專利名稱：改善的IgG4類抗體的制作方法
改善的lgG4類抗體本發明涉及與野生型抗體相比較具有改變的二硫鍵排列的改善的抗體和產生所述改善的抗體的方法。包括重組蛋白質、單克隆抗體(mAb)和基于核酸的藥物的生物藥劑工業正在快速發展。抗體工程已導致抗體片段或替代形式的設計和產生。當選擇基于抗體的蛋白質作為治療劑時，要考慮優選的分子形式以及其它方面例如產品得率(production yield)、蛋白質質量和貯存穩定性。所有免疫球蛋白(Ig)分子的基本結構包含，通過二硫鍵偶聯的兩個相同的重鏈(HC)和兩個相同的輕鏈(LC)。每一個LC由可變結構域(')和恒定結構域(CJ組成。基于HC，5個主要的Ig種類公認為:IgG、IgA、IgD、IgE和IgM0對于IgG7HC由一個可變結構域(Vh)和三個恒定結構域(Ch1-3)組成。(^和^^結構域形成了負責刺激效應子功能的分子的Fe部分，并且通過賦予IgG分子柔性的鉸鏈區連接至Fab片段(Vh'和QA)。兩個抗原識別位點位于' 和Vh結構域的末端。I gG還被細分成4個不同的同種型:I gG1、I gG2、IgG3 和 IgG4。Fe-介導的效應子功能，即抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)，是同種型依賴性的。每一個同種型已進化來進行體內的特定功能。IgGl同種型因其延長的半衰期、增強的ADCC激活和補體激活而目前被最廣泛地用作治療劑。取決于靶和期望的作用，其它同種型也被當作治療劑。例如，當僅中和靶抗原并且效應子功能不太重要時，可使用替代性同種型例如IgG2和IgG4。或者，可考慮具有再工程化的Fe/效應子功能的 IgG0IgG2也具有最小的相關效應子功能，且易于二聚化(這尚未被完全理解)。由于其相對缺乏效應子功能的誘導，因此IgG4仍然是有用的同種型。然而，IgG4還具有一些固有的使用難題，即其形成半抗體的傾向、其交換半分子的能力及其較短的血清半衰期。
在體外，IgG4分子符合典型的IgG結構，但在體內已觀察到，它們形成各自包含單個輕鏈和單個重鏈的半分子(通過在鉸鏈區內形成重鏈內二硫鍵而引起)。已觀察到大百分比的循環IgG4是雙特異性的，但功能上是單價的。這是因為半分子可與其它IgG4 半分子形成 IgG4 (Schuurman, J., Van Ree, R., Perdok, G.J., Van Doorn, H.R., Tan, Κ.Y.,Aalbersej R.C., 1999.Normal human immunoglobulin G4 is bispecific:1t has twodifferent antigen-combining sites.1mmunology 97，693-698)。可通過在鉸鏈中的位置241 (根據Kabat編號系統編號的)上引入Ser至Pro的突變來減少 IgG4 半分子的形成(Angal, S.等人，1993.Asingle amino acid substitutionabolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.Mol Tmmunol30，105-108)。此外，該點突變不影響IgG4的緊湊結構，從而使得IgG4能夠保留其減弱的激活補體的能力。在發現S241P突變后，已研究了 IgG4的其它突變，以理解IgG4抗體的重鏈間相互作用，減弱IgG4的效應子功能并且增加結構穩定性。在Schuurman等人(Schuurman, J等A, 2001.The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium withintra-chain disulphide bonds.Molecular Immunology38, 1-8)中，使用 IgG4 突變體研究了觀察到的IgG4的重鏈間二硫鍵的不穩定性。在突變體Ml中，參與重鏈-輕鏈間(Q-Chi)二硫鍵的Cys 131 (根據EU編號系統編號的或根據Kabat編號系統的Cys 127)被絲氨酸替代，并且發現該突變體導致輕鏈二聚體和重鏈二聚體的形成。在突變體M2中，參與鉸鏈中的重鏈間二硫鍵的半胱氨酸226 (根據EU編號系統編號的226或根據Kabat編號系統的239)被絲氨酸替代，并且發現該突變體與IgG4相比較具有更穩定的重鏈間連接并且阻止重鏈內二硫鍵的形成。為了減少IgG4抗體的聚集物的形成，還已研究了 IgG4抗體的CH2和CH3結構域中的突變。US 2008/0063635 Takahashi等人已研究了這樣的IgG4突變體，其中CH3結構域中的位置409 (根據EU編號系統編號的409或根據Kabat編號系統編號的440)上的精氨酸被賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸置換，以在低PH下抑制聚集物形成。為了減弱CDC活性，還教導了 L235、D265、D270、K322、P329和P331 (根據EU編號系統編號的L235、D265、D270、K322、P329 和 P331 或根據 Kabat 編號系統編號的 L248、D278、D283、K341、P348和P350)上的其它突變。W02008/145142 Van de Winkel等人公開了，即使在鉸鏈區中的S228P (根據EU編號系統編號的S228或根據Kabat編號系統編號的S241)突變不存在的情況下，通過置換位置409上的精氨酸殘基、位置405上的Phe殘基或位置370上的Lys殘基(根據EU編號系統編號的409、F405和K370或根據Kabat編號系統編號的R440、F436和K393)，具有減弱的進行Fab-臂交換的能力的穩定的IgG4抗體。先前已研究了存在于抗體的鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的數目的改變。US 5677425Bodmer等人公開了，為了有利于使用半胱氨酸巰基連接效應子或報道分子，可增加鉸鏈區中半胱氨酸殘基的數目。US 5677425還教導，為了有利于裝配抗體分子，可將鉸鏈區中的半胱氨酸殘基的數目減少至I個(由于其僅是形成單個二硫鍵所必需的)，這將為將鉸鏈區連接至另一個鉸鏈區或至效應子或報道分子提供特異性靶。然而，仍然需要提供具有使得它們甚至更適合用作治療劑的改良的性質的新型抗體。本發明提供了與野生型抗體相比較具有有利性質(包括改善的生物物理性質)的新的突變型抗體。特別地，已 令人驚訝地發現，對與輕鏈中的半胱氨酸形成二硫鍵的IgG4抗體重鏈中的半胱氨酸殘基位置的修飾提供了，與野生型IgG4抗體相比較，具有提高的穩定性的IgG4抗體。發明概述在一個方面，本發明提供了 IgG4類抗體，所述抗體包含至少一個含有C0I結構域和鉸鏈區的重鏈，其中在每一個重鏈中:a.ChI結構域中根據Kabat編號系統編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一個
氨基酸置換；和b.位于上鉸鏈區(upper hinge region)中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI結構域中的半胱氨酸為根據Kabat編號系統編號的位置127上的半胱氨酸，且示于
圖1b中。改變IgG4恒定區中的二硫鍵的位置導致，對于Fab結構域觀察到更高的Tm。50%的蛋白質解折疊時的溫度被指定為Tm。根據實驗,Tm被測定為例如突光-對-溫度曲線的拐點(即，熒光-對-溫度曲線最陡峭時的溫度)。
因此，更高的Tm反映出更高的熱穩定性。因此，本公開內容的分子具有更高的熱穩定性。然而，不希望受理論束縛，這可以是因為所獲得的二硫鍵或多肽分子的應力(strain)或內部張力的減小。還可通過將其它修飾引入IgG4恒定區來獲得熱穩定性的進一步提高。位于上鉸鏈區中的被半胱氨酸置換的一個或多個氨基酸可選自根據Kabat編號系統編號的226、227、228、229、230、237和238，如圖1b中顯示的(上鉸鏈區中以下劃線標示的氨基酸)。在優選實施方案中，位于上鉸鏈區中的被半胱氨酸置換的一個或多個氨基酸為選自根據Kabat編號系統編號的227、228、229和230的位置上的氨基酸中的一個或多個，如圖1b和2a中顯示的。在該較后的排列中，隨后形成的鏈間(輕鏈-重鏈)二硫鍵的位置與IgGl恒定區中發現的_■硫鍵類似。本發明人已確定，IgGl在Fab和Fe結構域中具有比IgG4分子更高的熱穩定性。然而，本公開內容使得能夠提供不具有ADCC效應子功能但具有如IgGl分子的熱穩定性和/或其它有利性質的IgG4分子。顯示存在影響形成的IgG4分子中的Fab結構域的穩定性的3個一般方面。第一個方面是二硫橋的位置。第二個方面是靠近二硫橋的環境，即二硫鍵周圍的殘基的性質，第三個方面是上鉸鏈區的長度。因此，本發明還提供了，包含具有上鉸鏈、核心和下鉸鏈(1werhinge)的重鏈的IgG4抗體，并且其中重鏈或每一個重鏈中的所述上鉸鏈和核心在長度上為13至17個，例如15個氨基酸。在一個實施方案中，IgG4抗體具有長度為15個氨基酸的上鉸鏈和核心。在一個實施方案中，上鉸鏈和核心包含在IgG4鉸鏈中發現的天然12個氨基酸和3個其它的氨基酸，例如3個丙氨酸殘基或3個甘氨酸殘基或其組合。在一個實施方案 中，鉸鏈具有下列序列之一:
權利要求
1.一種IgG4類抗體，其包含至少一個含有(^1結構域和鉸鏈區的重鏈，其中在每一個重鏈中: a.所述ChI結構域中的根據Kabat編號系統編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一種氨基酸置換；和 b.位于上鉸鏈區的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
2.權利要求1的抗體，其中位于上鉸鏈區中的被半胱氨酸置換的一個或多個氨基酸選自根據Kabat編號系統編號的227、228、229和230。
3.權利要求2的抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置230上的甘氨酸被半胱氨酸置換。
4.權利要求2的抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置229上的酪氨酸被半胱氨酸置換。
5.權利要求2的抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置228上的賴氨酸被半胱氨酸置換。
6.權利要求2的抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置227上的絲氨酸被半胱氨酸置換。
7.權利要求1至6的任一項的抗體，其中重鏈中根據Kabat編號系統編號的位置239上的半胱氨酸和位置242上的 半胱氨酸被另一種氨基酸置換。
8.權利要求1至6的任一項的抗體，其中重鏈中根據Kabat編號系統編號的位置239上的半胱氨酸被另一種氨基酸置換。
9.權利要求1至6的任一項的抗體，其中重鏈中根據Kabat編號系統編號的位置242上的半胱氨酸被另一種氨基酸置換。
10.一種IgG4類抗體，其包含至少一個含有(^1結構域和鉸鏈區的重鏈，其中在每一個重鏈中: a.根據Kabat編號系統編號的的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一種氨基酸置換；和 b.根據Kabat編號系統編號的位置239上的半胱氨酸或位置242上的半胱氨酸被另一種氨基酸置換。
11.權利要求7至10的任一項的抗體，其中位置239上的半胱氨酸和/或位置242上的半胱氨酸被不含巰基的氨基酸置換。
12.權利要求11的抗體，其中所述不含巰基的氨基酸是絲氨酸。
13.前述權利要求任一項的抗體，其中位置127上的半胱氨酸被不含巰基的氨基酸置換。
14.權利要求13的抗體，其中所述不含巰基的氨基酸是絲氨酸。
15.前述權利要求任一項的抗體，其中所述重鏈經突變以在根據Kabat編號系統編號的氨基酸226與243之間插入3個氨基酸。
16.權利要求15的抗體，其中所述重鏈經突變以在根據Kabat編號系統編號的位置238與239之間插入3個氨基酸。
17.權利要求16的抗體，其中在根據Kabat編號系統編號的位置238與239之間插入3個丙氨酸。
18.權利要求16的抗體，其中在根據Kabat編號系統編號的位置238與239之間插入蘇氨酸、組氨酸和另外的蘇氨酸。
19.前述權利要求任一項的抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置241上的絲氨酸被脯氨酸置換。
20.前述權利要求任一項的抗體，其中位置230上的甘氨酸被半胱氨酸置換，位置227上的絲氨酸被脯氨酸置換，位置229上的酪氨酸被絲氨酸置換，位置237上的脯氨酸被天冬氨酸置換，位置238上的脯氨酸被賴氨酸置換，氨基酸序列蘇氨酸-組氨酸-蘇氨酸被插入在位置238與239之間，并且位置241上的絲氨酸被脯氨酸置換。
21.前述權利要求任一項的抗體，其中所述重鏈包含CH2結構域和CH3結構域。
22.前述權利要求任一項的抗體，其中所述抗體包含兩條如先前任一權利要求中所定義的重鏈。
23.權利要求22的抗體，其中所述重鏈是相同的。
24.權利要求1至23的任一項的抗體，其中所述重鏈或每一個重鏈包含長度為12至17個氨基酸的上鉸鏈區和核心區。
25.權利要求24的抗體，其中上鉸鏈和核心區的長度為15個氨基酸。
26.一種表達載體，其包含編碼如權利要求1至25的任一項中所定義的抗體的序列。
27.—種宿主細胞，其包含權利要求26中定義的載體。
28.權利要求1至25的任一項中定義的抗體，其用于治療疾病或障礙。
29.一種用于治療疾病 或障礙的方法，其包括施用治療有效量的權利要求1至25任一項中定義的抗體。
30.一種包含重鏈的IgG4抗體，所述重鏈具有上鉸鏈、核心和下鉸鏈，并且其中所述重鏈或每一個重鏈的所述上鉸鏈和核心的長度為12至17個氨基酸，例如15個氨基酸。
全文摘要
本發明提供了IgG4類抗體，其包含至少一個含有CH1結構域和鉸鏈區的重鏈，其中在每一個重鏈中a.所述CH1結構域中根據Kabat編號系統編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一種氨基酸置換；并且，b.位于上鉸鏈區中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
文檔編號A61K39/395GK103097410SQ201180040277
公開日2013年5月8日 申請日期2011年8月19日 優先權日2010年8月20日
發明者D·P·漢弗萊斯, S·J·彼得斯, R·亞當斯, J·黑茲 申請人:Ucb醫藥有限公司