使用金顆粒豐富凝溶膠蛋白血液樣本的制作方法

專利名稱：使用金顆粒豐富凝溶膠蛋白血液樣本的制作方法
使用金顆粒豐富凝溶膠蛋白血液樣本本發明涉及一種制備至少一種治療性蛋白質或包含在容器中的具有體液、培養物和治療性蛋白質的蛋白質混合物。本發明還涉及用于進行該方法的容器和含有該制備的蛋白質作為活性成分的藥物。關節變性疾病在人類和動物中均大量存在。在人類中，老年病人會自發性地產生關節病(由于已知的風險因素)，在年輕患者中，也會由于創傷后以并發癥的形式產生。但兩種形式具有相同的臨床癥狀，包括關節疼痛和功能受限，以及會使患者的生活質量大幅受限。大量的原因，例如負荷過大、不合適的負荷、關節不穩定或其它的感染，都會由于軟骨細胞的細胞凋亡，導致關節軟骨的機械和酶損傷，也會引起膠原II型和蛋白多糖的缺失。因此，在退化和修補中存在不平衡。軟骨的退化是發病的核心，該疾病不僅影響軟骨，還影響關節囊和軟骨下的骨頭。在軟骨損傷的情況下，分解物會到達滑液并引起滑膜炎。此外，對關節囊的損害還會直接釋放出炎癥介質，且嚴重受損的關節囊還會導致關節不穩定。在大且環形的負荷下，軟骨下的骨頭層會相應地提高骨密度。然而，這種硬化的結果是，骨頭越來越硬，越來越脆。這首先會導致振動吸收能力的降低，在已經過負的軟骨上會增加更大的負荷，其次，在移動中，會在軟骨下骨板和礦物化骨頭之間產生剪切力。在患有關節病和/或骨關節炎和/或其它關節疾病的馬中，在體液中已經測出了促炎癥(炎癥促進)細胞活素腫瘤壞死因子Ct (TNFa )、白介素I (IL 一 I)和白介素6 (IL — 6)以及前列腺素E2(PGE2)和金屬蛋白酶的濃度升高。在患有關節病的人類中，促炎癥細胞活素在血液和體液中也升高。促炎癥(炎癥促進)細胞活素TNF a、IL 一 I和IL 一 6通過滑膜的B —滑膜細胞(synoviocyti sectetorii )、滑膜中的炎癥細胞和軟骨細胞隱藏,且會刺激基體金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶和其它的炎癥介質釋放，該炎癥介質例如是前列腺素(PGE2)或一氧化氮(NO)。金屬蛋白酶是可以降解軟骨基體(包括膠原II型、蛋白多糖)、IL 一 I和TNF a，也能直接抑制膠原II型的產生。在大多數情況下，對 變性關節疾病的常規治療包括對于炎癥的癥狀療法，例如通過合適的藥物，在全身或關節內抑制炎癥。這包括皮質類固醇，有時與玻璃酸聯用，其直接在關節內給藥，且經常被使用。此外，還經常使用軟骨保護劑。然而,這些藥物治療存在大量不良反應。癥狀治療的替代方法(基于非留族和留族消炎)通過細胞因子抑制劑或軟骨保護劑進行，其被認為是“疾病改性藥物”(Qvist等2008)。其還包括患者血液獲得由內源(內源)蛋白質，并作為個體藥物再次向所述患者給藥的治療。W09909051公開了一種在事先由(動物或人類)患者獲得的體液試樣中制備治療性，內源(=內源)蛋白質，以及用于進行該方法的注射器。該方法所得蛋白質被描述為紅細胞生成素、胰島素、干擾素、白介素4、白介素10、可溶腫瘤枯斑因子受體和白介素一 I受體拮抗劑。蛋白質在注射器中制備并提供。該注射器的內部結構包括排列在注射器中的顆粒、浸潰在硫酸鉻中的玻璃珠，這樣的結構被能刺激所需蛋白質生物合成的固定誘導物覆蓋。在以血液作為體液試樣的情況下，免疫球蛋白，尤其是免疫球蛋白G被看作是用于刺激包含在血液中的單核細胞，從而形成消炎蛋白質的誘導物。該方法通過用來自患者的體液來充滿和培養該注射器進行。該治療性蛋白質在體液中形成。該方法得到的體液被無菌保存在注射器中，當需要時，直接重新導入患者，而無需額外的處理，例如，在離心和/或無菌過濾后。本發明的一個目的是進一步發展或改進該方法，使得產生的蛋白質具有更高的量，且避免不期望的副作用。該方法通過提供下述的方法實現，其中，容器含有金顆粒。術語“容器”在本文中是指用于儲存液體足夠時間的密閉容器或密閉貯藏器具，其中，容器或貯藏器具能防止儲存液體泄露。金作為藥物的用途在藥物領域中已知很久了。在19世紀末期，金尤其是用于治療肺結核。由于類風濕性關節炎也是傳染性疾病的錯誤假設，金也被用于該情況。治療是成功的，并持續使用多年直至現在(Kean and Kean 2008)。人類軟骨細胞的體外試驗示出金化合物(硫代蘋果酸金)能已知軟骨細胞產生一氧化氮(NO)。一氧化氮會對促炎癥細胞因子IL 一 I和TNFa產生破壞性的效果(Green等2006)。這會導致膠原和蛋白多糖的產生降低，會引起軟骨細胞細胞凋亡 并刺激金屬蛋白酶(Vuolteenaho等2005)。在現有技術已知的治療方法中，金可以肌肉給藥或口服。然而，使用合適的給藥方法和合適的金藥劑，在體內研究中已知的期望效果只能達到一定的程度。根據本發明的方法，首次提供了將金顆粒與人類或動物內源或同源體液，尤其是一個人自己的血樣在一個密閉體系中混合，令人驚訝地發現不僅(i )與以前的方法相比，在血液的情況下，期望的蛋白質濃度明顯提高，特別是軟骨系統(尤其是IL 一 1、IL 一 6、IL 一8、IL — 10、G — CSF,MCP — 1、MIP — 1、RANTES、TNF — alpha、GRO — alpha、MCP — 3、MIF和IL 一 1RA)，而且(ii)在培養過程中，由于老化的生理蛋白質得到已知，因此可疑的蛋白的質量更好，以及(iii)蛋白質凝溶膠蛋白明顯收集。凝溶膠蛋白是一種肌動蛋白粘結蛋白質，其普遍存在于動物細胞中(包括人類細胞)和體外(例如在血漿中)，其能使Ca2 +—肌動蛋白片段片段化，且能防止再聚合，其在肌動蛋白片段的收集和解聚的過程控制中能起到關鍵作用。凝溶膠蛋白在細胞質萃取物中發現并被確定，其普遍存在以及運動性細胞的種族發育保存揭示了其作為內細胞控制蛋白質的重要作用。稍后僅公開了凝膠溶蛋白還存在于哺乳動物的血漿中，且能解聚肌動蛋白。該所謂的血漿凝膠溶蛋白(pGelsolin，pGS)是細胞質凝膠溶蛋白(cGelsolin, cGS)的異構形式,且與其結構不同，其在N端基末端具有額外的23氨基酸。血漿凝溶膠蛋白的生理功能仍然是大量研究工作的目標(DiNubriu，2007和其中引用的文獻)。凝膠溶蛋白調控重要的細胞功能，例如細胞運動性、吞噬、細胞凋亡和血小板激活(Silacci等2004, Trickey等2004)。在患有類風濕性關節炎的患者情況下，凝膠溶蛋白的血漿濃度降低(Osborn等2008).在包括組織變性在其它疾病的情況下，尤其是在敗血癥的情況下，凝膠溶蛋白的血衆濃度也會降低(Suhler等1997, Osborn等2008,Lee等2007)。現有技術的知識指出了血漿凝膠溶蛋白起到吸收身體過量炎癥反應的緩沖液(DiNubile2008)。通過本發明方法制備的蛋白質，尤其是溶膠凝蛋白和細胞因子，能(但不是必須)與直接與容器中的其它液體成分一起重新向患者給藥，例如不進一步處理，例如離心、無菌萃取或轉移至其它容器。結果，可以避免蛋白質溶液的污染，在蛋白質給藥中患者感染的風險被最小化。在根據本發明方法的本發明的變形中，金顆粒可以在體外培養后，從體液，例如血清中移除，并拋棄。其優點是在所述體液，例如所述血清的給藥中或之后，金引誘的不利效果可以完全避免。在根據本發明方法的另一優選的本發明變形中，不僅金屬顆粒，而且細胞(例如血液細胞)與其它不溶收集物在體外培養后從體液(例如血清)移除并拋棄。制備的內源人體體液，尤其是血清具有出人意料的容忍性，且沒有不期望的副作用。該方法中使用的金顆粒具有限定的結構和/或尺寸。具有10納米 500微米的顆粒尺寸的微粒和/或納米顆粒是特別適合的。在本發明方法的變形中，金顆粒可以在體外培養后，從體液，例如血清中移除，并拋棄，優選在該方法中使用約Iym尺寸的金顆粒，更優選每IOml存在IO3 — IO4量的金顆粒。對于該用途，實踐中，容積為約IOml的容器(例如注射器)已經被確認。在實際使用中已經被驗證成功的實施方式中，金顆粒以每Iml體液為O. 3mg的量存在于容器中。每Iml為O.1 — Img的濃度是理論事實并被使用。容器的內部結構優選沒有阻凝劑，例如肝素、檸檬酸、EDTA或CPDA，這是由于本發明基于的部分事實，令人驚訝地發現，存在少量該物質的情況下，與沒有其相比，會生物合成出少量的蛋白質。尤其是在血液作為體液，肝素作為阻凝劑的情況下，存在肝素，例如涂布在容器內壁上，與沒有肝素和其它阻凝劑相比，獲得明顯少量的細胞因子。作為容器，尤其可以是 注射器，這是由于其不僅可以用作培養容器，還可以同時作為用于收集裝置和/或作為用于向患者注射蛋白質的給藥裝置。作為容器，還可以是密封袋，尤其是在相對大體積的情況下，與具有相同體積的注射器相比，其處理和儲存更方便，且由于其能通過技術上簡單且安全的方法與注射器連接，且能通過該注射器填充和清空。根據本發明的方法非常適合由血液細胞制備(生物合成)并收集蛋白質。因此，作為體液，可以是血液，尤其是血清。令人驚訝的是，使用根據本發明的方法，可以特別有效地，例如大量地制備治療性蛋白質凝膠溶蛋白。因此，根據本發明的方法尤其適合獲得凝膠溶蛋白。除了裝滿體液的容器的培養條件以外，實踐中還示出了培養時間為12 — 72小時，優選24小時。溫度為20°C — 41°C，優選37°C能獲得良好的結果。所述任務的解決方法還可以是提供一種用于在體液中進行體外合成和收集(體外誘導)治療性蛋白質的容器，其中，容器含有金顆粒，且適合收集，儲存和再分散體液試樣，其能與中空針(插管、注射管)連接，從而其所含物可以通過所述中空針(插管、注射管)注射。使用該容器，尤其適合進行上述蛋白質制造方法，且具有相關的優點。制備的蛋白質可以通過連接的中空針直接在期望的位置給藥，尤其是直接導入人體或動物體。金顆粒優選具有規定的結構和/或規定的尺寸。微粒和/或納米顆粒(顆粒尺寸在10納米一 500微米)是特別適合的。金顆粒在容器中的合適量是每Iml體液為O.1mg 一IOmg,優選每Iml體液O. 3mg。容器優選為注射器或密封袋。注射器的優點是其不僅可以用作培養容器，同時還能作為用于收集體液的收集裝置和/或作為將蛋白質注入患者的給藥裝置。密封袋的優點是與具有相同體積的注射器相比，其處理和儲存更方便，且能與注射器相連以填充和清空。特別適合的容器是市售的在內部沒有特別設計的注射器(例如，5 -1OOml注射器)。可以將金顆粒(例如來自Biorad Laboratories,Cat. 165 一 2264的金微載體)引入注射器圓筒中。注射器，尤其是注射器圓筒的內壁和在圓筒中的注射器注射塞，優選由塑料構成，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚偏氯乙烯、聚丙烯(中性S — Monovettes, Sarstedt)或類似物質或其類似物。容器特別適合用于由血液細胞制備(生物合成)和收集蛋白質，尤其是凝膠溶蛋白。因此，作為體液，可以是血液，尤其是血清。根據本發明方法在體液中制備的蛋白質可以與體液和金顆粒，或沒有金顆粒，來制備用于治療疾病的藥物。通過本發明方法制備的富蛋白質，尤其是富細胞因子和富凝膠溶蛋白的體液，特別是血液血清能安全、廉價、快速地制備，尤其是在副作用上，能有效代替常規的藥劑。因此，本發明還提供了一種富蛋白質體液，尤其是富細胞因子和富凝膠溶蛋白的血液血清，用于藥物或用于制備藥物，該體液通過如下獲得，使用體液，尤其是血液血清，容器含有金顆粒，優選金顆粒尺寸為I μ m, 優選每IOml容器具有IO3 — IO4金顆粒(或每Iml血液/容器為O. 3mg直徑為I μ m的金顆粒)，培養該由體液，尤其是血清以及金顆粒組成的混合物(例如培養12 - 72小時，優選24小時，在20°C — 41°C下，優選在37°C下)，接著將金顆粒和優選(例如任選)額外的血液細胞和其它不溶的成分從體液，尤其是血清移除并拋棄(優選通過離心和/或無菌過濾)。本發明還提供了內源或同源血液與金顆粒聯用作為藥物或制備藥物的用途。換句話說本發明還提供了由內源或同源血液與金顆粒組成的物質混合物用作藥物，或包含由內源或同源血液與金顆粒組成的物質混合物，其中包括積聚的蛋白質作為活性成分。根據本發明的藥物能簡單、廉價、低風險和有效的治療。所述藥物特別適合于治療變形關節疾病，尤其是關節病和肌腱病。尤其是用金顆粒培養，然后將顆粒去除的藥物特別適合用于治療關節病和其它與組織病變和/或與凝膠溶蛋白缺乏相關的疾病。根據本發明的優選實施方式是用金顆粒培養體液(尤其是血液)，在培養后，凝膠溶蛋白的含量至少是相應的凝膠溶蛋白的血液標準值的兩倍。在本文中，術語“凝膠溶蛋白的血液標準值”是指在需要用藥物治療的患者群中藥物或獸藥凝膠溶蛋白的標準值。患者群的特征是動物學種類和種族，性別以及年齡。該富凝膠溶蛋白藥物非常適合于治療與患者血液中凝膠溶蛋白缺乏相關的疾病，例如敗血癥或中風。培養的血液一金混合物可以整體或分批給藥。如果需要，可以在向(動物或人類)患者給藥前，進行離心和/或無菌分離，從而例如從血液移除細胞和細胞片段，因此同時可以降低注射體積。
以下本發明通過實施例和附圖進行更詳細的描述

圖1表示在不同患者中，在進行(TO)根據本發明方法和之后(T24)，與對照群的蛋白質特征的MID - FTIR光譜分析。藍色表示TO時間的蛋白質特征，綠色表示在T24時間，使用根據本發明的方法治療的患者的蛋白質特征，紅色表示在T24時間，對照血清的蛋白質特征。圖2表示蛋白質的多成分分析的結果GS =凝膠溶蛋白IL —4=白介素一4IL— 10=白介素一10IL— I3=白介素一I3
IL -1Ra =白介素一I受體拮抗劑IL— 1β=白介素一1βTNF — α =腫瘤壞死因子αG - CSF =粒細胞菌群刺激因子GM - GSF =粒細胞巨噬細胞菌群刺激因子IFN — g =干擾素 YSCGF - β =造血干細胞成長因子MIP -1a =巨噬細胞炎癥蛋白質一 IaMIP — 1β =巨噬細胞炎癥蛋白質一1βVEGF =血管內皮成長因子IL— I8=白介素一I8MCP - 3 =巨噬細胞趨藥性蛋白質SDF — a =基質衍生因子Basic FGF =成纖維細胞GRoa =成長調節致癌基因α在血液中培養TO時間(“Τ0”)和培養24小時后，沒有進一步的處理(“Kontrolle”)，以及根據W09909051 (“StdT”)或通過根據本發明的方法(“Erfindung”)。圖3表示所有測試馬匹在根據本發明的治療前和治療后，在特定的再測試時間的膨脹程度的圖示。圖4表示所有測試馬匹在根據本發明的治療前和治療后，在特定的再測試時間的殘疾程度的圖示。圖5表不在患有膝關節病的患者治療如或后的KOOS值。圖6表示患有膝關節病的患者在如下時間段的滑液中的積液和凝膠溶蛋白濃度在第一次(Tl)、第二次(T2)、第三次(T3)注射后。圖7表不在沖擊治療后外植體/軟骨制劑的蛋白多糖釋放。實施例1 :在根據本發明的方法后，以及在根據本發明的容器中，通過MID - FTIR光譜方法和多成分分析，檢測血樣中的蛋白質制備在根據本發明的容器中，從11個不同的患者(Nr.1 — 11)收集兩份9ml血樣，該容器是實現填充了 2.7mg金顆粒(直徑為Ιμπι)的9ml注射器。在沒有金顆粒作為含有物的同樣的9ml注射器中收集來自同樣來源(患者)的同樣量的血樣。在不同的時間分析試樣，即在血液去除后的TO時間立刻進行和在37°C下培養24小時的T24時間。通過傅立葉轉換紅外光譜，在中紅外范圍(光譜范圍從4000CHT1 - 400CHT1)分析試樣，通過短 MID — FTIR 光譜分析(例如 Firma Micro — BiolyticsGmbH/Esslingen 的AquaSpec法)分析試樣。傅立葉轉換紅外光譜的測定原則是基于具有電磁波的物質的輻射，其在特定范圍內被吸收。由于紅外線輻射在分子間振動程度的范圍內具有能量，吸收會刺激鍵的振動。使在測量范圍(表格)中，以偏離的形式可見。由于每一種鍵的能量或頻率是特定的，因此還可以鑒定出物質和明確的結構。TFIR光譜特別適合于分析生物大分子中的結構，反應引誘變形。使用該方法，能研究生物系統，由于是含蛋白質的含水液體。該試樣既不能改性，也不能被破壞，且需要在生物分子的天然條件下進行，即可以測定“實際狀態”，這是由于需要既不是固定，也沒有各種種類的試樣。 由于蛋白質所有的分子組成在紅外光譜范圍內具有吸收帶，實際上蛋白質所有的區域都可以觀察到，且能獲得關于蛋白質結構的詳細信息。MID - FTIR光譜法可以自動和重復地定性和定量蛋白質構造中的改變，并確定蛋白質濃度。即使非常低的蛋白質濃度(低至O. lmg/ml)和非常小的構造改變，也能夠測定。當在本發明的文字描述中進行該方法時，具有或沒有金顆粒的血樣可以在“實際”狀態下，在光譜測定細胞(轉移細胞)中進行分析，該分析非常準確，生物可兼容，且適合用于含水試樣。使用內部校準，對于每一測量試樣，可溶蛋白質的濃度及其第二結構(α —螺旋，β —片)均能自動測定。該測定的結果在圖1中進行圖示。其表示在金顆粒存在下，根據本發明進行培養的試樣的生物特性與對照試樣不同。所有試樣在TO時間下的測量值用藍色顯示，且主要集中在左上象限。在根據本發明的方法，培養24小時后的測量值用綠色顯示，且主要集中或靠近左下象限。這表示在血液培養中生理蛋白質的老化被添加的金已知。對照試樣培養24小時后的測量值用紅色顯示，且主要集中在右上象限。偏右表示蛋白質結構老化。使用基于不同代碼微顆粒(例如來自BioRad Laboratories, Munich的BioPlex 2200系統)的多參數分析方法(同義詞多成分分析)，在時間TO和T24，在與根據本發明(“Erfindung”)相關的試樣，與根據W09909051 (“StdT”和)相關的試樣和沒有處理的相應對照群中，測定下述蛋白質凝膠溶蛋白(GS)、白介素一 4 (IL 一 4)、白介素一 10 (IL 一 10)、白介素-13(IL-13)、白介素-1受體拮抗劑(IL_41Ra)、腫瘤壞死因子a (TNF - α )、粒細胞菌群刺激因子(G — CSF)、粒細胞巨噬細胞菌群刺激因子(GM — GSF)、干擾素Y (IFN — g)、造血干細胞成長因子(SCGF — β )、巨噬細胞炎癥蛋白質一 la(MIP — la)、巨噬細胞炎癥蛋白質一1β (MIP — 1β )、血管內皮成長因子(VEGF)、白介素一 18 (IL — 18)、巨噬細胞趨藥性蛋白質(MCP - 3)、基質衍生因子(SDF - a)、成纖維細胞(Basic FGF)、成長調節致癌基因α(GRoa)。這些蛋白質在組織繁殖和組織修補中扮演著重要的角色。該分析的結果在表I中示出，并在圖2中進行圖示。
其顯示出根據本發明處理的試樣(“Erfindung”)在處理24小時后，凝膠溶蛋白濃度(因子10)明顯增加，然而在對比試樣(“KontiOlle-T24”和“StdT T24”)中，發現凝膠溶蛋白消失而不是凝膠溶蛋白積聚。根據本發明處理試樣中的腫瘤壞死因子a(TNF — α)、巨噬細胞趨藥性蛋白質(MCP — 3)、成長調節致癌基因a (GRoa)也基本上(TNF-α :因子30-40，MCP-3 :因子 20-30)或明顯高于對比試樣(“Kontrolle_T24” 和 “StdT T24”)。實施例2 :在動物中的藥效研究A)軟組織腫脹作為預期的臨床研究的一部分，用根據本發明的藥物對8匹由于肌腱(在于骨骼相連的部分進行變性改變)導致軟組織腫脹的馬進行治療。為了制備該藥物，根據本發明的容器是含有金顆粒的注射器形式，其裝滿了來自動物的血液，并在37°C范圍的溫度下培養24小時。在培養期的末期，藥物以在注射器中的血液形式完成，含有在該期間合成和積聚的蛋白質，尤其是細胞因子和凝膠溶蛋白，以及金顆粒，其可以直接并立刻使用。由于藥物在注射器中制備，其可以通過注射向動物給藥，而無需轉移，因此沒有污染的風險和物質損失。對于目前的研究，對于每匹馬，在時間TO制備四份該藥劑，即將四個含金顆粒的注射器裝滿來自動物的血液，并在37°C范圍的溫度下培養24小時。在每個案例中，該藥物注射劑每隔一星期就向每匹馬給藥。第一次給藥在時間T24進行，第二、三、四次在I周 、2周、3周后進行。用于第二、三和四次給藥的含藥物的注射器在零下20°C下儲存直至使用。在I周、2周、3周、3個月、6個月和I年后檢查腫脹的狀態，并用0_5的等級鑒定(0=完全沒有腫脹，5=大量腫脹)。在全部8個案例中，在僅3周后發現腫脹明顯減少，在6個月，甚至I年后，所有的馬匹完全沒有腫脹。在治療中，完全沒有發現副作用。該研究的結果在圖3中圖示。B)殘疾在進一步的馬匹研究中，對存在殘疾臨床癥狀的11匹馬(12個影響的末端)用根據本發明的藥物進行治療。殘疾的醫學原因是，在6個案例中，在關節中存在變性軟骨改變(η = 6)，在6個案例中，存在軟組織疾病(η = 6)。為了制備該藥物，對于每匹馬，將四個含有金顆粒的注射器形式的根據本發明的容器再次裝滿來自動物的血液，并在37°C范圍的溫度下培養24小時。在培養期的末期，藥物基本以在注射器中的血液形式完成，含有在該期間合成和積聚的蛋白質，尤其是細胞因子和凝膠溶蛋白，以及金顆粒。為了最小化注射體積，通過在接下來的離心方法中，通過在5000rpm下離心10分鐘以移除細胞成分。僅將各自的上清液用于注射。在每個案例中，該藥物注射劑每隔一星期就向每匹馬給藥。第一次給藥在時間T24進行，第二、三、四次在I周、2周、3周后進行。用于第二、三和四次給藥的含藥物的注射器在零下20°C下儲存直至使用。在1、2、3周、3個月、6個月和I年后檢查殘疾的狀態，并用0_4的等級鑒定(0=完全沒有殘疾，5=大量殘疾)。
在全部12個案例中，在僅3周后發現殘疾明顯減少，在6個月，甚至I年后，所有的馬匹完全沒有癥狀。在治療中，完全沒有發現副作用。該研究的結果在圖4中圖示。實施例3 :制備根據本發明的含金顆粒的容器使用的金顆粒是金粉末(顆粒尺寸lym, Bio-Rad Laboratories, Munich)。僅可以首先進行無菌化，如制造商推薦的將需要量的金顆粒/金粉末，例如是30mg，與lml70%乙醇混合，在緩慢攪拌(混合器，渦流器)下培養10分鐘，在沉淀后簡單地離心I分鐘，接著移出上清液。然后，在每個案例中，用Iml無菌兩次蒸餾水洗滌金顆粒三次。在最后一次洗滌過程后，通過之后的離心和傾析上清液，將金顆粒在無菌PBS中再次懸浮，并調整成期望的濃度，例如60mg/ml。在連續攪拌下，使用移液管移出10 μ I金顆粒溶液，并轉移至S-Monovette-來自 Sarstedt (REF02. 1726. 001)的 neutral/9ml (92X 16mm)η 先在無菌工作臺(screw cap)中打開該monovettes,向內注射器壁中加入10 μ I金顆粒溶液,接著再次關上。填充的monovettes在室溫下儲存直至使用。在進行根據本發明的方法需要使用時,將9ml體液(例如血液)注入準備好的monovettes,并與金顆粒/PBS溶液混合。實施例4 :在人體中的藥效研究作為預期的長期研究的一部分，將患有放射學檢測的膝關節疾病的九個患者或十三個關節由注冊醫師治療。關節病的程度用根據Kellgren-Lawrence-Klassifkation(Kellgren J. H. and Lawrence J. S. RadiologicalAssessment ofOsteo-Arthrosis”，Ann. rheum. Dis. (1957), 16, 494-501)的等級 3-4 鑒定。所有的患者均每隔一周，接受向四次關節內注射根據本發明的內源血清，其先用金進行處理，然后去除顆粒。如果存在關節內積水，在每個案例中，均需在注射前排出，對排出量進行記錄，將Iml等分試樣在零下20°C冷凍以做進一步的處理。對在治療前以及使用確認點評價體系(同義詞:分數)“K00S” (Roos E. M. , Roos H. P. , Lohmander L. S. , Ekdahl C. , BeynnonB.D. : “Knee Injury andOsteoarthritis Outcome Score (KOOS - development of aself-administered outcomemeasure，，，J. Orthop. Sports Phys. Ther. 1998, 28:88-96)進行治療后1、3、6、12個月的治療臨床結果進行記錄。最大的可得點數量為100。點的數量越多，獲得的結果就越好。結果在圖5中圖示。對參數“癥狀”和“活動能力”的K00S分數的評估顯示，在3和6個月后，臨床癥狀得到明顯改進(參見圖5)。在一個患者中，開始存在大量積水。在每次注射治療前均將積水排除，對積水量進行記錄，并對滑液析出物測試其凝膠溶蛋白濃度。由于凝膠溶蛋白濃度取決于積水系統的程度，因此凝膠溶蛋白濃度基于脲濃度(Kraus et al. :Urea asa PassiveTransport Marker for Arthritis Biomarker Studies, ARTHRITIS&RHEUMATISMVol. 46, No. 2, February 2002，pp. 420-427)。結果在圖 6 中圖示。通過關節內給藥根據本發明制備的血清，即在用金顆粒培養，然后移除(所有的)顆粒的血清，可以明顯提高關節內凝膠溶蛋白濃度(參見圖6)。同時，積水的量減少(參見圖6 )，在臨床癥狀上也得到明顯改進。因此，該研究提供了用于治療關節病，通常是與凝膠溶蛋白缺失有關的疾病的藥物用途。
實施例5 :根據本發明的藥物在體內軟骨沖擊模型中的軟骨保護效果的證據在關節病發展期間，在關節軟骨中施加過量的機械負荷的影響是眾所周知的。也已經建立和確定了體外模型，其能測試在軟骨骨骼組織上施加機械負荷的影響，例如來自 Huser 和 Davies 的模型(Huser C. A. and Davies Μ. Ε. : ^Validationof an in vitrosingle-1mpact load model of the initiation of osteoarthritis-like changesinarticular cartilage”，J Orthop Res·，Apr 2006; 24 (4) : 725-732)。在該模型中，開始軟骨變性的良好指示是測量用于測試的軟骨骨骼試樣的培養介質中的蛋白多糖。在完成本發明的研究過程中，在迷你豬“O'lllmgCT Minipig”的動物實驗研究中，在6頭動物中，通過分別包含IO3金顆粒的9ml注射器，在每頭動物中收集(9ml)血液，并根據本發明的方法，在37°C下培養24小時。在培養期后，在注射器圓通中離心血液試樣，對于每一個注射器(或注射器圓筒)，通過無菌過濾器，將上清液移至清潔/新的無金顆粒的注射器圓筒中。在收集血液試樣的同時，在無菌條件下，從各個股骨頭收集軟骨骨頭試樣并切割成8X8X8mm (長/寬/高)的塊。在所有的組織中，軟骨肉眼觀察均是完好無損的。在沖擊實驗以前，將軟骨骨頭試樣塊放置在補充了 10%人類血清(HS)，100U/ml盤尼西林，100 μ g/ml慶大霉素和1. 25U/ml兩性霉素的DMEM介質中。在試樣收集的當 天進行沖擊試驗。出于該目的，將軟骨骨頭試樣塊/組織在無菌條件下排列在由聚甲基丙烯酸甲酯構成的圓形自由脫體管(滴下管)中，并高度為33cm，軸向在沖擊盤下方4cm。沖擊盤為如下形式高度為5cm，直徑為3. 94cm，重量為493g。沖擊盤(沖擊塞)通過線與實際沖擊盤(沖擊單元)相同，該盤重量為7g，高度/厚度為1cm，且直徑為0. 6cm。沖擊在每一個軟骨骨頭試樣塊放置在“滴下管”后進行，其中，具有沖擊塞的沖擊盤(沖擊器)的自由壁離試樣的高度為15cm。沖擊在28. 3mm2的軟骨表面上佳佳0. 736J。軟骨骨頭試樣塊/組織分成如下三部分·沒有進行沖擊處理的組織=“非沖擊對照” =“O對照”·進行了沖擊處理的組織=“沖擊過的對照”=“沖擊對照” 進行了沖擊處理，然后用根據本發明制備的富蛋白質血液血清進行培養的組織。在沖擊處理后，處理的軟骨產物以及O對照用PBS清洗三次，并移送至12頸培養盤中。每一個組織均提供3ml個字的處理介質，并在標準條件(37°C，5%C02)下，在培養期中培養。培養介質每72小時進行更換。根據本發明制備的富蛋白質血液血清在培養器中，在第O天和第7天添加組織群。在第2、7和14天時，對所有的測量標本測量培養介質中的蛋白多糖含量。因此使用來自 Biocolor Ltd. (Carrickfergus, UK)的 Blyscan GlycosaminoglycanAssay。結果在圖7中圖示。蛋白多糖釋放的分析示出，在所有三個組中，即O對照和兩個沖擊處理/沖擊組織/軟骨產物，蛋白多糖量在一定時間后增加。然而，在使用根據本發明的富蛋白血液血清處理的組織/軟骨產物中，該提高僅比非沖擊對照(O對照)稍高，然而，沒有響應血清處理的沖擊處理/沖擊組織(軟骨產物)顯不出非常聞的提升。
因此，該試驗提供了根據本發明藥物的軟骨保護效果的證據。表1:多參數分析方法
權利要求
1.一種在容器中制備至少一種治療性蛋白質或蛋白質混合物的方法，其中裝有體液，并進行培養，且在體液中形成治療性蛋白質，其特征在于，容器含有金顆粒。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，金顆粒在體外培養后，從體液移除并拋棄。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，金顆粒和身體細胞以及其他不溶的積聚物在體外培養后，從體液移除并拋棄。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，金顆粒具有規定的尺寸，尤其是微粒和/或納米顆粒。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，在容器中，金顆粒的量是每Iml體液為O.1mg-1Omg,優選每Iml體液為O. 3mg。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，金顆粒的尺寸為Iμ m，每IOml的金顆粒量為103-104。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，容器是注射器。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，容器是密封袋。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，體液是血液。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，裝有體液的容器在200C -41°C，優選37°C的溫度下，培養12-72小時，優選24小時。
11.根據權利要求ι- ο中任一項所述的方法，其特征在于，治療性蛋白質是凝膠溶蛋白。
12.—種在體液中體外生物合成和積聚(體外誘導)治療性蛋白質的容器，其特征在于，容器含有金顆粒，其適于收集、儲存和再分散體液試樣，并能與中空針管相連，使得其所含物能夠通過中空針管進行注射。
13.根據權利要求12所述的容器，其中，金顆粒具有規定的尺寸，尤其是微粒和/或納米顆粒。
14.根據權利要求12或13所述的容器，其特征在于，在容器中，金顆粒的量是每Iml體液為O.1mg-1Omg,優選每Iml體液為O. 3mg。
15.根據權利要求12-14中任一項所述的容器，其特征在于，容器是注射器。
16.根據權利要求12-14中任一項所述的容器，其特征在于，容器是密封袋。
17.根據權利要求12-16中任一項所述的容器，其特征在于，體液是內源或同源血液。
18.根據權利要求12-17中任一項所述的容器，其特征在于，治療性蛋白質是凝膠溶蛋白。
19.一種用作藥物的物質混合物,其由內源或同源血液和金顆粒組成。
20.根據權利要求19所述的物質混合物，其特征在于，凝膠溶蛋白的含量至少是相應的凝膠溶蛋白的血液標準值的兩倍。
21.根據權利要求19或20所述的物質混合物，其特征在于，該藥物適合并認為能夠用于治療與凝膠溶蛋白相關的疾病。
22.根據權利要求19或20所述的物質混合物，其特征在于，該藥物適合并認為能夠用于治療與組織變性有關的疾病。
23.根據權利要求22所述的物質混合物，其特征在于，疾病是關節病，且該藥物適合并認為能夠用于治療關節病。
24.用作藥物的富細胞因子和富凝膠溶蛋白血液血清，其特征在于，在含有金顆粒的容器中收集血液血清，培養該血液血清與金顆粒組成的混合物，接著將金顆粒由血清移除并拋棄。
25.根據權利要求24所述的血液血清，其特征在于，凝膠溶蛋白的含量至少是相應的凝膠溶蛋白的血液標準值的兩倍。
26.根據權利要求24或25所述的血液血清，其特征在于，金顆粒和血液細胞以及其他不溶成分從血清移除并拋棄。
27.根據權利要求24-26中任一項所述的血液血清，其特征在于，金顆粒尺寸為約I μ m0
28.根據權利要求24-27中任一項所述的血液血清，其特征在于，-每IOml容器的金顆粒量為IO3-1O4,或每Iml血液/容器存在O. 3mg具有I μ m直徑的金顆粒。
29.根據權利要求24-28中任一項所述的血液血清，其特征在于，該藥物適合并認為能夠用于治療與組織變性有關的疾病。
30.根據權利要求29所述的血液血清，其特征在于，疾病是關節病，且該藥物適合并認為能夠用于治療關節病。
31.根據權利要求24-28中任一項所述的血液血清，其特征在于，該藥物適合并認為能夠用于治療與凝膠溶蛋白缺失相關的疾病。
全文摘要
本發明涉及一種在容器中制備至少一種治療性蛋白質或蛋白質混合物的方法。在該方法中，容器裝有體液和金顆粒，并進行培養，且在體液中形成治療性蛋白質。
文檔編號A61P19/02GK103037873SQ201180033707
公開日2013年4月10日 申請日期2011年6月21日 優先權日2010年7月7日
發明者尤里奇·施耐德 申請人:阿爾特羅根股份有限公司, 尤里奇·施耐德