布第WO 2005/112967號涉及希俄斯乳香的抗癌活性。Van der Berg等人(1998)公開了利用萃取和尺寸排阻色譜對乳香的聚合物級分的分離和純化(Van der Berg 等人(1998) Tetrahedron Lett 3:2645-2648)。Barra等人(2007)公開了對來自乳香黃連木的精油的萃取和氣相色譜分析(Barra 等人(2007) J Agric Food Chem 55(17):7093-7098)。根據該公開內容，鑒定了總45個化合物，包括作為主要化合物之一的β -月桂烯。
本發明的發明人中的某些的國際專利申請公布第WO 2010/100650號涉及乳香級分的治療應用。本發明的發明人中的某些的國際專利申請公布第WO 2010/100651號涉及聚月桂烯的組合物。國際專利申請公布第WO 2005/094837號涉及乳香二烯酸作為DNA聚合酶-β的抑制劑、用于治療癌癥、腫瘤和神經變性疾病的應用。Marner等人(1991)公開了來自乳香黃連木(P.lentiscus)的乳香的多種類三職(triterpenoid)的鑒定(Marner 等人(1991) Phytochemistry, 30, 3709-3712)。Giner-Larza 等人(2002)公開了來自黑黃連木(pistacia terebinthus)樹瘤的抗炎三職(triterpene) (Planta Med (2002)，68，311—315)。然而，對于用來治療多種病癥的安全、通用和有效的劑仍存在未滿足的需求，所述多種病癥比如與神經功能缺損相關的那些病癥和相關的神經變性病癥，包括，例如，阿爾茨海默病、中風和類似病癥，以及其他病癥諸如組織再生、傷口和組織修復。發明概述本發明提供了包括乳香的分離的酸性級分的藥物組合物，其包含在極性和非極性有機溶劑中均可溶的酸性化合物。本發明的級分表現出可被開發用于多種治療應用的多種有益的生物活性。更具體地，現在公開了乳香的分離的酸性級分具有活性且可用于治療神經功能缺損和相關的神經變性病癥(例如，通過對神經變性病癥進行逆轉)、中風、組織再生、傷口和組織修復，和類似的病癥。根據一些實施方案，本發明還提供了包括來自乳香的分離的酸性級分的分離的化合物的組合物，所述分離的化合物具有治療活性。在一些實施方案中，組合物可包括多種分離的化合物，所述分離的化合物選自在根據本發明的乳香的酸性級分中發現的單獨的酸性化合物。根據一些實施方案，組合物包括選自乳香二烯酸(masticadienoic acid)、異乳香二烯酸(isomasticadienoic acid)、乳香二烯醇酸(masticadienolic acid)、異乳香二烯醇酸(isomasticadienolic acid)、3_0_乙酸基乳香二烯醇酸(3-0-acetylmasticadienolic acid)、3_0_ 乙酸基表乳香二烯醇酸(3-0-acetyl epimasticadienolicacid)、3_0_ 乙酸基異乳香二烯醇酸(3-0-acetyl isomasticadienolic acid)、3_0-乙酸基表_異乳香二烯醇酸(3-0-acetyl ep1-1somasticadienolic acid)、齊墩果酮酸(oleanonic acid)、模繞酮酸(moronic acid)和 3-氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸(3-oxo_lup-20 (29)-en-28-oic acid)的至少3種分離的化合物。在一些示例性的實施方案中，組合物包括至少乳香二烯酸、異乳香二烯酸和齊墩果酮酸。這樣的組合物意外地表現出協同效應，從而在神經功能缺損和神經變性疾患/病癥的治療中，與僅單獨的化合物比較，化合物的組合表現出顯著增高的療效。根據本發明的實施方案的乳香酸性級分可與現有技術中所公開的乳香級分區別，因為其制備包括使用極性溶劑和非極性溶劑，而現有技術僅教導使用極性溶劑。通過僅使用極性溶劑制備的酸性級分包含不溶于非極性溶劑諸如己烷的化合物，而這些化合物在本發明的酸性級分中是不存在的。因此，本發明的級分包括與現有技術中所公開的不同的化合物的組合。并且，本發明的發明人已發現，本發明的酸性級分意外地具有現有技術未提到的一系列非常意外的治療活性。
本發明的教導由以下來示例:通過三步提取程序制備乳香提取物，從而獲得在極性溶劑和非極性溶劑中均可溶的酸性級分，且其中去除了在極性溶劑中可溶但在非極性溶劑中保持不可溶的來自乳香的物質。在另外的實施方案中，分離的酸性級分的主要化合物已被分離和鑒定。這些化合物中的一些的多種組合在多種神經功能缺損(比如，例如，中風)的治療中和在相關神經變性疾患諸如阿爾茨海默病的治療中表現出意外的協同效應。不希望被任何特定的理論或作用機制所束縛地，本文所公開的乳香的分離的酸性級分的活性使本發明對于與受損的神經元病癥相關的多種疾病或病癥是有用的，比如，例如，受與突觸形成不足相關聯的病理影響的腦和神經組織中神經元間連接點的再形成和克服有缺陷的神經元間通訊。該病理是許多神經系統病狀的基礎，包括例如阿爾茨海默病。顯示乳香的分離的酸性級分的活性可用于中風的治療。本發明還可用于促進傷口愈合和大量細胞和組織的復壯。本發明還可用于延長動物的壽命。還需理解的是，本文所公開的級分和組合物的生物活性受存在于在不應用本文所公開的前兩個提取步驟的情況下制備的酸性級分中的某些化合物的存在所抑制。根據一些實施方案，本發明提供了包括有效量的乳香的分離的酸性級分，和藥學上可接受的載體的組合物；其中所述級分的特征在于其在至少一種極性有機溶劑中是可溶的且在至少一種非極性有機溶劑中是可溶的，且其中所述級分基本上不含在所述極性有機溶劑中可溶但在所述非極性有機溶劑中不可溶的化合物。在一些實施方案中，組合物由包括以下步驟的方法所獲得:(a)用極性有機溶劑處理乳香；(b)分離在所述極性有機溶劑中可溶的級分；(C)任選地去除所述極性有機溶劑；

(d)用非極性有機溶劑處理步驟(b)或(C)中獲得的可溶級分，(e)分離在所述非極性有機溶劑中可溶的級分；(f)任選地去除所述非極性有機溶劑；(g)將步驟(f)中獲得的級分溶解于有機溶劑中；(h)用堿性溶液處理步驟(g)中獲得的溶液從而獲得堿性級分；和(i)用酸溶液使步驟(h)中獲得的所述堿性級分酸化；在一些實施方案中，步驟(d)至(f)可位于步驟(a)至(C)之前。在一些實施方案中，步驟(h)中用堿性溶液進行的處理(堿化)包括用一種或多種適宜的堿性水溶液萃取步驟(g)中獲得的溶液；或將步驟(g)中獲得的溶液與堿性離子交換樹脂接觸。在一些實施方案中，步驟(h)包括將步驟(g)中獲得的溶液與堿性離子交換樹脂接觸，且之后通過過濾去除堿性離子交換樹脂。在這些實施方案中，步驟(i)包括用酸性溶液處理堿性尚子交換樹脂。在一些實施方案中，該方法還包括以下步驟:(j)用有機溶劑萃取步驟(i)中獲得的酸化的級分；k)任選地，用干燥劑與步驟(j)中獲得的有機級分接觸從而去除剩余的水；(I)從步驟⑴、(j)或(k)中的任一步驟中獲得的級分中去除有機溶劑和/或多余的酸；和
(m)將步驟(1)中獲得的分離的級分溶于載體中。在一些實施方案中，在步驟(d)至(f)之前進行步驟(a)至(C);或在步驟(a)至(C)之前進行步驟⑷至⑴。在一些實施方案中，(a)至(C)和/或步驟⑷至⑴重復多個循環。在一些實施方案中，步驟(c)、(f)和(I)包括通過選自由旋轉蒸發、施加高真空和其組合組成的組的手段去除溶劑。在一些實施方案中，步驟(h)包括用堿性水溶液萃取步驟(g)中獲得的溶液，并收集從而獲得的有機級分。在一些實施方案中，該方法還包括合并從步驟(h)獲得的有機級分與步驟(i)、(j)或(k)的任一步驟中獲得的級分。在一些實施方案中，將步驟(h)中獲得的有機級分與以從步驟(h)中獲得的有機級分的從約0.1%至約50%的范圍的量的在步驟或(k)的任一步驟中獲得的級分合并。在一些實施方案中，該量在從0.5至50%的范圍中；或2至25%的范圍中；或0.1至10%的范圍中。適用于本發明的極性有機溶劑可選自醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈、和其組合。適宜的極性有機溶劑的具體的實例包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲-丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-丁醇、乙二醇、乙二醇單甲醚、乙醚、甲基乙醚、乙基丙醚、甲基丙醚、I，2- 二甲氧基乙烷、四氫呋喃、二氫呋喃、呋喃、吡喃、二氫吡喃、四氫吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙 酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基甲酮、二乙基甲酮、乙腈、丙腈、和其組合。在一些實施方案中，極性有機溶劑選自甲醇和乙醇、或其組合。在一些實施方案中，極性溶劑是乙醇。適用于本發明的非極性有機溶劑可選自無環的或環狀的、飽和的或不飽和的脂族烴和芳族烴、和其組合，其中每一個任選地由一個或多個鹵素取代。在一些實施方案中，非極性有機溶劑選自C5-C10烷烴，C5-C10環烷烴，C6-C14芳族烴和C7-C14全氟烷烴、和其組
口 ο在一些實施方案中，非極性有機溶劑選自戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、環戊烷、環己烷、環庚烷、苯、甲苯、二甲苯和其異構體和混合物。在一些實施方案中，C5-C10烷烴選自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、環己烷，和其異構體和混合物組成的組。在一些實施方案中，非極性有機溶劑是己烷。在一些實施方案中，步驟(g)和步驟(j)中的有機溶劑獨立地選自由二烷基醚(dialkyl ether)、烷基芳基醚、二芳基醚、酯、酮、鹵化烴、C5-C14芳族烴、C5-C14全氟烷烴組成的組。在一些實施方案中，步驟(g)和步驟(j)中適宜的有機溶劑是相同的或不同的。在一些實施方案中，有機溶劑包括二烷基醚。在一些實施方案中，有機溶劑是乙醚。在一些實施方案中，極性有機溶劑包括乙醇，非極性有機溶劑包括己烷且有機溶劑包括乙醚。在一些實施方案中，步驟(h)包括用堿性水溶液進行堿化。在一些實施方案中，堿性水溶液通過將無機堿溶于水中而制備。在一些實施方案中，無機堿選自由碳酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸氫鈉、磷酸鈉、氫氧化鋰、碳酸鋰和磷酸鉀組成的組。在一些實施方案中，無機堿是碳酸鈉。在一些實施方案中，水中的碳酸鈉的濃度在2至20% w/w的范圍。在一些實施方案中，碳酸鈉的濃度在3至15% w/w的范圍。在一些實施方案中，碳酸鈉的濃度為約5% w/w。在一些實施方案中，無機堿是氫氧化鈉。在一些實施方案中，堿性水溶液通過將水溶性的有機堿溶于水中而制備。在一些實施方案中，第一無機堿為約5% w/w碳酸鈉水溶液,然后為約4% w/w氫氧化鈉水溶液。在一些實施方案中，步驟(h)中的堿化包括將步驟(g)中獲得的溶液與堿性離子交換樹脂接觸。在一些實施方案中，堿性離子交換樹脂包括苯乙烯二乙烯苯、聚丙烯共聚物或酚醛共聚物(formophenolic copolymer)。在一些實施方案中，使溶液堿化至高于約7的pH。在一些實施方案中，使溶液堿化至8-10的pH范圍。在一些實施方案中，使溶液堿化10-13的pH范圍。在一些實施方案中，使溶液堿化至> 13的pH。在一些實施方案中，步驟(i)中的酸性溶液包括酸性水溶液或酸性非水溶液。在一些實施方案中，步驟(i)中的酸性水溶液通過將無機酸溶于水中而制備或通過稀釋濃縮的礦物酸溶液而制備。在一些實施方案中，酸性水溶液是鹽酸或磷酸的溶液。在一些實施方案中，酸性水溶液是鹽酸的溶液。在一些實施方案中，步驟(i)中的酸性水溶液通過將有機酸溶于水中或通過稀釋濃縮的礦物酸溶液來制備。在一些實施方案中，進行酸化至低于約7的pH。在一些實施方案中，進行酸化至低于約6的pH。在一些實施方案中，進行酸化至低于約5的pH。在一些實施方案中，進行酸化至低于約4的pH。在一些實施方案中，進行酸化至低于約3的pH。在一些實施方案中，進行酸化至范圍在1-3的pH。在一些實施方案中，步驟(i)中的酸性非水溶液通過將有機酸溶于選自醇、酯、醚、酰胺或其混合物的非水有機溶劑而制備。在一些實施方案中，非水溶劑是甲醇或乙醇或其混合物。在一些實施方案中，有機酸選自由甲酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸和對甲苯磺酸組成的組。在一些實施方案中，步驟(k)中所用的干燥劑選自由硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸鈣、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鉀組成的組。在一些實施方案中，組合物基本上不含在所述極性有機溶劑中可溶和在所述非極性有機溶劑中不可溶的萜烯化合物。
在一些實施方案中，組合物包括基于組合物的總重量從約0.01至約25% (w/w)的乳香的分離的酸性級分。在一些實施方案中，組合物包括基于組合物的總重量從約0.01至約12% (w/w)的乳香的分離的酸性級分。在一些實施方案中，分離的酸性級分包括以下中的至少一種:乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；模繞酮酸；和3-氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸。每種可能性是本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，分離的酸性級分還包括以下中的至少一種:齊墩果醇酸(oleanolic acid);烏宋酸(ursonic acid);和熊果酸(ursolic acid)。每種可能性是本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，分離的酸性級分基本上不含乳香二烯酸。在一些實施方案中，分離的酸性級分可以基本上不含精油。在一些實施方案中，分離的酸性級分包括至少一種職酸(terpenoic acid)。在一些實施方案中，分離的酸性級分包括至少一種三職酸(triterpenoic acid)。在一些實施方案中，至少一種萜酸包括至少一種三萜酸。在一些實施方案中，至少一種三萜酸選自由以下組成的組:乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；模繞酮酸；3_氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸、和其組合。每種可能性是本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，至少一種萜酸是單體形式。在一些實施方案中，至少一種萜酸是寡聚形式。在一些實 施方案中，寡聚形式選自由二聚體、三聚體、和其組合組成的組。每種可能性是本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，寡聚形式是二聚體。在一些實施方案中，寡聚形式是三聚體。在一些實施方案中，至少一種三萜酸是單體形式。在一些實施方案中，至少一種三萜酸是寡聚形式。在一些實施方案中，寡聚形式選自由二聚體、三聚體、和其組合組成的組。每種可能性是本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，寡聚形式是二聚體。在一些實施方案中，寡聚形式是三聚體。在一些實施方案中，分離的酸性級分包括單體三萜酸和二聚三萜酸的組合。在一些實施方案中，分離的酸性級分包括單體三萜酸、二聚三萜酸和三聚三萜酸的組合。在一些實施方案中，組合物包括以下中的至少一種:乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；模繞酮酸；和3-氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸。每種可能性代表本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，組合物還包括以下中的至少一種:齊墩果醇酸；烏宋酸；和熊果酸。每種可能性代表本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，組合物包括至少一種萜酸。萜酸的實施方案如上所述。在一些實施方案中，組合物包括至少一種三萜酸。三萜酸的實施方案如上所述。
在一些實施方案中，組合物基本上不含乳香二烯酸。在一些實施方案中，乳香來自分類為漆樹科的植物。適宜的植物包括分類為選自由以下組成的組的屬的那些:黃連木屬(Pistacia)、松屬(Pinus)、云杉屬(Picea)、刺柏屬(Juniperus)、Alsies、落葉松屬(Larix)、金魚草屬(Antirrhinum)、乳香屬(Boswellia)、柑橘屬(Citrus)和三七草屬(Gynura)。在一些實施方案中，適宜的植物選自黃連木屬。在一些實施方案中，黃連木屬的物種選自由以下組成的組:乳香黃連木(P.lentiscus)、大西洋黃連木(P.atlantica)、P.palestina、P.saportae、黑黃連木(P.terebinthus)、阿月渾子(P.vera)和全緣葉黃連木(P.1ntegerrima)。在一些實施方案中,黃連木屬的物種是乳香黃連木。在一些實施方案中，分離的酸性級分來自選自由樹脂、葉、枝、根、花、種子、芽、樹皮、果實和根組成的組的植物物質。在一些實施方案中，乳香的分離的酸性級分通過包括以下步驟的方法來獲得:(a)用極性有機溶劑處理乳香；(b)分離在所述極性有機溶劑中可溶的級分；(C)任選地去除所述極性有機溶劑；(d)用非極性有機溶劑處理步驟(b)或(C)中獲得的可溶的級分，(e)分離在所述非極性有機溶劑中可溶的級分；(f)任選地去除所述非極性有機溶劑；(g)將在步驟(f)中獲得的級分溶于有機溶劑中；(h)用堿性溶液處理步驟(g)中獲得的溶液以獲得堿性級分；(i)用酸溶液使步驟(i)中獲得的堿性級分酸化；(j)用有機溶劑萃取步驟(i)中獲得的酸化的級分；(k)任選地將步驟(k)中獲得的有機級分與干燥劑接觸以去除剩余的水；(I)從步驟⑴、(j)或(k)中的任一步驟中獲得的級分中去除有機溶劑和/或多余的酸；和(m)將步驟(I)中獲得的分離的級分溶于載體中。在另外的實施方案中，本發明提供了包括至少一種三萜酸；和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一些實施方案中，至少一種三萜酸選自由以下組成的組:乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；乳香二烯酸；齊墩果酮酸；模繞酮酸；3_氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸、和其組合。每種可能性是本發明的獨立的實施方案。根據一些實施方案， 本發明提供了基本上由作為藥物活性成分的異乳香二烯酸和乳香二烯酸；和藥學上可接受的載體組成的藥物組合物。關于組合物治療神經功能缺損(并進而治療神經變性疾患/病癥)的效力，當與單獨的化合物的效力相比較時，兩種化合物的組合存在導致了增強/協同效應。異乳香二烯酸和乳香二烯酸中的任一種可分離自諸如乳香的天然來源，或可以是化學合成的產物。
在一些實施方案中，異乳香二烯酸和乳香二烯酸之間的比率為約1: lw/w。根據一些實施方案，本發明提供了基本上由作為僅有的藥物活性成分的齊墩果酮酸、異乳香二烯酸和乳香二烯酸；和藥學上可接受的載體組成的藥物組合物。關于組合物治療神經功能缺損和治療神經變性疾患的效力，當與單獨的化合物的效力或該三種化合物中的僅兩種的混合物的效力相比較時，全部三種化合物的組合存在導致了顯著的協同效應。齊墩果酮酸、異乳香二烯酸和乳香二烯酸中的任一種可分離自天然來源，諸如乳香，或可以是化學合成的產物。在一些實施方案中，異乳香二烯酸和乳香二烯酸和齊墩果酮酸之間的比率為約1:1: lw/w/w0在一些實施方案中，至少一種三萜酸是單體。在一些實施方案中，組合物包括齊墩果酮酸和模繞酮酸的單體。在一些實施方案中，齊墩果酮酸和模繞酮酸的單體是化學合成反應的產物。在一些實施方案中，至少一種三萜酸包括寡聚形式。在一些實施方案中，寡聚形式選自由二聚體、三聚體、和其組合組成的組。每種可能性是本發明的獨立的實施方案。在一些實施方案中，寡聚形式是二聚體。在一些實施方案中，至少一種三萜酸是化學合成的產物。在一些實施方案中，包括寡聚形式的至少一種三萜酸是化學合成的產物。在一些實施方案中，至少一種三萜酸是二聚形式且是化學合成的產物。在一些實施方案中，至少一種三萜酸來自天然來源，尤其是植物來源。在一些實施方案中，組合物包括不同的三萜酸的組合，其中至少一種三萜酸是化學合成的產物且至少一種另外的三萜酸來自植物來源。天然來源包括分類為漆樹科的植物。適宜的植物包括分類為選自由以下組成的組的屬的那些:黃連木屬、松屬、云杉屬、刺柏屬、Alsies、落葉松屬、金魚草屬、乳香屬、柑橘屬
和三七草屬。在一些實施方案中,適宜的植物選自黃連木屬。在一些實施方案中，黃連木屬的物種選自由乳香黃連木、大西洋黃連木、P.palestina、P.saportae、黑黃連木、阿月渾子和全緣葉黃連木組成的組。在一些實施方案中，黃連木屬的物種是乳香黃連木。在一些實施方案中，天然來源是選自由以下組成的組的植物物質:樹脂、葉、枝、根、花、種子、芽、樹皮、果實和根。在一些實施方案中，天然來源是分類為選自由羅勒屬(Ocimum)、月桂屬(Laurus)和薰衣草屬(Lavendula)組成的組的屬的植物。在一些實施方案中，藥學上可接受的載體包括疏水載體。在一些實施方案中,疏水載體包括至少一種油。在一些實施方案中，油選自由礦物油、植物油和其組合組成的組。在一些實施方案中，植物油選自由棉籽油、橄欖油、杏仁油、油菜籽油(canola oil)、椰子油、玉米油、葡萄籽油、花生油、藏紅花油(saffron oil)、芝麻油、大豆油、和其組合組成的組。在一些實施方案中，礦物油是輕質礦物油。在一些實施方案中，疏水載體包括至少一種蠟。在一些實施方案中，疏水載體包括至少一種油和至少一種蠟的組合。在不同的實施方案中， 根據本發明的組合物為適宜于通過選自由胃腸外、透皮、口服和局部(topical)組成的組的途徑施用的形式。在不同的實施方案中，根據本發明的組合物為適宜于局部施用的形式。在不同的實施方案中，根據本發明的組合物為適宜于口服施用的形式。在不同的實施方案中，根據本發明的組合物為適宜于胃腸外施用的形式。在一些實施方案中，組合物為適宜于通過注射施用的形式。在不同的實施方案中，組合物是用于通過選自由以下組成的組的途徑施用的胃腸外制劑:皮下的、靜脈內的、肌內的、皮內的、腹膜內的、動脈內的、大腦內的、腦室內的、骨內的和鞘內的。在一些實施方案中，組合物是用于通過皮下途徑施用的胃腸外制劑。在不同的實施方案中，組合物被配制為用于通過選自由以下組成的組的途徑施用:表皮的、陰道的、直腸的、吸人的、鼻內的、眼睛的、耳的和□腔的。在一些實施方案中，組合物為適宜于化妝施用或皮膚病學施用的形式。在一些實施方案中，藥物組合物為選自由膠囊、片劑、脂質體、栓劑、懸浮劑、軟膏、乳霜、洗劑(lotion)、溶液、乳液、薄膜、粘固劑(cement)、粉末、膠、氣溶膠和噴霧劑組成的組的形式。在一些實施方案中，膠囊選自由硬明膠膠囊和軟明膠膠囊組成的組。在一些實施方案中，乳液是納米乳液或微乳液。在一些實施方案中，制劑包括以下中的至少一種:包合復合物、納米乳液、微乳液、粉末、脂筏、脂質微粒、樹狀聚物(dendrimer)和脂質體。在一些實施方案中，包合復合物包括至少一種環糊精。在一些實施方案中，至少一種環糊精包括羥丙基環糊精。在一些實施方案中，納米乳液包括具有小于800nm的平均粒徑的液滴。在一些實施方案中，液滴具有小于500nm的平均粒徑。在一些實施方案中，液滴具有小于200nm的平均粒徑。在一些實施方案中，粉末是噴霧干燥的粉末。在一些實施方案中，脂質體包括多層囊泡。在一些實施方案中，微乳液包括非離子型表面活性劑。在一些實施方案中，非離子型表面活性劑選自由以下組成的組:聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(聚山梨醇酯)、泊洛沙姆、維生素E衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯或飽和的多糖酵解的甘油酯、或其組
口 ο在一些實施方案中，組合物以涂層(coating)的形式被置于制品上。在一些實施方案中，制品包括容器，其中所述組合物被置于容器中。在一些實施方案中，制品選自由以下組成的組:織物制品、尿布、傷口敷料、醫療裝置、針或多個針、顯微針或多個顯微針、注射裝置和噴霧分配器。在一些實施方案中，制品包括多個顯微針。在一些實施方案中，醫療裝置選自由以下組成的組:假體、人工器官或其組件、閥門、導管、試管、支架、人工膜、起搏器、傳感器、內窺鏡、顯像裝置、泵、金屬絲(wire)和植入物。在一些實施方案中，植入物選自由以下組成的組:心臟植入物、耳蝸植入物、角膜植入物、顱骨植入物、牙科植入物、頜面植入物、器官植入物、整形外科植入物、血管植入物、關節內植入物和乳房植入物(breastimplant)。在一些實施方案中，組合物適宜于通過選自由電穿孔、聲裂法、射頻、加壓噴霧和其組合組成的組的方式的施用。

在一些實施方案中，組合物用于治療神經功能缺損。在一些實施方案中，神經功能缺損包括選自由認知功能、感覺功能、運動功能和其組合組成的組的功能的降低。在一些實施方案中，神經功能缺損與病癥或疾病相關聯。在一些實施方案中，所述病癥或疾病選自由以下組成的組:阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、多發性硬化癥、帕金森氏病、血管性癡呆和老年性癡呆。在一些實施方案中，病癥是創傷(trauma)或中風。在一些實施方案中，病癥或疾病是精神病疾患，比如精神分裂癥、雙相性精神障礙或抑郁。在一些實施方案中，病癥或疾病選自肥胖癥、厭食癥、惡病質、感染和免疫疾患。在一些實施方案中，神經功能缺損由于與藥物接觸而導致，比如麻醉劑。在一些·實施方案中，病癥或疾病選自由以下組成的組:血管性癡呆、老年性癡呆、阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、多發性硬化癥、帕金森氏病和中風。在一些實施方案中，病癥是中風。在一些實施方案中，病癥是創傷。在一些實施方案中，病癥或疾病選自由血管性癡呆、老年性癡呆、阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥(ALS)和多發性硬化癥組成的組。在一些實施方案中，病癥或疾病選自由血管性癡呆、老年性癡呆、阿爾茨海默病和肌萎縮側索硬化癥(ALS)組成的組。在一些實施方案中，病癥或疾病選自由血管性癡呆、老年性癡呆和阿爾茨海默病組成的組。在一些實施方案中，疾病是阿爾茨海默病。在一些實施方案中，疾病是肌萎縮側索硬化癥(ALS)。在一些實施方案中，組合物是用于治療皮膚傷口的，包括例如，下肢靜脈性潰瘍、壓迫性潰瘍、糖尿病足潰瘍、燒傷、截肢傷口、褥瘡潰瘍(褥瘡)、分層皮膚供體移植物(split-skin donor graft)、皮膚移植的供區、醫療裝置植入位點、咬傷、凍傷、刺傷、彈片傷、皮膚磨削術(dermabrasion)、挫傷、感染、傷口和外科傷口。在一些實施方案中，組合物用于誘導或促進組織修復。如本文所用的，組織修復包含誘導和促進組織再生，包括神經組織。在一些實施方案中，組合物用于誘導或促進損傷或傷害后的組織修復。在一些實施方案中，損傷或傷害選自由以下組成的組:心肌梗塞、肺栓塞、腦梗塞、外周動脈閉塞性疾病、疝、脾梗塞、靜脈潰瘍、軸索顯微外科術(axotomy)、視網膜剝離、感染和手術操作。在一些實施方案中，組合物用于在動物中誘導或促進壽命延長。在一些實施方案中，動物選自由人類、非人類哺乳動物、鳥類和魚組成的組。本發明的其他目的、特征和優點將從以下的描述和圖中變得清楚。附圖簡述

圖1顯示根據本發明的分離的酸性級分的反相HPLC色譜圖。利用UV-VIS檢測器獲得在波長205nm處檢測的色譜圖。圖2A顯示根據本發明的分離的酸性級分的LC-MS色譜圖，指示三萜酸二聚體的混合物。圖2B顯示圖2A的色譜圖的主峰的質譜。圖2C顯示放大的如圖2A中所示的保留時間6.09分鐘處的峰的質譜。圖2D顯示放大的如圖2A中所示的保留時間6.17分鐘處的峰的質譜。圖3A顯示乳香的分離的酸性級分的TOF質譜，指示單體三萜酸和二聚三萜酸的混合物。圖3B是圖3A的峰的列表。圖4顯示根據實施例1所制備的分離的酸性級分的制備型色譜圖。峰編號與圖1的分析型色譜圖的峰編號一致。圖5A顯示模繞酮酸的1H-NMR譜，所述模繞酮酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。圖5B顯示模繞酮酸的13C-NMR譜，所述模繞酮酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。圖6A顯示齊墩果酮酸的1H-NMR譜，所述齊墩果酮酸通過制備型HPLC從根據實施例I制備的酸性級分分離。圖6B顯示齊墩果酮酸的13C-NMR譜，所述齊墩果酮酸通過制備型HPLC從根據實施例I制備的酸性級分分離。圖7A顯示乳香二烯酸的1H-NMR譜，所述乳香二烯酸通過制備型HPLC從根據實施例I制備的酸性級分分離。圖7B顯示乳香二烯酸的13C-NMR譜，所述乳香二烯酸通過制備型HPLC從根據實施例I制備的酸性級分分離。圖8A顯示異乳香二烯酸的1H-NMR譜，所述異乳香二烯酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。 圖SB顯示異乳香二烯酸的13C-NMR譜，所述異乳香二烯酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。圖9A顯示3- (O-乙酰基)-乳香二烯醇酸的1H-NMR譜，所述3_ (O-乙酰基)-乳香二烯醇酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。圖9B顯示3-(0-乙酰基)_乳香二烯醇酸的13C-NMR譜，所述3-(O-乙酰基)_乳香二烯醇酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。圖1OA顯示3-(O-乙酰基)_異乳香二烯醇酸的1H-NMR譜，所述3-(O-乙酰基)_異乳香二烯醇酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。 圖1OB顯示3- (O-乙酰基)-異乳香二烯醇酸的13C-NMR譜，所述3_ (O-乙酰基)_異乳香二烯醇酸通過制備型HPLC從根據實施例1制備的酸性級分分離。圖1IA顯示根據WO 2003/097212的教導制備的酸性級分對ARPE-19細胞的作用。圖1lB顯示根據本發明的實施例2制備的酸性級分對ARPE-19細胞的作用。圖1lC顯示棉籽油運載體(vehicle)對ARPE-19細胞的作用。圖12A顯示從根據W02003/097212的教導制備的酸性級分分離的己烷不可溶級分對ARPE-19細胞的作用。圖12B顯示根據本發明的實施例1制備的分離的酸性級分的1% (w/w)乙醇溶液對ARPE-19細胞的作用。圖12C顯示乙醇運載體對ARPE-19細胞的作用。圖13A-C顯示用RPh-Ac處理的細胞(上圖)或未處理的細胞(運載體，下圖)并用針對以下的抗體(Ab.)進行染色的照片:突觸素(圖13A);磷酸化的Akt(pAkSOT473)(圖13B);磷酸化的 GSK3-P Sel:9(圖 13C)。
圖14A顯示的圖描繪對于本發明的不同的組合物，大鼠MCAO模型關于從對側爪清除膠帶的時間的結果。圖14B顯示描繪以下組合物對從對側爪清除膠帶的基線改變倍數的圖:異乳香二烯酸(MDA)、或異乳香二烯酸和乳香二烯酸的組合(IMDA+MDA);或齊墩果酮酸、異乳香二烯酸和乳香二烯酸的組合(0A+MDA+MDA)。圖15顯示大鼠的照片，表明棉籽運載體(左圖)、RPh_Ac (中圖)和0A+MDA+MDA的組合(右圖)對來自實施例5的MCAo模型的大鼠中的外科傷口的愈合的作用。發明詳述本發明的發明人已驚人地發現，乳香的分離的酸性級分在改善或逆轉神經功能缺損、中風康復、皮膚傷口的愈合、促進組織修復和促進動物壽命延長當中表現了高度活性。本文首次公開了，由于其刺激和誘導細胞再生的多種活性，如本文所描述的乳香的分離的酸性級分以及從中分離的化合物的組合，可用作用于大量治療適應癥的藥物組合物中的活性成分。有利地，本發明的組合物可用于治療神經功能缺損和皮膚病癥的方法中。在與人類和非人類受治療者的細胞接觸后，組合物在包括皮膚、內皮、粘膜、骨、腱和軟骨的一系列廣泛的組織、細胞區室(cell compartment)和細胞譜系中誘導細胞分化。此外，可開發藥物組合物的細胞分化活性以用于促進醫療裝置、植入物和器官移植物的體內并入。并且，藥物組合物可用于在動物中促進壽命延長。定義如本文所 用的，術語“乳香(mastic) ”、“乳香樹脂(mastic resin) ”、“乳香(gummastic) ”和“乳香(mastic gum) ”互換地使用,指作為來自分類為漆樹科的任何樹的滲出物獲得的樹脂(也稱作油樹脂)。黃連木屬的樹，最著名的是乳香黃連木，且尤其是栽培品種乳香黃連木Chia品種(P.lentiscus L.cv.Chia)(在希臘的Chios島上栽培)以其乳香高產量而聞名。其他品種包括P.lentiscus L.var.emarginata Engl.和P.lentiscus L.var.1atifolia Coss。更多黃連木屬物種包括:例如,大西洋黃連木、P.palestina、P.saportae、黑黃連木、阿月渾子和全緣葉黃連木。如本文所用的，術語“乳香的分離的酸性級分”指在利用至少一種極性和至少一種非極性有機溶劑萃取乳香之后，通過對從而獲得物質的溶液進行酸堿萃取和分離所得的酸性級分而獲得的級分。本發明的分離的酸性級分在極性有機溶劑和非極性有機溶劑中均是可溶的。如本文所用的，術語“多個”指多于一個，優選地多于兩個。如本文所用的術語“協同的”意為多于加和的。如本文所用的，術語“酸堿萃取”指其中用一種或多種堿性水溶液處理/萃取含有機酸性組分和有機非酸性組分的有機溶劑溶液的方案。其結果是，有機酸性組分被去質子化并從而轉化為其對應的離子鹽形式，并且從而將溶于所述堿性水溶液中。非酸性有機組分將留在原始的有機溶液中。隨后，對含酸性組分的鹽形式的堿性水溶液進行酸化，導致了有機酸性組分的質子化酸性形式的再形成。根據酸性化合物的性質，可用多種方式將這些質子化酸形式(酸性級分)從酸化的水溶液中移去。用于將酸性級分從酸化的溶液中移去的一個選擇是通過萃取到適宜的有機溶劑中。實施例1是如上所述的酸堿萃取的非限制性例子。根據酸性化合物在酸化的水溶液中的溶解度，酸性級分可經由酸化的水溶液的過濾來分離。代替將堿性水溶液用于酸堿萃取，還可使用離子交換樹脂的堿性形式。在這些情況下，酸性有機組分(酸性級分)以其去質子化的陰離子形式被樹脂所捕捉。隨后從初始溶液中移出樹脂，留下非酸性的組分。隨后通過用適宜的酸性溶液處理樹脂將酸性組分(酸性級分)從樹脂中釋放。離子交換樹脂用于酸堿萃取的應用尤其適宜于規模擴大的工藝，且可用于(半)連續萃取工藝的開發。以上的酸堿萃取和其他變化形式的例子可見于許多教科書和其他出版物中，并認為是本領域技術人員所公知的。有用的教科書的例子為“Vogel’s Textbook of PracticalOrganic Chemistry，，,第 5 版，1989,(第 162-163 頁)。如本文所用的，術語“純度”指制備物中特定的化學化合物的含量，表示為特定的化學化合物相對于制備物中的其他化學化合物的基于重量/重量的百分比。

如本文所用的，“職化合物(terpene compound) ”指含異戍二烯的烴,其具有頭接尾方向的異戊二烯單元(CH2 = C(CH3)-CH = CH2)。萜烴通常具有分子式(C5H8)n，且包括半萜(C5)、單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)和四萜(C40)，其分別具有1、2、
3、4、6和8個異戊二烯單元。萜可被進一步分類為無環的或環狀的。如本文所用的，“類職(terpenoid) ”和“類職化合物(terpenoid compound) ”互換地指萜相關的化合物，其除異戊二烯單元之外含有氧原子，且因此包括醇、醛和酮。類萜根據碳原子的數目以相似于萜的方式細分，且因此包括類半萜(hemiterpenoid) (C5)、類單職(monoterpenoid) (C10)、類倍半職(sesquiterpenoid) (C15)、類二職(diterpenoid)(C20)、類三職(triterpenoid) (C30)和類四職(tetraterpenoid) (C40),其分別具有 1、2、
3、4、6和8個異戊二烯單元。類萜的骨架可通過片段的缺失或移動而與異戊二烯單元的嚴格相加性不同，所述片段通常是甲基。類單萜的例子包括樟腦、丁香酚和冰片。類二萜的例子包括植醇和紫杉酚。類三萜的例子包括角鯊烯和羊毛甾醇。如本文所用的，“萜酸”指含至少一個羧酸基團的類萜化合物。萜酸可另外地含有一個或多個其他的含氧官能團，包括羥基、酮基、醛基、醚基(環狀的和非環狀的)和酯基(環狀的和非環狀的)。如本文所用的，“三萜酸”指含有至少一個羧酸基團的類三萜化合物。三萜酸可另外地含有一個或多個其他含氧官能團，包括羥基、酮基、醛基、醚基(環狀的和非環狀的)和酯基(環狀的和非環狀的)。如本文所用的，“萜酸的寡聚形式”指寡聚萜酸，其中單體單元為相同的萜酸或不同的萜酸，且以任何可能的排列連接，且通過任何可能的鍵或官能團彼此連接，比如C-C
鍵、酯基或醚基。如本文所用的，“三萜酸的寡聚形式”指寡聚三萜酸，其中單體單元為相同的三萜酸或不同的三萜酸，且以任何可能的排列連接，且通過任何可能的鍵或官能團彼此連接，t匕如C-C鍵、酯基或醚基。如本文所用的，術語“乳香二烯酸(masticadienoic acid) ”、“乳香二烯酮酸(masticadienonic acid) ”、“乳香二烯酸(masticadienoic) ” 和“乳香二烯酮酸(masticadienonic acid) ”可互換地使用。如本文所用的，術語“異乳香二烯酸(isomasticadienoic acid) ”、“異乳香二烯酮酸(isomasticadienonic acid) ”、“異乳香二烯酸(isomasticadienoic) ” 和“異乳香二烯酮酸(isomasticadienonic) ”可互換地使用。如本文所用的，“基本上不含”意為根據本發明的制備物或藥物組合物一般含有低于約5%的指定物質。例如，低于約3%、低于I %、低于0.5%、低于0.1%。如本文所用的，“治療有效量”指顯著誘導、促進或導致期望的治療效果的藥物成分的量。如本文所用的，“藥學上可接受的載體”指用于增強與其一同配制的藥物成分的遞送性能和/或藥代動力學性能的稀釋劑或運載體，但其自身無治療效果，也不會在受治療者中誘導或導致任何不想要的或不適當的效果或不良反應。如本文所用的，“藥學上可接受的疏水載體”指在其中溶解或懸浮乳香級分的疏水的非極性稀釋劑或運載體。如本文所用的，“細胞分化”指其中較不特化的細胞變為較特化的細胞的過程。細胞分化可基于多種細胞特性中的任一種的改變而建立，所述特性包括但不限于大小、形狀、細胞器外觀、膜電位、代謝活性和信號響應性。可對細胞類型給出具體“級”以描述分化程度。如本文所用的，“神經功能缺損”指感覺、認知或運動功能中的至少一種與功能或活性的先前的水平相比較和/或與根據公認標準匹配的非受損的個體相比較下降或減少。

如本文所用的關于本文所指定的數值的術語“約”應被理解為如所指定的值+/_10%。Ξ萜酸和包括萜酸的分離的酸性級分在一些實施方案中，本發明提供了包括萜酸的特定的組合的組合物，比如見于乳香的分離的酸性級分中的萜酸的特定的組合的組合物。在一些實施方案中，本發明提供了由特定的三萜酸化合物組成的組合物，這些組合物顯示在神經系統疾患的治療中與相同的單獨的三萜酸化合物相比較具有意外的協同作用。三萜酸化合物可來自植物來源，尤其是乳香，或可以是化學合成反應的產物。在某些情況下，組合物可對應于化合物的組合，其中某些是化學合成的且某些來源于植物來源。可用于獲得本發明的組合物的植物物種包括但不限于，黃連木屬、松屬、云杉屬、刺柏屬、Alsies、落葉松屬、羅勒屬、月桂屬和薰衣草屬的那些。有用的黃連木屬的物種包括但不限于,乳香黃連木、大西洋黃連木、P.palestina、P.saportae、黑黃連木、阿月渾子和全緣葉黃連木。乳香的商業上的制備物是可獲得的，例如，從Chios Gum Mastic GrowersAssociation 或 G.Baldwin&C0., U.K 獲得。用于確定所獲得的乳香的分離的酸性級分的精確化學組成的分析方法包括核磁共振(例如1HNMR和13CNMR)、粘度測定法、多種質譜測定方法(例如MALD1-T0F)、HPLCJi合方法諸如液相色譜-質譜測定法(LC-MS)、UV-VIS光譜測定法、IR和FT-1R光譜測定法和本領域中已知的其他方法。
用于獲得乳香的分離的酸性級分的方法可如以下所描述。通過概述的方式，將收集的植物物質，例如乳香與適宜的溶劑在適宜的器皿中混合，所述溶劑通常是極性溶劑。適宜的極性溶劑包括例如，醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈、和其組合。極性有機溶劑的具體的例子是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲-丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-2- 丁醇、2-甲基-2- 丁醇、乙二醇、乙二醇單甲醚、乙醚、甲基乙醚、乙基丙醚、甲基丙醚、1，2-二甲氧基乙烷、四氫呋喃、二氫呋喃、呋喃、吡喃、二氫吡喃、四氫吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基甲酮、二乙基甲酮、乙腈、丙腈、和其組合。優選地混合乳香和溶劑而使溶劑大量過量，例如10:1或20:1。在范圍從幾分鐘到幾小時的時間段中可周期性地或持續地攪拌混合物。可不做任何處理而傾去溶劑，或可選地使混合物首先經歷低速離心，如本領域所知，例如以100至2000rpm離心。從提取物中回收不可溶的物質并將新鮮的溶劑等份添加到不可溶的物質中，從而重復提取和溶解過程若干循環，以獲得盡可能多的極性溶劑可溶的化合物。在最終的溶解步驟之后，合并含有極性溶劑可溶物質的提取物并蒸發極性溶劑(例如通過利用如本領域中已知的旋轉蒸發)，從而產生極性溶劑可溶的物質，可將其稱作粗產物，或“第一步”提取物。將第一步提取物物質與非極性有機溶劑混合，并通過振蕩I至2小時的時間段來萃取。適宜的非極性溶劑包括無環的或環狀的、飽和的或不飽和的脂族烴和芳族烴，例如，C5-C10烷烴、C5-C10環烷烴、C6-C14芳族烴、和其組合。前述中的每一種可任選地被一個或多個鹵素所取代，例如，C7-C14全氟烷烴。非極性有機溶劑的具體的例子是戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、環戊烷、環己烷、環庚烷、苯、甲苯、二甲苯和其異構體和混合物。將在非極性溶劑存在下保持不可溶的或沉淀的物質去除并棄去。然后通過蒸發非極性溶劑(例如通過旋轉蒸發)獲得非極性溶劑可溶級分。該級分可稱為純化的或“二步驟”提取物，對應于乳香的分離的級分，其特征為在極性溶劑和非極性溶劑中均可溶的事實，同時在極性溶劑中可溶但在非極性溶劑 中不可溶的物質已被去除。隨后將第二步提取物質溶于有機溶劑中并用堿性水溶液重復(例如，四次)萃取該溶液。可進行用不同的堿性水溶液的第二萃取。用稀酸水溶液對從而獲得的堿性級分酸化至酸性pH。用有機溶劑萃取酸化的水溶液若干次。將從而獲得的合并的有機溶劑萃取物(也稱作“三步驟提取物”)用干燥劑處理。然后通過蒸發有機溶劑(例如通過旋轉蒸發)獲得該乳香的分離的酸性級分。該級分被稱作乳香的分離的酸性級分。如本領域中已知的，在其他步驟之間可進行干燥和/或溶劑去除的另外的中間步驟。可選地，第二步提取物質可與堿性離子交換樹脂例如Amberlyst A26混合。用非水的酸性溶液處理分離的離子交換樹脂以將酸性級分從樹脂釋放。然后通過蒸發該非水溶劑和任何多余的酸獲得分離的酸性級分。區分本發明的乳香的分離的酸性級分和現有技術提取物的特征是:在方案的前兩步中已去除了某些酸性化合物，否則其將留在最終酸性級分中。根據本發明的教導，在分離工序的前兩步過程中去除的酸性化合物對本文所公開的分離的酸性級分的有利的生物活性具有有害作用。
還可將三步提取物進一步干燥，例如通過高真空處理(例如< 0.01毫巴持續長達數天)以去除殘余溶劑和其他揮發性物質，稱重并與非極性有機溶劑或其他載體混合以使其溶解。在一些實施方案中，本發明的分離的級分可通過包括以下步驟的方法來獲得:(a)用極性有機溶劑處理乳香；(b)分離在所述極性有機溶劑中可溶的級分；(C)任選地去除所述極性有機溶劑；(d)用非極性有機溶劑處理步驟(b)或(C)中獲得的可溶級分，(e)分離在所述非極性有機溶劑中可溶的級分；(f)任選地去除所述非極性有機溶劑；(g)將步驟(f)中獲得的級分溶解于有機溶劑中；(h)用堿性溶液處理步驟(g)中獲得的溶液以獲得堿性級分；和(i)用酸溶液酸化步驟(h)中獲得的堿性級分。在一些實施方案中，步驟(h)中用堿性溶液進行的處理(堿化)包括用一種或多種適宜的堿性水溶液萃取步驟(g)中獲得的溶液；或將步驟(g)中獲得的溶液與堿性離子交換樹脂接觸，可隨后用酸性溶液處理樹脂以釋放所捕捉的酸性級分。然后通過利用例如施加真空去除任何揮發物而獲得分離的酸性級分。在一些實施方案 中，步驟(h)包括將步驟(g)中獲得的溶液與堿性離子交換樹脂接觸，并此后通過過濾除去堿性離子交換樹脂。隨后可用酸性溶液處理堿性離子交換樹脂以釋放所捕捉的酸性級分。然后通過利用例如施加真空去除任何揮發物而獲得分離的酸性級分。在一些實施方案中，該方法還包括以下的步驟:(j)用有機溶劑萃取步驟⑴中獲得的酸化的級分；k)任選地用干燥劑與步驟(j)中獲得的有機級分接觸以去除剩余的水；(I)從步驟⑴、(j)或(k)中的任一步驟中獲得的級分中去除有機溶劑和/或多余的酸；和(m)將步驟(I)中獲得的分離的級分溶于載體中。該方法還可包括在步驟(c)、(f)或(I)中的任何步驟之后去除溶劑。溶劑去除可通過本領域中已知的任何方式來進行，例如旋轉蒸發、施加高真空和其組合。在一些實施方案中，步驟(a)至(C)在步驟⑷至(f)之前進行或反之。在一些實施方案中，極性有機溶劑包括乙醇，非極性有機溶劑包括己烷，且用于酸堿萃取的有機溶劑包括乙醚。如本領域技術人員所易于理解地，步驟(a)至(C)和步驟(d)至(f)可各自獨立地進行多個循環以優化提取過程和產物的純度。在一些實施方案中，步驟(h)包括用堿性水溶液萃取步驟(g)中獲得的溶液，并收集從中獲得的有機級分。在一些實施方案中，該方法還可包括將從步驟(h)中獲得的有機級分與在步驟(i)、(j)或(k)的任一步驟中獲得的級分合并。在一些實施方案中，將步驟(h)中獲得的有機級分與以從步驟(h)中獲得的有機級分的0.1至50%的范圍中的量的步驟或(k)中的任一步驟中獲得的級分合并。在一些實施方案中，該量在從約0.5-50% ;或2至25% ;或0.1至10%的范圍中。
分離的酸性級分可包括至少一種萜酸，比如多種三萜酸組合的組合。三萜酸包括，例如，乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基表-乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；齊墩果醇酸；烏宋酸；熊果酸；模繞酮酸；和3-氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸。在一些實施方案中，分離的酸性級分可包括至少兩種萜酸化合物，選自，例如，乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；齊墩果醇酸；烏宋酸；熊果酸；模繞酮酸；和3-氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸。在一些實施方案中，分離的酸性級分可包括至少三種萜酸化合物，選自，乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；齊墩果醇酸；烏宋酸；熊果酸；模繞酮酸；和3-氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸。在一些實施方案中，分離的酸性級分可包括至少兩種萜酸化合物，選自，乳香二烯醇酸，異乳香二烯酸和齊墩果酮酸。

在一些實施方案中，分離的酸性級分可基本上不含特定的三萜酸，諸如，例如，乳香二烯酸，或模繞酮酸。每種可能性是獨立的實施方案。在一些實施方案中，分離的酸性級分可基本上不含精油。并且，分離的酸性級分中的萜酸和或三萜酸可以是單體形式、或寡聚形式，比如二聚體、三聚體、或其組合。藥物纟目合物用于本發明的組合物包括治療有效量的本文描述的乳香的分離的酸性級分，和藥學上可接受的疏水載體。本發明還提供了包括至少一種三萜酸；和藥學上可接受的載體的組合物。如前所述，三萜酸可分離自植物產物，比如乳香，或其可以是化學合成的產物。并且，組合物可包括三萜酸的組合，其中的一些是化學合成的，且其中的一些分離自一種或多種植物產物。在某些實施方案中，組合物可由作為藥物活性成分的至少兩種三萜酸化合物和藥學上可接受的載體組成。此外，組合物可包括三萜酸的二聚形式、三聚形式和更高的寡聚形式；寡聚體可從相同的和不同的單體三萜酸形成。在一些實施方案中，組合物可由作為藥物活性成分的至少三種三萜酸化合物和藥學上可接受的載體組成。為制備用于治療應用的組合物，可使用適宜的載體，比如疏水載體，包括藥學上可接受的油，任選地與蠟組合，如本文所描述。疏水載體包括至少一種油，比如例如，礦物油、植物油、或其組合。術語“礦物油”指從石油的蒸餾中獲得的澄清無色幾乎無臭和無味的液體。其還可稱為白油、白礦物油、液體凡士林(liquid petrolatum)、液體石臘或白石臘油。根據本發明的一些實施方案，礦物油是輕質礦物油，其為可作為NF (National Formulary,國家處方集)級產品或作為USP(US Pharmacopoeia，美國藥典)級產品從商業上可獲得的產品。對于本發明中的應用，礦物油優選地無芳香劑或不飽和的化合物。適宜的植物油包括，但不限于，棉籽油、橄欖油、杏仁油、油菜籽油、椰子油、玉米油、葡萄籽油、花生油、藏紅花油、芝麻油、大豆油、或其組合。在一些實施方案中，礦物油是輕質礦物油。藥學上可接受的載體可可選地或另外地包括油替代物。油替代物包括具有至少10個碳的燒烴(例如，異十六燒)，苯甲酸酯、脂族酯、無致粉刺性酯(noncomodogenicester)、揮發性硅酮化合物(例如，環甲硅油)，和揮發性硅酮替代物。苯甲酸酯的例子包括C12C15烷基苯甲酸酯、異硬脂酰苯甲酸酯、2-乙基己基苯甲酸酯、二丙二醇苯甲酸酯、辛基十二烷基苯甲酸酯、硬脂酰苯甲酸酯和山崳醇苯甲酸酯。脂族酯的例子包括C12C15烷基辛酸酯和馬來酸二辛酯。無致粉刺性酯的例子包括異壬酸異壬酯、異壬酸異癸酯、二異硬脂酰二聚二亞油酸酯、花生醇丙酸酯和異十三烷基異壬酸酯。揮發性硅酮替代物的例子包括癸酸異己酯、異壬酸辛酯、辛酸異壬酯和二乙二醇二辛酸酯。環甲硅油是蒸發的硅酮，其可被含于載體中以協助生成適應于從噴霧分配器中噴出的組合物。并且，由于其蒸發性質，環甲硅油可協助將制劑保留和固定在其所噴霧的表面，例如傷口位置。疏水載體還可包括至少一種蠟。蠟包括例如，蜂蠟；植物蠟，甘蔗蠟、礦物蠟和合成的蠟。植物蠟包括例如，巴西棕櫚蠟，小燭樹蠟，小冠椰子蠟和荷荷巴蠟。礦物蠟包括，例如，石蠟、褐煤蠟、微晶蠟和地蠟。合成的蠟包括例如，聚乙烯蠟。藥物組合物可以多種形式中的任一種來配制，諸如例如，膠囊(包括軟膠囊)、片齊 、凝膠、脂質體、栓劑、懸浮劑、軟膏、溶液、乳液或微乳液、薄膜、粘固劑、粉末、膠、氣溶膠、噴霧劑和凝膠。為制備藥物組合物，可適宜地將乳香的分離的酸性級分配制為包合復合物、納米乳液、微乳液、粉末和脂質體。在一些實施方案中，包合復合物包括至少一種環糊精。在一些實施方案中，環糊精包括羥丙基環糊精。在一些實施方案中，納米乳液包括具有小于800nm的平均粒徑的液滴。在一些實施方案中，液滴具有小于500nm的平均粒徑。在一些實施方案中，液滴具有小于200nm的平均粒徑。在一些實施方案中，粉末是噴霧干燥的粉末。在一些實施方案中，脂質體包括多層囊泡。在一些實施方案中，微乳液包括非離子表面活性劑。非離子表面活性劑包括，但不限于，聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(聚山梨醇酯)、泊洛沙姆、維生素E衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、飽和的多糖酵解的甘油酯、或其組合。本文在實施例7-11中公開了乳香的分離的酸性級分的不同的制劑和其制備。本發明的藥物組合物可通過實現其預期目的的任何方式來施用。例如，施用可通過，例如，口服施用途徑、胃腸外施用途徑、局部施用途徑、透皮施用途徑比如例如皮下施用途徑、靜脈內施用途徑、肌內施用途徑、皮內施用途徑、腹膜內施用途徑、動脈內施用途徑、子宮內施用途徑、尿道內施用途徑、心臟內施用途徑、大腦內施用途徑、腦室內施用途徑、腎內施用途徑、肝內施用途徑、腱內施用途徑、骨內施用途徑、鞘內施用途徑、皮膚施用途徑、陰道施用途徑、直腸施用途徑、吸入施用途徑、鼻內施用途徑、眼施用途徑、耳施用途徑和口腔施用途徑。
施用可另外包括諸如電穿孔或聲裂法的技術或方法以協助其遞送，例如，透皮遞送。可使用的其他技術包括例如，射頻或加壓噴霧應用。施用的劑量將取決于受治療者的年齡、健康和體重、并行治療的應用(若有的話)、治療的頻率和期望的效果的性質。任何單位劑型中本發明的乳香的分離的酸性級分的量包括治療有效量，其可根據接受者受治療者、施用途徑和頻率而不同。通常，藥物組合物中存在的乳香的分離的酸性級分的量基于組合物的總重量可適宜地在重量/重量基礎上從約0.01%至約50%的范圍中，比如，0.01%至約25%，比如0.01%至約12%的范圍中。對于局部應用，組合物中乳香的分離的酸性級分的百分比可在從約0.05%至約2.5%的范圍中。對于通過注射施用，組合物中的乳香的分離的酸性級分可適宜地在從約0.1%至約7%的范圍中。對于口服施用，組合物中的乳香的分離的酸性級分的百分比可在從約0.005%至約7%的范圍中。在示例性的實施方案中，乳香二烯酸和異乳香二烯酸在由作為活性成分的該兩種化合物組成的組合物中的量可為每種化合物在約0.05%至約20%的范圍中。對于通過注射施用，每種化合物的量可在從約0.1%至約10%的范圍中。對于局部施用，每種化合物的量可在從約0.5%至約12%的范圍中。對于口服施用，每種化合物的量可在從約0.5%至約15%的范圍中。
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在示例性的實施方案中，齊墩果酮酸、乳香二烯酸和異乳香二烯酸在由作為活性成分的該三種化合物組成的組合物中的量可為每種化合物在約0.05%至約15%的范圍中。對于通過注射施用，每種化合物的量可在從約0.1%至約10%的范圍中。對于局部施用，每種化合物的量可在從約0.5%至約12%的范圍中。對于口服施用，每種化合物的量可在從約0.5%至約15%的范圍中。本發明的藥物組合物可以本領域技術人員已知的方式來制造，例如，通過常規的混合、粒化、制造糖衣藥丸、軟膠封裝、溶解、萃取或凍干方案。用于口服施用的藥物組合物可通過將活性化合物與固體和半固體賦形劑和適宜的防腐劑、和/或抗氧化劑混合來獲得。任選地，可磨碎和處理所得的混合物。若必要，在添加適宜的輔助劑后，所得的顆粒混合物可用于獲得片劑、軟膠、膠囊或糖衣藥丸核心。適宜的賦形劑具體為填充劑，諸如糖類，例如，乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纖維素制備物和/或磷酸鈣，例如，磷酸三鈣或磷酸氫鈣；和粘合劑，例如淀粉糊，其利用例如，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉，明膠，黃蓍膠，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮。若需要，可添加崩解劑，如上述淀粉以及羧甲基淀粉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，比如海藻酸鈉。輔助劑為流動調節劑和潤滑劑，例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸或其鹽，比如硬脂酸鈉或硬脂酸鈣，和/或聚乙二醇。糖衣藥丸核心設有適宜的包衣，若需要，該包衣對胃液具有耐受性。為此目的，可使用濃縮的糖溶液，其可任選地包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和適宜的有機溶劑或溶劑混合物。為生成對胃液具有耐受性的包衣，使用適宜的纖維素制備物比如醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯的溶液。可向片劑或糖衣藥丸包衣添加染料或顏料，例如以用于識別或便于表征活性化合物劑量的組合。用于口服施用的其他藥物組合物包括由明膠制成的壓接膠囊(push-fitcapsules)和由明膠和增塑劑諸如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。壓接膠囊可包含顆粒形式的活性化合物，該活性化合物可與如下混合:填充劑，諸如乳糖；粘合劑，諸如淀粉；和/或潤滑劑，諸如滑石或硬脂酸鎂；以及任選地，穩定劑。在軟膠囊中，活性化合物優選地溶于或懸浮于適宜的液體中，諸如脂肪油或液體石蠟。此外，可添加穩定劑。
用于口服施用的其他藥物組合物包括薄膜，該薄膜被設計為粘附于口腔粘膜，如例如以下中所公開的:美國專利第4，713，243號；第5，948，430號；第6，177,096號；第6，284，264 號；第 6，592，887 號和第 6，709，671 號。栓劑形式的藥物組合物由活性化合物與栓劑基料的組合組成。適宜的栓劑基料包括例如，天然或合成的甘油三酯、聚乙二醇或石蠟烴。用于胃腸外施用的制劑視情況包括活性化合物的懸浮液和微粒分散體。在一些實施方案中，可施用油性注射懸浮液。適宜的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如，油酸乙酯、甘油三酯、聚乙二醇-400、克列莫佛或環糊精。注射懸浮液可包含使懸浮液粘度增大的物質，包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。任選地，懸浮液還可包含穩定劑。還可利用包含活性成分的脂質體制備藥物組合物。如本領域中已知的，脂質體一般來自磷脂或其他脂類物質。脂質體由分散在水介質中的單層或多層水合液態晶體形成。任何能形成脂質體的無毒的、生理上可接受的和可代謝的脂質均可使用。一般，優選的脂質為磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，天然的和合成的均可。形成脂質體的方法是本領域中已知的，如以下中所公開的，例如，Prescott,編，Methods in Cell Biology, XIV 卷，AcademicPress, New York, N.Y.(1976)和美國專利第 7，048，943 號。用于局部施用的制劑包括軟膏。適宜的載體包括植物油或礦物油、白凡士林、支鏈脂肪或油、動物脂肪和蠟。優選的載體是活性成分可溶于其中的載體。還可包含穩定劑、濕潤劑和抗氧化劑以及，若需要的話，包含賦予顏色或香味的劑。通過如下可制成軟膏:例如，將含活性成分的植物油諸如杏仁油的溶液與溫軟的石蠟混合，并使混合物冷卻。藥物組合物可包括水包 油乳液或微乳液，以有助于其用于口服施用、胃腸外施用或局部施用的制劑。這樣的乳液/微乳液一般包含脂質、表面活性劑、任選地濕潤劑以及水。適宜的脂質包括通常已知可用于生成水包油乳液/微乳液的脂質，例如脂肪酸甘油酯。適當的表面活性劑包括通常已知可用于生成水包油乳液/微乳液的表面活性劑，其中脂質被用作乳液中的油成分。非離子型表面活性劑可以是優選的，比如例如，乙氧基化蓖麻油、磷脂和環氧乙烷與環氧丙烷的嵌段共聚物。適宜的濕潤劑(若使用)，包括例如丙二醇或聚乙二醇。藥物組合物可被配制成凝膠的形式，比如由凝膠形成聚合物諸如卡拉膠、黃原膠、梧桐膠、阿拉伯膠、刺槐豆膠、瓜爾豆膠形成的水凝膠。水凝膠可與含活性成分的水包油乳液混合。藥物組合物可被配制為粘固劑的形式，諸如矯形手術中所用的含聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或磷酸鈣的那些粘固劑。藥物組合物可被配制為粉末形式，尤其是諸如利用射頻用于經皮應用的粉末，如例如美國專利第6，074，688號和第6，319，541號和WO 2006/003659中所描述的。藥物組合物可以膠的形式來配制，比如用于傷口閉合應用的包括氰基丙烯酸辛酯的那些膠。治療應用本發明提供了在需要治療的受治療者中治療神經功能缺損、治療皮膚和頭皮疾患、誘導組織修復和傷口的治療應用和方法。該方法包括向受治療者施用治療有效量的包括如本文所描述的乳香的分離的酸性級分的組合物。在一些實施方案中，該方法包括向受治療者施用治療有效量的包括選自以下的至少兩種三萜酸的組合的組合物:乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；和齊墩果酮酸。在另外的實施方案中，該方法包括向受治療者施用治療有效量的包括選自乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸和齊墩果酮酸的至少兩種三萜酸的組合的組合物。在一些實施方案中，該方法包括向受治療者施用治療有效量的包括由乳香二烯酸和異乳香二烯酸組成的三萜酸的組合物。在另外的示例性的實施方案中，該方法包括向受治療者施用治療有效量的包括由齊墩果酮酸、乳香二烯酸和異乳香二烯酸組成的三萜酸的組合物。施用組合物的步驟可包括任何可接受的途徑，包括，口服施用途徑、局部施用途徑、胃腸外施用途徑和透皮施用途徑，比如，例如，胃腸外施用包括靜脈內施用途徑、肌內施用途徑、皮下施用途徑、皮內施用途徑、腹膜內施用途徑、動脈內施用途徑、子宮內施用途徑、尿道內施用途徑、心臟內施用途徑、大腦內施用途徑、腦室內施用途徑、腎內施用途徑、肝內施用途徑、腱內施用途徑、骨內施用途徑、鞘內施用途徑、皮膚施用途徑、陰道施用途徑、直腸施用途徑、吸入施用途徑、鼻內施用途徑、眼施用途徑、耳施用途徑和口腔施用途徑。在一些實施方案中，施用的步驟包括將特定類型、特定譜系或處于分化的特定階段的細胞與組合物接觸。細胞可以是多種細胞類型的任一種，包括，尤其是，神經細胞、神經元細胞、內皮細胞、上皮細胞和所述譜系的干細胞。并且，細胞可以是任何譜系的，例如，夕卜胚層譜系、中胚層譜系、內胚層譜系和所述譜系的干細胞。在不同的實施方案中，在體內、離體(ex vivo)或體外進行接觸細胞的步驟。在一些實施方案中，待接觸的細胞是干細胞且細胞的接觸在體內、離體和體外進行。在一些實施方案中，在體內接觸干細胞。在一些實施方案中，離體接觸干細胞。在一些實施方案中，在體外接觸干細胞。

本文所公開的用于治療神經功能缺損的方法對于罹患神經變性病癥和疾病的受治療者是尤其有利的，所述神經變性病癥和疾病包括，尤其是，創傷、中風、血管性癡呆、老年性癡呆、阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、多發性硬化癥(MS)和帕金森氏病。在另外的情況下，該方法可應用于患有由于感染(例如，病毒、細菌、真菌、寄生蟲)導致的神經功能缺損的受治療者。在一些實施方案中，該方法可應用于患有由于免疫性疾患導致的神經功能缺損的受治療者。在一些實施方案中，神經功能缺損由于暴露于藥物諸如麻醉劑而導致。在一些實施方案中，神經功能缺損還可與選自由精神分裂癥、雙相性精神障礙、抑郁、肥胖癥、厭食癥和惡病質組成的組的病癥相關。在一些實施方案中，皮膚和頭皮疾患包括皮膚、頭皮和毛發附屬物，包括，例如，指甲和毛囊，的所有疾患。可受益于本發明的具體的病癥包括脫發、濕疹、牛皮癬、脂溢性角化病、皮脂溢和皮膚傷口。皮膚傷口包括下肢靜脈性潰瘍、壓迫性潰瘍、糖尿病足潰瘍、燒傷、截肢傷口、褥瘡潰瘍(褥瘡)、分層皮膚供體移植物、皮膚移植的供區、醫療裝置植入位點、咬傷、凍傷、刺傷、彈片傷、皮膚磨削術、挫傷、感染傷口和外科傷口。傷口可以是感染的結果；暴露于電離輻射的結果；暴露于激光的結果，或與化學劑接觸的結果。在一些實施方案中，本發明對于治療慢性非愈合傷口可以是有效且經濟的。如本領域普通技術人員所已知的，具體的治療在促進傷口愈合中的效力可通過多種標準來評估，包括通過傷口的長度、寬度和深度隨時間測量的閉合的速率、上皮形成速率、肉芽組織的形成和組織伸展強度。在一些實施方案中，本發明對于在人類、非人類哺乳動物、鳥類和魚中誘導和促進壽命延長可以是尤其有效的。在一些實施方案中，本文所公開的用于誘導或促進組織再生的方法對于患有組織損傷的受治療者是尤其有利的，所述組織損傷例如可與損害或傷害相關或是損害或傷害的結果。用于誘導或促進組織再生的方法可用于患有選自由以下組成的組的損害或傷害的受治療者:心肌梗塞、肺栓塞、腦梗塞、外周動脈閉塞性疾病、疝、脾梗塞、靜脈曲張性潰瘍、軸索顯微外科術、視網膜剝離、傷口(例如，燒傷、咬傷、凍傷、刺傷、彈片傷、挫傷、感染傷口或外科傷口)、感染和手術操作。在一些實施方案中，本發明對于傷口的無疤痕修復術是有效的。在一些實施方案中，該方法可在在受治療者中植入醫療裝置之前或之后進行。醫療裝置包括，但不限于，假體、人造器官或其組件、閥門、導管、試管、支架、人工膜、起搏器、傳感器、內窺鏡、顯像裝置、泵、金屬絲和植入物。植入物包括，但不限于心臟植入物、耳蝸植入物、角膜植入物、顱骨植入物、牙齒植入物、頜面植入物、器官植入物、整形外科植入物、血管植入物、關節內植入物和乳房植入物。在一些實施方案中，醫療裝置是器官植入物，其在某些情況下可包括受治療者的自體細胞。在一些實施方案中，接觸的步驟包括選自由電穿孔、聲裂法、射頻、加壓噴霧和其組合組成的組的方式。在一些實施方案中，接觸的步驟包括在間質液和組合物之間建立接觸。這對于為間質液所包圍的傷口是尤其有利的。間質液和組合物之間的接觸可通過用針、顯微針、或包括多個針或顯微針的器械刺和/或挑真皮來實現。這樣的針或顯微針優選地是非中空的，且可以多個的方式在諸如梳子或刷樣設備上成型。本發明的方法適宜于在人類、非人哺乳動物、魚和鳥類中應用。制品本發明的方法可包括并入了含本文所描述的乳香的分離的酸性級分的組合物的制品的應用。藥物組合物可以是制品上的涂層的形式，或可被包含在與該制品構成一體的容器中。藥物組合物有利地作為裝置上的涂層存在，該裝置被嵌入機體并為了在其中整合，例如植入物。因此藥物組合物可由于乳香的分離的酸性級分在誘導細胞分化方面的活性而促進組織在植入物上閉合。藥物組合物可有利地被并入到用于傷口愈合或組織修復的制品上或制品中，例如，敷料或繃帶。因此藥物組合物可由于乳香的分離的酸性級分在誘導細胞分化方面的活性促進傷口愈合。在其他情況下， 藥物組合物可被并入遞送裝置，比如針、注射裝置或噴霧分配器，組合物從所述裝置被遞送到需要治療的機體部位，例如傷口部位。制品包括但不限于織物制品、尿布、傷口敷料、醫療裝置、針、顯微針、注射裝置和噴霧分配器。在一些實施方案中，制品包括多個顯微針。醫療裝置和植入物如上文所述。給出以下實施例以更充分地說明本發明的某些實施方案。但其無論如何都不應被解釋為限制本發明的寬泛范圍。本領域技術人員可容易地對本文所公開的原理作出多種改變和修正，而不脫離本發明的范圍。
實施例 實施例1.乳香的分離的酸性級分的制備將乳香樹脂(IOg)與無水乙醇(200ml)混合，并允許混合物放置過夜。在150rpm下振蕩混合物約15分鐘，使任何較大的不可溶的顆粒沉降20分鐘，并將乙醇轉移至新燒瓶。用一份新鮮的無水乙醇部分(150ml)在200rpm下振蕩殘余物10分鐘。將該乙醇級分與第一級分混合。用另一份150ml的無水乙醇部分重復該過程，將該級分與前兩個乙醇級分混合。隨后，利用旋轉蒸發器(水浴溫度30°C)在真空中去除乙醇。向殘余物添加己烷(300ml)，并在150rpm下振蕩混合物兩小時。在封閉的燒瓶中放置過夜以完成可溶的物質的完全溶解和任何不可溶物質的沉淀，然后將澄清的己烷溶液轉移至干凈的、預稱重的燒瓶中，并利用旋轉蒸發器去除己烷，得到約6克萃取的物質。隨后將所獲得的萃取的物質溶于乙醚(300ML)中并用5%碳酸鈉水溶液(4X100ML)萃取，然后利用0.1N氫氧化鈉水溶液(3X100ML)萃取。通過緩慢添加10%的鹽酸水溶液將該兩種堿性水性萃取物分別酸化至PH 1-2，且隨后用新鮮的乙醚(3X100ML)萃取。合并由此獲得的醚級分并在無水硫酸鈉中干燥。在過濾掉硫酸鈉之后，利用旋轉蒸發器去除乙醚。得到白色固體的約3克乳香的分離的酸性級分。為進行比較，將己烷添加到根據W02003/092712或Parachos等人，(2007)，Antimacrobial Agents and Chemotherapy, 51 (2), 551 的教導所制備的酸性級分，顯不大量的該酸性級分在己烷中是不可溶的。當在如實施例4中所描述的體外測定中試驗作為I %乙醇溶液的該己烷-不可溶物質時(據發現其在棉籽油中基本上不可溶)，發現其可對細胞導致嚴重的脅迫。無水乙醇(plane ethanol)用作陰性對照且以所用的體積對細胞不導致任何脅迫或害處。此外，根據本發明制備的酸性級分的I %乙醇溶液誘導細胞有效分化成神經元細胞。該結果清楚地表明，本發明的酸性級分不含存在于現有技術所公開的酸性級分中的有害物質。實施例2.乳香的分離的酸性級分(RPh-Ac)在USP/NF級棉籽油中的5% (w/w)組合物的制備向I克的來自實施例1的獲得的分離的酸性級分中添加19克棉籽油(USP/NF)并以150rpm搖動混合物直至獲得澄清和均一的組合物(約2小時)。實施例3.乳香的分離的酸性級分的分離和化學表征根據實施例1萃取來自乳香黃連木的乳香以獲得級分，通過反相HPLC(圖1)對其進行分析以鑒定主要成分。在與分析型標準相比較的基礎上，HPLC分析與分離的級分中的模繞酮酸和齊墩果酮酸的分離的級分的存在一致。分離的酸性級分的反相HPLC方法所用的條件為:流速:Iml/分鐘；檢測UV波長220nm ;樣品濃度lmg/ml ;注入體積20 μ I ;用20%的乙腈水溶液回洗針頭和泵；ELSD_氮流速Iml/分鐘；蒸發溫度_80°C ;霧化溫度60°C ；0.8%乙酸-ACN梯度。酸性物質和制劑樣品的梯度比顯示于表I中:表I
權利要求
1.一種組合物，包括有效量的乳香的分離的酸性級分，和藥學上可接受的載體；其中所述級分的特征在于其在至少一種極性有機溶劑中和在至少一種非極性有機溶劑中是可溶的，且其中所述級分基本上不含在所述極性有機溶劑中可溶但在所述非極性有機溶劑中不可溶的化合物。
2.如權利要求1所述的組合物，其中所述酸性級分通過酸堿萃取獲自在至少一種極性有機溶劑中和至少一種非極性有機溶劑中可溶的乳香的分離的級分，從而將乳香的分離的酸性級分與在至少一種極性有機溶劑中和一種非極性有機溶劑中可溶的乳香的非酸性級分分離而獲得。
3.如權利要求1所述的組合物，其中所述分離的酸性級分包括以下中的至少三種:乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；模繞酮酸；和3-氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述極性有機溶劑選自由醇、醚、酯、酰胺、醛、酮、腈、和其組合組成的組。
5.根據權利要求1所述的組合物，其中所述極性有機溶劑選自由以下組成的組:甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、仲-丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、新戊醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-2- 丁醇、2-甲基-2- 丁醇、乙二醇、乙二醇單甲醚、乙醚、甲基乙醚、乙基丙醚、甲基丙醚、1，2- 二甲氧基乙烷、四氫呋喃、二氫呋喃、呋喃、吡喃、二氫吡喃、四氫吡喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙醛、甲酸甲酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙基甲基甲酮、二乙基甲酮、乙腈、丙腈、和其組合。
6.根據權利要求1所述的組合物，其中所述非極性有機溶劑選自由以下組成的組:無環的或環狀的、飽和的或不飽和的脂族烴和芳族烴、和其組合，其每一個任選地被一個或多個鹵素取代。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中所述非極性有機溶劑選自由C5-C10烷烴、C5-C10環烷烴、C6-C14芳族烴和C7-C14全氟烷烴、和其組合組成的組。
8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述非極性有機溶劑選自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、環戊烷、環己烷、環庚烷、苯、甲苯、二甲苯、和其異構體和混合物組成的組。
9.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物包括基于所述組合物的總重量從約0.01至約50% (w/w)、或約0.01至約12% (w/w)的所述乳香的分離的酸性級分。
10.根據權利要求1所述的組合物， 所述組合物通過包括以下的步驟的方法獲得: (a)用極性有機溶劑處理所述乳香； (b)分離在所述極性有機溶劑中可溶的級分； (C)任選地去除所述極性有機溶劑； (d)用非極性有機溶劑處理步驟(b)或(C)中獲得的可溶性級分； (e)分離在所述非極性有機溶劑中可溶的級分； (f)任選地去除所述非極性有機溶劑； (g)將步驟(f)獲得的級分溶于有機溶劑中；(h)用堿性水溶液處理步驟(g)中獲得的溶液以獲得堿性水性級分；和 (i)用酸溶液對步驟(h)中獲得的所述堿性水性級分進行酸化以獲得酸化的水溶液。
11.根據權利要求10所述的組合物，其中所述方法還包括以下步驟: U)用有機溶劑萃取步驟(i)中獲得的酸化的水性級分； (k)任選地將干燥劑與步驟(j)中獲得的有機級分接觸以去除殘余的水； (I)從步驟或(k)中的任一步驟中獲得的級分中去除有機溶劑和/或多余的酸；和 (m)將步驟(I)中獲得的分離的級分溶于藥學上可接受的載體中。
12.根據權利要求10所述的組合物，其中步驟(a)至(c)在步驟⑷至⑴之前進行；或其中步驟⑷至(f)在步驟(a)至(C)之前進行。
13.根據權利要求10所述的組合物，其中重復(a)至(C)和/或步驟⑷至⑴多個循環。
14.根據權利要求10或11所述的組合物，其中步驟(g)和步驟(j)中所述的有機溶劑獨立地選自由二烷基醚、烷基芳基醚、二芳基醚、酮、鹵化烴、C5-C14芳族烴、C5-C14全氟烷烴、和其組合組成的組。
15.根據權利要求10或權利要求11所述的組合物，其中所述極性有機溶劑包括乙醇，所述非極性有機溶劑包括己烷且用于所述酸堿萃取的所述有機溶劑包括乙醚。
16.根據權利要求10或權利要求11所述的組合物，其中所述極性有機溶劑是乙醇，所述非極性有機溶劑是正己烷且用于所述酸堿萃取的所述有機溶劑是乙醚。
17.根據權利要求10所述的組合物，其中步驟(h)中的所述堿性水溶液從選自由以下組成的組的無機堿制備:碳酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸氫鈉、磷酸鈉、氫氧化鋰、碳酸鋰和磷酸鉀。
18.根據權利要求1所述的組合物，其中所述乳香獲自選自由乳香黃連木(P.1entiscus)、大西洋黃連木(P.atlantica)、P.palestina、P.saportae、黑黃連木(P.terebinthus)、阿月渾子(P.vera)和全緣葉黃連木(P.1ntegerrima)組成的組的黃連木屬(Pistacia)的物種。
19.根據權利要求1所述的組合物，其中所述載體是選自由至少一種油、至少一種蠟、和其組合組成的組的疏水載體。
20.根據權利要求19所述的組合物，其中所述至少一種油選自由棉籽油、杏仁油、油菜籽油、椰子油、玉米油、葡萄籽油、橄欖油、花生油、藏紅花油、芝麻油、大豆油、和其組合組成的組。
21.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物為適宜于通過選自由以下組成的組的途徑施用的形式:口服的、局部的、胃腸外的、肌內的、皮下的、皮內的、陰道的、直腸的、顱內的、鼻內的、眼內的、耳的、肺病灶內的、腹膜內的、動脈內的、大腦內的、腦室內的、骨內的和鞘內的。
22.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物為適宜于局部施用的形式。
23.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物為適宜于胃腸外施用的形式。
24.根據權利要求1所述的組合物，所述組合物用于治療神經功能缺損。
25.根據權利要求24所述的組合物，其中所述神經功能缺損與選自由以下組成的組的病癥或疾病相關:阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、多發性硬化癥、帕金森氏病、血管性癡呆和老年性癡呆。
26.根據權利要求24所述的組合物，其中所述神經功能缺損與阿爾茨海默病相關。
27.根據權利要求24所述的組合物，其中所述神經功能缺損與創傷或中風相關。
28.一種用于治療神經功能缺損的組合物，所述組合物基本上由包括至少三種三萜酸的類三萜的混合物和藥學上可接受的載體組成，所述至少三種三萜酸選自由以下組成的組:乳香二烯醇酸；異乳香二烯酸；異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基乳香二烯醇酸；3-0-乙酰基表乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基異乳香二烯醇酸；3-0_乙酰基表-異乳香二烯醇酸；齊墩果酮酸；模繞酮酸；3_氧代-羽扇-20 (29)-烯-28-酸、和其組合。
29.如權利要求28所述的組合物，所述組合物基本上由乳香二烯酸；異乳香二烯酸和齊墩果酮酸組成。
30.如權利要求28所述的組合物，其中所述三萜酸中的至少一種是化學合成反應的產物。
31.如權利要求28所述的組合物，其中所述三萜酸中的至少一種來自植物來源。
32.如權利要求31所述的組合物,其中所述植物屬選自由黃連木屬(Pistacia)Iiv屬(Pinus)、云杉屬(Picea)、刺柏屬(Juniperus)、Alsies、落葉松屬(Larix)、金魚草屬(Antirrhinum)、乳香屬(Boswellia)、柑橘屬(Citrus)和三七草屬(Gynura)組成的組。
33.如權利要求31所述的組合物，其中所述植物來源來自黃連木屬。
34.如權利要求33所述的組合物，其中所述黃連木屬的物種選自由乳香黃連木、大西洋黃連木、P.palestina、P.saportae、黑黃連木、阿月渾子和全緣葉黃連木組成的組。
35.如權利要求28所述的組合物，其中所述神經功能缺損與選自由以下組成的組的病癥或疾病相關:阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、多發性硬化癥、帕金森氏病、血管性癡呆和老年性癡呆。
36.如權利要求28所述的組合物，其中所述神經功能缺損與阿爾茨海默病相關。
37.如權利要求28所述的組合物，其中所述神經功能缺損與創傷或中風相關。
38.如權利要求28所述的組合物，所述組合物為適宜于通過選自由以下組成的組的途徑施用的形式:口服的、局部的、胃腸外的、肌內的、皮下的、皮內的、陰道的、直腸的、顱內的、鼻內的、眼內的、耳的、肺病灶內的、腹膜內的、動脈內的、大腦內的、腦室內的、骨內的和鞘內的。
39.如權利要求28所述的組合物，所述組合物為適宜于局部施用的形式。
40.如權利要求28所述的組合物，所述組合物為適宜于胃腸外施用的形式。
全文摘要
本發明涉及包括乳香的分離的酸性級分的組合物和制劑，和其用于治療神經功能缺損以及傷口和組織修復的應用。
文檔編號A61K36/00GK103167871SQ201180049685
公開日2013年6月19日 申請日期2011年9月7日 優先權日2010年9月7日
發明者Z·哈扎, 安德烈·C·B·呂卡森 申請人:瑞吉納拉制藥公司