嵌合凝血因子的制作方法

專利名稱：嵌合凝血因子的制作方法
嵌合凝血因子相關(guān)申請該專利申請要求以下美國專利申請的權(quán)益:于2010年7月9日提交的美國臨時專利申請N0.61/363，183 ;于2010年7月9日提交的美國臨時專利申請N0.61/363，186 ；于2011年2月11日提交的美國臨時專利申請N0.61/442,029 ;于2011年2月11日提交的美國臨時專利申請No，61/442，150;于2011年2月11日提交的美國臨時專利申請N0.61/442，055 ;于2011年3月25日提交的美國臨時專利申請N0.61/467，880 ;和于2011年3月31日提交的美國臨時專利申請N0.61/491，762。上面提及的臨時專利申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
外源性凝血途徑的引發(fā)通過由于損傷而暴露于血管壁的組織因子與因子VIIa之間的復(fù)合物的形成介導(dǎo)。然后該復(fù)合物將因子IX和X轉(zhuǎn)化成其活性形式。在組織因子承受細胞上，因子Xa將有限量的凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶。然后，所產(chǎn)生的凝血酶從組織因子承受細胞中擴散開并活化血小板，而因子V和VIII，制備因子Va和Villa。在凝血的增殖階段，因子IXa由在活化血小板表面上的因子IXa(與因子VIIIa復(fù)合)產(chǎn)生。與輔因子Va復(fù)合的因子Xa活化凝血酶原變成凝血酶，產(chǎn)生凝血酶爆發(fā)。通過凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白終止級聯(lián)反應(yīng)，這導(dǎo)致形成纖維蛋白血塊。在引發(fā)凝血中，因子VII和組織因子是關(guān)鍵成員。因子VII是一種血漿糖蛋白，其在血液中以單鏈酶原循環(huán)。該酶原為催化無活性的。盡管單鏈因子VII可通過多種因子在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成雙鏈因子Vila，但是因子Xa是因子VII的重要的生理活化劑。通過切割連接在氨基酸152位的精氨酸殘基和在氨基酸153位的異亮氨酸殘基之間的肽鍵，將酶原因子VII轉(zhuǎn)化成活化的兩條鏈分子。存在組織因子、磷脂和鈣離子時，該雙鏈因子VIIa活化因子X或因子IX。因子VIIa被認為是如下凝血級聯(lián)反應(yīng)的生理引發(fā)劑:通過作用在組織因子生成細胞(典型地，受損內(nèi)皮細胞)表面，產(chǎn)生初始量的凝血酶，然后凝血酶擴散到血小板以活化它們，并且對它們初免以用于凝血酶原生成的增殖階段。治療上來說，重組體FVIIa通過在活化血小板表面上活化因子X、繞過FIXa或FVIIIa在凝血的增殖階段過程中產(chǎn)生凝血酶爆發(fā)的需要而起作用。由于FVIIa對血小板的親和力相對較低，所以重組FVIIa以超生理水平給藥。該過程被認為是不依賴組織因子的。人因子IX以單鏈糖蛋白循環(huán)(分子量57，000)。其在血漿中以酶原存在，并且在鈣離子存在時通過因子XIa(活化的血漿促凝血酶原激酶前體)轉(zhuǎn)化成絲氨酸蛋白酶，因子IXa ^ (更普遍稱為FIXa)。在該活化反應(yīng)中，在因子IX中水解兩個內(nèi)部肽鍵。這些斷裂在特異性精氨酰-丙氨酸肽鍵和特異性精氨酰-纈氨酸肽鍵上發(fā)生。這造成了從前體分子的內(nèi)部區(qū)域中釋放活化肽(分子量約等于11，000)并產(chǎn)生因子IXaP (分子量約等于46，000)。因子IXaP由輕鏈(分子量約等于18，000)和 重鏈(分子量約等于28，000)組成，而且這些鏈由二硫鍵連在一起。因子X還以單鏈多肽合成，其含有由精氨酸-賴氨酸-精氨酸三肽連接的輕鏈和重鏈。然后該單鏈分子通過兩個(或多個)內(nèi)部肽鍵斷裂而轉(zhuǎn)化成輕鏈和重鏈。在血漿中，這兩條鏈通過二硫鍵連接，從而形成因子X。活化因子X、因子Xa參與最終的共同路徑，通過該路徑將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶，凝血酶進而將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。給患者施用凝血因子以改善止血達一段時間。重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)極大地改善了對凝血障礙患者的治療，從而允許開發(fā)安全又穩(wěn)定的蛋白質(zhì)治療劑。例如，將重組活化因子VII廣泛用于治療如在患有血友病A或B、凝血因子XI或VII缺乏、血小板功能缺陷、血小板減少或血管性血友病(von Willebrand's disease)的患者中所發(fā)生的嚴重出血。重組因子IX也是治療上有用的。盡管這樣的重組分子是有效的，仍然需要這樣的改進形式，即將治療劑定位于凝血位點，具有改進的藥代動力學(xué)性質(zhì)、具有降低的清除率、具有提高的可制備性、具有降低的凝血活性，或具有增強的活性或具有一種以上的這些特征。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有增強的活性的嵌合凝血因子。本發(fā)明的特征尤其在于:用于制備嵌合凝血因子的方法，使用這些方法制備的嵌合凝血因子，以及使用這些凝血因子改善止血的方法。本發(fā)明的嵌合凝血因子具有提高的藥代動力學(xué)性質(zhì)、具有降低的清除率、具有提高的可制備性、具有降低的凝血活性、具有增強的活性或具有一種以上的這些特征。在一個實施方案中，本發(fā)明的改進的凝血因子在需要之處具有增加的活性，例如，通過將凝血因子靶向血小板或者通過以在血塊形成的位點被活化的可活化形式(非天然存在的可活化形式)存在于受:試者中。一方面，本發(fā)明涉及嵌合凝血因子，其包含選自FVI1、FIX和FX的凝血因子和與血小板結(jié)合的靶向部分以及任選地在凝血因子和靶向部分之間的間隔基部分。在一個實施方案中，凝血因子包含由式A、B和C表示的結(jié)構(gòu)，其中A是凝血因子；其中B是間隔基部分； 以及其中C是至少一個與血小板結(jié)合的靶向部分。在一個實施方案中，凝血因子包含由選自A B C、C B A的式表示的從氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，凝血因子在血小板存在下顯示出與缺少至少一個靶向部分的適當(dāng)?shù)膶φ障啾仍黾拥哪干伞Ｔ谝粋€實施方案中，凝血因子包含支架部分和任選地第二間隔基部分。在一個實施方案中，凝血因子還包括D和E，其中D是間隔基部分；且E為支架部分，并且其中嵌合凝血因子包含選自ABCD E、ADEB C、EDAB C、CBAD E、EDCB A和C B E D A的式表示的從氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，E是二聚體Fe區(qū)，其包含第一 Fe部分Fl和第二 Fe部分F2。在一個實施方案中，凝血因子被表達為包含在兩個Fe部分之間插入的可切割scFc (cscFc)接頭的多肽，其中cscFc接頭與至少一個引起cscFc多肽接頭切割的酶切位點相鄰。在一個實施方案中，cscFc接頭與至少一個引起cscFc多肽接頭切割的酶切位點相鄰。在一個實施方案中，權(quán)利要求9所述的嵌合凝血因子，其中至少一個酶切位點是細胞內(nèi)加工位點。
在一個實施方案中，其中多肽接頭的兩側(cè)為兩個酶切位點，其被相同的或不同的酶識別。在一個實施方案中，多肽接頭長度為約10個至約50個氨基酸。在一個實施方案中，多肽接頭長度為約20個至30個氨基酸。在一個實施方案中，多肽接頭包含gly/ser肽。在一個實施方案中，gly/ser肽具有式(Gly4Ser) n或Ser (Gly4Ser) n,其中n是選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整數(shù)。在一個實施方案中，(Gly4Ser)n接頭選自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。在一個實施方案中，凝血因子包含兩條多肽鏈。在一個實施方案中，嵌合凝血因子具有選自以下的結(jié)構(gòu):A通過間隔基部分連接Fl且C與F2連接；A通過間隔基部分連接Fl且C通過間隔基部分連接F2 ；A連接Fl且C通過間隔基部分連接F2 ；A通過間隔基部分連接Fl且C通過間隔基部分連接F2。在一個實施方案中，嵌合凝血因子包含兩條多肽鏈，其中第一條多肽鏈包含部分AB F1、A B F1、A B Fl 或 A B FlD C，且第二條多肽鏈包含部分 C F2、C D F2、F2D C 或 F2DC，其中兩條多肽鏈形成Fe區(qū)。在一個實施方案中，靶向部分融合Fe區(qū)的多肽鏈中的至少一條。在一個實施方案中，靶向部分直接融合Fl和F2中的至少一個。在一個實施方案中，靶向部分通過間隔基部分融合Fl和F2中的至少一個。在一個實施方案中，靶向部分通過可切割接頭融合Fl和F2的至少一個。在一個實施方案中，祀向部分選自:抗體分子、抗體分子的抗原結(jié)合片段、scFv分子、受體的受體結(jié)合部分、肽。在一個實施方案中，其中靶向部分與靜息血小板結(jié)合。在一個實施方案中，靶向部分選擇 性地與活化血小板結(jié)合。在一個實施方案中，靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIba、GPVI，和GPIIb/IIIa的非活性形式。在一個實施方案中，靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIIb/IIIa的活性形式、P選擇蛋白、GMP-33、1^1^-1、1^1^-2、^4(^和11 -1。在一個實施方案中，靶向部分與GPIb復(fù)合物結(jié)合。在一個實施方案中，靶向部分是選自下組的肽:PS4、0S1和0S2。在一個實施方案中，靶向部分包含來自抗體的抗體可變區(qū)，其選自SCE5、MB9和AP3。在一個實施方案中，其中凝血因子是因子VII。在一個實施方案中，凝血因子是因子VII的高比活變體。在一個實施方案中，凝血因子是因子IX。在一個實施方案中，凝血因子是因子IX的高比活變體。在一個實施方案中，凝血因子是因子X。在一個實施方案中，凝血因子是因子X的高比活變體。在一個實施方案中，凝血因子由細胞以活性形式分泌。在一個實施方案中，凝血因子在體內(nèi)活化。在一個實施方案中，嵌合凝血因子包含不是天然存在于凝血因子中的異源性酶切位點。在一個實施方案中，酶切位點與凝血因子的重鏈部分的氨基端基因融合。在一個實施方案中，支架部分是蛋白質(zhì)分子，其增加嵌合凝血因子的流體動力學(xué)半徑。在一個實施方案中，支架部分，如果存在，選自白蛋白和XTEN:\另一方面，本發(fā)明涉及包含F(xiàn)VII的多肽，所述FVII包含可被凝血級聯(lián)的組分活化的異源性酶切位點。
在一個實施方案中，多肽包含支架部分和任選地間隔基部分。在一個實施方案中，支架部分是二聚體Fe區(qū)，其包含第一 Fe部分Fl和第二 Fe部分F2。在一個實施方案中，凝血因子包含兩條多肽鏈。在一個實施方案中，嵌合凝血因子具有選自以下的結(jié)構(gòu):凝血因子通過間隔基部分與第一 Fe部分連接；凝血因子通過間隔基部分與第二 Fe部分連接；凝血因子直接連接Fl ;且凝血因子直接連接F2。在一個實施方案中，嵌合凝血因子還包括靶向部分。在一個實施方案中，嵌合凝血因子以單獨的多肽鏈合成，所述多肽鏈包含cscFc接頭。在一個實施方案中，cscFc接頭與至少一個引起接頭切割的酶切位點連接(例如，直接連接或相鄰)。在一個實施方案中，至少一個酶切位點是細胞內(nèi)加工位點。在一個實施方案中，cscFc接頭的兩側(cè)為兩個酶切位點，其被相同的或不同的酶識別。在一個實施方案中，cscFc接頭的長度為約10個至約50個氨基酸。在一個實施方案中，cscFc接頭的長度為約20個至30個氨基酸。在一個實施方案中，cscFc接頭包含gly/ser肽。在一個實施方案中，gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n,或Ser(Gly4Ser)n,其中n是選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整數(shù)。在一個實施方案中，(Gly4Ser)n接頭選自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。在一個實施方案中，凝血因子是因子VII的高比活變體。在一個實施方案中，不是天然存在于凝血因子中的異源性酶切位點在血塊形成的位點被切割。在一個實施方案中，切割位點選自:因子XIa切割位點、因子Xa切割位點和凝血酶切割位點。在一個實施方案中，酶切位點與凝血因子的重鏈部分的氨基端基因融合。在一個實施方案中，靶向部分與靜息血小板結(jié)合。在一個實施方案中，靶向部分選擇性地與活化血小板結(jié)合。在一個實施方案中，靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIba、GPVI，和GPIIb/IIIa的非活性形式。在一個實施方案中，靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIIb/IIIa 的活性形式、P 選擇蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L 和 L0X-1。在一個實施方案中，支架部分是蛋白質(zhì)分子，其增加嵌合凝血因子的流體動力學(xué)半徑。在一個實施方案中，支架部分，如果存在，選自白蛋白和XTENac,,一方面，本發(fā)明涉及選自 A B C、C B A、A B C D E、A D E B C、E D A B C、C B AD E、E D C B A、C B E D A的從氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)，其中A為可活化的凝血因子，B不存在或為接頭，C為靶向部分，D不存在或為接頭,且E為支架部分。在一個實施方案中，凝血因子包含凝血因子的輕鏈和重鏈，并且每條輕鏈和重鏈被表達為單獨的多肽鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明編碼本發(fā)明的嵌合凝血因子的核酸分子。在一個實施方案中，核酸分子存在于載體中。在一個實施方案中，載體還包括編碼酶的核苷酸序列，所述酶切割至少一個酶切位點。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的表達載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞表達能夠在細胞內(nèi)加工的酶。在一個實施方案中，所述酶對于該細胞是內(nèi)源性的。在一個實施方案中，所述酶對于該細胞是外源性的。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于制備嵌合凝血因子的方法，所述方法包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞，并從培養(yǎng)基中回收嵌合凝血因子。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含兩條多肽鏈的加工的、異源二聚體多肽，其中所述加工的、異源二聚體多肽通過在于細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中表達載體并且從所述培養(yǎng)基中分離成熟的、異源二聚體多肽來制備。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含嵌合凝血因子和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及在受試者中改善止血的方法，其包括施用本發(fā)明的組合物。一方面，本發(fā)明涉及嵌合凝血因子，其包含凝血因子的輕鏈部分和重鏈部分，以及至少一個靶向部分，其中所述靶向部分(i)與血小板特異性結(jié)合，(ii)不在凝血因子的輕鏈和重鏈之間插入，并且其中所述嵌合凝血因子在血小板存在下顯示出與缺少至少一個靶向部分的適當(dāng)?shù)膶φ障啾仍黾拥哪干伞Ａ硪环矫?，本發(fā)明涉及嵌合凝血因子，其包含呈線性序列的部分A-B-C-D-E，其中A為凝血因子、可活化的凝血因 子或活化凝血因子；B不存在或為接頭；C為靶向部分；D不存在或為接頭；且E不存在或為支架部分。又一方面，本發(fā)明涉及嵌合凝血因子，其包含選自A B C、A B⑶E、A D E B C、EDAB C、CBAD E、EDCB A、CBEDA的從氨基端至羧基端部分的線性序列，其中A為凝血因子、可活化的凝血因子或活化凝血因子，B不存在或為接頭，C為靶向部分，D不存在或為接頭，且E為支架部分。再一方面，本發(fā)明涉及嵌合凝血因子，其包含選自ABFl:F2、ABFl:⑶F2、ABFl:F2DC、ABFlDC:F2DC的從氨基端至羧基端部分的線性序列，其中A為凝血因子、可活化的凝血因子或活化凝血因子，B不存在或為接頭，C為靶向部分，D不存在或為接頭，且Fl和F2各自為Fe部分，并且:表示由兩條多肽鏈的Fl和F2鏈介導(dǎo)的二聚化。又一方面，本發(fā)明涉及嵌合凝血因子，其包含凝血因子的輕鏈部分和重鏈部分，以及至少一個靶向部分，其中所述靶向部分與血小板特異性結(jié)合，其中所述嵌合凝血因子包含二硫鍵連接的Fe區(qū)，所述Fe區(qū)包含兩條多肽鏈。附圖簡述

圖1示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其包括祀向結(jié)構(gòu)域。這些示例性的構(gòu)建體包含F(xiàn)e區(qū)。圖2示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體,其包括祀向結(jié)構(gòu)域。這些示例性的構(gòu)建體包含可切割的單鏈Fe (cscFc)，其中scFc接頭由細胞加工，在所述細胞中其被表達形成雙鏈Fe區(qū)。圖3示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其包含靶向結(jié)構(gòu)域，其中凝血因子部分缺少Gla結(jié)構(gòu)域。這些示例性的構(gòu)建體包含F(xiàn)e區(qū)。
圖4示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其包含靶向結(jié)構(gòu)域，其中凝血因子部分缺少Gla結(jié)構(gòu)域。這些示例性的構(gòu)建體包含可切割的單鏈Fe (cscFc),其中scFc接頭由細胞加工，在所述細胞中其被表達形成雙鏈Fe區(qū)。圖5示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其被活化(例如，在體內(nèi)活化后或者通過單獨表達凝血因子的輕鏈和重鏈)或者是可活化的，即其包含可在體內(nèi)的凝塊位點切割的部分(參見小圖D和E)。這些示例性的構(gòu)建體包含F(xiàn)e區(qū)。構(gòu)建體A、B和C在早期實驗中沒有很好表達。圖6示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其被活化(例如，在體內(nèi)活化后或者通過單獨表達凝血因子的輕鏈和重鏈)或者可活化的，即其包含可在體內(nèi)的凝塊位點切割的部分。這些示例性的構(gòu)建體包含可切割的單鏈Fe (cscFc)，其中scFc接頭由細胞加工，在所述細胞中其被表達形成雙鏈Fe區(qū)。圖7示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其包括靶向結(jié)構(gòu)域。圖8示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其包含靶向結(jié)構(gòu)域，其中凝血因子部分缺乏Gla結(jié)構(gòu)域。圖9示出了示例性的嵌合凝血因子構(gòu)建體，其被活化(例如，在體內(nèi)活化后或者通過單獨表達凝血因子的輕鏈和重鏈)或者可活化的，即其包含可在體內(nèi)的凝塊位點切割的部分。圖10示出了用于純化和活化FVI1-Oll的SDS PAGE。圖11示出了用于純化活性FVI1-053的SDS PAGE。圖12示出了 FVI1-Ol和FVI1-102的示意圖，并且示出了通過FACS測定的FVI11-011和FVI1-027與活 化血小板的結(jié)合。圖13示出了在活化血小板存在下測量FVI1-027、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成測定。圖14示出了 PAC-1消除與血小板結(jié)合的增加以及與FVI1-027有關(guān)的凝血酶生成速率的增加。圖15示出了在活化血小板存在下測量FVI1-037和Novoseven的活性的凝血酶生成測定中使用的構(gòu)建體。圖16示出了在活化血小板存在下測量FVI1-037和Novoseven的活性的凝血酶生成測定。圖17 示出了在活化血小板存在下測量 FVI1-044、FVI1-045、FVI1-046、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成測定(如圖18所示)中使用的構(gòu)建體。圖18 示出了在活化血小板存在下測量 FVI1-044、FVI1-045、FVI1-046、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成測定。圖19 示出了在活化血小板存在下測量 FVI1-047、FVI1-048、FVI1-049、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成測定(如圖20所示)中使用的構(gòu)建體。圖20 示出了在活化血小板存在下測量 FVI1-047、FVI1-048、FVI1-049、FVI1-Oll和Novoseven的活性的凝血酶生成測定。圖21示出了在活化血小板存在下測量FVI1-053和FVI1-Oll的活性的凝血酶生成測定(如圖22所示)中使用的構(gòu)建體。
圖22示出了在活化血小板存在下測量FVI1-053和FVI1-Oll的活性的凝血酶生成測定。圖23示出了 PAC-1消除與FVI1-053有關(guān)的凝血酶生成速率的增加。圖24示出了短暫轉(zhuǎn)染HEK293細胞和蛋白A pulldown之后，F(xiàn)VIIFc種類的蛋白質(zhì)印跡分析(如圖25所示)中使用的構(gòu)建體。圖25示出了短暫轉(zhuǎn)染HEK293細胞和蛋白A pulldown之后，F(xiàn)VIIFc種類的蛋白質(zhì)印跡分析。 圖26示出了在具有或不具有pSYN-PC5-003下短暫轉(zhuǎn)染pSYN-FVI1-024之后，蛋白A免疫沉淀的蛋白質(zhì)印跡。泳道1:非還原性pSYN-FVI1-024 ;泳道2，非還原性pSYN-FVI 1-024 ;泳道 3，還原性 pSYN-FVI1-024 ;泳道 4，還原性 pSYN-FVI1-024。圖27示出了短暫轉(zhuǎn)染HEK293細胞和蛋白A pulldown之后，F(xiàn)VIIFc種類的蛋白質(zhì)印跡分析(Fe western)。圖28 示出了通過 FXIa 處理的 FVI1-039 和 FVI1-040。圖29示出了向GPIIbIIIa的活性形式的FVIIaFc變體靶，其示出了增加的凝血酶生成速率。圖30示出了測量A型血友病人血液中的FVI1-088和野生型重組FVIIaFc的活性的Rotation凝血彈性測量法(ROTEM)測定。圖中示出了凝血時間、血塊形成的時間和a角度參數(shù)。圖31示出了示例性的切割位點和這種切割位點在可活化的凝血因子構(gòu)建體中的說明性位置。在該圖中 ，F(xiàn)VII用作實例。圖32示出了圖31中說明的構(gòu)建體的切割。圖33示出了另外的可活化的構(gòu)建體及說明其切割的蛋白質(zhì)印跡。圖34示出了使用FVI1-062和FVI1-090構(gòu)建體的凝血酶生成測定的結(jié)果。FVI1-062是陰性對照，其缺乏凝血酶切割位點，所以構(gòu)建體不能被活化。FVI1-090包含ALRPR切割位點，所以被凝血酶活化。圖35說明了高比活FVII變體的切割。FVII重鏈Fe和輕鏈Fe在帶I中折攏，因為重鏈在插入胰蛋白酶170環(huán)后失去了糖基化位點并變得很小。圖36說明了使用FVI1-090和FVI1-100的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖37說明了使用FVI1-090和FVI1-115的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖38說明了被凝血酶活化的可活化FVIIFC的氨基酸分解活性?？苫罨淖凅w的氨基酸分解活性可在凝血酶活化后被測量，并且與FVI1-090相比，高比活變體的氨基酸分解活性增加。在這些測定中，可活化分子被凝血酶活化后，加入水蛭素以抑制顯色底物的凝血酶裂解。以這種方式，凝血酶不干擾檢測FVIIa活性的能力。圖39說明了使用底物S2765通過FVIIa測量FX活化的測定的結(jié)果，所述底物不被FVIIa切割。在該測定中，在37°C下使用FVIIaFc將IOuM FX孵育15分鐘。該反應(yīng)用EDTA淬滅，并加入底物。圖39示出了對照實驗的結(jié)果，其證明了通過FVIIaFc活化的FX能夠被檢測。圖40示出了“可活化的FVIIFc”的FXa生成活性。圖40中示出的該實驗示出了高比活變體的FX活化活性增加。在該實驗中，F(xiàn)VIIFc (IOOnM)被凝血酶(IOOnM)活化，力口入水蛭素以抑制凝血酶。加入FX(IOuM)，接著加入EDTA以抑制反應(yīng)。通過檢測FXa底物來測量FX的活性。圖41說明了示例性的可活化的構(gòu)建體形式，其包括用于FVI1-118、FVI1-119和FVI1-127中的可活化的單體結(jié)構(gòu)。圖42說明了與異源二聚體(FVI1-090)相比，可活化的構(gòu)建體，特別是單體(FVI1-118和FVI1-119)的凝血酶切割的效能。圖43說明了將野生型可活化的FVIIFc (FVI1-118)與高比活變體(FVI1-127)比較的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖44A說明了幾個靶向構(gòu)建體。在這種情況下，在該構(gòu)建體的各種位置上包括與GPIIbIIIa的活性構(gòu)象結(jié)合的SCE5scFv。圖44B說明了通過使用這些構(gòu)建體在富含血小板的缺乏FVIII的血衆(zhòng)中進行的凝血酶生成測定的結(jié)果。N7是Novoseven對照。圖44C說明了通過FACs進行的重組FVIIaFc變體與血小板的結(jié)合。圖45A說明了幾個靶向FVIIa構(gòu)建體，其包括AP3，一種對抗存在于靜息血小板和活化血小板上的GPIIbIIIa的scFv。圖45B示出了在富含血小板的缺乏FVIII的血漿中的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖45C示出了通過FACS進行的rFVIIaFc變體與血小板的結(jié)合。圖46A示出了幾個靶向FVIIa構(gòu)建體，其使用與該分子結(jié)合的肽，特別是PS4、0S1和0S2肽靶向GPIb- a。圖46B示出了使用圖46A所示的C端肽構(gòu)建體在富含血小板的缺乏FVIII的血漿中進行的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖47A示出了使用圖46A所示的N端肽構(gòu)建體在富含血小板的缺乏FVIII的血漿中進行的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖47B示出了 FVI1-045與FVI1-048的直接比較。圖48示出了通過FACS測定的FVI1-045和FVI1-048以及野生型FVIIaFc與血小板的結(jié)合。該圖還示出了如Bernard等，Biochemistry2008, 47:4674-4682中報導(dǎo)的革巴向肽的親和力。圖49A示出了示例性的靶向FVIII構(gòu)建體。圖49B示出了在缺乏FVIII的富含血小板的血漿中進行的凝血酶生成測定的結(jié)果。在該實驗中，用組織因子(上圖)或通過血小板活化(下圖)活化該測定。圖50示出了測量包含gla結(jié)構(gòu)域(FVI1-Oll)而缺乏gla結(jié)構(gòu)域(FVI1-028)的靶向FVII構(gòu)建體的半衰期的實驗的結(jié)果。圖51A示出了幾個FIX構(gòu)建體，其包含靶部分，在此實例中是SCE5scFv。圖51B示出了通過使用圖51A的構(gòu)建體在富含血小板的缺乏FIX的血漿中進行的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖51C說明了如通過凝血酶生成所測量的，F(xiàn)IX-068和FIX-088都具有比FIX-042高至少4倍的活性。圖52A示出了通過 比較FIX-090和Benefix進行的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖52B示出了 FIX-090的活性幾乎為Benefix活性的四倍。圖53A示出了靶向FIX構(gòu)建體，其包含與在靜息血小板和活化血小板上存在的GPIb結(jié)合的肽。圖53B示出了在富含血小板的缺乏FIX的血漿中進行的凝血酶生成測定的結(jié)果。圖53C說明了如通過凝血酶生成所測定的，F(xiàn)IX-089比FIX-042大約強4倍，但其具有較低的比活。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及嵌合凝血因子。本發(fā)明基于，至少部分基于增強凝血因子的效力、藥代動力學(xué)性質(zhì)和/或可制備性的新方法的開發(fā)。在一個實施方案中，本發(fā)明的改進的凝血因子在需要之處具有增加的活性，例如通過使凝血因子靶向血小板或者通過以在血塊形成的位點被活化的可活化形式(非天然存在的可活化形式)存在于受試者中。這可以，例如通過靶向凝血因子或通過以可活化形式制備它們來完成。在一個實施方案中，主題凝血因子靶向凝血位點。通過結(jié)合將凝血因子靶向靜息血小板或活化血小板的靶向部分，可增強凝血因子的活性。例如，在因子VII的實例下，不像內(nèi)源性FVII (其有可能通過組織因子(TF)在內(nèi)皮細胞表面活化以生成活化因子X(FXa))，外源性FVII有可能以不依賴于TF的方式生成FXa/FIXa，在其他凝血因子定位于其中的活化血小板的表面處最有效。然而，生理學(xué)上來說，F(xiàn)VIIa在TF生成細胞(如內(nèi)皮細胞)的表面起作用，并且對于血小板具有低親和力。據(jù)推測，治療重組體FVIIa通過在活化血小板表面將因子X轉(zhuǎn)化成因子Xa起作用。為了克服低血小板親和力并且在治療出血方面有效，以超生理水平給藥重組FVIIa。因此，在FVIIa的實例下，靶向血小板表面能顯著增加該分子的效力。盡管其他的凝血因子(例如FIX、FVII1、FX)具有高血小板親和力，但是這些也可通過結(jié)合血小板靶向部分而表現(xiàn)出增強的活性。另外，F(xiàn)VIIa在人體內(nèi)具有相對短的半衰期C2.3小時)。這種短的半衰期可能歸因于需要多次給藥重組FVIIa以控制出血。因此，將凝血因子，特別是FVIIa靶向至血小板可提高效能。靶向部分可 以位于嵌合凝血因子的許多位置。列出了靶向的嵌合凝血因子的示例性結(jié)構(gòu)，例如在圖1_4、7、8、17、19、21、44、46、49、51和53中所示。在另一實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子以可在凝血位點活化的形式制備。對于在旁路治療中的應(yīng)用，只有當(dāng)以活化形式給予時，外源性凝血因子才是有效的。然而，這種活化的凝血因子通過內(nèi)源性途徑(例如抗凝血酶II1、TFPI)快速失活，導(dǎo)致活性形式的清除以及短的有效半衰期。給予高劑量并沒有解決這個問題，因為它可以導(dǎo)致凝血效果。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及“可活化的”嵌合凝血因子構(gòu)建體，其包含不是通常存在于凝血因子中的異源性酶切位點，這些分子作為增強的酶原循環(huán)，并且由于給藥后缺乏失活而具有較長的半衰期，但是其很容易在凝血位點通過酶切割被活化。在一個實施方案中，這樣的異源性酶切位點是在凝血級聯(lián)反應(yīng)中產(chǎn)生的酶的異源性酶切位點。例如，在一個實施方案中，可活化的構(gòu)建體的異源切割位點包含因子XIa、Xa或凝血酶切割位點。示例性的FXIa切割位點包括，例如TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位點包括，例如DFLAEGGGVR、TTKIKPR和ALRPR。在一個實施方案中，異源切割位點在凝血因子的輕鏈和重鏈之間插入。在另一實施方案中，異源切割位點不在凝血因子的兩條鏈之間插入。在一個實施方案中，異源切割位點是凝血因子重鏈的氨基端。存在于可切割接頭中的異源切割位點能夠置于嵌合凝血因子的多個位置。列出了可活化的嵌合凝血因子的示例性結(jié)構(gòu)，例如在圖5、6、9、29、27、31和41中所示。典型地,示例性的此類構(gòu)建體在血塊形成存在下被活化，并且以下進行更詳細的描述。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子包含支架，例如，以增加分子的流體動力學(xué)半徑。例如，本發(fā)明的嵌合凝血因子可以是融合蛋白。示例性的支架包括，例如FcRn結(jié)合部分(例如，完整Fe區(qū)或者其部分，其結(jié)合于FcRn)，單鏈Fe區(qū)(ScFc區(qū)，例如，如US2008/0260738、W02008/012543 或 W02008/1439545 中所描述)、可切割 scFc 區(qū)(如本文所描述的cscFc區(qū))、不太復(fù)雜的蛋白質(zhì)及其部分，例如XTen多狀 或白蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子使用Fe區(qū)或其FcRn結(jié)合部分作為支架部分。在一個實施方案中，與嵌合凝血因子融合的Fe部分為天然存在的(或野生型(WT))Fe部分。在另一實施方案中，F(xiàn)e部分包含序列中的一個或多個變異。在另一實施方案中,Fe部分是scFc部分(例如,包含不可切割的接頭或cscFc接頭)。在包含cscFc接頭的構(gòu)建體中，未加工的分子包含可切割的單鏈Fe區(qū)，在單鏈Fe區(qū)中組分Fe部分以單個多肽鏈基因融合，從而形成功能的、單鏈、二聚體Fe區(qū)。scFc多肽接頭能夠串聯(lián)連接將包含多肽的二聚體Fe區(qū)的Fe部分或可將一個Fe部分與構(gòu)建體的非Fe部分(例如凝血因子或祀向部分)連接，非Fe部分進而連接第二 Fe部分。該cscFc接頭在Fe部分之間插入，所述Fe部分包含scFc區(qū)并且兩側(cè)具有至少一個酶切位點，例如細胞內(nèi)酶加工點。在一個實施方案中，scFc接頭的兩側(cè)為兩個酶切位點，當(dāng)由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)在細胞中加工時， 導(dǎo)致接頭切除(例如全部或基本上全部的接頭)。在另一實施方案中，scFc接頭與至少一個酶切位點相鄰(該酶切位點允許在多肽被細胞分泌后體外切割接頭)或者包含至少一個酶切位點(該酶切位點允許在向受試者施用構(gòu)建體后體內(nèi)切割接頭)。因此，在一個實施方案中，盡管這種多肽包含在單個開放閱讀框(ORF)中編碼的scFc區(qū)作為未加工形式的一個連續(xù)核苷酸序列的部分，但是cscFc接頭被酶切割(例如在施用之前或在施用之后體內(nèi))，導(dǎo)致為包含F(xiàn)e區(qū)的異源二聚體分子的多肽不以單個氨基酸鏈融合，即獲得的加工的構(gòu)建體具有Fe區(qū)，其包括兩條多肽鏈。在該實施方案中，全部或基本上全部的接頭被切除，而在一些實施方案中，切割位點的一部分可以保留，例如RRRR切割位點的四個精氨酸。在一個實施方案中，scFc接頭的兩側(cè)為用于切割的兩個加工位點。這兩個加工位點可以相同或不同。在一個實施方案中，至少一個加工位點是堿性氨基酸殘基簇，其被精氨酸kex2/弗林蛋白酶識別。所述酶直接切割精氨酸殘基的C端。在另一實施方案中，至少一個切割位點為可在體內(nèi)被切割的切割位點，例如被凝血酶識別的切割位點。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子在包含csFc接頭的scFc分子的背景下以活性形式制備。例如，因子VII通常作為酶原重組地制備，并在制備期間要求活化以生成用于施用的活性形式。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子由細胞分泌，在該細胞中其以活性形式表達從而提高可制備性。正如下文更詳細地列出，這種凝血因子能夠通過將單鏈Fe區(qū)整合到分子中來制備。單鏈Fe區(qū)通過Fe部分的二聚化來形成，所述Fe部分存在于單個多肽鏈中。在一個實施方案中，這種構(gòu)建體包含scFc多肽接頭，其連接scFc的兩個Fe部分，所述scFc與至少一個內(nèi)源性加工位點相鄰。例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與在反式高爾基體中的活性加工酶共定位時，這種構(gòu)建體的切割被延遲直到分泌途徑后期。在一個實施方案中，表達編碼本發(fā)明的多肽的構(gòu)建體的細胞內(nèi)源性表達酶，該酶在一個或多個加工位點切割scFc接頭，導(dǎo)致嵌合分子包含兩條多肽鏈。在另一實施方案中，表達編碼本發(fā)明的多肽的構(gòu)建體的細胞外源性表達酶，該酶在一個或多個加工位點切表I] scFc接頭。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子能夠組合兩個或多個這些特征以生成優(yōu)化的構(gòu)建體，例如使可活化的融合蛋白構(gòu)建體靶向靜息血小板，以使其能夠被有效活化以及在活性凝血位點以較高局部濃度被活化。示例性的這種組合構(gòu)建體包括都是靶向的嵌合凝血因子并且包含用于增強加工的scFc接頭。在另一實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體是靶向并且可活化的。在所附的附圖和序列表中對本發(fā)明的示例性構(gòu)建體進行說明。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如附圖中所示的結(jié)構(gòu)的多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及具有所附的序列表中列出的序列的多肽，或編碼此類多肽的核酸分子。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有所附的序列表中列出的序列的成熟形式的多肽。應(yīng)理解的是，這些構(gòu)建體及編碼其的核酸分子能夠用于在受試者改善止血。為了更加清楚的理解本說明書和權(quán)利要求，下面提供了以下定義。1.定義本文中使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“多肽”是指兩個或兩個以上的天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。術(shù)語“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)，脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。非傳統(tǒng)的氨基酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸，以及如Ellman等，Meth.Enzym.202:301-336(1991)所描述的其他氨基酸殘基類似物。為了產(chǎn)生這樣的非天然存在的氨基酸殘基，可以使用Noren等,Science244:182 (1989)和Ellman等，同上。簡言之,這些過程涉及化學(xué)地活化具有非天然存在的氨基酸殘基的抑制子tRNA，接著在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯RNA。同樣可以使用本領(lǐng)域已知的肽化學(xué)完成非傳統(tǒng)氨基酸的引入。本文中使用的術(shù)語“極性氨基酸”包括靜電荷為零的氨基酸，但在其側(cè)鏈的不同部分具有非零部分電荷(例如M、F、W、S、Y、N、 Q、C)。這些氨基酸能夠參與疏水相互作用和靜電相互作用。本文中使用的術(shù)語“帶電氨基酸”包括氨基酸，其在其側(cè)鏈上具有非零靜電荷H^^BR、K、H、E、D)。這些氨基酸能夠參與疏水相互作用和靜電相互作用?！鞍被嶂脫Q”是指在預(yù)定的氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中至少一個現(xiàn)有氨基酸殘基被第二個不同的“替代”氨基酸殘基替代?！鞍被岵迦搿笔侵笇⒅辽僖粋€另外的氨基酸整合到預(yù)定的氨基酸序列中。盡管插入通常由一個或兩個氨基酸殘基的插入組成，但是可制備目前較大的“肽插入”，例如插入約三到五個、甚至最高約十、十五或二十個氨基酸殘基。插入的殘基可以天然存在或非天然存在的，如上所公開的?！鞍被崛笔А笔侵笍念A(yù)定的氨基酸序列中移除至少一個氨基酸殘基。多肽可以是單體或者多聚體。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白是二聚體。本發(fā)明的二聚體多肽可包含兩條多肽鏈或可由一個多肽鏈組成(例如，在scFc分子的實例下)。在一個實施方案中，本發(fā)明的二聚體是同源二聚體，其包含兩個相同的單體亞基或多肽(例如，兩個相同的Fe部分或兩個相同的生物活性部分)。在另一實施方案中，本發(fā)明的二聚體是異源二聚體，其包含兩個非相同的單體亞基或多肽(例如，包含兩個不同的凝血因子或其部分或僅包含一個凝血因子)。參見，例如，美國專利7404956，其以引用方式并入本文。本文中使用的術(shù)語“多肽接頭”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)，其連接多肽鏈的線性氨基酸序列的兩個結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽由核酸分子編碼，所述核酸分子編碼多肽接頭，該多肽接頭直接或間接地連接兩個組成構(gòu)建體的Fe部分。本文中使用的這些接頭為“scFc接頭”，并且scFc接頭在多肽的兩個Fe部分之間插入，其中多肽包括scFc接頭。如果scFc接頭連續(xù)地連接線性多肽序列中的兩個Fe部分，則其為“直接”連接。反之，scFc接頭可以連接第一 Fe部分到結(jié)合部分，其進而連接第二 Fe部分,從而形成間接連接。這些scFc接頭允許形成單鏈基因構(gòu)建體。在一個實施方案中，該多肽包含酶切位點，其導(dǎo)致scFc接頭可被切割(cscFc接頭)，并且在一個實施方案中，基本上被切除(例如，在細胞的加工過程中)。因此，所獲得的加工的多肽是嵌合分子，其包含至少兩個氨基酸并且基本上缺少外部接頭氨基酸序列。在一些實施方案中，切除了所有或基本上所有的接頭，而在一些實施方案中，切割位點的一部分可以保留，例如RRRR切割位點的四個精氨酸。在另一實施方案中，多肽接頭的另一種類型，此處也稱為“間隔基”可以用于連接不同的部分，例如，將凝血因子或靶向部分與多肽上的Fe部分連接。這種接頭類型可以提供給多肽分子靈活性。典型地，間隔基不被切割；然而，在某些實施方案中，這種切割是期望的。在附圖中示出了間隔基示例性的位置。間隔基可以位于凝血因子、靶向部分和/或支架之間，例如在這些部分的N端或C端。在一個實施方案中，這些接頭在加工過程中未被除去?？纱嬖谟诒景l(fā)明的嵌合凝血因子的第三種類型的接頭在本文也稱為“可切割的接頭”，其包括異源切割位點(例如，因子XIa、Xa或凝血酶切割位點)，并且其可在切割位點的N端或C端或兩端包括另外的間隔基接頭。在附圖中示出了這種位點的示例性的位置，其包括，例如鄰近靶向部分的位置。在另一實施方案中，所述接頭可以鄰近凝血因子或其部分。例如，在一個實施方案中，可切割的接頭可與凝血因子的重鏈的N端融合以制備凝血因子的可活化的形式。在這種實例下，可切割的接頭可在切割位點的N端包括另外的間隔基接頭，但要求切割位點的C端與凝血因子的重鏈的氨基端直接融合。本文中使用的術(shù)語“gly-ser多肽接頭”是指由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的肽。示例性的gly/ser多肽接頭包含氨基酸序列(Gly4Ser)n(SEQ ID N0:4)。另一示例性的gly/ser多肽接頭包含氨基酸序列S (Gly4Ser) n。在一個實施方案中，n=l。在一個實施方案中，n=2。在另一實施方案中，n=3，SP(Gly4Ser) 3o在另一實施方案中，n=4,即(Gly4Ser) 4 (SEQ ID N0:6)。在另一實施方案中，n=5。在又一實施方案中，n=6。在另一實施方案中，n=7。在又一實施方案中，n=8。在另一實施方案中，n=9。在又一實施方案中，n=10。另一示例性的gly/ser多肽接頭包含氨基酸序列Ser (Gly4Ser)n(SEQ ID NO:26) 0在一個實施方案中，n=l。在一個實施方案中，n=2。在優(yōu)選實施方案中，n=3。在另一實施方案中，n=4。在另一實施方案中，n=5。在又一實施方案中，n=6?！霸醋浴敝付ǖ亩嚯幕虻鞍椎亩嚯幕虬被嵝蛄?，是指多肽源。優(yōu)選地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有與所述序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中該部分由至少10-20個氨基酸，優(yōu)選地至少20-30個氨基酸，更優(yōu)選地至少30-50個氨基酸組成，或其可被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員以其它方式鑒定為在序列中具有其來源。

來自另一個肽的多肽相對于起始多肽可具有一個或多個突變，例如，一個或多個氨基酸殘基被另外的氨基酸殘基置換或者其具有一個或多個氨基酸殘基插入或缺失。優(yōu)選地，多肽包含非天然存在的氨基酸序列。這種變體必然地與起始抗體具有少于100%的序列同一性或相似性。在優(yōu)選實施方案中，變體，例如在變體分子的長度上，將與起始多肽的氨基酸序列具有約75%至少于100%的氨基酸序列的同一性和相似性，更優(yōu)選地約80%至少于100%,更優(yōu)選地約85%至少于100%，更優(yōu)選地約90%至少于100%(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)，最優(yōu)選地，約95%至少于100%。在一個實施方案中，在起始多肽序列與由此產(chǎn)生的序列之間有一個氨基酸差異。關(guān)于該序列的同一丨I"生和相似性在本文被定義為在比對序列并引入缺口(如有必要)以實現(xiàn)最大的序列同一性百分比后，候選序列中與起始氨基酸殘基相同的氨基酸殘基(即相同的殘基)的百分比。本發(fā)明優(yōu)選的多肽包含源自人蛋白序列的氨基酸序列(例如，至少一個凝血因子或Fe部分或結(jié)構(gòu)域)。然而，多肽可包含來自其他哺乳類動物的一個或多個氨基酸。例如，凝血因子，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域或靶向部分可以源自非人物種，并且包括在主題多肽中?？蛇x地，源自非人物種的多肽中可以存在一個或多個氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)選多肽不具有免疫原性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的多肽可以變化，以使多肽與其所源自的天然存在或天然的多肽在氨基酸序列方面不同，同時保留天然多肽的期望活性。例如，可以進行核苷酸或氨基酸置換，導(dǎo)致“非必要”氨基酸殘基發(fā)生保守置換或改變?？赏ㄟ^將一個或多個核苷酸置換、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列中產(chǎn)生編碼源自免疫球蛋白(例如，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域、部分或抗原結(jié)合位點)的多肽的非天然變體的分離的核酸分子，以使將一個或多個氨基酸置換、添加或缺失引入所編碼的蛋白中。通過標準技術(shù)引入突變體，例如定點突變和PCR介導(dǎo)的誘變。本發(fā)明的多肽在一個或多個氨基酸殘基處，例如在必需或非必需氨基酸殘基處可包含保守的氨基酸置換?！氨Ｊ氐陌被嶂脫Q”是氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已經(jīng)確定，其包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，未荷電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸 、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，3 -分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，多肽中的非必需氨基酸殘基可以被另外的來自相同側(cè)鏈家族的氨基酸殘基替代。在另一實施方案中，氨基酸串可以被結(jié)構(gòu)上類似的順序不同的串和/或側(cè)鏈家族成員的組合物替代?？蛇x地，在另一實施方案中，可在編碼序列的全部或其部分隨機引入突變，例如通過飽和誘變，并且所獲得的突變體能夠被整合到本發(fā)明的多肽中，并篩選其結(jié)合所需靶標的能力。在多肽的上下文中，“線性序列”或“序列”是氨基酸在多肽中從氨基端到羧基端方向的順序，其中序列中彼此緊鄰的殘基在多肽的初級結(jié)構(gòu)序列中是連續(xù)的。本文中使用的術(shù)語“連接”，“融合的”或“融合”是指通過肽鍵(例如，基因融合)、化學(xué)連接或其他方式的連接。例如，可以連接分子或部分的一種方式采用通過肽鍵連接分子或部分的多肽接頭。術(shù)語“基因融合的”、“基因連接的”或“基因融合”可以互換地使用，并且是指兩個或兩個以上的蛋白質(zhì)、多肽及其片段經(jīng)由其單獨的肽骨架共線性、共價連接或連接，通過編碼這些蛋白質(zhì)、多肽或其片段的單個多聚核苷酸分子進行基因表達。這種基因融合導(dǎo)致單個連續(xù)基因序列的表達。優(yōu)選的基因融合在框內(nèi)，即兩個或更多個開放閱讀框(ORF)被融合以形成連續(xù)的更長的0RF，以保持原始ORF的正確閱讀框的方式進行。因此，獲得的重組融合蛋白是含有兩個或更多個的蛋白片段的單個多肽，所述蛋白片段對應(yīng)于由原始ORF編碼的多肽(所述片段通常并不是天然連接)。在這種情況下，在加工過程中單個多肽被切割以生成包含兩條多肽鏈的嵌合分子。本文中使用的術(shù)語“Fe區(qū)”被定義為多肽的部分，所述多肽對應(yīng)于天然免疫球蛋白的Fe區(qū)，即通過其兩條重鏈的各自Fe結(jié)構(gòu)域的二聚體締合形成。天然Fe區(qū)是同源二聚的并且包含兩條多肽鏈。相比之下，本文中使用的術(shù)語“基因融合的Fe區(qū)”或“單鏈Fe區(qū)”(scFc區(qū))是指合成的嵌合Fe區(qū)，其由在單個多肽鏈中基因連接(即在單個連續(xù)的基因序列中編碼)的Fe結(jié)構(gòu)域組成。本文中使用的術(shù)語“Fe結(jié)構(gòu)域”是指單個免疫球蛋白重鏈的部分，其開始于鉸鏈區(qū)(正好位于木瓜蛋白酶切割位點的上游(即在IgG中的殘基216，取重鏈恒定區(qū)的第一殘基為114位))，并結(jié)束于抗體C端。因此，完整Fe結(jié)構(gòu)域包含至少鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。本文中使用的術(shù)語“Fe結(jié)構(gòu)域部分”或“Fe部分”包括Fe結(jié)構(gòu)域或源自Fe結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在某些實施方案中，F(xiàn)e部分包含以下中的至少一個:鉸鏈(例如，上、中和/或下鉸鏈區(qū) )結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、CH4結(jié)構(gòu)域或其變體、部分及片段。在其他實施方案中，F(xiàn)e部分包含完整Fe結(jié)構(gòu)域(即鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域)。在一個實施方案中，F(xiàn)e部分包含融合到CH3結(jié)構(gòu)域(或其部分)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其部分)。在另一實施方案中，F(xiàn)e部分包含融合到CH3結(jié)構(gòu)域(或其部分)的CH2結(jié)構(gòu)域(或其部分)。在另一實施方案中，F(xiàn)e部分由CH3結(jié)構(gòu)域或其部分組成。在另一實施方案中，F(xiàn)e部分由鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其部分)和CH3結(jié)構(gòu)域(或其部分)組成。在另一實施方案中，F(xiàn)e部分由CH2結(jié)構(gòu)域(或其部分)和CH3結(jié)構(gòu)域組成。在另一實施方案中，F(xiàn)e部分由鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其部分)和CH2結(jié)構(gòu)域(或其部分)組成。在一個實施方案中，F(xiàn)e部分缺少CH2結(jié)構(gòu)域(例如，全部或部分CH2結(jié)構(gòu)域)的至少一部分。本文中使用的術(shù)語“半衰期”是指特定多肽在體內(nèi)的生物半衰期。半衰期可以通過向受試者施用的量的半數(shù)在動物的循環(huán)和/或其他組織中清除所需的時間表示。當(dāng)給定多肽的清除曲線構(gòu)建為時間函數(shù)時，該曲線通常是快速a相和更長的P相的雙相曲線。典型地，a相表示在血管內(nèi)和血管外的空間之間施用Fe多肽的平衡，其部分由多肽的大小確定。典型地，P相表示位于血管內(nèi)空間的多肽的分解代謝。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的術(shù)語半衰期是指多肽在P相中的半衰期。在人體中的人抗體的典型P相半衰期為21天。本文中使用的術(shù)語“部分”是指嵌合多肽的組成部分或組分。本文中使用的術(shù)語“靶向部分”是指多肽的分子、其部分及其片段的組成，其定位或定向本發(fā)明的多肽到所需位點或細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包含“靶向部分”，其例如，通過將分子定位在所需位點增強多肽的活性。這樣的部分可以例如使抗體及其變體(例如，和scFv)或肽。在另一實施方案中，這種靶向部分可以是多肽、配體的受體結(jié)合部分或受體的配體結(jié)合部分，其連接本發(fā)明的多肽并與所需靶標(例如，在細胞或組織中的靶標)結(jié)合。靶向部分可以與構(gòu)建體基因融合，與構(gòu)建體化學(xué)綴合或通過間隔基與構(gòu)建體連接。例如，靶向部分可以通過形成位于構(gòu)建體的靶向部分和Fe部分之間的鍵與本發(fā)明的構(gòu)建體連接，其中靶向部分包含第一官能團并且Fe部分包含第二官能團，其中第一官能團和第二官能團能夠彼此相互反應(yīng)以形成化學(xué)鍵(參見，例如，美國專利7381408)。在一個實施方案中，靶向部分結(jié)合血小板。以下將更詳細地描述示例性的靶向部分。在一個實施方案中，用于本發(fā)明構(gòu)建體中的靶向部分包含抗體變體。術(shù)語“抗體變體”或“修飾的抗體”包括不是天然存在的抗體，其的氨基酸序列或氨基酸側(cè)鏈化學(xué)與天然獲得的抗體的氨基酸序列或氨基酸側(cè)鏈化學(xué)的不同之處在于如本文所述的至少一個氨基酸或氨基酸修飾。本文中使用的術(shù)語“抗體變體”包括抗體的合成形式，所述抗體改變以使其不是天然存在的，例如，包含至少兩條重鏈部分但是兩條不完整的重鏈(例如，結(jié)構(gòu)域缺失抗體或小體)的抗體；抗體的多特異性形式(例如，雙特異性、三特異性等)，其被改變以結(jié)合到兩個或兩個以上的不同抗原上或在單個抗原的不同表位上)；與scFv分子連接的重鏈分子；單鏈抗體；雙抗體；三抗體；以及具有改變的效應(yīng)子功能的抗體及其類似物。本文中使用的術(shù)語“scFv分子”包括結(jié)合分子，其由一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)或其部分及一條重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)或其部分組成，其中每個可變結(jié)構(gòu)域(或其部分)來自相同或不同的抗體。scFv分子優(yōu)選地包含scFv接頭,其在VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域之間插入。scFv分子在本領(lǐng)域已知，并在例如，美國專利5，892，019，Ho等，1989.Gene77:51 ；Bird等，1988Science242:423 ；Pantoliano 等，1991.Biochemistry30:10117 ；Milenic 等，1991.Cancer Research51:6363 ;Takkinen 等，1991.Protein Engineering4:837 中描述。本文中使用的“scFv接頭”是指在scFv的VL和VH結(jié)構(gòu)域之間插入的部分。scFv接頭優(yōu)選地將scFv分子以抗原結(jié)合構(gòu)象維持。在一個實施方案中，scFv接頭包含scFv接頭肽或由scFv接頭肽組成。在某些實施方案中，sc`v接頭肽包含gly/ser多肽接頭或由gly/ser多肽接頭組成。其他實施方案中，scFv接頭包含二硫鍵。術(shù)語“糖基化”是指一個或多個碳水化合物與多肽的共價連接。典型地，糖基化是翻譯后發(fā)生的事件，其發(fā)生在細胞的細胞內(nèi)環(huán)境或其提取物中。術(shù)語糖基化包括，例如，N-連接糖基化(其中一個或多個糖連接到天冬酰胺殘基)和/或0-連接糖基化(其中一個或多個糖連接到具有羥基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)的氨基酸殘基)。在一個實施方案中，本發(fā)明的分子是糖基化的。在另一實施方案中，本發(fā)明的分子是無糖基化的。在又一實施方案中，本發(fā)明的分子與野生型Fe區(qū)相比具有還原的糖基化。本文中使用的術(shù)語“二硫鍵”包括在兩個硫原子之間形成的共價鍵。氨基酸半胱氨酸包含巰基，其能夠形成二硫鍵或與第二個巰基形成橋。在大多數(shù)天然存在的IgG分子中，CHl和CL區(qū)通過天然二硫鍵連接，并且兩條重鏈通過兩個天然二硫鍵在使用Kabat編號系統(tǒng)對應(yīng)于239和242位(EU編號系統(tǒng)，則為226或229位)的位置連接。本文中使用的術(shù)語“載體”或“表達載體”是指根據(jù)本文中所使用的載體作為引入并在細胞中表達所需多核苷酸的媒介物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，這種載體可以容易地選自質(zhì)粒、噬菌體、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中。一般來說，與本發(fā)明相容的載體將包含選擇標記、適當(dāng)?shù)睦诳寺∷杌虻南拗莆稽c并進入原核或真核細胞中和/或在其中復(fù)制的能力?？梢圆捎迷S多表達載體系統(tǒng)以生成本發(fā)明的嵌合凝血因子。例如，一類載體利用DNA元件，所述DNA元件源自動物病毒，例如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(RSV、MMTV或M0MLV)或SV40病毒。此外，將DNA整合到其染色體中的細胞可以通過引入一個或多個標記進行選擇，所述標記允許選擇轉(zhuǎn)染的宿主細胞。標記可以為營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)型，提供生物殺滅劑抗性(例如，抗生素)或?qū)χ亟饘?例如銅)的抗性。可選擇的標記基因可以直接連接待表達的DNA序列或通過共轉(zhuǎn)化引入到相同的細胞中。在一個實施方案中，可以采用可誘導(dǎo)的表達系統(tǒng)。需要另外的元件以優(yōu)化mRNA的合成。這些元素可以包括信號序列、剪接信號以及轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子和終止信號。在一個實施方案中，分泌信號例如數(shù)個熟知的細菌前導(dǎo)肽中的任一個(例如，pelB、phoA或ompA)能夠框內(nèi)融合到本發(fā)明多肽的N末端以獲得多肽的最佳分泌(Lei等，(1988), Nature, 331:543 ;Better 等,(1988) Science, 240:1041 ;Mullinax 等，(1990).PNAS,87:8095)。術(shù)語“宿主細胞”是指用使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化的細胞并且編碼至少一個異源基因。在從重組宿主中分離蛋白的過程的描述中，除非另有明確說明，否則使用的術(shù)語“細胞”或“細胞培養(yǎng)”可互換地表示蛋白質(zhì)源。換句話說，蛋白質(zhì)從“細胞”中的回收可以指從下旋的整個細胞中或從含培養(yǎng)基和懸浮細胞的細胞培養(yǎng)物中回收。用于蛋白質(zhì)表達的宿主細胞系最優(yōu)選地為哺乳動物源的；本領(lǐng)域技術(shù)人員具有優(yōu)先確定最適于在其中表達的所需基因產(chǎn)物的特定宿主細胞系的能力。示例性的宿主細胞系包括，但不限于，DG44和DUXBlU中國倉鼠卵巢細胞系，DHFR-)、HELA(人宮頸癌)、CVI (猴腎細胞系)、C0S(CVI與SV40T抗原的衍生物)、R1610(中國倉鼠成纖維細胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細胞)、PerC6細胞、HAK(倉鼠腎細胞系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT (牛內(nèi)皮細胞)、RAJI (人淋巴細胞)以及293 (人腎)。典型地，宿主細胞系可以從商業(yè)服務(wù)、美國組織培養(yǎng)物保藏中心或從公開的文獻中獲得。本發(fā)明的多肽可以也在非哺乳動物細胞中表達，例如細菌或酵母或植物細胞。在這方面，將會理解的是各種單細胞非哺乳動物微生物，如細菌也可以被轉(zhuǎn)化；即那些可以在培養(yǎng)物或發(fā)酵中生長的細胞。易于轉(zhuǎn)化的細菌包括腸桿菌科的成員，如大腸桿菌或沙門氏菌屬的菌株；芽胞桿菌科，如枯草芽孢桿菌、肺炎球菌、鏈球菌和 流感嗜血桿菌。將進一步理解的是，當(dāng)在細菌中表達時，多肽通常變成內(nèi)含體的一部分。該多肽必須被分離、純化然后組裝成功能性分子。除了原核生物之外，也可以使用真核微生物。在所有的真核微生物中，最常使用的是釀酒酵母或普通的面包酵母，雖然一些其他的菌株也通常容易獲得，包括畢赤酵母(Pichia pastoris)。為了在酵母屬中表達,通常使用質(zhì)粒YRp7,例如(Stinchcom等，(1979)，Nature, 282:39 ；Kingsman 等，(1979)，Gene, 7:141 ；Tschemper 等，(1980)，Gene,10:157)。該質(zhì)粒已經(jīng)含有TRPl基因，其為酵母的突變株提供選擇標記，所述酵母的突變株不能在色氨酸中生長，例如 ATCC N0.44076 或 PEP4-1 (Jones, (1977)，Genetics, 85:12)。然后作為酵母宿主細胞基因組特性的trpl損傷的存在提供用于檢測在不存在色氨酸下的生長產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化。本文中使用的術(shù)語“內(nèi)源性的”是指分子(例如，核酸和/或蛋白質(zhì)分子)不是天然存在于細胞中的。相反，術(shù)語“外源性的”或“異源的”是指這種分子在給定條件下(例如，在細胞中或在多肽中)通常不被發(fā)現(xiàn)。例如，外源性的或異源的分子可以被引入到細胞中，并僅在對細胞進行操作(例如通過轉(zhuǎn)染或其他基因工程形式)后存在，或者異源氨基酸序列可以存在于蛋白質(zhì)中，其不是天然存在于該蛋白質(zhì)中。本文中使用的術(shù)語“切割位點”或“酶切位點”是指由酶識別的位點。某些酶切位點包含細胞內(nèi)加工位點。在一個實施方案中，多肽具有被在凝血級聯(lián)中被活化的酶切割的酶切位點，以使這種位點的切割發(fā)生在血塊形成的位點。示例性的這種位點包括例如，被凝血酶、因子XIa或因子Xa識別的位點。示例性的FXIa切割位點包括，例如TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位點包括，例如DFLAEGGGVR、ITKIKPR、LVPRG (SEQ IDNO:35)和ALRPR。其他酶切位點在本領(lǐng)域已知。本文中使用的術(shù)語“加工位點”或“細胞內(nèi)加工位點”是指酶切位點在多肽中的一種類型，其是在翻譯多肽后起作用的酶的靶。在一個實施方案中，這種酶在從高爾基體到反式高爾基體部分的轉(zhuǎn)運中起作用。細胞內(nèi)加工酶在蛋白質(zhì)從細胞中分泌之前切割多肽。這種加工位點的實例包括，例如，被內(nèi)肽酶類家族的PACE/弗林蛋白酶(其中PACE是成對堿性氨基酸切割酶的首字母簡稱)靶向的位點。這些酶定位在高爾基體膜上，并且序列在基序Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)_Arg的羧基端切割蛋白質(zhì)。本文中使用的“弗林蛋白酶”酶家族包括，例如，弗林蛋白酶、PC2、PCl/Pc3、PC4、PACE4、PC5/PC6 和 LPC/PC7/PC8/SPC7。其他加工位點在本領(lǐng)域已知。在包括一個以上的加工或切割位點的構(gòu)建體中，應(yīng)該理解的是這種位點可以是相同的或者不同的。體外制備允許放大以獲得大量所需的本發(fā)明的改變的多肽。在組織培養(yǎng)條件下用于培養(yǎng)哺乳動物細胞培養(yǎng)的技術(shù)在本領(lǐng)域已知，其包括均質(zhì)懸浮培養(yǎng)，例如，在氣升式反應(yīng)器或在連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，或固定的或包埋的細胞培養(yǎng)，例如，在中空纖維、微膠囊中，在瓊脂糖微珠上或在陶瓷筒內(nèi)培養(yǎng)。如果有必要和/或如果需要，多肽溶液可以通過常規(guī)的色譜方法純化，例如凝膠過濾、離子交換色譜。疏水相互作用色譜儀(HIC，DEAE-纖維素色譜或親和色譜)。本文中使用的短語“將受益于多肽的施用的受試者”包括受試者，如哺乳動物受試者，將受益于本發(fā)明的多肽的施用，例如，以改善止血。本文中所使用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指任何蛋白質(zhì)，其由來自第一來源的第一氨基酸序列與來 自第二來源的氨基酸序列共價或非共價結(jié)合，其中第一來源和第二來源不同。不同的第一來源和第二來源能包括兩個不同的生物實體，或來自相同生物實體的兩個不同的蛋白，或生物實體或非生物實體。嵌合蛋白可能包括例如，來自至少2個不同生物源的蛋白質(zhì)。生物源可能包括任何非合成地制備的核酸或氨基酸序列(如本發(fā)明中所進一步說明的以上任一個的基因組或cDNA序列、質(zhì)?；虿《据d體、天然病毒粒子或突變體或類似物)。合成源可能包括化學(xué)產(chǎn)生而不是由生物系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或核酸序列(例如，氨基酸序列的固相合成)。嵌合蛋白同樣也可包括源自至少2個合成源的蛋白質(zhì)或源自至少一個生物源和至少一個合成源的蛋白質(zhì)。嵌合蛋白可還包含共價地或非共價地連接核酸的源自第一來源的第一氨基酸序列，所述核酸源自任何來源或小的源自任何來源的有機或無機分子。嵌合蛋白可包含接頭分子，其位于第一和第二氨基酸序列之間或位于第一氨基酸序列和核酸之間，或位于第一氨基酸序列和小的有機或無機分子之間。本文中使用的術(shù)語“凝血因子”是指分子、或其類似物，天然存在或重組產(chǎn)生，其阻止或降低受試者體內(nèi)出血事件的持續(xù)時間。換句話說，它是指具有原凝血活性即負責(zé)成纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成不溶性纖維蛋白的網(wǎng)，引起血液凝血或凝固的分子。本文中所使用的凝血活性指的是參與生化反應(yīng)級聯(lián)的能力，其導(dǎo)致纖維蛋白凝血的形成和/或降低嚴重度、流血或出血事件的持續(xù)時間或頻率。本文中所使用的止血是指使出血或者流血停止或者減慢；或者使血流通過血管或身體部分停止或減慢。本文中所使用的止血障礙是指基因遺傳或后天獲得的疾患，其特征在于具有流血傾向，或者自發(fā)地，或作為創(chuàng)傷的結(jié)果，由于能力損傷或者不能夠形成血蛋白纖維凝塊。三種主要的形式是甲型血友病(缺乏因子VIII)、乙型血友病(缺乏因子IX或“克雷司馬斯病(Christmas disease)”)以及丙型血友病(缺乏因子XI,中度出血傾向)、血管性血友病、缺乏因子Xi (缺乏PTA)、缺乏因子XI1、纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VI1、因子X或因子XIII的缺乏或結(jié)構(gòu)異常、伯納德-蘇利耶綜合征是GPIb缺陷或缺乏GPIb。GPIb (vWF受體)可以具有缺陷并導(dǎo)致缺少初級凝血形成(初級止血)和增加出血傾向,Glanzman和Naegeli的血小板機能不全(血小板無力癥)。在肝功能衰竭(急性或慢性形式)中，由于肝臟凝血因子的產(chǎn)量不足，可能會增加出血的危險。本文中所使用的嵌合分子可以預(yù)防地使用。本文中使用的術(shù)語“預(yù)防治療”是指分子的施用先于出血事件。在一個實施方案中，需要一般止血劑的受試者經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷手術(shù)。本發(fā)明的嵌合蛋白能夠在手術(shù)之前或之后作為預(yù)防進行施用。本發(fā)明的嵌合蛋白能夠在手術(shù)之前或之后施用以控制急性出血事件。手術(shù)可能包括，但不限于，肝移植、肝切除或干細胞移植。按需治療包括出血事件、關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、流血、流血到肌肉、口腔流血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷(頭創(chuàng)傷)、消化道出血、顱內(nèi)流血、腹腔內(nèi)流血、胸內(nèi)出流、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后區(qū)出血、腹膜后隙出血或骼腰肌鞘出血的治療。受試者可需要預(yù)防手術(shù)，圍手術(shù)期的管理或手術(shù)治療。所述手術(shù)包括，例如小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝切開術(shù)、滑 膜切除術(shù)、全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)、開顱術(shù)、骨縫合術(shù)、創(chuàng)傷手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹腔內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。本文中使用的術(shù)語〃急性失血〃是指不管根本原因的出血事件。例如，受試者可具有外傷、尿毒癥、遺傳性出血性障礙(例如，缺乏因子VII)、血小板障礙或由于針對凝血因子的抗體形成而產(chǎn)生的抗性。本文中使用的治療(treat、treatment、treating)是指,例如減少疾病或疾患的嚴重度；減少病程的持續(xù)時間；改善與疾病或疾患相關(guān)的一個或多個癥狀；向受試者提供關(guān)于疾病或疾患的有益效果，而不一定治愈疾病或疾患，預(yù)防與疾病或疾患有關(guān)的一個或多個癥狀。I1.凝血閔子特別地，本發(fā)明涉及因子VI1、IX和X的改進的形式。所有這些因子在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，因為輕鏈的每個氨基端不適于額外部分的整合。相似地，這三個凝血因子的重鏈的氨基端不適于額外部分的整合，除了切割部分之外，即通過切割位點或由切割位點組成的部分連接的部分。本發(fā)明的嵌合凝血因子構(gòu)建體的設(shè)計基于那些共有性質(zhì)，應(yīng)當(dāng)理解的是盡管通常示出因子VII用于說明本發(fā)明示例性的實施方案，主題構(gòu)建體可以使用因子VI1、IX或X來制備。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的是本發(fā)明構(gòu)建體的FVII部分可能被FVII1、FIX或FX部分取代以制備這些凝血因子之一的增強的形式。本發(fā)明的示例性嵌合凝血因子構(gòu)建體在附圖中列出。盡管附圖通常說明了作為單鏈(以其酶原形式)的凝血因子，應(yīng)當(dāng)理解的是這些凝血因子可同樣以其活性形式存在于本發(fā)明的構(gòu)建體中，例如以雙鏈、二硫鍵的形式。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子被細胞以活性形式表達。在另一實施方案中，嵌合凝血因子以非活性形式表達并且隨后在體外在適當(dāng)?shù)臈l件下被活化，以使凝血因子的活性形式存在于構(gòu)建體中。在另一實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子包含非活性形式的凝血因子并且凝血因子在施用后在體內(nèi)活化。在一個實施方案中，scFc支架可用于產(chǎn)生分子的活性形式。凝血因子通常作為酶原重組產(chǎn)生，因此要求在制備過程中活化。因子VI1、IX和X的活性形式由二聚體分子組成，其中重鏈和輕鏈僅通過二硫鍵連接。在一個實施方案中，嵌合凝血因子在向受試者施用之前被活化以改善止血。用于活化凝血因子的方法在本領(lǐng)域已知。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子與含有濃度為約5mM的CaCl2的培養(yǎng)基接觸。在另一實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子被細胞(在該細胞中其被表達)以活性形式分泌。在一個實施方案中，活性嵌合凝血因子通過將凝血因子的重鏈和輕鏈表達成單獨的多肽制備。在另一實施方案中，凝血因子的重鏈的N末端被修飾，以包含細胞內(nèi)加工位點，其在合成過程中延緩凝血因子的活化直到后來在分泌途徑中(即，直到蛋白質(zhì)與活性加工酶在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中共定位)，導(dǎo)致更多的產(chǎn)量。示例性的這種細胞內(nèi)加工位點包括那些被弗林蛋白酶識別的位點。示例性的該酶家族的切割位點包括基序Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的活性構(gòu)建體在Fe融合蛋白的背景下制備，例如使用scFc接頭(cscFc接頭)。示例性構(gòu)建體 在附圖中示出。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及加工的(例如，成熟的)多肽，其中至少一個鄰近scFc多肽接頭的切割位點被切割，以使分子不再是單個多肽鏈，從而該多肽由至少兩條多肽鏈組成(歸因于在酶切位點Pl和/或P2處的切割)。在一個實施方案中，這種加工的多肽包含凝血因子或其連接到第二 Fe部分(即，在多肽接頭切割之前從氨基端到羧基端計數(shù)時的第二 Fe部分)的部分，其在多肽接頭切割后具有游離的氨基端。在一個實施方案中，連接到第二 Fe部分的N末端的凝血因子具有催化活性，例如具有酶活性。在另一實施方案中，連接到第二 Fe部分的N末端的凝血因子被細胞作為酶原分泌，所述酶原需要凝血因子的進一步酶加工以便被完全活化。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及以活性或非活性形式從細胞中分泌，而不需要在加工過程中進一步活化的凝血因子。例如，因子VII通常作為酶原重組地產(chǎn)生，并在制備期間要求活化以產(chǎn)生用于施用的活性形式。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽由細胞分泌，在該細胞中其以活性形式表達從而提高可制備性。正如下文中所詳細描述的，這種凝血因子可通過在包含cscFc接頭的scFc分子的背景下分別表達凝血因子的輕鏈和凝血因子的重鏈而制備。當(dāng)延遲這種構(gòu)建體的活化直到在加工過程中分泌途徑的后期，例如蛋白質(zhì)與活性加工酶在反式高爾基體中共定位時。
在一個實施方案中，本發(fā)明的凝血因子是因子VII的成熟形式或其變體。因子VII (FVII, F7也被稱為因子7、凝血因子VI1、血清因子VI1、血清凝血酶原轉(zhuǎn)換加速器、SPCA、轉(zhuǎn)變素原和依他凝血素a)是絲氨酸蛋白酶類，其是凝血級聯(lián)的部分。FVII包括Gla結(jié)構(gòu)域，兩個EGF結(jié)構(gòu)域(EGF-1和EGF-2)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(或肽酶SI結(jié)構(gòu)域)，其在絲氨酸蛋白酶的肽酶SI家族的所有成員中高度保守，例如具有糜蛋白酶。FVII以單鏈酶原形式、活化的酶原樣雙鏈多肽和完全活化的雙鏈形式存在。本文中使用的“酶原樣”蛋白質(zhì)或多肽是指這樣的蛋白質(zhì)，其被蛋白分解切割活化，但是仍然顯示與酶原有關(guān)的性質(zhì)(例如低活性或沒有活性)，或與蛋白質(zhì)的酶原形式的構(gòu)象類似的構(gòu)象。例如，當(dāng)不結(jié)合組織因子時，F(xiàn)VII的雙鏈活性形式是酶原類蛋白；它保留了類似于未切割的FVII酶原的構(gòu)象，并因此展示出極低的活性。一旦結(jié)合組織因子，F(xiàn)VII的雙鏈活性形式經(jīng)歷構(gòu)象改變并獲得其作為穩(wěn)定因子的全部活性。示例性FVII變體包括具有增加的比活的變體，例如通過增加其酶活性(Kcat或Km)而增加FVII活性的突變。這種變體在本領(lǐng)域已被描述，并且包括，例如Persson等，2001.PNAS98:13583 ；Petrovan 和 Ruf.2001.J.Biol.Chem.276:6616 ；Persson 等，2001J.Biol.Chem.276:29195 ；Soejima 等，2001.J.Biol.Chem.276:17229 ；Soejima 等，2002.J.Biol.Chem.247 :49027中描述的分子的突變體形式。在一個實施方案中，F(xiàn)VII的變體形式包括突變，示例性的突變包括V158D-E296V-M298Q。在另一實施方案中，F(xiàn)VII的變體形式包括用來自胰蛋白酶的170環(huán)的具有氨基酸EASYPGK取代來自FVII成熟序列的氨基酸608-619 (LQQSRKVGDSPN，對應(yīng)于170-環(huán))。FIX的高比活變體也在本領(lǐng)域已知。例如，Simioni 等(2009N.E.Journal of Medicine361:1671)描述了 R338L 突變。Chang 等，(1988JBC273:12089)和 Pierri 等，(2009Human Gene Therapy20:479)描述了 R338A 突變。其他的突變體在本領(lǐng)域已知，并且包括在例如Zogg和Brandstetter.2009Structurel7:1669 ;Sichler等2003.J.Biol.Chem.278:4121 ;和Sturzebecher等，1997.FEBS Lett412:295中描述的突變。這些參考文獻的全部內(nèi)容通過引用并入本文。在從酶原樣形式構(gòu)象改變時存在的全活化在與輔因子組織因子結(jié)合時存在。同樣，可引入在不存在組織因子時引起構(gòu)象改變的突變。因此，提到的FVIIa包括其雙鏈形式，酶原樣形式和全活化的雙鏈形式。在一個實施方案中，本發(fā)明的凝血因子是因子VIII或其變體的成熟形式。FVIII在血液凝血的內(nèi)源性途徑中作為輔因子起作用以加速通過因子IXa對因子X的活化(存在鈣離子FVIII時在帶負電荷的磷脂表面上發(fā)生的一個反應(yīng))。FVIII以2351個氨基酸的單鏈多肽合成，所述單鏈多肽具有結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)A1-A2-B-A3-C1-C2。ffehar, G.A.等，Nature312:337-342 (1984)和 Toole, J.J.等，Nature312:342-347 (1984)。FVIII 的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)與同源凝血因子(因子 V(FV))相同。Kane, ff.H.等，PNAS(USA)83:6800-6804(1986)和 Jenny，R.J.等，PNAS (USA) 84:4846-4850 (1987)。FVIII A-結(jié)構(gòu)域具有 330 個氨基酸并且彼此之間和與FV的A結(jié)合域以及血漿銅結(jié)合蛋白血清銅藍蛋白具有40%的氨基酸同一性。Takahashi, N.等，PNAS (USA) 81:390-394 (1984)。每個 C-結(jié)構(gòu)域具有 150 個氨基酸，并示出了與FV的C-結(jié)構(gòu)域和結(jié)合糖綴合物和帶負電荷的磷脂的蛋白質(zhì)具有40%的同一性。StubbsJ.D.等，PNAS (USA) 87:8417-8421 (1990)。FVIII B-結(jié)構(gòu)域由單個外顯子編碼并顯示與任何已知的蛋白質(zhì)(包括FV B結(jié)構(gòu)域)具有很少的同源性。Gitschier, J.等，Nature312:326-330(1984)和 Cripe, L.D.等，Biochemistry31:3777-3785 (1992)。FVIII作為重鏈(結(jié)構(gòu)域A1-A2-B)和輕鏈(結(jié)構(gòu)域A3_C1_C2)的異源二聚體分泌到血漿中，該重鏈和輕鏈通過位于Al-和A3-結(jié)構(gòu)域之間的非共價的二價金屬離子鍵合而締合。在血漿中，F(xiàn)VIII通過與VonWillebrand因子結(jié)合而被穩(wěn)定化。更具體地說，F(xiàn)VIII輕鏈通過非共價鍵相互作用與von Willebrand因子的氨基端的主要結(jié)合位點結(jié)合。一旦被凝血酶蛋白水解活化，F(xiàn)VIII被活化成2條重鏈片段(Al，50kDa片段和A2，43kDa片段)和I條輕鏈(A3-Cl-C2，73kDa鏈)的異源三聚體。因此，F(xiàn)VIII的活性形式(FVIIIa)由通過二價金屬離子鍵合與凝血酶-切割的A3-C1-C2輕鏈締合的Al亞基，和通過離子鍵合與Al 結(jié)構(gòu)域締合的游離 A2 亞基組成。Eaton, D.等，Biochemistry25:505 (1986) ；Lollar, P.等，J.Biol.Chem.266:12481 (1991);和 Fay, P.J.等，J.Biol.Chem.266:8957 (1991)。該FVIIIa異源三聚體是不穩(wěn)定的，并且通過在生理條件下解離A2亞基而經(jīng)受快速失活。在一個實施方案中，凝血因子包含因子VIII的B-結(jié)構(gòu)域缺失的形式。本文中使用的因子VIII的“B-結(jié)構(gòu)域”與本領(lǐng)域已知的B-結(jié)構(gòu)域相同，其被內(nèi)部氨基酸序列同一性和蛋白水解切割位點所限定，例如全長人因子VIII的殘基絲氨酸Ser741-Argl648。其他的人因子VIII結(jié)構(gòu)域被以下氨基酸殘基所限定:A1,殘基Alal-Arg372 ；A2,殘基絲氨酸 373-Arg740 ；A3,殘基絲氨酸 Serl690_Asn2019 ;C1，殘基 Lys2020_Asn2172 ；C2,殘基絲氨酸Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Serl690_Tyr2332。剩余的序列(殘基Glul649-Argl689)通常被稱為a3酸性區(qū)。對于豬科動物、鼠和犬科動物因子VIII，所有結(jié)構(gòu)域(包括B結(jié)構(gòu)域)的邊界的位置也在本領(lǐng)域已知。在一個實施方案中，因子VIII的B結(jié)構(gòu)域是缺失的(“B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的實例是REFACTO (具有S743/Q1638融合的重組BDD FVIII)，其在本領(lǐng)域已知?！癇-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII”可以具有在美國專利號6，316，226,6, 346，513、7，041，635,5, 789，203,6, 060，447,5, 595，886,6, 228，620,5, 972，885,6, 048，720、5，543，502,5, 610，278,5, 171，844,5, 112，950,4, 868，112 和 6，458，563 中公開的全部或部分缺失，其每一個通過引用 整體并入本文。在一些實施方案中，本發(fā)明的B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII序列包含任何一個在美國專利號6，316，226 (也在US6，346，513)的第4欄第4行到第5欄第28行和實施例1至5中公開的缺失中的任一種。在另一實施方案中，B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII是S743/Q1638B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII (SQ形式因子VIII)(例如，因子VIII具有從氨基酸744到氨基酸1637的缺失，例如，因子VIII具有SEQ ID NO:6的氨基酸1-743和氨基酸的1638-2332，即SEQ ID NO:2)。在一些實施方案中，本發(fā)明的B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有在美國專利號5，789，203(同樣US6，060，447、US5, 595, 886和US6, 228，620)中的第2欄第26至51行和實施例5至8中公開的缺失。在一些實施方案中，B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有在美國專利號5，972，885的第I欄第25行至第2欄第40行；美國專利號6，048，720的第6欄第I至22行和實施例1 ;美國專利號5，543，502的第2欄第17至46行；美國專利號5，171，844的第4欄22行至第5欄第36行；美國專利號5，112，950的第2欄第55至第68行、圖2和實施例1 ;美國專利號4，868，112的第2欄第2行至第19欄第21行和表2 ;美國專利號7，041，635的第2欄第I行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄43行至第8欄第26行、第11欄第5行至第13欄第39行；或者美國專利號6，458，563的第4欄第25至53行。在一些實施方案中，B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII缺失大部分B結(jié)構(gòu)域，但仍然含有B結(jié)構(gòu)域的氨基端序列，其對于將初級翻譯產(chǎn)物體內(nèi)蛋白水解加工成兩條多肽鏈是必不可少的蛋白水解過程，如W091/09122(其通過引用整體并入本文)所公開。在一些實施方案中，B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII用氨基酸747-1638缺失構(gòu)建，即實際上是B結(jié)構(gòu)域的完全缺失。Hoeben R.C.等，J.Biol.Chem.265(13):7318-7323 (1990)，其通過引用整體并入本文。B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII也可含有因子VIII的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺失。MeulienP.等，Protein Eng.2 (4): 301-6 (1988),其通過引用整體并入本文。另外的B結(jié)構(gòu)域也是本發(fā)明的部分，其包括:氨基酸982至1562或760至1639的缺失(Toole等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(1986) 83，5939-5942))，氨基酸 797 至 1562 的缺失(Eaton 等，Biochemistry (1986) 25:8343-8347))，氨基酸 741 至 1646 的缺失(Kaufman (PCT 公布申請?zhí)朩087/04187))，氨基酸 747-1560 的缺失(Sarver 等，DNA (1987) 6:553-564))，氨基酸 741 至1648的缺失(Pasek (PCT申請N0.88/00831))或氨基酸816至1598或741至1648的缺失(Lagner (Behring Inst.Mitt.(1988)No82:16-25，EP295597))，其通過引用整體并入本文。每種上述缺失可以在任何因子VIII序列中制備。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及FVIII的靶向形式，其中靶向(i)特異性結(jié)合血小板，(ii)未在凝血因子的輕鏈和重鏈之間插入，并且其中所述嵌合凝血因子在血小板存在時展示出與缺乏至少一個靶向部分的適當(dāng)?shù)膶φ障啾仍黾拥哪干?。在一個實施方案中，本發(fā)明的凝血因子是因子IX或其變體的成熟形式。因子IX以415個氨基酸的單鏈血漿酶原循環(huán)(A.Vysotchin等，J.Biol.Chem.268，8436 (1993))。FIX的酶原被FXIa活化或被組織因子/FVIIa復(fù)合物活化。精氨酸-丙氨酸145-146和精氨酸-纈氨酸180-181之間的特異性切割產(chǎn)生通過半胱氨酸132和半胱氨酸289連接之間的單個二硫鍵連接的輕鏈和重鏈(S.Bajaj等，Biochemistry22，4047 (1983))。FIX的結(jié)構(gòu)組織類似于維生素K依賴型凝血蛋白FVI1、FX和蛋白C(B.Furie和B.Furie,同上)。氨基端的大約45個氨基酸包含Y-羧基谷氨酸或gla結(jié)構(gòu)域。其后面是兩個表皮生長因子同源結(jié)構(gòu)域(EGF)，活化肽和催化“重鏈”，其是絲氨酸蛋白酶家族的成員(A.Vysotchin等，J.Biol.Chem.268, 8436 (1993) ；S.Spitzer 等，Biochemical Journal265, 219(1990)；H.Brandstetter 等，Proc.Natl.Acad Sc1.USA92, 9796 (1995))。

在一個實施方案中，本發(fā)明的凝血因子是因子X的成熟形式。因子X是分子量為
58.5kDa的維生素K依賴型糖蛋白，其作為酶原形式從肝細胞分泌到血漿。最初，因子X作為具有信號肽的前肽原制備，該信號肽由總計488個氨基酸組成。信號肽在輸出到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中時被信號肽酶切割，Y羧基化在成熟的N末端鏈的N末端的第一 11谷氨酸殘基處發(fā)生后前肽原序列被切除。進一步的加工步驟通過在Argl82和Serl83之間的切割發(fā)生。該加工步驟同樣附隨地導(dǎo)致三肽Argl80-Lysl81-Argl82的缺失。所得的分泌因子X酶原由139個氨基酸(M，16，200)的N末端輕鏈和306氨基酸(M，42，000)的C末端重鏈組成，其通過Cysl72和Cys342之間的二硫橋共價地連接。進一步的翻譯后加工步驟包括Aspl03的3羥化以及N和0型糖基化。應(yīng)當(dāng)理解的是，除了這些凝血因子或其生物活性部分的野生型(WT)形式，本發(fā)明也可采用具有活性的前體截短形式、等位基因變體和種類變體、由剪接變體編碼的變體以及其他變體，包括與凝血因子的成熟形式具有至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性并保留促進血塊形式的能力的多肽。例如，保留FVII的至少一種活性，例如FVII的TF結(jié)合、因子X結(jié)合、磷脂結(jié)合和/或促凝活性的修飾FVII多肽及其變體可以被采用。通過保留活性，所述活性可以改變，例如與野生型凝血因子相比降低或增加活性，只要所保留的活性水平足以生成可檢測的效應(yīng)?？捎糜诒景l(fā)明構(gòu)建體的凝血因子的示例性序列可以在隨附的序列表中找到。示例性的修飾多肽包括但不限于組織特異性同工型及其等位基因變體，通過核酸的翻譯制備的合成分子，通過化學(xué)合成(如包括較短多肽通過重組方法的連接反應(yīng)的合成)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，從人和非人組織和細胞分離的蛋白質(zhì)，嵌合多肽及其修飾形式。本發(fā)明的凝血因子可由野生型分子的片段或部分組成，所述野生(WT)型分子具有足夠長度或包括合適的區(qū)域以保留全長成熟多肽的至少一種活性(如果有需要在活化時)。示例性的凝血因子變體在本領(lǐng)域已知。本文中使用的術(shù)語“Gla結(jié)構(gòu)域”是指保守膜結(jié)合基序，其存在于維生素K依賴型蛋白，如作為凝血酶原、凝血因子VI1、IX和X，蛋白C、S和Z。這些蛋白質(zhì)需要用于翻譯后合成G-羧基谷氨酸(一種聚集在這些蛋白質(zhì)的N末端Gla結(jié)構(gòu)域的氨基酸)的維生素K。所有存在于結(jié)構(gòu)域中的谷氨酸殘基都是潛在的羧基化位點，因此其中許多被羧基化修飾。在存在鈣離子時，Gla結(jié)構(gòu)域與包括磷脂酰絲氨酸的磷脂膜相互作用。Gla結(jié)構(gòu)域也在結(jié)合FVIIa輔因子、組織因子(TF)中起作用。與TF復(fù)合，F(xiàn)VIIa的Gla結(jié)構(gòu)域負載有7個Ca2+離子，在細胞表面與磷脂相互作用的細胞膜方向上伸出三個疏水性側(cè)鏈，并且與TF的C末端結(jié)構(gòu)域明顯接觸。因子VII的Gla結(jié)構(gòu)域包含罕有的氨基酸-羧基谷氨酸(Gla)，其在凝血因子與帶負電的磷脂表面的結(jié)合中起作用。GLA結(jié)構(gòu)域負責(zé)鈣離子的高親和力結(jié)合。它起始于蛋白質(zhì)的成熟形式的N末端終點并且以保守的芳族殘基結(jié)束。在結(jié)構(gòu)域中部發(fā)現(xiàn)保守的Gla-x (3)-Gla-X-Cys基序，其似乎對于羧化酶的底物識別而言是重要的。使用停流熒光動力學(xué)測量結(jié)合表面等離子體共振分析，發(fā)現(xiàn)Gla結(jié)構(gòu)域在事件的序列中很重要，據(jù)此，F(xiàn)VIIa的蛋白酶結(jié)構(gòu)域啟動與sTF的接觸(Biochemical andBiophysical Research Communications.2005.337:1276)。另外，凝血因子的清除可通過例如在肝細胞和清除受體(例如，EPCR)上的Gla相互作用顯著地介導(dǎo)。在一個實施方案中，對靶向的凝血因子進行修飾以缺乏Gla結(jié)構(gòu)域。Gla結(jié)構(gòu)域負責(zé)通過多條途徑介導(dǎo)凝血因子的清除，如結(jié)合肝細胞，清除受體如EPCR等。因此，去除Gla結(jié)構(gòu)域?qū)δ蜃拥陌胨テ诰哂杏幸孀饔谩ｋm然Gla結(jié)構(gòu)域通常也通過將凝血因子定位于凝血位點而需要活性，但是靶向結(jié)構(gòu)域部分的血小板的內(nèi)含物使Gla缺失的凝血因子靶向血小板。在一個實施方案中，本發(fā)明的凝血因子包含靶向部分并缺少Gla結(jié)構(gòu)域。例如，在因子VII的情況下，Gla結(jié)構(gòu)域存在于輕鏈的氨基端并由氨基酸1-35組成。示例性的凝血因子的Gla結(jié)構(gòu)域在隨附的序列表中示出。該結(jié)構(gòu)域可能通過使用標準的分子生物學(xué)技術(shù)來去除，用靶向結(jié)構(gòu)域進行替換，并且修飾的輕鏈結(jié)合到本發(fā)明的構(gòu)建體中。在一個實施方案中，切割位點可以結(jié)合到缺少Gla結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體中以促進分子的活化。例如，在一個實施方案中，這種切割位點可以在氨基酸之間引入 ，當(dāng)凝血因子被活化時該氨基酸被切割(例如，對于因子VII，在氨基酸152與153之間)。在附圖中示出了示例性的缺少Gla結(jié)構(gòu)域的凝血因子。在一個實施方案中，切割位點可以被引入到構(gòu)建體中，所述構(gòu)建體缺少Gla結(jié)構(gòu)域以促進分子的活化。例如，在一個實施方案中，這種切割位點可以被引入到氨基酸之間，當(dāng)凝血因子被活化時該氨基酸被切割(例如，對于因子VII，位于氨基酸152和153之間)。在附圖中示出了示例性的缺少Gla結(jié)構(gòu)域的凝血因子。示例性的凝血因子是哺乳動物(例如人)來源的凝血因子。示例性的凝血因子的序列在隨附的序列表中示出，例如，單獨或在嵌合凝血因子構(gòu)建體的上下文中。II1.靶向部分在一個實施方案中，本發(fā)明的凝血因子通過使用“靶向部分”將凝血因子定位在凝血位點而被靶向到血小板中以增強其效力，所述“靶向部分”結(jié)合在血小板上表達的靶分子。優(yōu)選地，靶向分子不在除血小板之外的細胞或組織上表達，即靶向部分特異性與血小板
彡口口 在一個實施方案中，在靜息血小板上發(fā)現(xiàn)的受體/構(gòu)象被靶向。這樣做，凝血位點可能為增強的效力做好準備。靶向這樣的分子也可延長凝血因子的半衰期和/或預(yù)防清除。這種靶標的實例包括GpIb/V/IX復(fù)合物的Gplb，GpVI和GPIIb/IIIa的非活性形式。在一個實施方案中，為了將凝血因子定位在活性凝血位點，僅在活化血小板上發(fā)現(xiàn)的受體/構(gòu)象被靶向。這種靶標的實例包括，例如，GpIIb/IIIa以及⑶62P的活性形式。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含“靶向部分”，其具有對血小板的親和性并結(jié)合血小板。例如，在一個實施方案中`，靶向部分結(jié)合GPIb復(fù)合物，例如GPIb-a。這種靶向部分的實例包括肽PS4、OSl和0S2，其結(jié)合活性和非活性的血小板(Benard等，2008Biochemistry47:4674);在另一實施方案中，祀向部分結(jié)合GPIIbIIIa的活性構(gòu)象。這種靶向部分的實例包括SCE5和MB9可變區(qū)，其僅結(jié)合活性血小板(Schwarz等，2004FASEBJournal express articlel0.1096/fj.04-1513fje ；Schwarz 等，2006CirculationResearch.99:25-33 ;美國公開20070218067)。在另一實施方案中，靶向部分結(jié)合GPIIbIIIa的活性/非活性構(gòu)象。這種祀向部分的實例是AP3抗體的可變區(qū)(Peterson等，2003.Hemostasis, Thrombosis 和 Vascular BiologylOl: 937 ;W02010115866)。其他的革巴標和靶向部分在本領(lǐng)域已知。具有增加的凝血活性的因子IX的另一形式(三倍突變體V86A/E277A/R338A)已由 Lin 等人 2010.Journal of Thrombosis and Haemostasis8:1773 描述。這些參考文獻的內(nèi)容通過該參考文獻并入本文。本發(fā)明的嵌合凝血因子可能包含一個或多于一個的靶向部分。在附圖中列出了示例性的構(gòu)象。此外，兩個或更多個靶向部分可以彼此連續(xù)地連接(例如，通過間隔基)，并且串聯(lián)排列可操作地連接本發(fā)明的構(gòu)建體。當(dāng)兩個或更多個靶向部分存在于本發(fā)明的嵌合凝血因子中時，它們可以是相同的或不同的。在一個實施方案中，靶向部分通過可切割接頭融合本發(fā)明的嵌合凝血因子，所述接頭可被切割以在血塊位點去除靶向部分。在另一實施方案中，靶向部分不通過可切割接頭連接，因此，不在血塊位點被切割。在一個實施方案中，靶向部分定位在因子VIII的N末端或C末端。在另一實施方案中，靶向部分定位在FVI1、FIX、FX的C末端，或在FVIIa、FIXa中的任一鏈或雙鏈、FXa的C末端。在其中采用Fe區(qū)或其部分的實施方案中，靶向部分可位于第二 Fe鏈的N末端或C末端，或者在Fe鏈的任一鏈或雙鏈的C末端。在一個實施方案中，靶向部分不與構(gòu)建體基因融合，而是經(jīng)由間隔基或化學(xué)鍵與構(gòu)建體連接。例如，祀向部分通過在構(gòu)建體的祀向部分和Fe部分之間形成的鍵連接到本發(fā)明的構(gòu)建體上，其中靶向部分包含第一官能團，F(xiàn)e部分包含第二官能團，其中第一和第二官能團能夠彼此相互反應(yīng)形成化學(xué)鍵(參見，例如，美國專利7381408)。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個抗原結(jié)合位點(例如，抗體的抗原結(jié)合位點、抗體變體或抗體片段)、多肽、配體的受體結(jié)合部分或受體的配體結(jié)合部分，其與血小板特異性結(jié)合，例如，靜息血小板或活化血小板。示例性的靶向部分包括scFv分子或結(jié)合待靶向分子的肽。在本實施例和附圖中示出了靶向部分的實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本文的教義可以容易地選擇用作靶向分子的其他分子。A.與血小板結(jié)合的抗原結(jié)合位點在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含抗體的至少一個抗原結(jié)合部分(例如，結(jié)合位點)。在一個實施方案中，抗原結(jié)合部分使多肽靶向血小板。在其他實施方案中，本發(fā)明的多肽可包含抗原結(jié)合部分。術(shù)語“抗原結(jié)合部分”是指免疫球蛋白的多肽片段、抗體或抗體變體，其結(jié)合抗原或與完整抗體(即與它們所源自的完整抗體)競爭抗原結(jié)合(即特異性結(jié)合)。例如，所述抗原結(jié)合部分可源自上述抗體或抗體變體的任一種。抗原結(jié)合部分可通過本領(lǐng)域眾所周知的重組或生物化學(xué)方法制備。示例性的抗原結(jié)合部分包括Fv、Fab、Fab’和(Fab’ )2以及scFv分子。在其他實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子可包含來自單鏈結(jié)合分子(例如單鏈可變區(qū)或scFv)的結(jié)合位點。所述用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利N0.4，694，778 ；Bird, Scienc e242:423-442 (1988) ；Huston 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988)和 Ward 等人，Nature334:544-554 (1989))可適用于制備單鏈結(jié)合分子。單鏈抗體通過經(jīng)由氨基酸橋連接Fv區(qū)域的重鏈和輕鏈片段而形成，從而導(dǎo)致單鏈抗體。還可以使用在大腸桿菌中裝配功能Fv片段的技術(shù)(Skerra等人，Science242:1038-1041(1988))。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含一個或多個結(jié)合位點或區(qū)，所述區(qū)包含或由單鏈可變區(qū)序列(scFv)組成。單鏈可變區(qū)序列包含具有一個或多個抗原結(jié)合位點的單肽，例如，由柔性接頭連接到Vh結(jié)構(gòu)域的\結(jié)構(gòu)域。VL和/或VH結(jié)構(gòu)域可源自上述抗體或抗體變體的任一種。ScFv分子可能以Vh-接頭-Vlj方向或Vir接頭-Vh方向構(gòu)建。連接彌補抗原結(jié)合位點的\和Vh結(jié)構(gòu)域的柔性接頭優(yōu)選地包含約10至50個氨基酸。在一個實施方案中，多肽接頭是gly-ser多肽接頭。示例性的gly/ser多肽接頭具有式(Gly4Ser)n，其中n是正整數(shù)(例如，1、2、3、4、5或6)。其他的多肽在本領(lǐng)域已知。具有單鏈可變區(qū)序列(例如，單鏈Fv抗體)的抗體和制備所述單鏈抗體的方法在本領(lǐng)域眾所周知(參見例如，Ho 等，1989.Gene77:51 ；Bird 等，1988Science242:423 ；Pantoliano 等，1991.Biochemistry30:10117 ；Milenic 等，1991.CancerResearch51:6363 ;Takkinen 等，1991.Protein Engineering4:837)。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽采用的scFv分子是穩(wěn)定的scFv分子。在一個實施方案中，穩(wěn)定的cFv分子可包含在￥11結(jié)構(gòu)域和 '結(jié)構(gòu)域之間插入的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域通過Vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域的氨基酸之間形成的二硫鍵連接。在其他實施方案中，穩(wěn)定的scFv分子可包含scFv接頭,其具有優(yōu)化的長度或組成。在又一實施方案中，穩(wěn)定的scFv分子可包含Vh或'結(jié)構(gòu)域，其具有至少一個穩(wěn)定的氨基酸置換。在又一實施方案中，穩(wěn)定的scFv分子可以具有至少兩個上述列出的穩(wěn)定化特征。穩(wěn)定化scFv分子具有改進的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或給予可操作連接的多肽改進的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，與常規(guī)多肽相比，本發(fā)明優(yōu)選的scFv接頭使本發(fā)明的多肽的熱穩(wěn)定性提高至少約2°C或3°C。比較可能例如在本發(fā)明的scFv分子之間進行。在某些優(yōu)選的實施方案中，穩(wěn)定化scFv分子包含(Gly4Ser) 4scFv接頭和二硫鍵，其連接Vh氨基酸44和\氨基酸100?？捎糜诒景l(fā)明的多肽的其他示例性的穩(wěn)定化scFv分子在2006年12月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/873，996或2007年3月19日提交的美國專利申請?zhí)?1/725，970中描述，其每一個通過引用整體并入本文。本發(fā)明的多肽可包含源自使用本領(lǐng)域公認的抗體的可變區(qū)或其部分(例如，VL和/或VH結(jié)構(gòu)域)，例如可變結(jié)構(gòu)域可源自非人哺乳動物例如小鼠、豚鼠、靈長類、兔或大鼠中通過用抗原或其片段對該哺乳動物進行免疫而制備的抗體。參見，Harlow&Lane，同上，其為了所有目的通過引用并入。免疫球蛋白可通過相關(guān)抗原(例如，純化的腫瘤相關(guān)抗原或細胞或包含所述抗原的細胞提取 物)和佐劑的多次皮下注射或靜脈注射制備。典型地，該免疫誘發(fā)免疫應(yīng)答，其包括從活化的脾細胞或淋巴細胞產(chǎn)生抗原反應(yīng)抗體。盡管可變區(qū)可源自從免疫的哺乳動物的血清收獲的多克隆抗體，它通常從脾臟、淋巴結(jié)或外周血分離單獨的脾淋巴細胞以提供獲期望可變區(qū)所源自的單克隆抗體(MAb)的均勻制劑。典型地，使用兔和豚鼠制備多克隆抗體。典型地，使用小鼠制備單克隆抗體。針對抗原的單克隆抗體可通過將抗原片段注射到小鼠中制備，制備“雜交瘤”并且篩選雜交瘤的特異性結(jié)合抗原的抗體。在該眾所周知的過程(Kohler等，(1975)，Nature, 256:495)中，來自已用抗原注射小鼠的相對短壽命或致死的淋巴細胞與永生的瘤細胞系(例如，骨髓瘤細胞系)融合，因此，制備均為永生的并且能夠產(chǎn)生通過B細胞基因編碼的抗體的雜交細胞或“雜交瘤”。通過用各個單獨的包含用于單個抗體形成的特定基因的菌株選擇、稀釋和再生，獲得的雜合物分離成單獨的遺傳品系。它們產(chǎn)生同源的針對所需抗原的抗體，并且根據(jù)它們的純的遺傳百分比，將其稱為“單克隆”。接種由此制備的雜交瘤細胞并在合適的培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基優(yōu)選地含有一種或多種抑制非融合的親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，用于形成、選擇和生長雜交瘤的試劑、細胞系和培養(yǎng)基可從許多來源商業(yè)購得，并且標準化方案是成熟的。一般來說，測定雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)基的針對所需抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地，通過雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀法或通過體外測定來確定，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。鑒定制備具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，通過有限的稀釋程序可將克隆體進行亞克隆，并通過標準方法生長(Goding, Monoclonal antibody !Principles andPractice, pp59-103 (Academic Press, 1986))。還應(yīng)進一步理解，由亞克隆分泌的單克隆抗體可通過常規(guī)純化程序從培養(yǎng)基、腹水或血清分離，例如，親和色譜(例如，蛋白A、蛋白G或蛋白L親和色譜)、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳或透析。任選地，可篩選這樣的抗體，其結(jié)合特定活化狀態(tài)的血小板上或結(jié)合到抗原的特定區(qū)域或所需片段，而不結(jié)合抗原的其他非重疊片段。后者的篩選可以通過確定抗體到抗原缺失突變體的收集物的結(jié)合并確定哪個缺失突變體結(jié)合抗體而完成。例如，通過蛋白質(zhì)印跡或ELISA可評估結(jié)合。示出特異性結(jié)合抗體的最小片段限定抗體的表位?？蛇x地，表位特異性能夠通過競爭測定來確定，所述競爭測定是參考抗體競爭結(jié)合抗原的試驗。如果該試驗和參考抗體競爭，那么它們結(jié)合相同的表位或表位充分接近，以使一個抗體的結(jié)合干擾其他抗體的結(jié)合。編碼所需單克隆抗體或其結(jié)合位點的DNA可被容易地分離并使用任一種上述的用于分離恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域序列(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)的常規(guī)程序進行測序。分離的和亞克隆的雜交瘤細胞用作所述DNA的優(yōu)選來源。尤其是，分離的DNA(其可以如本文所描述地合成)可以用于克隆用于結(jié)合到本發(fā)明的多肽中的所需可變區(qū)序列。在其他實施方案中，結(jié)合位點源自全人抗體。人或基本上人抗體可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)中產(chǎn)生，其不能進行內(nèi)源性免疫球蛋白的制備(參見例如，美國專利號6，075，181,5, 939，598,5, 591，669和5，589，369，其每一個通過引用整體并入本文)。例如，據(jù)描述，在嵌合和種系突變型小鼠中的抗體重鏈聯(lián)結(jié)區(qū)的純合子缺失導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源性的抗體產(chǎn)生。人免疫球蛋白基因陣列向這種種系突變型小鼠的轉(zhuǎn)移將在抗原攻擊時導(dǎo)致產(chǎn)生人抗體。另外優(yōu)選的使用SCID小鼠產(chǎn)生人抗體的方法在美國專利號5，811，524中公開，其通過引用并入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，與這些人抗體相關(guān)的遺傳物質(zhì)也可如本發(fā)明所述地被分離或操作。在其他方面，本發(fā)明的多肽可包含抗原結(jié)合位點或其部分，其源自抗體的修飾形式。示例性的這種形式包括，例如，微型抗體、雙抗、三抗體、納米抗體、camelids、Dabs、四價抗體、內(nèi)雙抗(例如，Jendreyko等,2003.J.Biol.Chem.278:47813)、融合蛋白(例如，抗體細胞因子融合蛋白、融合Fe受體至少一部分的蛋白)以及雙特異性抗體。其他修飾的抗體在例如，美國專利號 4，745，055 ；EP256, 654 ；FauIkner 等，Nature298:286 (1982)；EP120, 694 ；EP125, 023 ；Morrison, J.Tmmun.123:793 (1979) ；Kohler 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77: 2197 (1980) ；Raso 等，Cancer Res.41:2073(1981) ；Morrison 等，Ann.Rev.1mmunol.2:239(1984) ；Morrison, Science229:1202 (1985) ；Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1 .USA81:6851 (1984) ;EP255, 694 ;EP266, 663 和 W088/03559 中描述。重新組合的免疫球蛋白鏈也是已知的。參見，例如，美國專利號4，444，878、W088/03565和EP68，763以及在其中所述的參考文獻。在另一實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子包含抗原結(jié)合位點或區(qū)，其是雙抗體或由此衍生的抗原結(jié)合位點。雙抗體是二聚四價分子，每個分子具有類似于scFv分子的多肽，但通常具有短的(例如，少于10，優(yōu)選I至5)個氨基酸殘基接頭，該接頭連接兩個可變結(jié)構(gòu)域，以使在同一多肽上的\和Vh結(jié)構(gòu)域不能相互作用?？商娲?，一個多肽鏈的\和Vh結(jié)構(gòu)域與第二多肽鏈上的Vl和Vh結(jié)構(gòu)域(分別地)相互作用(參見，例如W002/02781)。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含雙抗體，其可操作地連接至少一個基因融合的Fe區(qū)(即scFc區(qū))的N末端和/或C末端。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含單結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子(例如，單結(jié)構(gòu)域抗體)作為靶向部分。示例性的單結(jié)構(gòu)域分子包括抗體的分離的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，即重鏈可變結(jié)構(gòu)域，而沒有輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，和抗體的分離的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(')，即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，而沒有重鏈可變結(jié)構(gòu)域。用于本發(fā)明的結(jié)合分子的示例性的單結(jié)構(gòu)域抗體包括，例如，Camelid重鏈可變結(jié)構(gòu)域(約118至136個氨基酸殘基)，如在Hamers-Casterman，等，Nature363:446-448 (1993)和 Dumoulin，等，Protein Sciencell: 500-515 (2002)中所描述。其他示例性的單結(jié)構(gòu)域抗體包括單VH或VL結(jié)構(gòu)域，也被稱為Date8 (DomantisLtd.，Cambridge, UK)。其他單結(jié)構(gòu)域抗體包括鯊魚抗體(例如，鯊魚Ig-NAR)。鯊魚Ig-NAR包含一個可變結(jié)構(gòu)域(V-NAR)的同源二聚體和5個C樣恒定結(jié)構(gòu)域(C-NAR)，其中多樣性集中在延長的CDR3地區(qū)中，所述區(qū)長度從5至23個殘基變化。在駱駝科動物物種(例如，羊駝類)中，稱為VHH的重鏈可變區(qū)形成整個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。駱駝科動物VHH可變區(qū)和源自常規(guī)抗體(VH)的VHH區(qū)之間的主要差異包括(a)與相應(yīng)的VHH區(qū)相比，在VH的輕鏈接觸表面有更多的疏水性氨基酸，(b)VHH中更長的CDR3，以及(c) VHH中的CDRl和CDR3之間頻繁出現(xiàn)二硫鍵。用于制備單結(jié)構(gòu)域結(jié)合分子的方法在美國專利號6.005, 079和6，765，087中描述，其兩者通過引用并入本文。示例性的包含VHH結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體包 NanobodiesK' (Ablynx NV, Ghent, Belgium)。用于本發(fā)明的結(jié)合分子的示例性的抗體(結(jié)合位點可源自該抗體)在本領(lǐng)域已知。此類靶向部分的實例包括SCE5和MB9可變區(qū)，其僅結(jié)合活性血小板(Schwarz等人 2004FASEB Journal express articlel0.1096/fj.04-1513fje ；Schwarz 等人2006Circulation Research.99:25-33 ;美國專利公布 20070218067)。在另一實施方案中，靶向部分結(jié)合GPIIbIIIa的活性/非活性構(gòu)象兩者。此類靶向部分的實例是AP3抗體的可變區(qū)(Peterson 等人 2003.Hemostasis, Thrombosis 和 Vascular BiologylOl:937 ；W02010115866)。B.非免疫球蛋白血小板結(jié)合分子 在某些其它實施方案中，本發(fā)明的多肽包含一個或多個源自非免疫球蛋白結(jié)合分子的血小板結(jié)合位點。本文中使用的術(shù)語“非免疫球蛋白結(jié)合分子”是結(jié)合位點包含來自多肽而不是免疫球蛋白的部 分(例如，支架或框架)，但是可被工程化(例如，誘變)以賦予所需的對于血小板靶標的結(jié)合特異性的結(jié)合分子。包含不源自抗體分子的結(jié)合位點的結(jié)合分子的其他實例包括受體結(jié)合位點和結(jié)合血小板的配體結(jié)合位點。可通過從來自結(jié)合分子文庫中選擇或分離靶標結(jié)合變體來鑒定非免疫球蛋白結(jié)合分子，所述結(jié)合分子具有人工的多樣化結(jié)合位點。使用完全隨機的方法(例如，錯配PCR、外顯子改組、或定向進化)或借助于本領(lǐng)域公認的設(shè)計策略能夠產(chǎn)生多樣化文庫。例如，能夠通過在編碼結(jié)合位點的核苷酸內(nèi)相應(yīng)的位置中插入簡并密碼子、三核苷酸、隨機肽或整個環(huán)來隨機化當(dāng)結(jié)合位點與其同源靶標分子相互作用時通常涉及的氨基酸位置(參見例如，美國公開號20040132028)。氨基酸位置的定位能夠通過具有靶向分子的復(fù)合物的結(jié)合位點的晶體結(jié)構(gòu)的研究而鑒定。隨機化的候選位置包括環(huán)、平面、螺旋和結(jié)合位點的結(jié)合腔。在某些實施方案中，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)鑒定結(jié)合位點內(nèi)的氨基酸，其可能是多樣化的候選。在隨機化之后，多樣化庫可能經(jīng)過選擇或篩選程序以獲得具有所需結(jié)合特性的結(jié)合分子，例如，使用本領(lǐng)域已知方法的特異性結(jié)合血小板?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公認的方法如噬菌體展示、酵母展示或核糖體展示完成選擇。在一個實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體可以采用本領(lǐng)域已知結(jié)合血小板的分子。例如,如本領(lǐng)域所描述的結(jié)合GPIba的肽(例如，PS4、0S1或 0S2)可以被使用(Benard 等，2008.Biochemistry47:4674-4682)。
IV.可活化的凝血因子當(dāng)以活性形式給予時，用于旁路治療所給予的凝血因子是有效的，因為外源性的凝血因子通常不能被有效的充足動力學(xué)所活化。然而，它們通過內(nèi)源性途徑快速失活(例如，通過抗凝血酶III或TFPI)，導(dǎo)致活性形式的清除并縮短有效半衰期。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子是“可活化的”。這種可活化的構(gòu)建體作為具有更長的半衰期的增強的酶原循環(huán)，但是當(dāng)需要時能夠容易地在凝血部位被切割。在一個實施方案中，本發(fā)明可活化的構(gòu)建體包含可切割的接頭，其包含例如，因子XIa、Xa或凝血酶切割位點(其被分別由因子XIa、Xa或凝血酶切割)，導(dǎo)致在血塊位點形成凝血因子的活性形式。示例性的因子FXIa切割位點包括，例如，TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位點包括，例如，DFLAEGGGVR、TTKIKPR和包含ALRPR或由ALRPR組成的序列(例如，ALRPRVVGGA)。在一個實施方案中，可切割的接頭的兩側(cè)可以有被間隔基部分隔開的一個或多個側(cè)(上游、下游或兩側(cè))。在一個實施方案中，可切割的接頭在凝血因子的輕鏈和重鏈之間插入。在另一實施方案中，可切割的接頭不在凝血因子的輕鏈和重鏈之間插入。在一個實施方案中，可切割的接頭位于重鏈的氨基端。示例性的可活化的構(gòu)建體在附圖和以下實施例中示出。V.支架部分本發(fā)明的 一些實施方案包含支架部分，其可選自例如蛋白質(zhì)部分、ScFc區(qū)、Fe部分、白蛋白、XTEN等。A.蛋白質(zhì)部分在一個實施方案中，支架是蛋白質(zhì)部分。這種部分可包含完整蛋白質(zhì)或其部分或合成分子。優(yōu)選的蛋白質(zhì)部分具有足夠的分子尺寸，當(dāng)結(jié)合到構(gòu)建體中時，其改進本發(fā)明的嵌合凝血因子的半衰期。例如，在一個實施方案中，人工蛋白(XTEN)可包括在構(gòu)建體中作為支架(Schellenberger等，2009.27:1186)。在另一實施方案中，白蛋白(例如，人血清白蛋白)可包括在本發(fā)明的構(gòu)建體中。例如，如在本領(lǐng)域已知，血清白蛋白(例如，HSA)能用作蛋白支架。在HSA的特定各種結(jié)構(gòu)域和亞結(jié)構(gòu)域中，具有相當(dāng)經(jīng)得起用于產(chǎn)生血清白蛋白支架基蛋白文庫的突變和隨機化的結(jié)構(gòu)?？捎糜诒景l(fā)明的白蛋白的實例，例如其片段，是已知的。例如，美國專利號7, 592，010、美國專利號6，686，179和Schulte, ThrombosisRes.124增刊2:S6-S8 (2009)，其每一個通過引用整體并入本文。BscFc 區(qū)在一個實施方案中，本發(fā)明提供編碼多肽的核酸分子，所述多肽包含位于單個多肽鏈(即包含單鏈Fc(ScFc)區(qū)的多肽)內(nèi)的至少一個基因融合的Fe區(qū)或其部分，所述單個多肽鏈包含scFc區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼嵌合凝血因子，其包含選自FVI1、FIX和FX的凝血因子以及結(jié)合血小板的靶向部分以及任選地位于凝血因子和靶向部分之間的間隔基部分。多肽包含F(xiàn)VII，該FVII包含可被凝血級聯(lián)的組分活化的異源性酶切位點。在一個實施方案中，本發(fā)明提供未加工的多肽，其中位于相同線性多肽鏈內(nèi)的至少兩個Fe部分或結(jié)構(gòu)域(例如，2、3、4、5、6或更多個Fe部分或結(jié)構(gòu)域)能夠折疊(例如，分子內(nèi)或分子間折疊)以形成一個由Fe多肽接頭連接的功能scFc區(qū)。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，為了改進半衰期或觸發(fā)免疫效應(yīng)功能(例如，抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒作用(CDCC)和/或為了提高可制備性)，本發(fā)明的多肽能夠通過其scFc區(qū)結(jié)合至少一個Fe受體(例如，F(xiàn)cRn> Fe y R受體(例如，F(xiàn)e Y RIII)或補體蛋白(例如，Clq))?？商娲O(shè)計的多種多肽在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，在一個實施方案中，多肽包含呈從氨基端到羧基端的線性序列的部分:A-Fl-P1-L-P2-B-F2 (I)其中，A(如果存在)是凝血因子或其部分，F(xiàn)l是第一 Fe部分或結(jié)構(gòu)域，Pl是酶切位點，L是ScFc接頭，P2是酶切位點，B (如果存在)是凝血因子或其部分，F(xiàn)2是第二 Fe部分或結(jié)構(gòu)域，并且代表 肽鍵。式(I)至少包含A或B以及任選地包含兩者。A和B (如果都存在)可能是凝血因子的相應(yīng)的重鏈和輕鏈。式(I)至少包含Pl或P2以及任選地包含兩者。Pl和P2(如果都存在)可能相同或不同。式⑴至少包含F(xiàn)l和F2。Fl和F2(如果都存在)可能相同或不同。根據(jù)式I 的示例性的多肽包括:A-F1-P1-L-P2-F2、F1-P1-L-P2-B-F2、A-Fl-P 1-L-F2、Fl-P 1-L-B-F2、A-F1-L-P2-F2 和 F1-L-P2-B-F2。在一個實施方案中，每個Fl和F2包含CH2和CH3部分。在一個實施方案中，在切割和基本上切除cscFc接頭(L)后，本發(fā)明的多肽包含兩條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含連接第一 Fe部分的A，以及其中第二多肽鏈包含連接第二Fe部分的B，其中Fl和F2 二聚化以形成Fe區(qū)。在一個實施方案中，A和B任選地存在，并且它們是凝血因子或其部分。在一個實施方案中，A是凝血因子的輕鏈，并且B是凝血因子的重鏈。在一個實施方案中，B是凝血因子的輕鏈，并且A是凝血因子的重鏈。在一個實施方案中，當(dāng)A和B在多肽中締合時，則多肽形成功能凝血因子，例如，F(xiàn)VI1、FIX或FX。在一個實施方案中，此類多肽在從細胞分泌時就具有酶活性。i) Fe部分或結(jié)構(gòu)域用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的可用作Fl和F2的Fe部分可通過多種不同的來源獲得。在優(yōu)選的實施方案中，多肽的Fe部分源自人免疫球蛋白。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是Fe部分可源自其他哺乳動物類的免疫球蛋白，包括例如，嚙齒類動物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人靈長類動物(例如，黑猩猩、獼猴)物種。而且，多肽Fe結(jié)構(gòu)域或其部分可源自任何免疫球蛋白類，其包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同型，其包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在優(yōu)選實施方案中，使用人同型IgGl。多種Fe部分基因序列(例如，人恒定區(qū)基因序列)以公開可得的保藏物形式獲得。能夠選擇具有特定效應(yīng)子功能(或缺少特定的效應(yīng)子功能)或具有特定修飾的包含F(xiàn)e部分序列的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域以降低免疫原性。許多抗體和抗體編碼基因的序列已經(jīng)被公開，并且合適的Fe部分序列(例如，鉸鏈、CH2和/或CH3序列或其部分)可源自使用本領(lǐng)域公認的技術(shù)的這些序列。使用任何前述的方法獲得的遺傳物質(zhì)可然后被改變或合成以獲得本發(fā)明的多肽。應(yīng)當(dāng)進一步理解的是本發(fā)明的范圍涵蓋恒定區(qū)DNA序列的等位基因、變體和突變體。
例如，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)以及被選擇來擴增目標結(jié)構(gòu)域的引物克隆Fe部分序列。為了從抗體中克隆Fe部分序列，從雜交瘤細胞、脾或淋巴結(jié)細胞中分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄成DNA，并且用PCR擴增抗體基因。詳細的PCR擴增方法在美國專利號4，683，195 ；4，683，202 ;4，800，159 ;4，965，188 中描述，以及在例如“PCR Protocols: A Guide toMethods and Applications” Innis 等節(jié)基，Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Ho等，1989.Gene77:51 ;Horton 等，1993.Methods Enzymol.217:270)中描述。PCR 可以由共有序列恒定區(qū)引物或由基于公開的重鏈和輕鏈DNA和氨基酸序列的更多種特異性引物開始。如上所討論的，PCR還可用于分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在這種情況下，可以通過共有序列引物或更大的同源探針如鼠恒定區(qū)探針篩選文庫。適用于抗體基因擴增的多數(shù)引物組在本領(lǐng)域已知(例如，基于純化抗體的N末端序列的5’引物)(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering : 1509) ;cDNA 端的快速擴增(Ruberti, F.等，1994.J.1mmunol.Methods 173:33);抗體前導(dǎo)序列(Larrick 等，1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250)?？贵w序列的克隆進一步在1995年I月25日提交的Newman等,美國專利號5，658，570中描述，其通過引用并入本文。本發(fā)明的多肽可包含兩個或更多個Fe部分(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個Fe部分)。這些兩個或更多個Fe部分能夠形成Fe區(qū)。在一個實施方案中，F(xiàn)e部分可以是不同的類型。在一個實施方案中，存在于多肽中的至少一個Fe部分包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分多肽中。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包括至少一個CH2結(jié)構(gòu)域或其部分。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包括至少一個CH3結(jié)構(gòu)域或其部分。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包括至少一個CH4結(jié)構(gòu)域或其部分。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分,該Fe部分包括至少一個鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分以及至少一個CH2結(jié)構(gòu)域或其部分(例如，以鉸鏈-CH2方向)。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包括至少一個CH2結(jié)構(gòu)域或其部分以及至少一個CH3結(jié)構(gòu)域或其部分(例如，以CH2-CH3方向)。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包含至少一個鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分，至少一個CH2結(jié)構(gòu)域或其部分以及至少一個CH3結(jié)構(gòu)域或其部分，例如，以鉸鏈-CH2-CH3、鉸鏈-CH3-CH2或CH2-CH3-鉸鏈方向。在某些實施方案中，多 肽包含至少一個完整Fe區(qū)，其源自一個或多個免疫球蛋白重鏈(例如，包括鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Fe結(jié)構(gòu)域，雖然它們不需要來自相同的抗體)。在其他實施方案中，多肽包含至少兩條完整的Fe區(qū)，其源自一個或多個免疫球蛋白重鏈。在優(yōu)選的實施方案中，完整Fe部分源自人IgG免疫球蛋白重鏈(例如，人IgGl)。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包含完整CH3結(jié)構(gòu)域(根據(jù)EU編號的抗體Fe區(qū)的約341-438的氨基酸)。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包含完整CH2結(jié)構(gòu)域(根據(jù)EU編號的抗體Fe區(qū)的約231-340的氨基酸)。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包含至少一個CH3結(jié)構(gòu)域和至少一個鉸鏈區(qū)(根據(jù)EU編號的抗體Fe區(qū)的約216-230氨基酸)和CH2結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包含鉸鏈和CH3結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，其包含鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)e部分源自人IgG免疫球蛋白重鏈(例如，人IgGl)。在一個實施方案中，F(xiàn)e部分包含或由根據(jù)EU編號221至447的氨基酸組成。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，該Fe部分包含F(xiàn)cRn結(jié)合伴侶。FcRn結(jié)合伴侶是分子或其部分，其能夠被FcRn受體特異性結(jié)合，隨后被FcRn結(jié)合伴侶的FcRn受體活性轉(zhuǎn)運。特異性結(jié)合是指形成在生理條件下相對穩(wěn)定的復(fù)合物的兩個分子。特異性結(jié)合的特征在于高親和力和低至中等的穩(wěn)定，如與通常具有低親和力以及中至高度的能力的非特異性結(jié)合相區(qū)分。典型地，當(dāng)親和常數(shù)KA高于IO6M'更優(yōu)選高于IO8M-1時，則認為結(jié)合是特異性的。如果有必要，通過改變結(jié)合條件能夠降低非特異性結(jié)合而基本上不影響特異性結(jié)合。適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件如分子濃度、溶液的離子強度、溫度、允許結(jié)合的時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、牛奶酪蛋白)的濃度等，其可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)來優(yōu)化。FcRn受體已經(jīng)從幾種哺乳動物物種(包括人)中分離。人FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn 和小鼠 FcRn 的序列是已知的(Story 等，1994, J.Exp.Med.180:2377)。FcRn 受體在相對較低的PH下結(jié)合IgG(而不是其他免疫球蛋白類，如IgA、IgM、IgD和IgE)，從腔至漿膜方向積極轉(zhuǎn)運IgG抗體跨細胞，然后釋放在在間質(zhì)流體中發(fā)現(xiàn)的相對較高的pH下釋放IgG0它在包括肺和腸上皮(Israel等，1997，Immunology92:69)、腎小管上皮(Kobayashi等，2002，Am.J.Physiol.Renal Physiol.282:F358)以及鼻上皮、陰道表面和膽管樹表面的成人表皮組織中表達(美國專利號6，485，726,6, 030，613,6, 086，875 ；W003/077834 ；US2003-0235536A1)。本發(fā)明的FcRn結(jié)合伴侶涵蓋能被FcRn受體特異性結(jié)合的分子，所述受體包括整個IgG、IgG的Fe片段和其他包括FcRn受體的完整結(jié)合區(qū)的片段。基于X射線結(jié)晶學(xué)已經(jīng)描述了結(jié)合FcRn受體的IgG的Fe部分的區(qū)域(Burmeister等，1994，Nature372:379)。具有FcRn的Fe的主要接觸面接近CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的連接。Fc-FcRn接觸都在單個Ig重鏈內(nèi)。FcRn結(jié)合伴侶包括整個IgG、IgG的Fe片段和其他包括FcRn受體完整結(jié)合區(qū)的IgG片段。主要的接觸位點包括CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結(jié)構(gòu)域的385_387、428和433-436。提及的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區(qū)的氨基酸編號都基于Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, U.S.Department of Public Health, Bethesda, Md。根據(jù)公認的程序(如位點定向誘變及其類似程序)，IgG的Fe區(qū)能夠被修飾以生成修飾的IgG或Fe片段及其部分(其將被FcRn結(jié)合)。這種修飾包括在遠離FcRn接觸位點的修飾以及在接觸位點內(nèi)的修飾，這些修飾保護或甚至增強與FcRn的結(jié)合。例如，人IgGl Fe (Fe Y I)中的以下單個氨基酸殘基能夠被置換而不明顯損失Fe對于FcRnA的結(jié)合親和力:P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R41 6A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示野生型脯氨酸在第238位被丙氨酸置換。作為一個實例，在一個具體的實施方案，結(jié)合N297A突變，除去高度保守的N-糖基化位點。除了丙氨酸之外，其他氨基酸可以在以上指定的位點被野生型氨基酸置換。突變可單獨地引入到Fe,引起超過一百個的FcRn結(jié)合伴侶與天然Fe不同。此外,這些單獨突變的兩個、三個或更多個組合可以一起引入，引起數(shù)百個FcRn結(jié)合伴侶。此外，本發(fā)明構(gòu)建體中的一個FcRn結(jié)合伴侶可以發(fā)生突變而另一個FcRn結(jié)合伴侶根本不發(fā)生突變，或兩個都可以發(fā)生突變而具有不同的突變。本發(fā)明描述的任何一種突變(包括N297A)可用于修飾Fe，而不考慮生物活性分子(例如，EPO、IFN、因子VI1、因子IX、T20)。上述某些突變可能賦予FcRn結(jié)合配體新的功能性。例如，一個實施方案中包含去除高度保守的N-糖基化位點的N297A。這種突變體的結(jié)果是降低免疫原性，因此提高FcRn結(jié)合配體的循環(huán)半衰期，并使FcRn結(jié)合配體不能與Fe Y R1、Fe Y RIIA, Fe y RIIB和Fe Y RIIIA 結(jié)合，其不損害 FcRn 的親和力(Routledge 等，1995, Transplantation60:847 ；Friend 等,1999, Transplantation68:1632 ；Shields 等，1995, J.Biol.Chem.276:6591)。作為由上述突變產(chǎn)生的新功能性的另一個實例，F(xiàn)cRn的親和力可能增加高于在一些例子中野生型的親和力。這種增加的親和力可反映增加的“結(jié)合”速率、降低的“脫離”速率或同時的增加的“結(jié)合”速率和降低的“脫離”速率。認為賦予增加的FcRn親和力的突變包含T256A、T307A、E380A 和 N434A(Shields 等，2001，J.Biol.Chem.276:6591)。此外，至少3個人Fe Y受體看起來識別低鉸鏈區(qū)內(nèi)(一般為氨基酸234至237)的IgG上的結(jié)合位點。因此，新功能性和潛在降低的免疫原性的另一個實例可源于該區(qū)域的突變，例如將人IgGl〃ELLG〃的氨基酸233至236取代為IgG2〃PVA〃的相應(yīng)序列(缺失一個氨基酸)。已示出當(dāng)引入這種突變體后，介導(dǎo)各種效應(yīng)子功能的Fe Y R1、FcyRII和Fe Y RIII 不與 IgGl 結(jié)合(Ward 和 Ghetiel995, Therapeutic Immunology2:77 和 Armour等，1999, Eur.J.Tmmunol.29:2613)。在一個實施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合配體是多肽，其包含序列PKNSSMISNTP(SEQ IDNO: 12)，并任選地還包含選 自 HQSLGTQ (SEQ ID NO: 13)、HQNLSDGK (SEQ ID NO: 14)、HQNISDGK(SEQ ID NO:24)或 VIS SHLGQ(SEQ ID NO:25)(美國專利號 5，739，277)的序列。兩個FcRn受體可結(jié)合單個Fe分子。結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)表明每個FcRn分子結(jié)合Fe 二聚體的單一多肽。在一個實施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合伴侶(如IgG的Fe片段)與生物活性分子的連接提供口服、經(jīng)頰、舌下、直腸、陰道遞送生物活性分子的方法，作為經(jīng)鼻施用的氣溶膠或通過肺途徑或通過眼途徑。在另一實施方案中，可侵入性施用嵌合蛋白，例如皮下施用或靜脈內(nèi)施用。組成本發(fā)明的多肽的Fe部分的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域或其部分可源自不同的免疫球蛋白分子。例如。本發(fā)明的多肽可包含源自IgGl分子的CH2結(jié)構(gòu)域或其部分及源自IgG3分子的CH3區(qū)或其部分。在另一個實例中，多肽可包含F(xiàn)e部分，其包含部分源自IgGl分子且部分源自IgG3分子的鉸鏈結(jié)構(gòu)域。如本文所陳述的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解的是，F(xiàn)e部分可以被改變以使其氨基酸序列不同于天然存在的抗體分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽包含含有一個或多個截短的Fe部分的scFc區(qū)，盡管如此所述截短的Fe部分足以向Fe區(qū)賦予Fe受體(FcR)結(jié)合性能。例如，與FcRn (即FcRn結(jié)合部分)結(jié)合的Fe結(jié)構(gòu)域的部分包含約IgGl的氨基酸282至438，具有初始接觸位點的EU編號，CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸248,250至257、272、285、288、290至291,308至311和314及CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基385至387、428和433至436。因此，本發(fā)明的多肽的Fe部分可包含F(xiàn)cRn結(jié)合部分或由FcRn結(jié)合部分組成。FcRn結(jié)合部分可源自任何同工型的重鏈，包含IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在一個實施方案中，使用來自人同工型IgGl的抗體的FcRn結(jié)合部分。在另一實施方案中，使用來自人同工型IgG4的抗體的FcRn結(jié)合部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽缺少完整Fe區(qū)的一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，例如，其部分或全部缺失。在某個實施方案中，本發(fā)明多肽將缺失全部的CH2結(jié)構(gòu)域(ACH2構(gòu)建體)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到這種構(gòu)建體是優(yōu)選的，由于其CH2結(jié)構(gòu)域?qū)贵w代謝速率的調(diào)節(jié)屬性。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含CH2結(jié)構(gòu)域缺失的Fe區(qū)，該Fe區(qū)源自編碼IgG1人恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的載體(例如,來自IDEC Pharmaceuticals, San Diego)(參見，例如，W002/060955A2和W002/096948A2)。這種示例性載體設(shè)計為缺失CH2結(jié)構(gòu)域并提供為表達結(jié)構(gòu)域缺失的IgG^g定區(qū)的合成載體。人們將注意到這些示例性構(gòu)建體優(yōu)選地設(shè)計為將結(jié)合CH3結(jié)構(gòu)域與各自的Fe結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)直接融合。在其他構(gòu)建體中，在一個或多個組成Fe部分之間提供間隔基部分可能是令人期望的。例如，間隔基部分可位于鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域之間和/或CH2與CH3結(jié)構(gòu)域之間。例如，相容的構(gòu)建體可被表達，其中CH2結(jié)構(gòu)域缺失且其余CH3結(jié)構(gòu)域(合成的或非合成的)通過5至20個氨基酸間隔基部分與鉸鏈區(qū)連接?？商砑舆@種間隔基部分，例如，以確保恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)元件保持游離且可及的或鉸鏈區(qū)保持可彎曲性。優(yōu)選地，任何與本發(fā)明相容的連接肽將為相對地?zé)o免疫原性并不阻止scFc區(qū)的適當(dāng)折疊。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽可包含二聚體Fe區(qū)，其包含相同的或大體上相同的序列組成的Fe部分(此處被稱為“同型二聚體Fe區(qū)”)。在其他實施方案中，本發(fā)明的多肽可包含二聚體Fe區(qū)，其包含至少兩個具有不同序列組成(例如，此處被稱為“異型二聚體Fe區(qū)”)的Fe部分。在一個示例性實施方案中，異型二聚體Fe區(qū)包含第一 Fe部分的氨基酸置換(例如，天冬酰胺在EU位置297的氨基酸置換)，但不在第二 Fe部分。在某些實施方案中，F(xiàn)e區(qū)是半糖基化的。例如，異聚體scFc區(qū)可包含第一糖基化的Fe部分(例如，糖基化的CH2區(qū)`)和第二無糖基化的Fe部分(例如，無糖基化的CH2區(qū))，其中接頭在糖基化和無糖基化的Fe部分之間插入。在其他實施方案中，F(xiàn)e區(qū)完全糖基化，即所有的Fe部分都被糖基化。在又一實施方案中，F(xiàn)e區(qū)可以是無糖基化的，例如，沒有一個Fe部分被糖基化。在某些實施方案中，用于本發(fā)明的多肽的Fe部分被改變，例如，通過氨基酸突變(例如，添加、缺失或置換)。例如，在一個實施方案中，F(xiàn)e部分相比于Fe部分所源自的野生型Fe具有至少一個氨基酸置換。例如，其中Fe部分源自人IgGl抗體，變體相比于野生型氨基酸在人IgGlFc區(qū)的相應(yīng)位置包含至少一個氨基酸突變(例如，置換)。Fe變體的氨基酸置換可位于Fe部分內(nèi)的位置，其是指對應(yīng)于抗體的Fe區(qū)中給定的殘基的位置序號(如使用EU編號慣例所列出的)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地產(chǎn)生比對以確定對應(yīng)于Fe部分中的位置的EU編號。在一個實施方案中，F(xiàn)e變體包含位于鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分內(nèi)的氨基酸位置的置換。在另一實施方案中，F(xiàn)e變體包含位于CH2結(jié)構(gòu)域或其部分內(nèi)的氨基酸位置的置換。在另一實施方案中，F(xiàn)e變體包含位于CH3結(jié)構(gòu)域或其部分內(nèi)的氨基酸位置的置換。在另一實施方案中，F(xiàn)e變體包含位于CH4結(jié)構(gòu)域或其部分內(nèi)的氨基酸位置的置換。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含F(xiàn)e變體，其包含多于一個的氨基酸置換。本發(fā)明的多肽可包含，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸置換。優(yōu)選地，氨基酸置換的彼此空間定位的相互間隔為至少一個氨基酸位置或更多，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10個氨基酸位置或更多。更優(yōu)選地，工程化的氨基酸的空間定位的相互間隔為至少5、10,15,20或25個氨基酸位置或更多。在某些實施方案中，F(xiàn)e變體使由至少一個包含所述野生型Fe結(jié)構(gòu)域的Fe區(qū)賦予的效應(yīng)子功能發(fā)生變化(例如，F(xiàn)e區(qū)結(jié)合Fe受體(例如，F(xiàn)e YR1、Fc YRII或Fe Y RIII)或補體蛋白(例如，Clq)的能力的增強或減弱，或引發(fā)抗體依賴型細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴型細胞毒性(CDCC))。在其他實施方案中，F(xiàn)e變體提供工程化半胱氨酸殘基。本發(fā)明的多肽可使用公認的Fe變體，已知其能使效應(yīng)子功能和/或FcR或FcRn結(jié)合發(fā)生變化(例如，增強或減弱)。具體地來說，本發(fā)明的結(jié)合分子可包括，例如一個或多個氨基酸位置的變化(例如，置換)，如公開于國際PCT公布W088/07089A1、W096/14339A1、W098/05787AU W098/23289A1、 W099/51642A1、 W099/58572A1、 W000/09560A2、W000/32767A1、W000/42072A2、W002/44215A2、W002/060919A2, W003/074569A2、W004/016750A2, W004/029207A2, W004/035752A2, W004/063351A2, W004/074455A2,W004/099249A2, W005/040217A2, W004/044859, W005/070963A1, W005/077981A2,W005/092925A2、W005/123780A2, W006/019447AU W006/047350A2 和 W006/085967A2 ；US 專利公布 N0.US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603, US20070286859、US20080057056 ;或美國專利 5，648，260,5, 739，277,5, 834，250,5, 869，046,6, 096，871,6, 121，022,6, 194，551、6，242，195,6, 277，375,6, 528，624,6, 538，124,6, 737，056,6, 821，505,6, 998，253、7，083，784和7，317，091，其每一個通過弓I用并入本文。在一個實施方案中，特異性變化(例如，本領(lǐng)域公開的一個或多個氨基酸的特異性置換)可產(chǎn)生于一個或多個所公開的氨基酸位置。在另一實施方案中，可產(chǎn)生在一個或多個公開的氨基酸位置的不同變化(例如，本領(lǐng)域公開的一個或多個氨基 酸位置的不同置換)。在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽包含F(xiàn)e部分的氨基酸置換，其改變抗體的抗原非依賴型效應(yīng)子功能，尤其是抗體的循環(huán)半衰期。與缺失這些置換的多肽相比，這種多肽顯示出增加的或減少的與FcRn的結(jié)合，因此，其各自具有增加的或減少的在血清中的半衰期。預(yù)期具有增強的FcRn親和力的Fe變體具有較長的血清半衰期，且這種分子在治療哺乳動物的方法中具有有用的應(yīng)用，其中需要所施用的多肽的長半衰期，例如以治療慢性疾病或病癥(參見，例如美國專利7，348，004、7，404，956和7，862，820)。相反地，預(yù)期具有減弱的FcRn親和力的Fe變體具有較短的血清半衰期，且這種分子也是有用的(例如對于施用于哺乳動物)，其中縮短的循環(huán)時間可以是有利的，例如，用于體內(nèi)診斷性成像或在起始多肽在循環(huán)中存在長時間時具有毒性副作用的情況。具有減弱的FcRn結(jié)合親和力的Fe變體也不太可能穿過胎盤，且因此，其還用于孕婦的疾病或病癥治療。此外，需要降低的FcRn結(jié)合親和力的其他應(yīng)用包括需要定位腦、腎和/或肝的那些應(yīng)用。在一個示例性實施方案中，本發(fā)明的多肽顯示出從脈管系統(tǒng)穿過腎臟腎小球上皮細胞的輸送的減少。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽顯示出從腦穿過血腦屏障(BBB)進入血管容積的輸送的減少。在一個實施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合的多肽包含至少一個Fe部分(例如，一個或兩個Fe部分)，其具有Fe部分的“FcRn結(jié)合環(huán)”內(nèi)的一個或多個氨基酸置換。FcRn結(jié)合環(huán)由野生型全長Fe部分的氨基酸殘基280至299 (根據(jù)EU編號)組成。在其他實施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合親和力的本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分(例如，一個或兩個Fe部分)，其具有丨5 A丨“接觸區(qū)”內(nèi)的一個或多
個氨基酸置換。本文中使用的術(shù)語15 I FeRn“接觸區(qū)”包括野生型全長&部分的下述位置的殘基:243 至 261,275 至 280,282 至 293,302 至 319,336 至 348、367、369、372 至 389、391、393、408、424、425至440 (EU編號)。在優(yōu)選的實施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合親和力的本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分(例如，一個或兩個Fe部分)，其具有對應(yīng)于任何一個下述EU位置的氨基酸位置的一個或多個氨基酸置換:256、277至281、283至288、303至 309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如，N434A 或 N434K)和 438。具有改變的FcRn結(jié)合活性的示例性氨基酸置換在國際PCT公布N0.W005/047327中公開，其通過引用并入本文。本發(fā)明的多肽可還包含公認的改變多肽糖基化的氨基酸置換。例如，結(jié)合多肽的scFc區(qū)可包含具有突變的Fe部分，所述突變產(chǎn)生減少的糖基化(例如，N-或O-連接的糖基化)，或可包含野生型Fe部分的改變的糖形(例如，低巖藻糖或無巖藻糖聚糖)。在其他實施方案中，本發(fā)明的多肽包含至少一個Fe部分，所述Fe部分具有位于溶劑暴露表面的工程化的半胱氨酸殘基或其類似物。優(yōu)選地，工程化的半胱氨酸殘基或其類似物不干擾scFc區(qū)賦予的效應(yīng)子功能。更優(yōu)選地，所述改變不干擾scFc區(qū)與Fe受體(例如，F(xiàn)e Y R1、Fc YRII或Fe Y RIII)或補體蛋白(例如，Clq)的結(jié)合活性，或引發(fā)免疫的效應(yīng)子功能(例如， 抗體依賴型細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴型細胞毒性(CDCC))。在一個實施方案中，本發(fā)明的未處理的多肽可包含基因融合的Fe區(qū)(例如，scFc區(qū))，其具有兩個或多個獨立地選自本文描述的Fe部分的組成性Fe部分。在一個實施方案中，二聚體Fe區(qū)的Fe部分是相同的。在另一實施方案中，至少兩個Fe部分是不同的。例如，本發(fā)明的多肽的Fe部分包含相同數(shù)目的氨基酸殘基，或其長度不同相差一個或多個氨基酸殘基(例如，約5個氨基酸殘基(例如，1、2、3、4或5個氨基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基或約50個殘基)。在又一實施方案中，本發(fā)明的多肽的Fe部分在一個或多個氨基酸位置的序列不同。例如，至少兩個Fe部分在約5個氨基酸位置(例如，1、2、3、4或5個氨基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置或約50個位置不同。VL多肽接頭本文中使用的術(shù)語“多肽”是指肽或多肽序列(例如，合成的肽或多肽序列)，其連接多肽鏈的線性氨基酸序列中的兩個結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明多肽由核酸分子編碼，所述核酸分子編碼直接或間接連接兩個構(gòu)成所述構(gòu)建體的Fe部分的多肽接頭。這些接頭在本文中是指“scFc接頭”。如果scFc接頭在線性多肽序列中連續(xù)地連接兩個Fe部分，則其為“直接”連接。相反地，scFc接頭可將第一 Fe部分連接到結(jié)合部分,結(jié)合部分依次連接到第二 Fe部分，因此形成間接連接。這些scFc接頭(L)引起單鏈基因構(gòu)建體的形成。然而，在一個實施方案中，scFc多肽還包含導(dǎo)致可切割scFc接頭(cscFc接頭)的酶切位點,且在一個實施方案中，大體上切除(例如，細胞加工期間)。因此，加工的分子是二聚體分子，其包含至少兩個氨基酸鏈并大體上缺少外源性接頭氨基酸序列。在一些實施方案中，切除所有或基本上所有接頭，然而在一些實施方案中，切割位點的部分可保留，例如，RRRR切割位點的4個精氨酸。在另一實施方案中，多肽接頭的另一個類型(本文中指“間隔基”)可用于連接不同部分，例如，凝血因子或Fe部分的靶向部分。這種類型的多肽接頭可為多肽分子提供柔性。一般不切割間隔基，然而這種切割是可取的。附圖中示出了間隔基的示例性位置。間隔基可位于凝血因子、靶向部分和/或支架之間，例如，位于這些部分的N或C末端。在一個實施方案中，在加工過程中不去除這些接頭。可存在于本發(fā)明的嵌合凝血因子中的接頭的第三種類型是可切割的接頭，其包括切割位點(例如，因子XIa、Xa或凝血酶切割位點)且其可包括在切割位點的N末端或C末端或兩端的另外的間隔基接頭。這些可切割的接頭當(dāng)并入凝血因子時產(chǎn)生具有異源切割位點的嵌合分子。附圖中示出了 這些位點的示例性位置，且所述位置包括，例如，與靶向部分相鄰。在另一實施方案中，這種接頭可與凝血因子或其部分相鄰。例如，在一個實施方案中，可切割的接頭可融合到凝血因子重鏈的N末端以生成凝血因子的活性形式。在這種情況下，可切割的接頭可包括切割位點N末端的另外的間隔基接頭，但需要在切割位點C末端與凝血因子的重鏈的氨基端直接融合。本發(fā)明的未加工多肽包含兩個或更多個Fe結(jié)構(gòu)域或部分的多肽，所述Fe結(jié)構(gòu)域或部分通過cscFc接頭連接以形成包含于多肽單鏈的Fe區(qū)。cscFc接頭的兩側(cè)為至少一個酶切位點，例如，用于胞內(nèi)酶加工的位點。多肽在至少一個酶切位點的切割產(chǎn)生多肽，其包括至少兩個多肽鏈。在一個實施方案中，cscFc接頭任選地通過切割位點連接Fl或F2與，例如凝血因子。如上所陳述的，其他多肽接頭可任選地用于本發(fā)明的構(gòu)建體，例如，連接凝血因子或靶向部分與Fe部分。多肽接頭的一種類型在這里被稱為間隔基。可用于本發(fā)明的間隔基的一些示例性位置包括，例如，包含GlySer氨基酸的多肽，如附圖中所述和以下詳述的那些。在一個實施方案中，間隔基可與一個或多個部分相鄰，所述部分各自獨立地選自凝血因子、支架部分(例如Fe、切割位點)和靶向部分。在一個實施方案中，多肽接頭是合成的，例如，非天然存在的。在一個實施方案中，多肽接頭包括肽(或多肽)(其可以是天然存在的或非天然存在的)，其包含連接或基因融合第一氨基酸線性序列與第二氨基酸線性序列的氨基酸序列，其為非天然地連接或天然地基因融合。例如，在一個實施方案中，多肽接頭可包含非天然存在的多肽，其為天然存在的多肽的修飾形式(例如，包含突變，如添加、置換或刪除)。在另一實施方案中，多肽接頭可包含非天然存在的氨基酸。在另一實施方案中，多肽接頭可包含天然存在的氨基酸，其存在于不存在于自然界的線性序列。在又一實施方案中，多肽接頭可包含天然存在的多肽序列。例如，在某些實施方案中，多肽接頭可用于融合相同的Fe部分，因此形成同源scFc區(qū)。在其他實施方案中，多肽接頭可用于融合不同的Fe部分(例如，野生型Fe部分和Fe部分變體)，因此形成異源scFc區(qū)。在另一實施方案中，多肽接頭包含gly-ser接頭或由其組成。在一個實施方案中，scFc或cscFc接頭包含免疫球蛋白鉸鏈和gly-ser接頭的至少一部分。本文中使用的術(shù)語“gly/ser接頭”是指由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的肽。示例性的gly/ser接頭包含式為(Gly4Ser)n (SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，其中η為正整數(shù)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10)。優(yōu)選的 gly/ser 接頭為(Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 29), (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:6)或(Gly4Ser)6(SEQ ID NO:5)。另一個示例性的gly/ser接頭是GGGSSGGGSG(SEQ ID N0:30)。在某些實施方案中，所述gly-ser接頭可以在多肽接頭(例如，本文描述的任何多肽接頭)的兩個其他序列之間插入。在其他實施方案中，gly-ser接頭連接在多肽接頭(例如，本文描述的任何多肽接頭)的另一個序列的一端或兩端。在又一實施方案中，兩個或多個gly-ser接頭連續(xù)并入多肽接頭中。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽接頭包含上游鉸鏈區(qū)(例如，源自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分、中間鉸鏈區(qū)(例如，源自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分和一系列g(shù)ly/ser氨基酸殘基(例如，gly/ser接頭,如(Gly4Ser) n) (SEQ ID N0:4))。本發(fā)明的多肽接頭為至少一個氨基酸長且可具有不同長度。在一個實施方案中，本發(fā)明的接頭為約I個至約50個氨基酸長。如在本文中使用的，術(shù)語“約”+/_2個氨基酸殘基。由于接頭長度必須是正整數(shù)，其長度為約I個至約50個氨基酸長，是指長度為I到3個至48到52個氨基酸長。在另一實施方案中，本發(fā)明的接頭為約10至20個氨基酸長。在另一實施方案中，本發(fā)明的接頭為約15至約50個氨基酸長。在另一實施方案中，本發(fā)明的接頭為約20至約45個氨基酸長。在另一實施方案中，本發(fā)明的接頭為約15至約35或約20至30個氨基酸長。在另一實施方案中，本發(fā)明的接頭為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50 或 60 個氨基酸長。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽接頭為20或30個氨基酸長。可使用本領(lǐng)域的已知技術(shù)將多肽接頭引入到多肽序列中。可通過DNA序列分析確定修飾。可使用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞用于產(chǎn)生的多肽的穩(wěn)定制備。

VII1.酶切割位點在一個實施方案中，一個或多個酶切位點與例如側(cè)面相連接或與本發(fā)明的未加工的多肽cscFc接頭(L)相鄰。此類切割位點可在ccFc接頭的上游或下游或兩者。例如，在編碼本發(fā)明的多肽的構(gòu)建體的實施方案中，切割位點與cscFc接頭(L)的一個或兩個末端連接(例如，直接地或間接地)。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子具體指呈從氨基到羧基端的線性序列的由下式表示的多肽:A-Fl-P1-L-P2-B-F2 (I)其中A (如果存在)為凝血因子或其部分，F(xiàn)l為第一 Fe部分或結(jié)構(gòu)域，Pl為酶切位點，L為ScFc接頭，P2為酶切位點，B (如果存在)為凝血因子或其部分，F(xiàn)2為第二 Fe部分或結(jié)構(gòu)域且表示肽鍵。式(I)包含至少一個A或B及任選地兩個。A和B (如果都存在)可能為凝血因子對應(yīng)的重鏈和輕鏈。式(I)包含至少一個Pl或P2及任選地兩個。Pl和P2(如果都存在)可為相同的或不同的。式⑴包含至少一個Fl和F2。Fl和F2(如果都存在)可為相同的或不同的。在另一實施方案中，因子XIa或Xa切割位點可并入本發(fā)明的構(gòu)建體，例如，并入可切割的接頭中。示例性的FXIa切割位點包括，例如，TQSFNDFTR和SVSQTSKLTR。示例性的凝血酶切割位點包括，例如，DFLAEGGGVR、TTKIKPR、LVPRG(SEQ ID NO: 35)和 ALRPRVVGGA。其他有用的切割位點在本領(lǐng)域是已知的。在一個實施方案中，接頭的一些部分在至少一個酶切位點切割后可保留。為了使外來的氨基酸序列的存在降至最低，本發(fā)明的多肽可包括兩個切割位點。在一些實施方案中，所有或基本上所有接頭被切除，然而在一些實施方案中，切割位點的部分可保留，例如，RRRR切割位點的4個精氨酸。多肽的制備多種方法可用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合凝血因子。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明的嵌合蛋白的核酸序列。應(yīng)理解，由于密碼的簡并性，多種核酸序列將編碼多肽的氨基酸序列。所需的多核苷酸可通過重新的固相DNA合成或早期制備的多核苷酸的PCR誘變產(chǎn)生。寡核苷酸介導(dǎo)的誘變是用于制備置換，框內(nèi)插入，或改變(例如，改變的密碼子)以引入編碼氨基酸置換的密碼子(例如，到Fe變體部分)的一種方法。例如，通過使編碼所需突變的寡核苷酸與單鏈DNA模板雜交來改變起始多肽DNA。雜交后，使用DNA聚合酶合成模板的整個第二互補鏈，所述模板包含寡核苷酸引物。在一個實施方案中，基因工程，例如基于引物的PCR誘變，足以包含變化，如本文所定義的，用于制備編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸。對于重組制備，將編碼嵌合蛋白的多核苷酸序列插入到合適的表達載體中，例如，包含用于插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件，或在RNA病毒載體的情況下，用于復(fù)制和翻譯的必需元件的載體。將編碼嵌合蛋白的核酸插入到合適閱讀框中的載體。然后將表達載體轉(zhuǎn)染到將表達多肽的合適的靶細胞中。 本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)包括，但不限于，磷酸鈣沉淀(Wigler等，1978，Celll4:725)和電穿孔(Neumann等，1982，ΕΜΒ0，J.1:841)。可使用多種宿主表達載體系統(tǒng)表達真核細胞中本文中所述的嵌合蛋白。在一個實施方案中，真核細胞是動物細胞，包括哺乳動物細胞(例如，293細胞、？61^6、010、8皿、&^、抱1^細胞)。當(dāng)嵌合蛋白在真核細胞中表達時，編碼嵌合蛋白的DNA還可編碼使嵌合蛋白分泌的信號序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，在翻譯蛋白質(zhì)的同時信號序列被細胞切除以形成成熟的嵌合蛋白。各種信號序列在本領(lǐng)域是已知的，例如，天然因子VII信號序列、天然因子IX信號序列和小鼠IgK輕鏈信號序列?？蛇x地，不包含在嵌合蛋白中的信號序列可通過裂解細胞來恢復(fù)。本發(fā)明的嵌合蛋白可在轉(zhuǎn)基因動物中合成，如嚙齒類動物、山羊、綿羊、豬或牛。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”是指將外源基因并入其基因組的非人動物。由于這種基因存在于生殖細胞組織，其從親代傳遞到子代。外源基因被引入單細胞胚胎(Brinster等，1985，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:4438)。制備轉(zhuǎn)基因動物的方法在本領(lǐng)域是已知的，包括產(chǎn)生免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因?qū)W(Wagner 等，1981, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:6376 ；McKnight 等，1983，Cell34:335 ；Brinster 等，1983，Nature306:332;Ritchie 等，1984，Nature312:517 ；Baldassarre 等，2003，Theriogenology59:831 ；Rob;等，2003，Theriogenology59:107 ；Malassagne 等，2003, XenotransplantationlO (3): 267)。表達載體可編碼使重組產(chǎn)生的蛋白容易純化和識別的標簽。實例包括，但不限于，載體pUR278 (Ruther等，1983，EMBO J.2:1791)，其中本文所述的編碼序列的嵌合蛋白可框內(nèi)連接到具有l(wèi)ac z編碼區(qū)的載體中以生成雜合蛋白質(zhì)；pGEX載體可用于表達具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽的蛋白質(zhì)。通常這些蛋白質(zhì)是可溶的，且可通過谷胱甘肽-瓊脂糖小球的吸附及存在游離的谷胱甘肽下的洗脫而容易地從細胞純化。載體包括純化后易于去除標簽的切割位點(例如，PreCission蛋白酶(Pharmacia, Peapack, N.J.))。對于本發(fā)明的目的，可使用許多表達載體系統(tǒng)。這些表達載體作為游離基因或宿主染色體DNA的完整部分通常在宿主生物體內(nèi)是可復(fù)制的。表達載體可包括表達控制序列，其包括，但不限于，啟動子(例如，天然結(jié)合的或異源啟動子)、增強子、信號序列、剪接信號、增強子元件和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，表達控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)。表達載體還可使用源自動物病毒的DNA元件，所述病毒如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(RSV、MMTV或M0MLV)、巨細胞病毒(CMV)或SV40病毒。其他涉及具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點的多順反子系統(tǒng)的使用。通常，表達載體含有選擇標記(例如，氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)以允許檢測用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細胞(參見，例如，Itakura等，美國專利4，704，362)。可通過引入一個或多個可選擇轉(zhuǎn)染的宿主細胞的標記選擇將DNA整合到其染色體的細胞。 該標記可為營養(yǎng)缺陷型宿主、殺菌劑抗性(例如抗生素)或重金屬(如銅)抗性提供原養(yǎng)型。可選擇的標記基因能夠與被表達的DNA序列直接連接或通過共轉(zhuǎn)化引入到相同細胞中。優(yōu)選的表達載體是NE0SPLA(美國專利N0.6，159，730)。這個載體包含巨細胞病毒啟動子/增強子、小鼠β_球蛋白主要啟動子、SV40復(fù)制原點、牛生長激素多聚腺苷酸序列、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子I和外顯子2、二氫葉酸還原酶基因和前導(dǎo)序列。已發(fā)現(xiàn)這種載體在并入可變和恒定區(qū)基因、細胞中轉(zhuǎn)染及含有介質(zhì)和氨甲喋呤擴增的G418中的選擇后引起抗體很高水平的表達。載體系統(tǒng)還教導(dǎo)在美國專利號5，736，137和5，658，570中，其每一個都通過引用整體并入本文。該系統(tǒng)提供高表達水平，例如，>30pg/細胞/天。其他示例性載體系統(tǒng)在例如美國專利號6，413，777中公開。在其他實施方案中，本發(fā)明的多肽可使用多順反子構(gòu)建體來表達。在這些表達系統(tǒng)中，目標多基因產(chǎn)物如多聚體結(jié)合蛋白的多重多肽可由單個多順反子結(jié)構(gòu)體產(chǎn)生。這些系統(tǒng)有利地使用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)以提供真核宿主細胞中相對高水平的本發(fā)明的多肽。相容的IRES序列在美國專利號6，193,980中公開，其也并入本文。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認為這種表達系統(tǒng)可用于有效產(chǎn)生本應(yīng)用中公開的所有多肽。更普遍地，一旦制備編碼多肽的載體或DNA序列，可將表達載體引入到合適的宿主細胞。即可轉(zhuǎn)化宿主細胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種技術(shù)將質(zhì)粒引入到宿主細胞中。這些技術(shù)包括，但不限于，轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、包膜DNA的細胞融合、顯微注射及完整病毒的感染。參見，Ridgway, A.A.G."MammalianExpression Vectors//Chapter24.2, pp.470-472Vectors, Rodriguez 和 Denhardt 編輯(Butterworths, Boston, Mass.1988)。更優(yōu)選地,通過電穿孔將質(zhì)粒引入宿主。轉(zhuǎn)化細胞在適合制備輕鏈和重鏈的條件下生長，并測定重鏈和/或輕鏈蛋白合成。示例性的測定技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或熒光激活的細胞分選分析(FACS)、免疫組織化學(xué)等。
本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”應(yīng)在廣義上使用，是指DNA引入受體宿主細胞，所述細胞改變基因型且因此引起受體細胞中的變化。在這些相同的系之間，“宿主細胞”是指使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的并編碼至少一個異源基因的載體轉(zhuǎn)化的細胞。在描述多肽從重組細胞分離的過程中，可交換地使用術(shù)語“細胞”和“細胞培養(yǎng)物”以表示多肽來源，除非另有明確說明。換言之，多肽從“細胞”中的回收可指來自下旋的整個細胞或來自包含培養(yǎng)基和懸浮細胞的細胞培養(yǎng)物。用于蛋白表達的宿主細胞系最優(yōu)選為哺乳動物源；本領(lǐng)域的技術(shù)人員具有優(yōu)先確定最適于在其中表達的所需基因產(chǎn)物的特定宿主細胞系的能力。示例性的宿主細胞系包括但不限于DG44和DUXBlU中國倉鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宮頸癌)、CVI (猴腎臟系)、COS (具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中國倉鼠成纖維細胞)BALBC/3T3(小鼠成纖維細胞)、HAK(倉鼠腎臟系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63_Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-lclBPT (牛內(nèi)皮細胞)、RAJI (人體淋巴細胞)和293 (人體腎臟)。通常來自商業(yè)服務(wù)、美國組織培養(yǎng)物保藏或公布的文獻的宿主細胞系是可用的。在一個實施方案中，宿主細胞內(nèi)源性表達在形成成熟多肽的加工期間切割scFc接頭(例如，如果存在這種接頭且包含胞內(nèi)加工位點)所必需的酶。在此加工期間，scFc接頭可被大體上去除以減少外來氨基酸的存在。在本發(fā)明的另一實施方案中，宿主細胞被轉(zhuǎn)化以表達一種或多種對細胞異源的酶，從而發(fā)生scFc接頭的加工或?qū)⑵涓纳啤Ｔ谝粋€實施方案中，可由細胞內(nèi)源性或外源性表達的酶是弗林蛋白酶家族的成員。人弗林蛋白酶(即PACE)的完整cDNA和氨基酸序列在1990年公開。Van denOuweland A M 等，(1990)Nucleic Acids Res.18:664 ；Erratum in:Nucleic AcidsRes.18:1332(1990)。頒予Barr等的美國專利號5，460，950，描述了重組PACE及PACE與異源蛋白的基質(zhì)前體多肽的共表達以提高活性的，成熟的異源蛋白的表達。

頒予van de Ven等的美國專利號5，935，815,同樣描述了重組人弗林蛋白酶(即PACE)及弗林蛋白酶與異源蛋白的基質(zhì)前體多肽的共表達以提高活性的，成熟的異源蛋白的表達。這個專利中公開的可能的基質(zhì)前體包括因子IX的前體。除了 PACE，哺乳動物弗林蛋白酶/枯草桿菌蛋白酶/Kex2p-樣前蛋白轉(zhuǎn)化酶(PC)家族的其他家族成員被報導(dǎo)包括PC1/PC3、PC2、PC4、PC5/6 (下文中僅指 PC5)、PACE4 和 LPC/PC7/PC8/SPC7。雖然這些各種成員共有某些保守的整體結(jié)構(gòu)特點，但它們的組織分布、亞細胞定位、切割特異性和優(yōu)選基質(zhì)不同。關(guān)于綜述，參見Nakayama K(1997)Biochem J.327:625-35。與PACE相似，這些前蛋白轉(zhuǎn)移酶一般包括，從氨基端開始，信號肽、前肽(其可被自身催化地切割)、以Asp、His、Ser和Asn/Asp殘基為特征的枯草桿菌蛋白酶樣催化結(jié)構(gòu)域，以及對于催化活性也是必需的且以Arg-Gly-Asp (RGD)序列為特征的Homo B結(jié)構(gòu)域。PACE、PACE4和PC5還包括富含Cys的結(jié)構(gòu)域，其功能是未知的。此外，PC5具有含有及不含跨膜結(jié)構(gòu)域的同工型；這些不同的同工型分別被稱為PC5B和PC5A。PACE的催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與這個前蛋白轉(zhuǎn)移酶家族的其他成員的催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列之間的比較顯示以下同一性程度:PC4為70% ；PACE4 和 PC5 為 65% ；PC1/PC3 為 61% ；PC2 為 54% 且 LPC/PC7/PC8/SPC7 為 51%。NakayamaK(1997)Biochem J.327:625-35。已報導(dǎo)PACE和PACE4部分重疊但底物不同。特別是，PACE4 (與PACE相比顯著不同)已報導(dǎo)不能夠加工FIX的前體多肽。Wasley L C等，(1993) J Biol Chem.268:8458-65 ；Rehemtulla A 等,(1993)Biochemistry.32:11586-90o頒予Seidah等的美國專利號5，840，529，公開了人PC7的核苷酸和氨基酸序列及PC7的顯著活性(相比于其他PC家族成員)以切割HIV gpl60至gpl20和gp41。嚙齒類動物PC5的核苷酸和氨基酸序列首次被Lusson J等(1993) Proc Natl AcadSci USA90:6691-5 描述為 PC5，并且被 Nakagawa T 等，(1993) J Biochem(Tokyo) 113:132-5描述為PC6。頒予Day等的美國專利號6，380，171公開了人PC5A的核苷酸和氨基酸序列(為不含跨膜結(jié)構(gòu)域的同工型)。這些酶的序列和其克隆方法在本領(lǐng)域中是已知的。編碼本發(fā)明的多肽的基因還可在非哺乳細胞中表達，如細菌或酵母菌或植物細胞。在這方面，應(yīng)理解各種單細胞非哺乳動物的微生物如細菌也可被轉(zhuǎn)化，即能在培養(yǎng)基或發(fā)酵液中生長的那些。易于轉(zhuǎn)化的細菌包括腸桿菌科的成員，如大腸桿菌或沙門氏菌屬的菌株；芽胞桿菌科，如枯草芽孢桿菌；肺炎球菌屬；鏈球菌屬和流感嗜血桿菌。還可進一步理解，當(dāng)在細菌中表達時，多肽通常成為包涵體的部分。多肽必須被分離、純化且然后裝配到功能分子中。 除了原核生物，還可使用真核微生物。釀酒酵母或普通的面包酵母是真核微生物中最常使用的，雖然許多其他菌株通常是可用的。對于釀酒酵母中的表達，例如質(zhì)粒YRp7 是常用的(Stinchcomb 等，Nature, 282:39 (1979) ;Kingsman 等，Gene, 7:141 (1979)；Tschemper等，Gene, 10:157 (1980)) 這種質(zhì)粒已經(jīng)包含TRPl基因，其提供用于缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母的突變型菌株的選擇標記，例如ATCC N0.44076號或PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977))。作為酵母宿主細胞基因組的特征的trpl病變的存在然后提供了用于檢測缺乏色氨酸條件下生長的轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。還可使用其他酵母宿主如畢赤酵母屬。需要具有表達調(diào)控序列(例如，啟動子)的酵母表達載體、復(fù)制原點、終止序列等。示例性的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖解酶。誘導(dǎo)型酵母啟動子包括，來自醇脫氫酶、異細胞色素C和負責(zé)甲醇、麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子及其他?？蛇x地，多肽編碼核苷酸序列可并入轉(zhuǎn)基因中以引入到轉(zhuǎn)基因動物的基因組中并隨后在轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中表達(參見，例如，Deboer等，US5, 741，957，Rosen, US5, 304，489 和 Meade 等，US5, 849，992)。合適的轉(zhuǎn)基因包括與啟動子可操作連接的多肽的編碼序列和來自乳腺特異性基因的增強子，如酪蛋白或β -乳球蛋白。體外制備允許放大以產(chǎn)生大量所需多肽。在組織培養(yǎng)條件下用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，且包括均質(zhì)懸浮培養(yǎng)，例如，在氣升式反應(yīng)器或在連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，或固定的或包埋的細胞培養(yǎng)，例如，在中空纖維中、微膠囊中、瓊脂糖微珠或陶瓷筒上培養(yǎng)。如果有必要和/或如果需要，多肽溶液可通過常規(guī)的色譜法純化，例如，凝膠過濾、離子交換色譜法、DEAE-纖維素色譜或(免疫_)親和色譜法，例如，合成的鉸鏈區(qū)多肽的優(yōu)先生物合成之后或本文中描述的HIC色譜步驟之前或之后。親和標簽序列(例如，His (6)標簽)可任選地與多肽序列結(jié)合或包括在其內(nèi)以促進下游純化。在一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞包含編碼含有scFc支架的多肽的基因構(gòu)建體和一種或多種能夠加工cscFc接頭的酶。可使用單個載體或兩個載體表達所述構(gòu)建體和酶。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽的核酸分子。在一個實施方案中，核酸分子編碼嵌合凝血因子，該嵌合凝血因子選自FVI1、FIX和FX并且包含與血小板結(jié)合的靶向部分和任選地凝血因子和靶向部分之間的間隔基部分。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及編碼包含F(xiàn)VII的多肽的核酸分子，其中FVII包含可通過凝血級聯(lián)的組分活化的異源性酶切位點。一旦表達，嵌合凝血因子可通過本領(lǐng)域的標準程序純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱色譜法、HPLC純化、凝膠電泳等(一般參見Scopes, ProteinPurification (Springer-Verlag, N.Y.，(1982))并特異性地參見用于實施例的方法。具有至少約90%至95%的同質(zhì)性的大體上純的蛋白質(zhì)是優(yōu)選的，且具有98%至99%或更多的同質(zhì)性的大體上純的蛋白質(zhì)是最優(yōu)選的，其用于藥物用途。IX.施用本發(fā)明多肽的方法在另一實施方案中，本發(fā)明涉及治療具有止血障礙的受試者的方法，其包括施用治療有效量的本發(fā)明的增強的嵌合凝血因子。施用給受試者的組合物包括核酸分子和多肽分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明的嵌合凝血因子(用于基因治療)以及多肽分子的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的增強的凝血因子組合物與至少一種其他促進止血的試劑聯(lián)合施用。所述其他促進止血的試劑是證明具有凝血活性的治療劑。例如，但不作為限制，止血劑可包括因子V、因子VI1、因子VII1、因子IX、因子X、因子X1、因子XI1、因子XII1、凝血酶原、或纖維蛋白原或前述任何一種的活性形式。止血劑的凝血因子還可包括抗纖維蛋白溶解藥物，例如，ε氨基己酸、氨甲環(huán)酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物(例如，多肽或編碼多肽的核酸分子)是當(dāng)施用給受試者時凝血因子以活性形式存在的組合物。這種活化分子可被細胞以活性形式表達或可在施用給受試者之前體外活化。在另一實施方案中，組合物是其中凝血因子以活化形式存在且凝血因子在施用給 受試者后在凝血位點被體內(nèi)活化的組合物。本發(fā)明的嵌合凝血因子可靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)施用，或通過任何粘膜表面施用，如口服、舌下、經(jīng)頰、舌下、鼻腔、直腸、陰道或經(jīng)肺途徑施用。嵌合蛋白可被植入到生物聚合物固相載體內(nèi)或與其連接，所述載體能使嵌合蛋白緩慢釋放至所需位點。對于口服施用，藥物組合物可采用通過常規(guī)方法制備的片劑或膠囊的形式。組合物還可制成液體，例如糖漿或懸浮液。液體包括懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用油脂)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯樹膠)、非水相媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾的植物油)及防腐劑(例如，對羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯或山梨酸)。制劑還可包括調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。可選地，組合物可以供水或其他合適媒介物重構(gòu)的干品提供。對于頰和舌下施用，組合物可采用根據(jù)常規(guī)方法制備的片劑、錠劑或速溶薄膜片的形式。對于通過吸入施用，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物以氣溶膠噴霧劑形式用合適的推進劑從加壓包裝或霧化器(例如，PBS中)方便地遞送，所述推進劑例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供遞送計量數(shù)量的閥門確定劑量單位。例如吸入器或吹入器中使用的明膠的膠囊和藥筒可配制成含有化合物和合適的粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽的施用途徑是腸胃外施用。本文中使用的術(shù)語腸胃外包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸或陰道的施用。腸胃外施用的靜脈內(nèi)形式是優(yōu)選的。盡管所有這些施用形式都清楚地涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是施用形式將為用于注射的溶液，特別是用于靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合適的藥物組合物可包含緩沖液(例如，乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液)、表面活性劑(例如，多山梨醇酯)、任選地穩(wěn)定劑(例如，人白蛋白)等。然而，在其他與本文教義相容的方法中，多肽可直接遞送到不利細胞群體的位點，從而增加患病組織對治療劑的暴露。用于腸胃外施用的制劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖基質(zhì)。在本發(fā)明中，藥學(xué)上可接受的載體包括，但不限于，0.01至0.1M且優(yōu)選為0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8%鹽水。其他常見的腸胃外媒介物包括磷酸鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏(液)或非揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒介物包括液體和營養(yǎng)物補充劑、電解質(zhì)補充劑，如基于林格氏葡萄糖的那些物質(zhì)等。也可存在防腐劑和其他添加劑，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。更特別地，適于注射使用的藥物組合物包括無菌水性溶液(即水溶性)或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的無菌粉末。在這種情況下，組合物必須是無菌的且應(yīng)該是流體以達到容易注射的程度在制備和儲存條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的且優(yōu)選地保存在防止微生物(如細菌和真菌)污染的條件下。載體可為溶劑和分散介質(zhì)，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物?？杀３诌m當(dāng)?shù)牧鲃有?，例如，通過使用包衣劑如卵磷脂、通過在分散的情況下保持所需的顆粒大小及通過使用表面活性劑?？赏ㄟ^各種抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等實現(xiàn)對微生物作用的預(yù)防。在許多情況下，可優(yōu)選地包括等滲劑，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇或組合物中的氯化鈉。可通過組合物中包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)引起可注射組合物的延長吸收。在任何情況下，可通過將所需量的活性化合物(例如，自身或與其他活性劑組合的多肽)與本文列舉的成分中的一種或其組合在適當(dāng)溶劑中結(jié)合，根據(jù)需要，接著過濾滅菌來制備無菌可注射溶液。通常，通過將活性化合物并入無菌媒介物中制備分散劑，所述無菌媒介物包含基本的分散介質(zhì)和上述列舉的所需的其他成分。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分和任何其他所需成分(來自其之前經(jīng)無菌過濾的溶液)的粉末。將用于注射的制劑加工、裝入容器(如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶)中并根據(jù)本領(lǐng)域已知方法在無菌條件下密封。此外，可將制劑包裝并以試劑盒的形式銷售。此類制品將優(yōu)選地具有標簽或包裝插入物，其表明用于治療患有或易患凝血障礙的受試者的相關(guān)組合物。藥物組合物還可配制成為用于直腸施用的栓劑或保留灌腸劑，例如，包含常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯。用于治療條件的本發(fā)明組合 物的有效劑量，取決于多種不同因素，包括施用方法、革巴點、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動物、施用的其他藥物及治療是否為預(yù)防性的或治療性的。通常，患者是人而不是非人哺乳動物(包括也可被治療的轉(zhuǎn)基因哺乳動物)。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法滴定治療劑量以優(yōu)化安全性和效力。在一個實施方案中，生物活性部分(例如，包含F(xiàn)IX)的劑量的范圍可為25至100IU/kg,例如,0.417mg/kg至1.67mg/kg。在另一實施方案中，生物活性部分(例如,包含F(xiàn)VI11)的劑量的范圍可為 25 至 65IU/kg，例如，0.003125mg/kg 至 0.008125mg/kg。在另一實施方案中，生物活性部分(例如，包含F(xiàn)VII)的劑量的范圍可為90至2701^/1^或0.090至 0.270mg/kg。劑量的范圍可為1000ug/kg至0.lng/kg體重。在一個實施方案中，給藥范圍為lug/kg至100ug/kg。蛋白可連續(xù)施用或在特定時間間隔施用?？墒褂皿w外試驗確定最佳劑量范圍和/或施用計劃表。測量凝血因子活性的體外測定是本領(lǐng)域已知的，例如，STA-CLOTVlla-rTF凝血試驗。此外，可由動物模型(例如，患血友病的狗)獲得的劑量響應(yīng)曲線推算有效劑量(Mount 等，2002, Blood99 (8): 2670)。上述范圍的中間劑量也將在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢悦刻?、在可選天、每周或根據(jù)經(jīng)驗分析確定的任何其他計劃表施用給受試者。示例性的治療需要長時期的多劑量施用，例如,至少6個月。在一些方法中，可同時施用兩種或多種多肽，在這種情況下施用的每種多肽的劑量落入顯示的范圍內(nèi)。本發(fā)明的多肽可在多重情況下施用。單劑量之間的間隔可以是每天、每周、每月或每年。間隔也可為不規(guī)律的，通過測量患者中的修飾的多肽或抗原的血液水平表示?？蛇x擇地，可將多肽作為緩釋制劑施用，在這種情況下需要較低頻率的施用。劑量和頻率取決于患者中多肽的半衰期而改變。施用的劑量和頻率可根據(jù)治療是預(yù)防性的還是治療性的而改變。在預(yù)防性應(yīng)用中，將包含本發(fā)明多肽或其混合物的組合物施用給尚未在疾病狀態(tài)的患者以增強患者的抵抗力或最大限度地減少疾病的影響。這種數(shù)量定義為“預(yù)防性的有效劑量”。在長周期內(nèi)在相對不頻繁的間隔施用相對低的劑量。一些患者在其余生繼續(xù)接受治療。

本發(fā)明的多肽可任選地與其他試劑聯(lián)合施用，所述其他試劑有效地治療需要治療(例如，預(yù)防性或治療性的)病癥或疾患。如本文中使用的，與輔助療法結(jié)合或組合的本發(fā)明的多肽的施用是指順序的、同時的、同范圍的、共時發(fā)生的、伴隨的或同時期的施用或應(yīng)用療法和公開的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，組合的治療方案的各種組分的施用或應(yīng)用可定時的，以增加整體治療效果。技術(shù)人員(例如，內(nèi)科醫(yī)生)能夠容易地辨別有效的組合治療方案而不需要基于選擇的輔助治療和本說明書內(nèi)容的教義進行過度實驗。將進一步理解，本發(fā)明的多肽可用于與一種或多種試劑結(jié)合或組合(例如，以提供組合的治療方案)。可與本發(fā)明的多肽結(jié)合的示例性試劑包括表示護理正在治療的特定病癥的現(xiàn)行標準的試劑。這種試劑性質(zhì)上可為化學(xué)的或生物的。術(shù)語“生物的”或“生物試齊IJ”是指由生物體和/或其預(yù)期用作治療劑的產(chǎn)物制成的藥物活性劑。用于與本發(fā)明的多肽結(jié)合的試劑的量可根據(jù)受試者而改變或根據(jù)本領(lǐng)域已知的方面來施用。參見例如，Bruce A Chabner 等,Antineoplastic Agents, G00DMAN&GILMAN' STHE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS1233-1287 ((Joel G.Hardman 等編輯，第 9版1996)。在另一實施方案中，施用與護理標準一致的這種試劑的數(shù)量。
如前所述，可施用藥學(xué)上有效量的本發(fā)明的多肽用于體內(nèi)治療凝血障礙。在這方面，應(yīng)理解，可將本發(fā)明的多肽配制成容易施用并促進穩(wěn)定的活性劑。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的、無毒的、無菌載體如生理鹽水，無毒的緩沖液、防腐劑等。當(dāng)然，可以單劑量或多劑量施用本發(fā)明的藥物組合物以提供藥學(xué)有效量的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子可作為核酸分子施用。可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)施用核酸分子，所述技術(shù)包括通過載體、質(zhì)粒、脂質(zhì)體、DNA導(dǎo)入、電穿孔、基因槍、靜脈注射或肝動脈灌注。用于基因治療實施方案的載體在本領(lǐng)域是已知的。按照本公開的范圍，可根據(jù)前述治療方法，以足夠產(chǎn)生治療性或預(yù)防性效果的數(shù)量將本發(fā)明的嵌合凝血因子施用給人或其他動物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，本發(fā)明的嵌合蛋白具有很多用途，包括但不限于治療患有疾病或疾患的受試者的方法。所述疾病或疾患可包括但不限于止血障礙。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療患有止血障礙的受試者的方法，所述方法包括施用有效量的至少一種本發(fā)明的嵌合凝血因子。本發(fā)明的嵌合凝血因子通過促進纖維蛋白血塊形式來治療或預(yù)防止血障礙。本發(fā)明的嵌合凝血因子可活化凝血級聯(lián)系統(tǒng)的任何成員。凝血因子可參與外源性途徑、內(nèi)源性途徑或兩者。本發(fā)明的嵌合凝血因子可用于治療止血障礙，例如已知可用于存在于嵌合凝血因子中的特定凝血因子治療的止血障礙?？赏ㄟ^本發(fā)明的嵌合蛋白的施用來治療的止血障礙包括但不限于血友病A、血友病B、血管性血友病、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、以及纖維蛋白原、凝 血酶原、因子V、因子VI1、因子X或因子XIII中的缺乏或結(jié)構(gòu)異常。在一個實施方案中，止血障礙為遺傳性病癥。在一個實施方案中，該受試者患有血友病A，并且嵌合蛋白包括因子VII或因子Villa。在另一個實施方案中，受試者患有血友病A并且嵌合凝血因子包含因子VII或因子Vila。在另一個實施方案中，受試者患有血友病B并且嵌合凝血因子包含因子IX或因子IXa。在另一個實施方案中，受試者患有血友病B并且嵌合蛋白包含因子VII或因子Vila。在另一個實施方案中，受試者患有因子VII或因子VIIIa的抑制性抗體并且嵌合凝血因子包含因子VII或因子Vila。在又一個實施方案中，受試者患有針對因子IX或因子IXa的抑制性抗體并且嵌合蛋白包含因子VII或因子VIIa0本發(fā)明的嵌合凝血因子可用于預(yù)防性治療患有止血障礙的受試者。本發(fā)明的嵌合凝血因子可用于治療患有止血障礙的受試者的急性出血事件。在一個實施方案中，止血障礙是凝血因子例如因子IX、因子VIII的結(jié)果。在另一個實施方案中，止血障礙可以是缺陷性凝血因子的結(jié)果。在另一個實施方案中，止血障礙可以是后天獲得性障礙。后天獲得性障礙可由潛在的繼發(fā)性疾病或疾患引起。無關(guān)的疾患可以是，舉例而言，但不作為限制，癌癥、自身免疫性疾病或妊娠。后天獲得性障礙可由年老或由治療潛在的激發(fā)性病癥的藥物治療(例如癌癥化療)引起。本發(fā)明還涉及治療未患有止血障礙或?qū)е芦@得止血障礙的繼發(fā)性疾病或疾患的受試者的方法。本發(fā)明因此涉及治療需要一般止血劑的受試者的方法，其包括施用治療有效量的至少一種本發(fā)明的嵌合凝血因子。例如，在一個實施方案中，需要一般止血劑的受試者正進行或?qū)⒁M行手術(shù)。本發(fā)明的嵌合凝血因子可作為預(yù)防劑在手術(shù)之前或之后施用。本發(fā)明的嵌合凝血因子可在手術(shù)期間或之后施用以控制急性出血事件。手術(shù)可包括但不限于肝移植、肝切除術(shù)或干細胞移植。在另一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合凝血因子可用于治療患有急性出血事件但未患有止血障礙的受試者。急性出血事件可由嚴重創(chuàng)傷引起，例如手術(shù)、汽車事故、損傷、裂傷槍射擊或任何其它導(dǎo)致無法控制的出血的創(chuàng)傷事件。本發(fā)明通過以下實施例進一步說明，所述實施例不應(yīng)理解為限制。本申請引用的所有文獻、專利和公布的專利申請的內(nèi)容通過引用并入本文。
實施例除非另有說明，否則整個實施例中使用以下材料和方法。一般材料和方法一般而言，除非另有說明，否則本發(fā)明的實施采用化學(xué)、生物物理學(xué)、分子生物學(xué)、DNA重組技術(shù)，免疫學(xué)(特別是，例如抗體技術(shù))的常規(guī)技術(shù)，以及電泳中的標準技術(shù)。參見，例如，Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning:ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989) ；Antibody Engineering Protocols(Methodsin Molecular Biology),510,Paul, S., Humana Pr(1996) ；Antibody Engineering:APractical Approach (Practical Approach Series, 169)，McCafferty 編輯，Irl Pr (1996)；Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow 等，CS.H.L.Press, Pub.(1999)；和 CurrentProtocols in Molecular Biology 編輯 Ausubel 等，John Wiley&Sons (1992)。

實施例1.在第二 Fe鏈的氨基端包含F(xiàn)VI1-Fc和MB9_Fc的異源二聚體構(gòu)建體pSYN-FVI 1-027 的克降FVI1-027構(gòu)建體包含在細胞中制備的過程中加工時用于切割的cscFc。該構(gòu)建體包含靶向部分，與GPIIbIIIa結(jié)合的scFv部分，MB9。生成用于表達FVI1-Fc和MB9_Fc異源二聚體的質(zhì)粒(pSYN-FVI1-027)，其中MB9是之前示出的與活化血小板上的受體GPIIb/IIIa結(jié)合的scFv。來自pSYN-FVI1-027的蛋白在細胞中表達為單一的多肽，其中FVI1-Fc亞基的C-末端通過(GGGGS)6x多肽接頭與MB9-Fc亞基的N-末端連接。此外，將RRRRS和RKRRKR序列分別插入到多肽接頭的5’端和3’端，以用于被每個序列的最后一個精氨酸后面的前蛋白轉(zhuǎn)化酶胞內(nèi)切割。因此，細胞將表達雙鏈FVI1-Fc/MB9-Fc異源二聚體，其中FVI1-Fc鏈在C-末端具有RRRRS序列，但接頭的其余部分和RKRRKR序列以其他方式被除去。作為第一步，使用以下引物生成一系列中間質(zhì)粒:Hindlll-Sal1-BpsE1-Fc-FAGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACCBamH1-接頭-Fc-RCATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGBcl I—Fc-FCAGTCTTGATCAGACAAAACTCACACATGCCCACC
BcFc-EccB1-RACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGCCAGHindiI1-Kozak-FVI1-F:CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGFVI1-HC-BspE1-R:AGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG使用以下循環(huán)用25pmol HindII1-Sall-BpE1-Fc-F、BamH1-接頭-Fc-R 和模板pSYN-Fc-001 進行 50ul PCR 反應(yīng):95°C 2 分鐘；30 個循環(huán)(95°C 30 秒，54°C 30 秒，72°C I 分鐘)。用凝膠回收試劑盒(Qiagen, Valencia, Calif.)凝膠純化預(yù)期大小的條帶C700bp),并將其克隆到 pBUDCE4(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)的 HindIII 和 BamHI 限制性位點以生成中間體 pSYN-FVI1-007。引物 Hindi I 1-Sal 1-BpE1-Fc-F 和 BamH1-接頭-Fc-R 擴增起始于氨基酸221 (EU編號)的Fe區(qū)，并添加緊挨在位點Fe區(qū)的上游的HindIII和SalI限制性酶位點，及編碼(GGGGS)4x接頭的DNA片段，后面是緊挨在Fe編碼區(qū)下游的BamHI 位點。然后，用 25pmol Bcl1-FC-F, scFc-EcoR1-R 和模板 pSYN-Fc-Oll 使用與上面相同的循環(huán)進行50ul反應(yīng)。如上述凝膠純化預(yù)期大小的條帶Γ70(Λρ)，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI切割，并克隆到pS YN-FVI1-007的BclI/EcoRI限制位點中以生成中間質(zhì)粒pSYN-FVI1-008。引物對Bcl1-Fc-F和scFc-EcoR1-R擴增Fe區(qū)，同時添加分別緊挨在Fe編碼區(qū)的上游和下游的BclI和EcoRI限制性位點。為了生成最后一個中間質(zhì)粒，用25pmolHindi I 1-Kozak-FVI 1-F, FVI 1-HC-BspE1-R 和模板 pSYN-FVI1-OOl 使用以下循環(huán)進行50ulPCR反應(yīng):95°C2分鐘;30個循環(huán)(95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 90秒)。引物對擴增FVII編碼區(qū)，同時添加位于編碼(GGGGS)6x多肽接頭的分子3’端的DNA片段，后面是終止于氨基酸221 (EU編號)的Fe區(qū)片段。弓丨物Hindll1-Kozak-FVI1-F產(chǎn)生位于分子5’端的HindIII限制性酶切位點，所述分子后面是緊挨在FVII編碼區(qū)上游的Kozak序列。FVI1-HC-BspE1-R引物引入編碼多肽接頭的DNA和Fe部分。如上述凝膠純化預(yù)期大小的條帶Γ 50(Λρ)，并將其克隆到 pSYN-FVI1-008 的 Hindlll/BspEI 位點以生成 pSYN-FVI1-Oll。然后，合成兩個DNA 片段:Genescr ipt-FVI1-027-l 和 Genscr ipt-FVI1-026-2。Genescript-FVI1-027-l由編碼Fe區(qū)的部分(起始于核苷酸1306，EU編號)的DNA片段組成，所述Fe區(qū)的部分后面是序列RRRRS-(GGGGS) 6x-RKRRKR (其后面是MB9scFv的部分(殘基1-142))。使用遺傳密碼的簡并性將EcoRI位點引入MB9的編碼序列中以保持合適的氨基酸序列并與Genescript-FVI1-027-l的最后6個堿基重疊。此外,位于5’端的前6個堿基包括存在于Fe區(qū)內(nèi)的SapI位點。Genscript-FVI1-026-2由編碼MB9的部分(殘基143-273)的DNA片段組成，所述MB9的部分后面是(GGGGS) 6x多肽接頭(其后面是Fe區(qū)和EcoRI位點)。使用遺傳密碼的簡并性將EcoRI位點引入MB9的編碼序列中以保持合適的氨基酸序列并與Genescript-FVI1-026-2的前6個堿基重疊。將Genescript-FVI1-027-l 克隆到 pSYN-FVI1-Oll 的 SapI 和 EcoRI 位點以生成pSYN-FVI1-036。接下來，將 Genscript-FVI1-026-2 克隆到 pSYN-FVI1-036 的 EcoRI 位點以生成pSYN-FVI1-027。限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序證實了最后的克隆步驟的正確方向。
實施例2.在第二 Fe鏈的羧基端包含F(xiàn)VI1-Fc和MB9_Fc、MB9的異源二聚體構(gòu)建體FVI1-037 的克降使用加工期間未被切割的scFc支架制備FVI1-037構(gòu)建體。在該構(gòu)建體中，將靶向部分、然后結(jié)合GPIIbIIIa的MB9scFv連接到第二 Fe部分的C-末端。DNA片段Genscript-FVI1-037的合成是外包的(Genscript)。該片段包含F(xiàn)e區(qū)的部分(殘基434至447，EU編號)，其后面是(GGGGS)4x多肽接頭和MB9scFv。將Genscript-FVI1-037 的 SapI/EcoRI 片段亞克隆到 pSYN-FVI1-Oll (指 P0830)的 SapI/EcoRI以生成中間構(gòu)建體。將來自pSYN-FVI1-Oll的SapI片段亞克隆到中間構(gòu)建體的SapI位點以生成pSYNFVI1-037。實施例3.包含F(xiàn)VI1-Fc和在第二 Fe鏈的C末端緊靠GPIb的肽的異源二聚體構(gòu)建體pSYN-FVI 1-041中間構(gòu)律體的克降為了制備這種構(gòu)建體，首先將FVI1-041構(gòu)建體制備為中間體。DNA分子Genscript-FVI1-041的合成是外包的(Genscript)。用SapI消化該片段并將其克隆pSYN-FVI1-011的SapI位點以生成pSYN-FVI1-041。該過程在第二 Fe引入唯一的SalI位點(殘基 412-413EU 編號，GTG GAC 至 GTC GAC)。pSYN-FVI1-044-.-Q45 和-046 的克降將FVI1-041構(gòu)建體用作起始材料以生成幾種包含靶向部分的構(gòu)建體，所述靶向部分是與GPIb結(jié)合的肽。在-044構(gòu)建體中使用PS4肽，-045構(gòu)建體中使用OSl肽，-046構(gòu)建體中使用0S2肽。在這些構(gòu) 建體中使用scFc支架并且肽通過接頭與第二 Fe部分的C-末端連接。Genscript-FVI 1~044> -045 和-046 的合成是外包的(Genscript)。這些DNA片段被Sall/EcoRI切割并亞克隆到pSYN-FVI 1-041的Sall/EcoRI位點以生成pSYN-FVI1-044、-045 和-046。實施例4.包含F(xiàn)VI1-Fc和在第二 Fe鏈的C末端緊靠GPIb的肽的異源二聚體構(gòu)建體pSYN-FVI 1-043 中間體的克降為了制備這種構(gòu)建體，首先將FVI1-043結(jié)構(gòu)制備為中間體。DNA片段Genscript-FVI1-043的合成是外包的(Genscript)。該片段包含編碼Fe區(qū)的部分(殘基232至447，EU編號)的DNA分子，所述Fe區(qū)的部分的后面是(GGGGS) 4x多肽接頭和Fe區(qū)的另一個部分(殘基221至238，EU編號)。用BspEI和RsrII消化該DNA片段并將其亞克隆到pSYN-FVI1-042的BspEI/RsrII位點以生成pSYN-FVII_050。該過程在第一 Fe中引入唯一的 SalI 位點(殘基 412-413，EU編號，GTGGAC 至 GTC GAC)。將 pSYNFVI1-050 的 HindIII/EcoRI 片段亞克隆到 pSYN-FVI1-011 的 Hindlll/EcoRI 位點以生成 pSYN-FVI1-043。pSYN-FVI 1-047.-Q48 和-049 的克降將FVI1-043構(gòu)建體用作起始材料以生成幾種包含靶向部分的構(gòu)建體，所述靶向部分是與GPIb結(jié)合的肽。在-047構(gòu)建體中使用PS4肽，-048構(gòu)建體中使用OSl肽，-049構(gòu)建體中使用0S2肽。在這些構(gòu)建體中使用scFc支架且將肽在scFc接頭和與第二 Fe部分的N-末端連接的接頭之間插入。DNA 分子 Genscript-FVI1-047、-048 和-049 的合成是外包的(Genscript)。將來自 Genscript-FVI1-047、-048 和-049 的 Sal/RsrII 片段亞克隆到 pSYN-FVI1-043 的 SalI/RsrII 位點以分別產(chǎn)生 pSYN-FVI1-047、-048 和-049。實施例5.包含Gla缺失的FVI1-Fc和靶向分子的異源二聚體構(gòu)建體FVI1-028中間體的克降為了制備這種構(gòu)建體，首先將FVI1-028構(gòu)建體制備為中間體。DNA片段Genscript-FVI 1-028的合成是外包的(Genscript)。用Hindlll/Xbal切割該片段并將其亞克隆到 pSYN-FVI1-011 以生成 pSYN-FVI1-028。FVI1-053 的克降將FVI1-028構(gòu)建體用作起始材料以生成包含靶向部分且使用缺少Gla結(jié)構(gòu)域的凝血因子的構(gòu)建體。對于這種構(gòu)建體，將氨基酸I至35從FVII移除并在殘基R152 (WT FVII編號)后添加RKRRKR插入物以促進細胞內(nèi)活化。MB9scFv用作靶向部分。DNA分子Genscript-FVI 1-025被外包并且來自該分子的Xbal/BsiWI片段亞克隆到 pSYN-FVI1-028 的 Xbal/BsiWI 位點以生成 pSYN-FVI1-053。實施例6.包含作為兩個單獨的多肽的因子VII重鏈和輕鏈的異源二聚體構(gòu)建體pSYN-FVI 1-024中間構(gòu)律體的克降在FVI1-024構(gòu)建體中，因子FVII的重鏈和輕鏈在單鏈分子中是不鄰接的。該構(gòu)建體使用cscFc以使cscFc接頭在反式-高爾基體網(wǎng)絡(luò)中被蛋白酶切割。這種切割導(dǎo)致接頭去除及FVII活化，導(dǎo)致活化的FVIIaFc的表達。使用以下引物通過與聚合酶鏈反應(yīng)偶聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄作用從人肝臟mRNA庫(Ambion, Austin, Texas)獲得 FVII 的編碼序列:FVI1-FlGGGAATGTCAACAGGCAGGGFVI1-RlCTTGGCTTTCTCTCCACAGGC根據(jù)制備商的標準方案使用具有Platinum Taq系統(tǒng)的Superscript One-stepRT-PCR(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)在MJ溫度循環(huán)器中用IOpmol每種引物的進行50 μ I反應(yīng)。使用的循環(huán)為50°C逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，然后在94°C變性2分鐘，和30個循環(huán)(94 0C 30 秒，53°C 30 秒，72°C 90 秒)，后面是 72 °C 10 分鐘。使用 Gel Extraction 試劑盒(Qiagen, Valencia, Calif.)凝膠純化預(yù)期大小的條帶Cl400bp)并使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)將其克隆到pCR2.1T0P0中以生成中間質(zhì)粒pSYN-FVI1-001。為了構(gòu)建用于表達雙鏈FVI1-Fc和Fe異源二聚體的質(zhì)粒，使用以下引物將FVII編碼序列PCR擴增:Hindll1-Kozak-FVI1-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGBspe1-Fc-FVI1-RCGACTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGGAAATGGGGCTCGCAGG正向引物Hindlll-Kozak-FVI1-F添加了 HindIII限制性位點，其后面是緊挨在FVII編碼區(qū)上游的Kozak序列。反向引物Bspe1-Fc-FVI1-R添加了 IgGl (Fe區(qū))恒定區(qū)的片段，所述IgGl包含氨基酸221-233 (EU編號)。該過程還利用遺傳密碼的簡并性在氨基酸231-233并入BspEI限制性位點以保持正確的氨基酸序列(EU編號)。根據(jù)制備商的方案使用Platinum PfxDNA聚合酶系統(tǒng)在MJ溫度循環(huán)器中使用以下循環(huán)用15pmol每種引物和模板pSYN-FVI1-001進行50ul反應(yīng):95°C 2分鐘；30個循環(huán)(95°C 15秒，49°C 30秒，68°C90 秒)；68°C 10 分鐘。用 HindIII 和 BspEI 消化質(zhì)粒 pSYN_FIX_027 (pBUD FIXFc/Fc)并用Gel Extraction試劑盒(Qiagen, Valencia, Calif.)純化載體的預(yù)期大小的條帶(大約5800bp)以除去FIX插入物(預(yù)期大小的條帶大約1480bp)。接下來，在移除FIX插入物后將PCR-擴增的FVII序列亞克隆到源自pSYN-FIX-027的載體的HindIII和EcoRI位點。這生成pSYN-FVI1-002 (pBUD FVIIFc/Fc)。接下來，使用以下引物將(GGGGS) 6x多肽接頭添加到pSYN-FVI1-002中的FVII和Fe區(qū)編碼序列之間:FVI1-接頭-F:CATCCCCAGCACGTACGTCCFVI1-接頭-R:GGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGFe-接頭-F:GACAAAACTCACACATGCCCACCFe-接頭-R:
GCAGAATTCTCATTTACCCGGAG根據(jù)制備商的標準方案使用Expand High Fidelity System(BoehringerMannheim, Indianapolis, Ind.)在 MJ 溫度循環(huán)器中用 12pmol FVI1-接頭-F 和 FVI1-接頭-R (反應(yīng)I)或Fe-接頭-F和Fe-接頭-R (反應(yīng)2)進行兩個12 μ I PCR反應(yīng)。使用以下循環(huán)用I μ g pSYN-FVI 1-002作為模板進行第一和第二反應(yīng):94°C 2分鐘；14個循環(huán)(94°C 30秒，55°C 30 秒，72°C 2 分鐘)；72°C 10 分鐘。用 Gel Extraction 試劑盒(Qiagen, Valencia,Calif.)凝膠純化預(yù)期大小的條帶(反應(yīng)I為532bp，反應(yīng)2為670bp)，然后將其在PCR反應(yīng)中與如前所述的25pmol FVI1-接頭-F和Fe-接頭-R結(jié)合，但進行30輪擴增。用GelExtraction試劑盒(Qiagen, Valencia, Calif.)凝膠純化預(yù)期大小的條帶(1200bp)并用限制性酶KpnI和EcoRI消化。如前所述將預(yù)期大小的條帶(920bp)凝膠純化并將其克隆到pSYN-FVI 1-002 的 KpnI/EcoRI 位點以生成 pSYN-FVI1-003 (pBUD FVIIFc/6x (GGGGS) /Fe)。pSYN-FVI 1-024的克降以表汰雙鏈異源二聚體生成用于表達雙鏈異源二聚體的質(zhì)粒(pSYN-FVI1-024)，所述雙鏈異源二聚體中一條鏈由FVII輕鏈(殘基1-152)組成，F(xiàn)VII輕鏈的后面是(GGGGS)6x接頭(其后面是Fe區(qū))，而另一條鏈由FVII重鏈(殘基153至406)組成，F(xiàn)VII重鏈的后面是(GGGGS)6x接頭(其后面是Fe區(qū))。設(shè)計質(zhì)粒以表達異源二聚體作為單一多肽，其中FVII重鏈-接頭-Fe鏈的C末端通過以下多肽序列與重鏈-接頭-Fe鏈的N末端連接:RRRRS- (GGGGS) 6x-RKRRKR，其中RRRRS和RKRRKR序列是前蛋白轉(zhuǎn)化酶切割位點。通過在每個切割位點的最后一個精氨酸后面的前蛋白轉(zhuǎn)化酶的胞內(nèi)切割可引起多肽接頭的去除。因此，細胞將表達雙鏈異源二聚體，其中FVII輕鏈-接頭-Fe鏈在C末端具有RRRRS序列，但接頭的其余部分RKRRKR序列被去除。pSYN-FVI1-024和幾種中間質(zhì)粒的構(gòu)建需要使用以下引物:Hindll1-SaI1-EpE1-Fc-FAGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACCBamH1-接頭(PACEl)-Fc-RCATCGGATCCCCCGCCACCGGMCCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCCGCTCCGGCGGCGCCGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGHindll1-Kozak-FVI1-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGBspE1-Fc-接頭-FVIILC-RGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCCACCGGMCCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTGGGGTTTGCTGGBamHI_2xlin k-間隔-HC-FCAGTCTGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGATCMGGMGAGGGAGGMGAGGATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCFc-EcoRl-R ATGTCTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG為了生成第一中間質(zhì)粒，根據(jù)制備商的標準方案使用Expand High FidelitySystem (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)在 MJ溫度循環(huán)器中用 25pmol 引物Hindi I 1-Sal 1-BpE1-Fc-F 和 BamH1-接頭(PACEl)-Fc-R 和模板 pSYN-Fc-OOl 進行 PCR反應(yīng)。使用以下循環(huán):95°C 2分鐘；30個循環(huán)(95 °C 30秒，58°C 30秒，72°C I分鐘)；720C 10分鐘。如上述凝膠純化合適大小的條帶(大約730bp)并將其克隆到PBUDCE4載體(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)的 HindII I/BamHI 位點，生成 p SYN-FVI1-014 引物 Hindll1-Sal1-BpE1-Fc-F 和 BamH1-接頭(PACEl)-Fc-R 的 PCR 擴增生成編碼 Fe 區(qū)的部分(氨基A X-Y)的DNA片段，所述Fe區(qū)的部分后面是RRRRS序列和(GGGGS)2x多肽接頭。引物HindII1-Sal1-bpE1-Fc-F在分子5’端引入HindIII和SalI限制性位點，而引物BamH1-接頭(PACEl)-Fc-R在3’端引入BamHI，其與編碼GGGGS接頭的最后兩個殘基(密碼子為GGA TCC的殘基GS)的密碼子重疊。接下來，使用pSYN-FVI1-014的克隆中描述的相同條件，如所述用弓I物HindiI1-Kozak-FVI1-F和BspE1-Fc-接頭-FVIILC-R和模板pSYN-FVI 1-002進行另一個PCR反應(yīng)，但退火溫度為57°C。凝膠純化預(yù)期大小的條帶(大約 700bp)并將其克隆到 pSYN-FVI1-014 的 HindIII 和 BspEI 位點以生成 pSYN-FVII_023。引物 Hindll1-Kozak-FVI1-F 和 BspE1-Fc-接頭-FVIILC-R 擴增編碼 FVII 輕鏈的 DNA 片段，所述FVII輕鏈后面是(GGGGS)6xS肽接頭和直到氨基酸232 (EU編號)的Fe區(qū)的部分。引物Hindll1-Kozak-FVI1-F在分子5’端引入后面是Kozak序列的HindIII限制性酶切位點，而引物BspE1-Fc-接頭-FVIILC-R在分子3’端添加BspeI位點。在最后一步中，使用以下循環(huán)用引物BamH1-2xlink_間隔-HC-F和Fc-EcoR1-R以及模板pSYN-FVI1-003如上述進行PCR反應(yīng):95°C 2分鐘；30個循環(huán)(95°C 30秒，55°C 30秒，72 0C 2分鐘);72°C 7分鐘。該PCR反應(yīng)產(chǎn)生編碼(GGGGS) 2x多肽接頭的DNA分子，所述多肽接頭后面是RKRRKR序列(其后面是FVII重鏈)。引物BamH1-2xlink-間隔-HC-F和Fc-EcoR1-R在分子5’端和3’端分別引入BamHI位點和EcoRI位點。將預(yù)期大小的條帶(大約 1600bp)克隆到 pSYN-FVI1-023 的 BamHI 和 EcoR 位點以生成 pSYN-FVI1-024。中間體dSYN-FVI1-073 的克降通過基于PCR的定向位點的誘變方法，將沉默的突變引入FVI1-024的第一 Fe部分，導(dǎo)致在編碼412和413位(EU編號)氨基酸的氨基酸的DNA區(qū)生成SalI位點。其生成中間構(gòu)建體FVI1-073。pSYN-FVI 1-057 的克隆包含來自pSYN-FVI1-057的SalI至BsiWI位點的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。將該DNA亞克隆到pSYN-FVI1-073的Sall/BsiWI位點以生成pSYN-FVI1-057。pSYN-FVI1-0 58、pSYN-FVI1-059、pSYN-FVI1-060、P SYN-FVI1-061 和pSYN-FVI 1-062 的克隆如pSYN-FVI1-057中所述地克隆這些構(gòu)建體(從SalI至BsiWI的DNA的合成是外包的并亞克隆到pSYN-FVI1-073)。pSYN-FVI 1-066 的克隆包含來自pSYN-FVI1-066的SalI至RsrII位點的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。將該DNA亞克隆到pSYN-FVI1-043的Sall/RsrII位點以生成pSYN-FVI1-066。pSYN-FVI 1-067 的克隆包含來自pSYN-FVI1-067的SalI至EcoRI位點的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。將該DNA亞克隆到pSYN-FVI1-041的Sall/EcoRI位點以生成pSYN-FVI1-067。pSYN-FVI 1-090 的克隆包含來自pSYN-FVI1-090的BamHI至BsiWI位點的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。通過3種方法連接(其中外包的DNA用BamHI/BsiWI切割并且pSYN-FVII_061用BamHI/Bsiffl/Notl 切割)將該 DNA 亞克隆到 pSYN-FVI1-061 以生成 pSYN-FVI1-090。pSYN-FVI 1-100 的克隆用胰蛋白酶的170環(huán)(氨基酸EASYPGK)取代FVII的170環(huán)的部分(FVII成熟序列的氨基酸311至322)。通過標準重疊PCR方法使用pSYN-FVI1-090作為模板和主鏈結(jié)構(gòu)引入這種突變以生成pSYN-FVI1-100。pSYN-FVI1-115 的克隆通過基于PCR的定向位點誘變將三點突變(V158D、E296V和M298Q ;成熟FVII序列編號)引入pSYN-FVI1-090的FVII編碼區(qū)以生成pSYN-FVI1-115。pSYN-FVI1-118 的克隆包含來自pSYN-FVI1-118的XbaI至BsiWI位點的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。將該DNA亞克隆到pSYN-FVI1-011的Xbal/BsiWI位點以生成pSYN-FVI1-118。pSYN-FVI1-119 的克隆包含來自pSYN-FVI1-119的XbaI至BsiWI位點的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。將該DNA亞克隆到pSYN-FVI1-011的Xbal/BsiWI位點以生成pSYN-FVI1-119。pSYN-FVI 1-127 的克隆通過PCR使用pSYN-FVI1-100作為模板生成包含胰蛋白酶的170環(huán)的DNA片段。該PCR反應(yīng)在5’和3’端分別生成BsiWI和BspEI限制性位點。將該DNA亞克隆到pSYN-FVI1-118 的 BsiWI/BspEI 位點以生成 pSYN-FVI1-127。pSYN-FIX-042 的克隆將來自pSYN-FIX-030 (如美國專利7566565中所述)的HindiII/BspEI片段亞克隆到 pSYN-FVI1-011 的 Hindlll/BspEI 位點以生成 pSYN_FIX_042。pSYN-FIX-068 的克隆將來自pSYN-FIX-030 (US7566565中詳細描述的質(zhì)粒)的Hindlll/BspEI片段亞克隆到 pSYN-FVI1-066 的 Hindlll/BspEI 位點以生成 pSY N-FIX-068。pSYN-FIX-088 的克隆將來自pSYN-FIX-067 的 BspE1-EcoRI 片段亞克隆到 pSYN_FIX_053 的BspE1-EcoRI 位點以生成 pSYN-FIX-088。pSYN-FIX-089 的克隆將來自pSYN-FIX-048 的 BspE1-EcoRI 片段亞克隆到 pSYN_FIX_053 的BspE1-EcoRI 位點以生成 pSYN_FIX_089。pSYN-FIX-090 的克隆包含F(xiàn)IX編碼區(qū)、SCE5編碼序列和EcoRI位點的DNA片段是外包合成的，并將其亞克隆到pSYN-FIX-053的Xbal/EcoRI位點以生成pSYN-FIX-090，所述FIX編碼區(qū)為蛋白的XbaI位點至C末端且后面是6x (GGGGGS)接頭。SCE5序列如下所列:AQVQLQESGG GLVQPGGSLRLSCAASGFMFSRYAMSWVRQAPGKGPEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGATYTSRSDVPDQTSFDYWGQGTLVTVSSGSASAPKLEEGEFSEARVSELTQDPAVSVALGQTVRTTCQGDSLRNFYASWYQQKPGQAPTLVIYGLSKRPSGIPDRFSASSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCLLYYGGGQQGVFGGGTKLTVLRQPFAAPSVTLFPPSSAApSYN-FVI 1-094 的克隆包含編碼6x (GGGGS)接頭(所述接頭后面是SCE5編碼序列)的序列的DNA片段是合成的(外包的)，并將其克隆到預(yù)先修飾的pSYN-FVI1-011變體的EcoRV/EcoRI位點以在FVII編碼區(qū)的C末端生成EcoRV位點。pSYN-FVI1-088 的克隆包含來自pSYN-FVI1-088的SalI至RsrII位點的核苷酸的DNA序列的合成是外包的。將該DNA亞克隆到pSYN-FVI1-066的Sall/RsrII位點以生成pSYN-FVI1-088。pSYN-FVI 1-125 的克隆DNA片段由pSYN-FVI1-088進行PCR擴增，其包含AP3區(qū)和接頭的部分。該PCR反應(yīng)在DNA片段的5’和3’端分別生成BamHI和EcoRI位點。將該DNA片段亞克隆到pSYN-FVI1-011 的 BamHI/EcoRI 位點以生成 pSYN-FVI1-125。pSYN-FVII 1-041 的克隆通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)使用FVIII特異性引物從人體肝臟多聚腺苷酸RNA(Clontech)獲得人重組B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII的編碼序列。FVIII序列包括FVIII的天然信號序列。B-結(jié)構(gòu)域缺失在絲氨酸743 (S743 ；2287bp)之后開始，并在谷氨酸1638 (Q1638; 4969bp)之前終止，總共缺失 2682bp (SQ 型)。通過RT-PCR使用Fe特異性引物從人白細胞cDNA文庫(Clontech)獲得人重組Fe的編碼序列。設(shè)計引物以使B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII序列在沒有中間接頭下與Fe序列的N末端直接融合。在CMV啟動子的調(diào)控下將FVIIIFc DNA序列克隆到哺乳動物雙表達載體pBUDCE4.1 (Invitrogen)中。通過RT-PCR獲得包括小鼠Igk信號序列的第二個相同的Fe序列，并將其克隆到表達載體PBUDCE4.1中第二個啟動子EFla的下游。該最終構(gòu)建體稱作pSYN-FVII1-013。使用PCR和標準分子生物學(xué)技術(shù)從相似構(gòu)建體中產(chǎn)生第二個質(zhì)粒，以表達rFVIIIBDD-Fc-Fc,其中rFVIIIBDDFc編碼序列與具有(GGGGS) 4接頭的第二 Fe序列融合，允許在短暫轉(zhuǎn)染中只產(chǎn)生rFVIIIBDD-Fc單體-二聚體雜交體。該構(gòu)建體稱作pSYN-FVII1-041。pSYN-FVII 1-049 的克隆通過將Nhel/Xhol片段從pBUD_CE4.1克隆到pSYN-FVII1-013中以生成中間體pSYN-FVII 1-048。包含來自pSYN-FVIII_049的RsrII至XbaI位點的區(qū)域的DNA片段的合成是外包的。將該片段亞克隆到pSYN-FVI1-048的RsrII/Xbal位點以生成pSYN-FVI1-049。pSYN-FVII 1-108 的克隆將來自pSYN-FVI1-066 的 SalI/RsrII 片段亞克隆到 pSYN-FVI 11-049 以生成pSYN-FVII1-108。實施例7.在活化構(gòu)建體表達方面的其他嘗試以表達活化的FVII的目標制備幾種其他構(gòu)建體。然而，這些構(gòu)建體沒有成功地表達活化分子。通過蛋白質(zhì)印跡證實，使用將異源信號肽融合到重鏈N末端的一般方法，F(xiàn)VII重鏈不能被游離的N末端表達。pSYN-FVI1-010 的克降在FVI1-010構(gòu)建體中，因子VII的重鏈在scFc支架的環(huán)境下表達并且輕鏈被分開表達。使用pSYN-FVI 1-001(參見上文)，用引物對 FVI1-HC-Hind3-1ggKss-F/FVI1-HC-BspE1-R 進行 PCR 擴增。在 pSYN-FVI1-008 (參見上文)的 BspEI/Hindlll 位點克隆，生成 pSYN-FVI1-009。使用引物FVI1-LC-Notl-F/FVI1-LC-Xho1-R 由 pSYN-FVI1-003 (指 P0830) PCR 擴增 FVII 輕鏈并在 pSYN-FVI1-009 克隆以生成 pSYN-FVI1-010。引物FVI1-HC-BspE1-RAGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGFVI1-HC-Hind3-lggKss-f
ACTGACAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCFVI1-LC-Not1-FACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCTCCCAGG
FVI1-LC-XhoI—RACTGACCTCGAGTTATCGGCCTTGGGGTTTGCTGGpSYN-FVI1-013 的克降在FVI1-013構(gòu)建體中，輕鏈在scFc支架的環(huán)境下表達并且重鏈被分開表達。使用引物對FVI1-LC-接頭-BamH1-R/Hindlll-Kozak-FVI1-F 由pSYN-FVI1-001 (指 P0830)PCR 擴增并在 pSYN-FVI1-Oll 的 BamHI/Hindlll 位點克隆，生成pSYN-FVI1-012。使用引物對 FVI1-HC-Notl-F/FVI1-HC-Xho1-R 由 pSYN-FVII_009PCR 擴增FVI1-HC 并在 pSYN-FVI1-012 亞克隆以生成 pSYN-FVI1-013。引物FVI1-LC-6X 接頭-BamH1-RACTGACGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCA
CCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCHindII I—Kozak-FVI1-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGFVI1-HC-Not1-F`
ACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGAGACAGACFVI1-HC-Xhol-RACTGACCTCGAGTTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGpSYN-FVI1-018 的克降對于FVI1-018構(gòu)建體，F(xiàn)VII的重鏈被表達為Fe融合蛋白，并且FVII的輕鏈被分開表達為單獨的Fe融合蛋白。使用pSYN-FVI1-010 作為模板，用引物 FVI1-HC-Hind3-1ggKss-F/scFc-EcoR1-RPCR擴增HCFVI1-接頭-Fe。在pBUDCE4的Hindlll/EcoRI位點亞克隆。這生成pSYN-FVI1-017。然后，用引物 FVI1-LC-`Notl-F/FC-XHO1-R 由 pSYN-FVII_013PCR 擴增并在FVI1-017 的 Xhol/Notl 位點亞克隆。這生成 PSYN-FVI1-018。引物scFc—EcoRl—RACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGFe—XhoI—RAGCTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGG實施例8.在可活化的構(gòu)建體表達方面的嘗試FVI1-039.-040 的克降嘗試制備幾種構(gòu)建體以生成構(gòu)建體，其中因子VII可使用合適的切割位點(在這種實例下為DFTR因子XIa切割位點)在凝血位點體內(nèi)活化。在scFc支架的環(huán)境下制備039構(gòu)建體。該構(gòu)建體包括FVII輕鏈、FXIa切割位點和在線性序列中具有I153V突變的FVII重鏈，所述線性序列與第一 Fe部分的N末端相連接。在scFc支架的環(huán)境下也制備了 040構(gòu)建體。該構(gòu)建體包括缺失R152的FVII輕鏈、FXIa切割位點和在線性序列中具有I153V突變的FVII重鏈，所述線性序列與第一 Fe部分的N末端相連接。DFTR切割序列是FIX中發(fā)現(xiàn)的天然FXIa序列。在FIX中，DFTR序列后面是纈氨酸，所以I152V突變被引入pSYN-FVI1-039、-040以增加FXIa切割效率。DNA 分子 Genscript-FVI1-039 和-040 的合成是外包的(Genscript)。將來自Genscript-FVI 1-039 和-040 的 Xbal/BsiWI 片段亞克隆到 pSYN-FVI1-Oll 的 Xbal/BsiWI位點以分別生成pSYN-FVI1-039和-040。實施例9.構(gòu)建體的短暫轉(zhuǎn)染為了表達構(gòu)建體，在37°C /10%C02下HEK_293_F細胞在補充有維生素K3(只用于FVII 和 FIX 轉(zhuǎn)染)(Sigma Aldrich, St.Louis, MO)的 Freestyle 培養(yǎng)基(Invitrogen)的懸浮液中生長至2 μ g/升(生長培養(yǎng)基)作為懸浮液細胞。通過以5x10s細胞/ml的細胞密度接種每3至4天傳代培養(yǎng)細胞。在轉(zhuǎn)染前24 個小時，在補充有 L0NG R3IGF-l(Sigma Aldrich, St.Louis, MO)至20 μ g/升(轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基)的生長培養(yǎng)基中以7xl05細胞/ml的密度接種細胞。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，用等于5%的待轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物的總體積的體積制備轉(zhuǎn)染溶液。在轉(zhuǎn)染溶液中，將DNA (終濃度20mg/L)添加到新制備的PEI在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中的溶液^Omg/L)。將該溶液渦旋30秒并室溫下培養(yǎng)5分鐘，然后直接添加到細胞培養(yǎng)物中。4小時后，體積等于補充有維生素K3的OptiCHO(Invitrogen)的細胞培養(yǎng)物體積，將L0NG R3IGF_1和200mM L-谷氨酰胺添加到細胞中。將細胞培養(yǎng)物如上所示地成長并每日對培養(yǎng)基樣本取樣評估蛋白表達。在收獲當(dāng)天，使細胞下旋并且將培養(yǎng)基在制劑中過濾，所述制劑通過蛋白質(zhì)A pulldown/蛋白質(zhì)印跡用于蛋白質(zhì)純化或蛋白質(zhì)分析。實施例10.FVIIFc分子(除了 FVI1-028和FVI1-053)和FIXFc分子的蛋白純化使用以下柱從條件培 養(yǎng)液中純化FVIIFc分子:1)具有假親和洗脫的陰離子交換色譜(例如，Q瓊脂糖4FF(GE Healthcare)，接著用不同水平的CaCl2洗脫以選擇性洗脫活性最大的種類)，然后2) ShFcRn (可溶性人FcRn)親和(具有瓊脂糖4FF小珠的NHS-偶聯(lián)的shFcRn)色譜，低pH(例如，ρΗ6.2)時結(jié)合含有蛋白質(zhì)的Fe且中性ρΗ(例如，ρΗ8.0)時洗脫。在某些情況下，包括利用用NaCl洗脫的陽離子交換色譜法的額外步驟。這些純化步驟使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法以生成通過SEC分析和SDS-PAGE測得的純度>95%的純化的蛋白質(zhì)。如先前在美國專利7，566，565中所述地純化FIXFc蛋白。實施例11.FVI1-028和FVI1-053的蛋白純化使用以下柱從條件培養(yǎng)基純化FVI1-028和FVI1-053:1)疏水作用色譜(例如，Phenyl FF (high sub) (GE Healthcare)),然后2)具有鹽洗脫的陰離子/陽離子交換色譜。這些純化步驟使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法以生成通過SEC分析和SDS-PAGE測得的純度>95%的純化的蛋白質(zhì)。實施例12.FIX-090的純化通過兩步色譜過程純化FIX-090，首先使用具有抗GLA結(jié)構(gòu)域抗體的免疫親和層析步驟，后面是使用與上述FIXFc蛋白質(zhì)相似的假親和洗脫的陰離子交換色譜。這些純化步驟使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法以生成通過SEC分析和SDS-PAGE測得的純度>95%的純化的蛋白質(zhì)。實施例13.FVIIIFc蛋白質(zhì)的純化
使用兩個或三個柱純化過程，從凈化的和化學(xué)確定的收獲培養(yǎng)基中純化FVIIIFc蛋白質(zhì)，包括FVII1-特異性親和純化步驟(McCue2009)以及之后的陰離子交換與標準NaCl洗脫和/或ShFcRn (可溶性人FcRn)親和(具有瓊脂糖4FF小珠的NHS-偶聯(lián)的shFcRn)色譜(低PH(例如，pH6.2)時結(jié)合含有蛋白質(zhì)的Fe且中性pH(例如，pH8.0)時洗脫)的組合。這些純化步驟使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法以生成通過SEC分析和SDS-PAGE測得的純度>95%的純化的蛋白質(zhì)。實施例14.FVII構(gòu)建體的活化收集由含有FVIIFc的FcRn色譜柱洗脫的片段，且總蛋白濃度為4mg/ml。將CaCl2濃度提高到5mM，且在4°C下培養(yǎng)樣品24至48小時直到至少80%的FVIIFc被活化。通過SDS PAGE評估活化的程度。(圖10)實施例15.FVIIa活性測定，可溶性組織因子法通過可溶性組織因子法測定FVIIaFc變體的比活。不同于脂化的全長組織因子，可溶性組織因子(組織因子的胞外部分)不能將FVII活化為FVIIa，但其可作為因子X通過FVIIa轉(zhuǎn)化為因子Xa的活化劑。為了測定FVIIaFc變體的比活，按照制備商的建議使用A STAC LOT FVI1-rTF 試劑盒(Diagnostica Stago, Asnieres, France)。表 I 匯總了數(shù)據(jù)并且示出所有變體的可比較的比活。表1.基于可溶性組織因子方法的FVIIaFc變體的比活
權(quán)利要求
1.一種嵌合凝血因子，其包含i)選自FVI1、FIX和FX的凝血因子和ii)與血小板結(jié)合的靶向部分及任選地，iii)所述凝血因子與所述靶向部分之間的間隔基部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合凝血因子，其包含由式ABC表示的結(jié)構(gòu)，其中A為凝血因子；其中B為間隔基部分；且其中C為至少一個與血小板結(jié)合的靶向部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合凝血因子，其包含由選自ABC、CBA的式表示的從氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子在血小板存在下顯示出與缺少至少一個靶向部分的適當(dāng)?shù)膶φ障啾仍黾拥哪干伞?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合凝血因子，還包含支架部分和任選地第二間隔基部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合凝血因子，還包含D和E，其中D為間隔基部分；且E為支架部分，并且其中所述嵌合凝血因子包含由選自AB⑶E、ADEBC, EDABC, CBADE, EDCBA和CBEDA的式表示的從氨基端到羧基端的結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合凝血因子，其中E為包含第一Fe部分Fl和第二 Fe部分F2的二聚體Fe區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子被表達為包含在兩個Fe部分之間插入的可切割scFc(cscFc)接頭的多肽,其中所述cscFc接頭與至少一個引起所述cscFc多肽接頭切割的酶切位點相鄰。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接頭與至少一個引起所述cscFc接頭切割的酶切位點相鄰。
10.根據(jù)權(quán)利要 求9所述的嵌合凝血因子，其中所述至少一個酶切位點為細胞內(nèi)加工位點。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接頭的兩側(cè)為兩個酶切位點，所述酶切位點由相同的或不同的酶識別。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接頭的長度為約10個至約50個氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接頭的長度為約20個至約30個氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合凝血因子，其中所述多肽接頭包含gly/ser肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的嵌合凝血因子，其中所述gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n或Ser(Gly4Ser)n，其中 n 為選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 的正整數(shù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的嵌合凝血因子，其中所述(Gly4Ser)n接頭選自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。
17.根據(jù)權(quán)利要求8所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子包含兩條多肽鏈。
18.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子具有選自以下的結(jié)構(gòu):A通過間隔基部分與Fl連接且C與F2連接；A通過間隔基部分與Fl連接且C通過間隔基部分與F2連接；A與Fl連接且C通過間隔基部分與F2連接；A通過間隔基部分與Fl連接且C通過間隔基部分與F2連接。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的嵌合凝血因子，其包括兩條多肽，其中第一條多肽包含部分 A B FUA B FUA B FUA B FlD C 且第二條多肽包含部分 C F2、C D F2、F2D C、F2D C，其中所述兩條多肽鏈形成Fe區(qū)。
20.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分與所述Fe區(qū)的所述多肽鏈中的至少一條融合。
21.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分直接與Fl和F2的至少一個融合。
22.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分通過間隔基部分與Fl和F2的至少一個融合。
23.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分通過可切割接頭與Fl和F2的至少一個融合。
24.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分選自抗體分子、抗體分子的抗原結(jié)合片段、scFv分子、受體的受體結(jié)合部分、肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分與靜息血小板結(jié)
26.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分選擇性地與活化血小板結(jié)合。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIba、GPVIdP GPIIb/IIIa的非活性形式。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIIb/IIIa 的活性形式、P 選擇蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L 和 LOX-1。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分與GPIb復(fù)合物結(jié)合。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分是選自PS4、OSl和0S2的肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分包含來自抗體的抗體可變區(qū)，其選自SCE5、MB9和AP3。
32.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子VII。
33.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子VII的高比活變體。
34.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子IX。
35.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子IX的高比活變體。
36.根據(jù)權(quán)利要求1、2、5或7所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子X。
37.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或5所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子X的高比活變體。
38.根據(jù)權(quán)利要求8所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子由細胞以活性形式分泌。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子在體內(nèi)活化。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子包含非天然地存在于所述凝血因子中的異源性酶切位點。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的嵌合凝血因子，其中所述酶切位點與所述凝血因子的重鏈部分的氨基端基因融合。
42.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分是蛋白質(zhì)分子，其增加所述凝血因子的流體動力學(xué)半徑。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分，如果存在，選自白蛋白和 XTEN*、
44.一種包含F(xiàn)VII的多肽，其中FVII包含由所述凝血級聯(lián)的組分活化的異源性酶切位點。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的多肽，其中所述多肽包含支架部分和任選地間隔基部分。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分是包含第一Fe部分Fl和第二 Fe部分F2的二聚體Fe區(qū)。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子包含兩條多肽鏈。
48.根據(jù)權(quán)利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子具有選自以下的結(jié)構(gòu):所述凝血因子通過間隔基部分與所述第一 Fe部分連接；所述凝血因子通過間隔基部分與所述第二 Fe部分連接；所述凝血因子直接與Fl連接；且所述凝血因子直接與F2連接。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的嵌合凝血因子，還包含靶向部分C。
50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的嵌合凝血因子，其中所述嵌合凝血因子被合成為包含cscFc接頭的單個多肽鏈。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接頭與至少一個引起所述接頭切割的酶切位點相 鄰。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的嵌合凝血因子，其中所述至少一個酶切位點為細胞內(nèi)加工位點。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接頭的兩側(cè)具有兩個酶切位點，所述酶切位點由相同的或不同的酶識別。
54.根據(jù)權(quán)利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接頭的長度為約10個至約50個氨基酸。
55.根據(jù)權(quán)利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接頭的長度為約20個至約30個氨基酸。
56.根據(jù)權(quán)利要求49所述的嵌合凝血因子，其中所述cscFc接頭包含gly/ser肽。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的嵌合凝血因子，其中所述gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n或Ser(Gly4Ser)n，其中 n 為選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 的正整數(shù)。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的嵌合凝血因子，其中所述(Gly4Ser)n接頭選自(Gly4Ser) 6> Ser (Gly4Ser) 6> (Gly4Ser) 4 和 Ser (Gly4Ser) 4。
59.根據(jù)權(quán)利要求45所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子是因子VII的高比活變體。
60.根據(jù)權(quán)利要求44所述的嵌合凝血因子，其中非天然存在于所述凝血因子中的異源性酶切位點在血塊形成的位點被切割。
61.根據(jù)權(quán)利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述切割位點選自因子XIa切割位點、因子Xa切割位點和凝血酶切割位點。
62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的嵌合凝血因子，其中所述酶切位點與所述凝血因子的重鏈部分的氨基端基因融合。
63.根據(jù)權(quán)利要求48所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分與靜息血小板結(jié)合。
64.根據(jù)權(quán)利要求48所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分選擇性地與活化血小板彡口口
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIba、GPVIdP GPIIb/IIIa的非活性形式。
66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的嵌合凝血因子，其中所述靶向部分選擇性地與選自以下的靶標結(jié)合:GPIIb/IIIa 的活性形式、P 選擇蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L 和 LOX-1。
67.根據(jù)權(quán)利要求64所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分是蛋白質(zhì)分子，其增加所述凝血因子的流體動力學(xué)半徑。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的嵌合凝血因子，其中所述支架部分，如果存在，選自白蛋白^PXTFNn,
69.根據(jù)權(quán)利要求44所述的嵌合凝血因子，其包括選自ABC、CBA、ABCDE、ADEBC、EDABC、CBADE, EDCBA, CBE DA的從氨基端至羧基端部分的線性序列，其中A為可活化的凝血因子，B不存在或為接頭，C為靶向部分，D不存在或為接頭,且E為支架部分。
70.根據(jù)權(quán)利要求44所述的嵌合凝血因子，其中所述凝血因子包含凝血因子的輕鏈和重鏈且每個所述輕鏈和重鏈被表達成單獨的多肽鏈。
71.—種核酸分子,其編碼根據(jù)權(quán)利要求1、2、5、7、44、45、45和58中任一項所述的嵌合凝血因子。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的核酸分子，其中所述核酸分子存在于載體中。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的載體，其中所述載體還包括編碼酶的核苷酸序列，所述酶切割至少一個酶切位點。
74.—種宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求72所述的表達載體。
75.—種宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求72所述的表達載體，其中所述宿主細胞表達能夠細胞內(nèi)加工的酶。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的宿主細胞，其中所述酶對于所述細胞是內(nèi)源性的。
77.根據(jù)權(quán)利要求75所述的宿主細胞，其中所述酶對于所述細胞是異源性的。
78.一種用于制備嵌合凝血因子的方法，其包含在培養(yǎng)物中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求76或77所述的宿主細胞并從所述培養(yǎng)基中回收所述嵌合凝血因子。
79.—種包含兩條多肽鏈的加工的、異源二聚體多肽，其中所述加工的、異源二聚體多肽通過在于細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中表達根據(jù)權(quán)利要求78所述的載體并從所述培養(yǎng)基中分離所述成熟的、異源二聚體多肽來制備。
80.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、2、5、7、44、45、48和58中任一項所述的嵌合凝血因子和藥學(xué)上可接受的載體。
81.—種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求71所述的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體。
82.一種用于在受試者中改善止血的方法，包括施用根據(jù)權(quán)利要求80或81所述的組合物。
全文摘要
描述了嵌合凝血因子，和用于制備嵌合凝血因子的方法，以及使用這些凝血因子改善止血的方法，所述嵌合凝血因子使治療劑定位在凝血部位(例如，通過被靶向到血小板或可在凝血部分被活化)，具有降低的清除率、具有提高的可制備性、具有降低的凝血活性、具有增強的活性或具有一種以上的這些特征。
文檔編號A61K38/36GK103180439SQ201180042449
公開日2013年6月26日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者喬·薩拉斯, 羅伯特·彼得斯, 艾倫·比通蒂 申請人:比奧根艾迪克依蒙菲利亞公司