用于工業規模分散的生物基質支架的制作方法

用于工業規模分散的生物基質支架的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用于工業規模分散的生物基質支架。
【專利說明】用于工業規模分散的生物基質支架
[0001]優先權聲明
[0002]本申請在35 U.S.C.§ 119(e)下要求2010年7月2日提交的、序列號為61/360, 939的美國臨時申請的優先權，其全部內容通過引用并入本文。
[0003]政府支持聲明
[0004]本發明的各方面在國立衛生研究院(NIH)資助號AA014243和IP30-DK065933、國立糖尿病、消化系統和腎病研究院(NIDDK)資助號DK34987、國立癌癥研究院(NCI)資助號CAO16086和國立牙科和顱面研究所資助號DE019569的政府支持下做出。美國政府對本發明具有一定的權利。
【技術領域】
[0005]本發明涉及生物基質支架和產生生物基質支架的方法，以及它們作為完整支架或作為以各種方式被切片或粉碎以及被分散以用于特定的實驗和臨床用途的支架在不同應用中的用途。
[0006]發明背景
[0007]先體內后體外(ex vivo)或臨床項目如細胞療法中使用分化細胞的能力取決于維持具有成體表型并具有完全功能的細胞或能夠譜系限制干細胞或祖細胞(“干/祖細胞”)以實現該成體表型的能力。干細胞研究中正在進行的革命已經使得干/祖細胞群體包括來自胚胎、胎兒和出生后組織的那些的鑒定和分離成為可能^針對所有成體細胞類型鑒定和分離干/祖細胞的能力以及使它們擴增和分化的能力極大地增加了利用它們用于制藥學及其他工業研究項目、用于學術研究以及用于臨床項目諸如基于細胞的療法和組織工程的潛能2。
[0008]目前用于先體內后體外維持分化細胞或將干細胞譜系限制為成體命運的方法是部分成功的，并且涉及將細胞鋪板在或嵌入一種或多種細胞外基質成分的基質并嵌入對于所需成體表型定制的由特定激素、生長因子、和營養物組成的培養液中。對于非常原始的干細胞諸如胚胎干(ES)細胞或誘導多能干細胞(iPS)，或出生后衍生的可以轉變為多種成體命運的干細胞，諸如間充質干細胞(MSC)或羊水來源干細胞(AFSC)，這些干細胞經受可溶性信號和/或細胞外基質成分的混合物，并必須經數周時間以多組這樣的信號進行處理。典型地，所實現的成體表型隨著每次制備是不同的，并具有某些成體特異基因的過表達或低表達和/或一種或多種成體組織特異性基因的異常調節。
[0009]細胞外基質由細胞分泌，在一個或多個細胞表面上與它們鄰近，并且已經長期被理解為是對于細胞的結構支持物7。它是由多種生物活性分子組成的極其復雜的支架，所述生物活性分子被高度調節，并且對于決定附著細胞的形態、生長和分化是關鍵的8。培養細胞的組織特異性基因表達通過在基質提取物或純化的基質成分上培養細胞來改善9。然而，個別基質成分，單獨的或組合的，不能夠概括組織的復雜基質化學和結構。這與下列事實相關:基質成分處于與自然組織區域以及與組織學結構諸如血管相關的梯度中。組織基質的這種復雜性更加容易通過對組織脫細胞化并留下基質作為殘留物的提取法來實現1CK11。然而，當前的脫細胞化方案由于使用溶解基質成分的基質降解酶或緩沖液而導致一些基質成分的大量流失。
[0010]本發明提供了生物基質支架以及制備和使用這樣的生物基質支架的方法。本發明的方法導致產生富含組織的大部分膠原并具有結合基質成分和基質結合激素、生長因子和細胞因子的組織特異性提取物，所述膠原、結合基質成分和基質結合激素、生長因子和細胞因子對成熟細胞和干/祖細胞群體的譜系限制共同地產生重復性更高且更有效的分化效果O

【發明內容】

[0011]本發明提供了由生物組織產生生物基質支架的方法，所述生物基質支架用于分散(例如，利用所述量，例如實施例2中所述的方案中所述的量的工業規模分散)至培養裝置上的方法，其包括:a)以包含約3.5M NaCl至約4.5M NaCl的鹽濃度的緩沖液灌注生物組織或使生物組織均質化山)在第一培養液中以包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿，其中所述第一培養液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m sm/kg,以及所述第一培養液是無血清的且處于中性pH ;然后
[0012]c)用處于中性pH且包含約2.0M NaCl至約5.0 M NaCl的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度以保持生物組織中鑒定的膠原不溶?’然后
[0013]d)在緩沖液中用核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)灌注步驟(C)的組織或提取步驟(C)的勻漿；以及然后
[0014]e)用處于中性pH、無血清、且具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的第二培養液沖洗步驟(d)的組織或步驟(d)的勻漿，進而從所述生物組織產生完整的或均質化的生物基質支架，所述生物基質支架包含生物組織的至少95%的膠原和大部分膠原結合基質成分以及基質結合生長因子、激素和細胞因子；
[0015]f)在基礎培養液中稀釋所述生物基質支架；
[0016]g)在約-80°C冷凍(f)的生物基質支架；
[0017]h)通過低溫研磨將(g)的生物基質支架粉碎為約I μ m至約100 μ m大小范圍的生物基質顆粒；
[0018]i)在基礎培養液中懸浮解凍(h)的生物基質顆粒；以及
[0019]j)將步驟(i)的生物基質顆粒分散至培養裝置上，進而從生物組織產生生物基質支架，所述生物基質支架用于分散(例如，如本文所述的工業規模分散)至培養裝置上。
[0020]本發明還提供了通過本發明方法產生的生物基質支架。
[0021]本發明的前述和其他方面現在將關于本文描述的其他實施方案來進行更加詳細描述。應該理解的是，本發明可以以不同形式體現，并且不應該解釋為限于本文所述的實施方案。還有，提供這些實施方案，使得本公開將徹底且完整，并且將本發明的范圍充分地傳達給本領域技術人員。
[0022]附圖簡要說明
[0023]圖1A-El:大鼠肝臟生物基質支架制備。(A)四步脫細胞化過程，包括灌注清洗、以PLA2和SDC脫脂、高鹽量清洗、以及核酸酶處理用于核酸去除。(B-D)在大鼠生物基質支架制備中的四個階段。⑶在用基礎培養液灌注清洗10分鐘后，肝臟變得蒼白；(C)在脫脂期間，肝臟在GC下變得部分透明；(D)最終的完整支架在40分鐘灌注后看起來透明；(E)以低放大倍數顯示的生物基質支架。(El)用若丹明標記的葡聚糖顆粒灌注的支架可視化表明了沿通道從大血管至細血管分支的漸增流量，且沒有泄露，表明支架中的專有脈管。在不同階段的生物基質支架的相應蘇木精和伊紅(H&E)染色表明，封裝實質細胞的組織學結構如血管和網格狀基質被保留，而細胞被去除。正常的大鼠肝門三聯管結構由門靜脈(PV)Jfa脈(HA)、和膽管(BD)組成(BI);在脫細胞化過程期間，基質纖維隨著細胞被逐漸去除而變得透明(Cl);對比(BI)和(Dl)，脫細胞化肝門三聯管區；D2和D3顯示所有細胞從基質支架去除，但網狀結構被保留，諸如血管、GC、及圍繞實質細胞壁的網格狀基質。
[0024]圖2A-H:大鼠肝臟生物基質支架的TEM(A-C)和SEM(D-H)圖像。(A)具有厚壁(W)的血管(BV)的低放大倍數。I型膠原(大箭頭)是眾多的并且包含不攝取重金屬染料的纖維的橫截面(白點、小箭頭)。(B)血管壁的更高放大倍數顯示了基膜(大箭頭)、無定形彈性蛋白(*)和相關彈性纖維、少量的膜囊泡殘留物(小箭頭)、I型膠原帶狀纖維(箭頭)和小纖維(小箭頭)。小纖維可能是原纖蛋白(VI型膠原)，其與I型膠原密切關聯且幫助組織I型膠原。(C)具有64nm帶型模式的I型膠原的高放大倍數(箭頭)。(D)具有薄壁(BV)的血管和更大血管(W)的壁的低放大倍數。(E)在更高放大倍數，大血管壁(W)是圓齒狀的，與門三聯管的肝動脈一致，參見(A)。在壁下是眾多的I型膠原束(大箭頭)，其由長分支型薄的、網狀的(III型)膠原纖維(小箭頭)連接。(F)大束的I型膠原具有特征性的平行纖維(大箭頭)，其與各種較小纖維(箭頭)和結節或珠狀纖維(箭頭)關聯。(G)在平面中互連的大/小纖維的3D網絡，其將邊界形成例如為肝血竇。(H)網絡的更高放大倍數顯示了各種纖維(箭頭):ΙΠ型膠原(更大直徑直線)、彈性纖維或VI型膠原。
[0025]圖3Α-Β:生物基質支架中膠原的化學分析和細胞外基質(ECM)成分的表達。(A)所有在膠原中發現的三種氨基酸的含量:羥脯氨酸(Hyp)、羥賴氨酸(Hyl)及甘氨酸(Gly)。數字表示每種氨基酸/1000氨基酸的殘留。該數據顯示脫細胞化過程中膠原含量顯著增加，其從肝臟中< 0.2%至生物基質支架中的大于15%。(B)生物基質支架中基質分子的免疫組織化學染色，顯示了 肝臟生物基質支架中層粘連蛋白(LAM)、硫酸肝素(HS)、III型膠原(C0L3)和纖連蛋白(FN)以及與血管壁殘留物相關的典型的基膜蛋白的分布。在更高放大倍數，本領域技術人員可以觀察基膜的主要成員，包括IV型膠原(C0L4)、巢蛋白(Ent，也稱為內功素)、層粘連蛋白(LAM)和基底膜聚糖(Per)，其是靠近門三聯管的支架部分中HS-PG的形式。
[0026]圖4A-D:生物基質支架中從門三聯管至中央靜脈的ECM成分的模式。正常肝臟(A)與肝臟生物基質支架⑶的從門三聯管(I區)至中央靜脈(3區)的組織學比較；兩者都是蘇木精/伊紅染色切片。(C)該模型示意肝臟中干細胞和成熟譜系系統，其具有顯示形成與肝分區相關的模式的代表性基質成分。成分以免疫組織化學的發現中的豐度的順序列出。人肝臟中已知的譜系階段在I區門靜脈周圍(門三聯管周圍)開始并且進行成熟，在3區中以凋亡細胞結束。在肝臟干細胞龕中鑒定的已知基質化學物包括透明質酸、III型膠原、與α6β4整聯蛋白結合的形式的層粘連蛋白、以及弱硫酸化形式的CS-PG43'44。只是在干細胞龕外側發現IV型膠原、通常硫酸化的CS-PG和HS-PG、以及與α β I整聯蛋白結合形式的層粘連蛋白。HP-PG已經證實獨特地位于中心周圍45'46。(D)肝臟中基質成分和它們的位置與生物基質支架中基質成分及其位置的比較的研究，從免疫組織化學發現中總結的數據(N/D=未測試。*由其他人員發現的僅僅靠近中央靜脈)。細胞骨架的多數成分在清洗期間丟失，存在細胞骨架蛋白的一些殘留物但非全部。支架缺乏可檢測量的微管蛋白、肌間線蛋白和肌動蛋白(鬼筆環肽測定)。然而，存在在支架中隨機分散著的痕量細胞角蛋白；在門三聯管的血管殘留物周圍痕量的α平滑肌肌動蛋白；以及遍布的低水平的波形蛋白。
[0027]圖5Ε-Ι:肝臟生物基質支架上與I型膠原上比較的hHpSC的表征。相差圖像(A-D)顯示了源自相同肝臟并在無血清Kubota'培養液中和在組織培養塑料(A)上和在I型膠原上(B)上培養的hHpSC集落的形態變化，所述組織培養塑料是一種用于自我復制的條件，其與對于肝臟的無血清分化培養液中的分化條件對比，所述I型膠原與在牛肝臟生物基質支架上(C-E)對比。有功能的和完全存活的培養物在I型膠原上存活不超過~2周。通過對t匕，在肝臟生物基質支架上的細胞是存活且健康的，且具有功能的所有組成成分，且持續至少一個月。培養物通過7-12天轉換為具有增加的細胞質/細胞核比率和標記的糖原表達的細胞(C)，并且然后轉換為具有通過清楚膽小管散布的典型多邊形細胞形態的細胞(D)，所述培養形態在其后持續，如第24天的代表性培養物所顯示的(E)。RT-PCR測定顯示了第7天在培養塑料上(F)與在大鼠肝臟生物基質支架上(G)相比較、在自我復制條件下hHpSC的基因表達變化。我們對比以下表達，hHpSC標記，包括CXCR4和EpCAM ;早期肝細胞基因，包括CK19 (KRT19)、HNF6、F0XA2、AFP和低水平的白蛋白；成熟肝細胞標記，包括高水平的白蛋白(ALB)、轉鐵蛋白(TF)、CYP450-3A4、酪氨酸轉氨酶(TAT)、和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)，以及膽管上皮細胞基因，包括CFTR、伽馬谷氨酰轉肽酶(GGTl)、陽離子交換2 (AE2)和頂端鈉依賴性膽汁酸轉運蛋白(ASBT)。生化測定測量I型膠原上與大鼠肝臟生物基質支架上的培養物中合成的尿素(H)，以及測量I型膠原上與由大鼠或牛肝臟制備的生物基質支架上的培養物中CYP450-3A4活性(I)。表7提供了定量測量的總結，其比較了在針對自我復制的培養條件下(III型膠原)、或在針對I型膠原與肝臟生物基質支架上相比的分化的條件下新鮮分離的hHpSC的附著、存活力、生長、培養生命周期、以及組織特異性基因表達。
[0028]圖6A-D:在生物基質支架上由hHpSC譜系限制的細胞的免疫熒光染色。(A)以肝特異性標記白蛋白(Alb，淺灰色)染色和以肝干`細胞表面標記EpCAM(白色)染色。注意的是鋪板在生物基質支架上的細胞不表達EpCAM。比例尺= 200 μ m。(B)以早期肝標記甲胎蛋白(AFP，淺灰色)和針對人膽管上皮細胞標記細胞角蛋白19(CK19，白色)的抗體染色，所述標記在該表達水平顯示成熟膽管上皮細胞。針對CK19的抗體測定是人特異性的，并且不染色沒有細胞接種的支架中大鼠CK19處的殘留物。AFP表達是低的但在第7天仍是明顯的。比例尺= 200μπι。(C)以Alb (淺灰色)和肝星形細胞標記、α-平滑肌肌動蛋白(ASMA，白色)染色。白蛋白和ASMA的表達強烈顯示正在成熟的肝細胞和星形細胞都存在。比例尺=IOOym0 (D)以功能肝蛋白CYP450-3A4 (淺灰色)和膽管上皮細胞特異性標記分泌素受體(SR，白色)染色，所述標記顯示正在成熟的肝細胞和膽管上皮細胞是功能性的并且表達針對這兩種細胞類型的典型標記。比例尺=200 μ m。
[0029]圖7A-D:生物基質支架上的完全功能性的、成熟人肝細胞的穩定性。成體肝細胞鋪板在分化培養液中，以及鋪板在I型膠原(A、B)上與牛肝臟生物基質支架(C)上對比，它們是低溫粉碎的、分散在培養液中并允許沉積在板上。I型膠原上的細胞是完全存活的并且在第7-12天(A顯示第7天)處于它們的分化峰值；它們在~2周后開始惡化，并通過20天(B)它們死亡、正在死亡和無功能。通過對比，鋪板在肝臟生物基質支架上的那些細胞(C)持續至少8周是有功能的(還沒有評估更長時間)；這里顯示的21天后在粉碎的肝臟生物基質支架上的培養物中。對于鋪板在生物基質支架上與I型膠原上相比的冷凍成體肝臟細胞的兩種獨立制備物的培養的CYP450-3A4測定，并且在第12天測定(D)。樣本ZHep-007代表在解凍后具有良好附著的低溫保存樣本；樣本ZL-013代表在解凍后具有差附著或無附著的那些批次。因此，即使這些更差質量的樣本能夠附著至生物基質支架并長期維持存活。在所測定的兩種樣本中，P450s水平在肝臟生物基質支架上培養時更高。隨著在生物基質支架上的時間推移，更差質量的冷凍保存的批次將得到改進。
[0030]圖8:通過脫氧膽酸鈉激活磷脂酶A2來產生溶血卵磷脂。該方案的原理:由脫氧膽酸鈉激活的磷脂酶A2 (PLA2)將使位于細胞質膜和線粒體膜上的磷酸甘油酯降解為溶血卵磷脂，所述溶血卵磷脂是強力表面活性劑，其誘導細胞壞死。
[0031]圖9:大鼠肝臟與大鼠肝臟生物基質支架相比的膠原組成分析。生物基質(黑色)和整個肝臟(淺灰色)的氨基酸成分以玫瑰圖形式呈現。對于分析的每種氨基酸使用三字母縮寫。沒有分析色氨酸和半胱氨酸。數字顯示氨基酸殘基/1000。
[0032]圖10A-C:大鼠肝臟生物基質支架的核酸分析。肝臟生物基質載玻片的相差圖(A)和熒光DAPI染色(B)，以及來自大鼠新鮮肝臟組織與生物基質支架(C)相比的總DNA及RNA的定量測定。
[0033]圖1lA-C:在將hHpSC鋪板至生物基質支架上以后的生物基質支架的染色。活體(鈣黃綠素-AM，白色)/死亡(溴化乙錠或EtD-Br1，淺灰色)測定顯示hHpSC集落在生物基質支架切片 上是存活的，但在集落中部(A、B)在前幾天沒有攝取染料，這是由于干細胞中的已知泵(例如MDR1)消除了活體染料。在(B)中，熒光圖像與相位圖像合并以顯示集落中間含有細胞。通過7天，整個集落的細胞已經分化并在幾乎整個集落的所有細胞中攝取活體染料(C)。
[0034]圖12A-F:在I型膠原上培養的大鼠肝細胞與在大鼠肝臟生物基質支架上培養的大鼠肝細胞的對比。第3天(A、C)和第10天(B、D)在I型膠原上和生物基質支架上培養的成體大鼠肝細胞。它們在幾分鐘內附著在肝臟生物基質支架上并存活與測試一樣長的時間，持續大于8周(C、D);沒有測試更長時間。培養物在生物基質支架上是非常三維的。在第1、3、5、7、10、14、21和28天的尿素合成(E)和細胞存活力測定(F)，η = 3。
[0035]圖13A-D:人胰腺與人胰腺生物基質支架的對比。嵌入石蠟中、切片并以蘇木精和伊紅(Η&Ε)染色的人胰腺(A)與人胰腺生物基質支架(B-D)的對比。胰島結構已經在B中描繪出。胰腺生物基質支架的腺泡區在C和D中顯示。
[0036]圖14:在人胰腺組織中與大鼠胰腺生物基質支架中相比發現的代表性基質成分和一種細胞骨架成分波形蛋白。沒有發現可檢測量的其他細胞骨架成分(肌間線蛋白、微管蛋白、肌動蛋白)或發現痕量的細胞骨架成分(細胞角蛋白)。虛線環繞胰島，注意的是多配體聚糖I和VI型膠原在胰腺組織和生物基質支架的胰島中都是強陽性的。多配體聚糖I僅在胰島中(虛線)發現而沒有在腺泡細胞中(箭頭)發現；III型膠原在腺泡細胞中和血管周圍(箭頭)更富集，但在胰島中沒有。
[0037]圖15A-C:人十二指腸生物基質支架的組織學和免疫組織化學染色。(A)人十二指腸生物基質支架的外側和腔側。在Η&Ε染色切片中對比正常組織(B)和生物基質支架(C)之間的多層結構，并且結果顯示支架保留黏膜層和黏膜下層中的絨毛和血管。下圖顯示，人十二指腸生物基質支架的免疫組織化學染色顯示保留在支架中可變數量的細胞外基質蛋白。
[0038]圖16A-D:人膽囊組織與人膽囊生物基質支架的對比。人膽囊組織(A、B)與由其制備的生物基質支架(C、D)的對比。組織和生物基質支架嵌入在石蠟中、切片并以蘇木精和伊紅染色。
[0039]圖17:以1: 24稀釋的生物基質溶液的制備實例。30mlx3 = 90ml。30ml生物基質+90ml溶液5 = 120ml以1: 24稀釋的生物基質溶液。
[0040]發明詳細描述
[0041]現將在下文中更加全面地描述本發明。然而本發明可以以不同形式體現并不應該被解釋為限于本文所述的實施方案。還有，提供這些實施方案以使得本公開將徹底且完整，并且將本發明的范圍充分地傳達給本領域技術人員。
[0042]本文中本發明說明書中使用的術語僅用于描述特定實施方案的目的，并不旨在對本發明的限定。如本發明說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式“一個(a)”、“一個(an)”和“該”(the)還旨在包括復數形式，除非上下文中另有清楚的顯示。
[0043]除非另有限定，本文使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。還將理解的是，術語諸如在通常使用的詞典中定義的那些，應該解釋為具有與在本申請上下文和相關領域中的它們的含義相一致的含義，且不應該解釋為理想化的或過于正式的含義，除非本文明確這樣限定。本發明說明書中所使用的術語在本文中僅是用于描述特定實施方案的目的并且不旨在對本發明的限定。本文中所提及的所有出版物、專 利申請、專利和其他參考文獻的全部內容通過引用并入本文。
[0044]而且，如本文中所使用的，“和/或”是指并包括相關列出項中的一個或多個的任何和所有可能組合，以及在解釋為可替代的(“或”)時沒有組合。
[0045]除非上下文另有顯示，特別期望的是，本文中所描述的本發明的各種特征可以以任何組合使用。此外，本發明還考慮在本發明的一些實施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征組合。為了示意，如果說明書聲明復合物包括成分A、B和C，特別期望的是，可以單獨或以任何組合省略或放棄A、B或C中的任一個、或其組合。
[0046]如本文中所使用的，過渡詞“基本由…組成”(以及語法變體)應該解釋為包括所述的材料或步驟，“以及那些非本質上影響要求保護的發明的一個或多個基本和新的特征”的材料或步驟。參見 In re Herz, 537 F.2d 549，551-52，190 U.S.P.Q.461，463 (CCPA 1976)(原文中強調)；還參見MPEP §2111.03。因此，本文中所使用的術語“基本由…組成”不應該解釋為等同于“包括”。
[0047]如本文中所使用的術語“約”在是指可測量值如量或濃度(例如，生物基質支架中總蛋白中膠原的百分比)等時，旨在包括所指定量的20%、10%、5%、1%、0.5%、或甚至0.1 %的變化。
[0048]本發明涉及生物基質支架的發現和開發，所述生物基質支架比現在已知的脫細胞化的組織支架具有意外的改進和優勢，改進和優勢的一些實例是使用本發明的生物基質支架有效維持成熟細胞和/或譜系限制和/或使干細胞分化為成熟命運和/或維持該成熟細胞在長期的一段時期有功能。作為進一步實例，使用本發明的生物基質支架將產生成熟命運的細胞的時間從約3-6周或更多降低至約1-2周。本發明的生物基質支架使用特定方案來產生，其針對給定組織利用鹽濃度和離子強度(不同膠原具有不同溶解度常數(23))的適當平衡，以使得保留以不溶形式存在于該組織中的天然膠原，導致生物基質支架保留了高百分比的天然膠原，所述天然膠原提供信號以驅動譜系限制和分化。作為對比，根據已知方案產生的脫細胞化支架沒有利用使得保留高百分比的這些天然膠原的這樣的鹽濃度和離子強度的平衡，而大部分這些天然膠原在使用這些已知方案時丟失。此外，本發明的生物基質支架允許產生譜系依賴(例如，分化依賴的)病毒和/或病原體，其數量足以用于實驗和/或治療用途(例如，用于疫苗生產)。
[0049]因此，在一個實施方案中，本發明提供了從生物組織產生生物基質支架的方法，其包括如下步驟:a)用第一培養液灌注生物組織或使該生物組織均質化，其中所述第一培養液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m0sm/kg,以及所述第一培養液是無血清的且處于中性PH ;然后b)在所述第一培養液中用包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿；然后c)用處于中性pH且包含約
2.0MNaCl至約5.0M的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度以保持生物組織中鑒定的膠原不溶；然后d)在緩沖液中用核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)灌注步驟(C)的組織或提取步驟(C)的勻漿；以及然后e)用處于中性pH、無血清、且具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg重量摩爾滲透壓濃度的第二培養液沖洗步驟(d)的組織或勻漿，進而從所述生物組織產生完整的或均質化的生物基質支架，所述生物組織支架包含未處理生物組織的至少95 % (例如，80 %、85%、90 %、95 %、98%,99%,100% )的膠原和大部分膠原結合基質成分以及基質結合生長因子、激素和細胞因子。本文還提供了通過本發明的任何方法產生的生物基質支架。
[0050]如本文中所使用的“生物基質支架”是指細胞外基質中富集的分離的組織提取物，如本文所述，其保留了生物組織中天然存在的許多或大部分膠原和膠原結合因子。在一些實施方案中，基本所有的膠原和膠原結合因子被保留，以及在其他實施方案中，生物基質支架包含所有已知在該組織 中的所有膠原。生物基質支架可以包含天然生物組織中發現的任何組合的至少約 50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%,99.5%或100%的膠原、膠原結合基質成分、和/或基質結合生長因子、激素和/或細胞因子。在一些實施方案中，生物基質支架包含生物組織中至少95%的膠原和大部分膠原結合基質成分和基質結合生長因子、激素和/或細胞因子。如本文中所述的，“生物組織的大部分膠原結合基質成分和基質結合生長因子、激素和/或細胞因子”是指生物基質支架保留天然(例如，未處理)生物組織中發現的約 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%,99.5%或100%的膠原結合基質成分和基質結合生長因子、激素和/或細胞因子。
[0051]示例性膠原包括所有類型的膠原，諸如但不限于I型至XXIX型膠原。生物基質支架可包含天然生物組織中發現的至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%>98%>99%>99.5%或更多的一種或多種膠原，和/或可具有一種或多種膠原,所述膠原以天然生物組織中發現的至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%,99%,99.5%或更大的濃度存在。在生物基質支架中膠原的量可以通過本領域已知的以及如本文所述的各種方法來確定，諸如但不限于確定羥脯氨酸含量。[0052]示例性膠原結合基質成分包括但不限于，粘附分子；粘附蛋白；L_和P-選擇蛋白；肝素結合生長相關分子(HB-GAM);血小板反應蛋白I型重復序列(TSR);淀粉樣蛋白P(AP);層粘連蛋白；內功素/巢蛋白；纖連蛋白；彈性蛋白；波形蛋白；蛋白聚糖(PG);硫酸軟骨素-PG(CS-PG);硫酸皮膚素-PG(DS-PG);富含小亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)家族成員，如雙糖鏈蛋白聚糖和核心蛋白聚糖；肝素-PG(HP-PG);硫酸肝素-PG(HS-PG)，諸如磷脂酰肌醇聚糖、多配體聚糖、和基底膜聚糖；以及葡萄糖胺聚糖(GAG)，諸如透明質酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質素、和肝素。在一些實施方案中，生物基質支架包含(以任何組合)結合至各種基質成分的膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、內功素/巢蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、生長因子、激素、以及細胞因子，由其組成，或基本由其組成(以任何組合)。生物基質支架可包含天然生物組織中發現的至少約50 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%或更多的一種或多種膠原結合基質成分、激素和/或細胞因子，和/或可具有一種或多種這些成分，所述成分以在天然生物組織中發現的至少約 50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%或更大的濃度存在。在一些實施方案中，生物基質支架包含已知在組織中的所有或大部分的膠原結合基質成分、激素和/或細胞因子。在其他實施方案中，生物基質支架包含一種或多種膠原結合基質成分、激素和/或細胞因子，基本由其組成，或由其組成，其濃度處于接近于那些在天然原始生物組織中發現的濃度(例如天然組織所發現濃度的約
85%,90%,95%,98%^； 100% ) ?
[0053]示例性生長因子包括但不限于成纖維細胞生長因子(FGF)、神經生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子、肝細胞生長因子(HGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、IGF結合蛋白、堿性成纖維細胞生長因子、以及血管內皮生長因子(VEGF)。示例性細胞因子包括但不限于白細胞介素、淋巴因子、單核因子、集落刺激因子、趨化因子、干擾素和腫瘤壞死因子(TNF)。生物基質支架可包含天然生物組織中發現的至少約 50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%,99.5%、100%或更多(以任何組合)的一種或多種基質結合生長因子和/或細胞因子，和/或可具有一種或多種這些生長因子和/或細胞因子(以任何組合)，其以天然生物組織中發現的濃度的至少約50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95`%,97%,98%,99%,99.5%、100%或更大的濃度存在。在一些實施方案中，生物基質支架包含生理水平或接近生理水平的已知在天然組織中和/或在組織中檢測的許多或大部分基質結合生長因子、激素和/或細胞因子，以及在其他實施方案中，生物基質支架包含一種或多種基質結合生長因子、激素和/或細胞因子，其濃度接近于天然生物組織中發現的那些生理濃度(例如，對比差異不超過約
20%,25%,20%,15%,10%,5%,4%,3%,2%U%>0.5% )? 在生物基質支架中存在的生長因子或細胞因子的量或濃度可以通過本領域已知的和如本文中所述的各種方法來確定，諸如但不限于各種抗體測定和生長因子測定。
[0054]如本文中所使用的“生物組織”是指活體或死亡生物體的任何組織或源自活體或死亡生物體的任何組織。如本文中所使用的術語“天然生物組織”及其變化是指當其以其天然或未修飾狀態存在于生物體中的生物組織。本發明的生物基質支架可以由任何生物組織制備。生物組織可包括任何單一組織(例如，可以被互連的細胞的集合)或組成生物體的器官或部分或區域的一群組織。組織可包括均質細胞材料或者它可以是復合結構諸如在包括胸部的身體的區域中發現的復合結構，其例如可以包括肺組織、骨骼組織、和/或肌肉組織。
[0055]本發明的示例性生物組織包括但不限于肝臟、肺臟、甲狀腺、皮膚、胰腺、血管、膀胱、腎臟、大腦、膽系、十二指腸、腹主動脈、髂靜脈、心臟和腸，包括它們的任何組合。生物組織相關或來源的生物體(即，受試者)可以是任何動物，包括哺乳動物和非哺乳動物如無脊椎動物。
[0056]示例性受試者包括但不限于哺乳動物，例如但不限于:人、小鼠、大鼠、白融、倉鼠、兔、豚鼠、豬(Pigs)、豬(porcine)、狗、貓、馬、牛、綿羊、猴、和黑猩猩，以及非哺乳動物，例如但不限于:鳥類、爬行動物、和無脊椎動物。受試者可以是任何年齡和/或大小。生物組織可以是健康的、病變的、和/或具有基因突變。在一些實施方案中，本發明的生物基質支架在其化學和功能性方面是組織特異的，即所述生物基質支架在它們的化學和功能性方面是代表產生它們的生物組織，或與之相當。
[0057]在一些實施方案中，天然組織和專有脈管(patent vasculatures)保留在生物基質支架中。這可以包括生物組織的主要組織實體的可識別殘留物，例如但不限于針對任何組織的血管和其他脈管；肝臟的膽管和格利森氏囊(GC);胰腺管，胰腺的胰島和腺泡；肺的支氣管、氣管和肺泡，等。在其他實施方案中，生物基質支架的化學物與組織學匹配(例如，血管周圍的基質不同于肝細胞周圍的基質)。在一些實施方案中，生物基質支架的化學物處于與組織學相關的梯度中。例如，在生物組織是肝臟時，生物基質支架可以保留基質化學的梯度，所述基質化學的梯度與從門三聯管至中央靜脈的肝腺泡區1-3相關以及與組織學實體諸如血管通道及格利森氏囊(GC)相關。其他實例包括但不限于，血管，其中血管周圍基質的化學物充滿高水平的網絡膠原(例如，IV型和VI型)、彈性蛋白、各種形式的HS-PG ；門靜脈周圍區域(區I)的肝細胞周圍，其中層粘連蛋白連同CS-PG及HS-PG的混合物具有高濃度，而在中心周圍區(區3)周圍，是由HS-PG及HP-PG的混合物圍繞的肝細胞；與膽管相關的，其中存在高水平 的I型膠原、纖連蛋白、以及各種形式的CS-PG及DS-PG。在每種組織中存在基質化學的平行梯度。
[0058]存在多種沖洗培養液，諸如第一和第二培養液，以及可用于本發明中的緩沖液。特別的，可以使用以不溶狀態維持膠原和結合因子(例如，基質成分、生長因子、以及細胞因子)的任何沖洗培養液或緩沖液。在選擇培養液或緩沖液時，鹽濃度、pH、及離子強度應該適于以不溶狀態維持膠原和/或大部分或許多膠原結合基質成分以及其他因子(例如，依靠它們與膠原直接或間接的化學連接)。表1提供了針對各種類型膠原的氯化鈉的摩爾濃度范圍以幫助本領域普通技術人員提供確保膠原、膠原結合基質成分、及基質結合生長因子和細胞因子維持不溶的培養液或緩沖液。Deyl等人("Preparative proceduresand purity assessment of collagen proteins " Journal of Chromatography B790(2003)245-275)另外提供了關于膠原化學物的信息，其可以促進鑒定用于維持不溶狀態的膠原和結合因子的最佳條件，并且其全部內容通過引用并入本文。
[0059]表1表明pH是與鹽濃度一起作用來限定溶解度的變量。通過具有高鹽濃度，pH可以是中性的。在本發明的一些實施方案中，所選擇的鹽濃度是維持不溶狀態的所有組織膠原的濃度，而不是僅維持不溶狀態的一種組織膠原的濃度。例如，胎兒肝臟中已知的膠原在約4.5M NaCl的鹽濃度中是不溶的，而成體肝臟組織中的那些膠原在約3.4M-3.5MNaCl的鹽濃度中是不溶的。
[0060]沖洗培養液和/或緩沖液中任何的重量摩爾滲透壓濃度可以例如是200m0sm/kg至約 400m0sm/kg、約 250m0sm/kg 至約 350m0sm/kg、約 275m0sm/kg 至約 325m0sm/kg、或約300m0sm/kg至約325m0sm/kg,包括但不限于這些范圍內非明確陳述的任何值。蒸懼水和稀釋緩沖液(例如，具有重量摩爾滲透壓濃度< lOOmOsm/kg)將導致大量膠原、膠原結合基質成分和基質結合生長因子及細胞因子的損失。因此，在本發明的方法的一些實施方案中，不包括蒸餾水和稀釋緩沖液。
[0061]如本領域普通技術人員應該意識到的，重量摩爾滲透壓濃度是每質量溶質滲透濃度的表達，而摩爾滲透壓濃度是每體積的溶質。因此，從摩爾滲透壓濃度至重量摩爾滲透壓濃度的轉化可以通過乘以質量密度得到。重量摩爾滲透壓濃度可以使用測量依數性質的滲壓計測量，所述依數性質諸如凝固點下降、蒸汽壓、及沸點升高。
[0062]摩爾滲透壓濃度是溶質濃度的量度，定義為每升(L)溶液中溶質的滲透壓摩爾(Osm)數(osmol/L或Osm/L)。溶液的摩爾滲透壓濃度通常表示為0sm/L。而摩爾濃度測量每單位體積溶液中溶質的摩爾數，摩爾滲透壓濃度測量每單位體積溶液中溶質顆粒的滲透壓摩爾數。重量摩爾滲透壓濃度是每千克溶劑中溶質的滲透壓摩爾(osmol/kg或0sm/kg)的量度。
[0063]摩爾濃度和摩爾滲透壓濃度由于它們是溫度依賴的而在滲透壓測定中是不常用的。這是因為水隨著溫度改變其體積。然而，如果溶質濃度非常低，摩爾滲透壓濃度和重量摩爾滲透壓濃度則認為是相等的。
[0064]溶液的摩爾滲透壓濃度可以由下面表達來計算:
【權利要求】
1.由生物組織產生生物基質支架的方法，所述生物基質支架用于工業規模分散至培養裝置上，其包括: a)以包含約3.5M NaCl至約4.5M NaCl的鹽濃度的緩沖液灌注所述生物組織或使所述生物組織均質化；然后 b)在第一培養液中以包含脂肪酶和/或去污劑的脫脂緩沖液灌注步驟(a)的生物組織或提取步驟(a)的勻漿，其中所述第一培養液的重量摩爾滲透壓濃度是約250m0sm/kg至約350m0sm/kg,并且所述第一培養液是無血清的且處于中性pH ;然后 c)用處于中性pH且包含約2.0M NaCl至約5.0M NaCl的鹽濃度的緩沖液灌注步驟(b)的組織或提取步驟(b)的勻漿，選擇所述濃度以保持所述生物組織中鑒定的膠原不溶；然后 d)在緩沖液中用RNase和DNase灌注步驟(C)的組織或提取步驟(C)的勻漿；以及然后 e)用處于中性pH、無血清、且具有約250m0sm/kg至約350m0sm/kg的重量摩爾滲透壓濃度的第二培養液沖洗步驟(d)的組織或勻漿 ， 進而從所述生物組織產生完整的或均質化的生物基質支架，所述生物組織支架包含所述生物組織的至少95%的膠原和大部分膠原結合基質成分以及基質結合生長因子、激素和細胞因子； f)在基礎培養液中稀釋所述生物基質支架； g)在約_80°C冷凍(f)的生物基質支架； h)通過低溫研磨將(g)的生物基質支架粉碎為約Iμ m至約100 μ m大小范圍的生物基質顆粒； i)在基礎培養液中懸浮解凍(h)的生物基質顆粒；以及 j)將步驟(i)的生物基質顆粒分散至培養裝置上，進而從生物組織產生生物基質支架，所述生物基質支架用于工業規模分散至培養裝置上。
2.權利要求1的方法，還包括對所述生物基質支架消毒的步驟。
3.權利要求3的方法，其中所述消毒步驟通過伽馬輻射來進行。
4.權利要求1的方法，其中(f)的生物基質支架以約1: 6比例稀釋于所述基礎培養液中。
5.權利要求1的方法，其中(i)的生物基質顆粒以約1: 24比例稀釋于所述基礎培養液中。
6.權利要求1的方法，其中所述第一培養液包含鹽、礦物質、氨基酸、維生素和糖。
7.權利要求1的方法，其中所述第一培養液是基礎培養液。
8.權利要求7的方法，其中所述基礎培養液選自由RPMI1640、DME/F12、DME、F12、Waymouth培養液以及William培養液組成的群組。
9.權利要求1的方法，其中所述第二培養液包含組織液中所存在組分的至少一種。
10.權利要求1的方法，其中步驟(b)的所述脫脂緩沖液包含第一培養液中約20單位/L至約50單位/L的磷脂酶A2和約I %的脫氧膽酸鈉。
11.權利要求1的方法，其中步驟(C)的所述緩沖液的鹽濃度在用于從成體肝臟制備支架時為約3.4M NaCl至約3.5M NaCl，以及在用于從胎兒肝臟制備支架時為約4.0M NaCl至約 4.5M NaCl。
12.權利要求1的方法，其中步驟(c)的所述緩沖液還包含蛋白酶抑制劑。
13.權利要求12的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是大豆胰蛋白酶抑制劑。
14.權利要求1的方法，其中步驟(d)的所述緩沖液還包含蛋白酶抑制劑。
15.權利要求13的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是大豆胰蛋白酶抑制劑。
16.權利要求1的方法，其中步驟(a)至(e)的所有培養液和緩沖液中沒有可檢測量的使細胞外基質成分降解的酶。
17.權利要求1的方法，其中所述生物組織選自由肝臟組織、肺臟組織、胰臟組織、甲狀腺組織、腸組織、皮膚組織、血管組織、膀胱組織、心臟組織和腎臟組織組成的群組。
18.權利要求1的方法，其中所述生物組織來自哺乳動物。
19.通過權利要求1-18中 任一項的方法產生的生物基質支架。
【文檔編號】A61F2/00GK103491898SQ201180042690
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2011年7月1日 優先權日:2010年7月2日
【發明者】M·L·羅亞奇, R·H·馬拉瓦卡, Y·王, L·C·M·里德 申請人:北卡羅來納-查佩爾山大學, 吉加塞特有限責任公司