莢膜革蘭氏陽性細菌生物綴合物疫苗的制作方法

專利名稱：莢膜革蘭氏陽性細菌生物綴合物疫苗的制作方法
莢膜革蘭氏陽性細菌生物綴合物疫苗相關申請的引用本申請根據35U.S.C.§ 119(e)要求于2010年5月6日提交的美國臨時專利申請N0.61/332，170的優先權，以其全文整體并入本文作為參考。聯邦政府資助研究的聲明本發明的一些方面是在國立衛生研究院(National institutes of Health)授予的授權號1R01A1088754-2，子授權號105699的政府支持下做出的。政府在本發明的這些方面具有某些權利。序列表本申請包含序列表，其通過EFS-Web以ASCII格式下提交，并以其整體并入本文作為參考。所述ASCII的拷貝于2011年5月2日建立，命名為031229US.txt，大小為206，590字節。
背景技術：
疫苗是現代醫學公共衛生領域中最重大的發明之一，并且已經拯救了數百萬條生命。免疫已被證明是預防和控制感染的理想途徑。疫苗每年能夠使多達三百萬人免于死亡，并使750，000名兒童免于殘疾。(Global Alliance for Vaccines and Immunization-PressReleases (2006 年 3 月 11 日)網 tit:www.gavialliance.0rg/media_centre/press_releases/2006_03_09_en_pr_queenra nia_delh1.php)。在 1999 年，CDC 宣布免疫是 20世紀最偉大的公共衛生成就(Ten great public health achievements-United States,1900-1999.MMWRMorb Mortal Wkly R印48:241-3 (1999 年 4 月 2 日))。一些細菌，諸如引起破傷風和白喉的細菌，產生在很大程度上引起這些疾病的毒素。該毒素能夠以減毒形式被用作疫苗。然而，對于大多數細菌而言，并沒有能夠用于開發疫苗的單一毒素。最成功的疫苗是諸如流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)和肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的細菌病原體的綴合至載體蛋白的表面多糖。 這些細菌被莢膜所包圍，其促進了微生物的致病性和對吞噬細胞殺傷的抗性，并保護其免于干燥。如果細菌多糖偶聯至含有T細胞表位的蛋白載體，其就能夠引起人類的長期免疫應答。這一觀點在80年前就已被闡明(Avery，0.T.和W.F.Goebel.1929.Chemo — immunological studies on conjugatedcarbohydrate—proteins.11Immunological specificity of synthetic sugar-proteins.J.Exp.Med.50:521-533),并且之后被聯至蛋白載體白喉毒素的B型流感嗜血桿菌(Haemophi Ius influenzaetype B, HIB)的多糖偶所證實(Anderson, P.1983.Antibody responses toHaemophilus influenzae type b and diphtheria toxin induced by conjugates ofoligosaccharides of the type b capsule with the nontoxic protein CRM197.1nfect Tmmun39:233-8 ；Schneerson, R., 0.Barrera, A.Sutton 和 B.Robbins.1980.Preparation, characterization, andimmunogenicity of Haemophilus influenzaetype b po lysacchari de-protein conjugates.J Exp Medl52:361-76)。該糖綴合物(glycoconjugate)也是于1987年在美國被許可的第一種綴合物疫苗，并在之后不久就引入美國嬰兒免疫計劃。除了 HIB之外，綴合物疫苗也被成功用于對抗莢膜內人病原體腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)。這些疫苗的常規應用導致了鼻咽部定植和感染的減少。目前大約25%的全球疫苗市場包含綴合物疫苗。革蘭氏陽性細菌具有被莢膜多糖包圍的細胞膜。葡萄球菌(Staphylococcus)就是一類這樣的革蘭氏陽性細菌。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起感染。金黃色葡萄球菌是一種機會性細菌病原體，是引起廣譜的人類疾病的原因。盡管金黃色葡萄球菌可以在正常人的黏膜表面定植，但其也是傷口感染的主要原因，并具有引發嚴重感染的侵襲能力，包括骨髓炎、心內膜炎和菌血癥并伴有代謝性并發癥(Lowy, F.D.1998.Staphylococcus aureusinfections.New Engl J Med339:520-32)。金黃色葡萄球菌是涉及呼吸機相關性肺炎的最常見媒介之一，并且其也是社區獲得性肺炎的重要的和新興的起因，影響之前身體健康的成人和缺乏預防風險因素的兒童(Kollef, M.H.，K.Shorr, Y.P.Tabak, V.Gupta, L.Z.Liu和 R.S.Johannes.2005.Epidemiology and outcomes of health-care-associatedpneumonia:results from a large US database of culture-positive pneumonia.Chestl28:3854-62 ；Shorr, A.F.2007.Epidemiology and economic impact ofmeticillin—resistant Staphylococcus aureus: review and analysis of theliterature.Pharmacoeconomics25:751-68)。金黃色葡萄球菌是醫院內菌血癥(nosocomial becteremia)的第二常見的起因，并且耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus, MRSA)菌株占據了美國加護病房的所有感染的50%以上。醫院和社區的金黃色葡萄球菌的感染還在增加。MRSA菌株在1974年從2%的葡萄球菌感染一級在2004年從63%的葡萄球菌感染中被分離出來。許多醫院內MRSA菌株是耐多藥的，并且即使甲氧西林敏感性菌株也可以是致死性的。一份最近的報告利用基于 種群的活性實例發現，其顯示2005年在美國發生了 94，360例侵襲性MRSA感染，并且這些大部分(58%)發生在醫院外(Klevens，R.Μ.，M.A.Morrison, J.Nadle,S.Petit, K.Gershman, S.Ray, L.H.Harrison, R.Lynfield, G.Dumyati, J.M.Townes,A.S.Craig, E.R.Zell, G.E.Fosheim, L.K.McDougal, R.B.Carey 和 S.K.Fridkin.2007.1nvasive methici11 in-resistant Staphylococcus aureus infections in the UnitedStates.JAMA298:1763-71)。在該分析中，相比于AIDS，在2005年更多美國人死于MRSA(>18，000 例死亡)。金黃色葡萄球菌USA100，也稱為紐約/日本克隆，是主要的美國醫院獲得性MRSA 菌株的 MRSA 菌株(McDougal, L.K.，C.D.Steward, G.E.Killgore, J.M.Chaitram,S.K.McAllister 和 F.C.Tenover.2003.Pulsed-field gel electrophoresis typingof oxaci11 in-resistant Staphylococcus aureus isolates from the UnitedStates:establishinga national database.J Clin Microbiol41:5113-20)。流行病學分析表明，金黃色葡萄球菌每年僅在美國就引起大約兩百萬例臨床感染(Fridkin, S.K., J.C.Hageman, M.Morrison, L.T.Sanza, K.Como-Sabetti, J.A.Jernigan,K.Harriman, L.H.Harrison, R.Lynfield 和 Μ.M.Farley.2005.Methicillin-resistantStaphylococcus aureus disease in three communities.N Engl J Med352:1436—44 ;King，M.D.，B.J.Humphrey, Y.F.Wang, E.V.Kourbatova, S.M.Ray 和 Η.M.Blumberg.2006.Emergence of community-acquired methici11 in-resistantStaphylococcus aureusUSA300clone as the predominant cause of skin and soft—tissue infections.AnnIntern Medl44:309-17 ;Klevens，R.Μ.，M.A.Morrison, J.Nadle，S.Petit, K.Gershman,S.Ray, L.H.Harrison，R.Lynfield, G.Dumyati, J.M.Townes, A.S.Craig, E.R.Zell,G.E.Fosheim, L K.McDougal，R.B.Carey, S.K.Fridkin 和 M.1.for the Active BacterialCore surveillance.2007.1nvasive methicillin-resistant Staphylococcus aureusinfections in the United States.JAMA298:1763-1771 )。金黃色葡萄球菌感染不僅在數量上增加，而且金黃色葡萄球菌對抗生素的耐性也在增加。MRSA占了美國醫院金黃色葡萄球菌感染的40%-60%，而這些菌株的大多數是耐多藥的。由于作為醫院內感染的主要來源而聲名狼藉的金黃色葡萄球菌最近又具有了一個新角色，即引起缺乏預防風險因素的非醫院人群的社區性獲得性感染的數目逐漸增加。惡性社區相關MRSA (CA-MRSA)菌株在美國和歐洲變得更加流行，已經在全球范圍內觀察到其傳播(Baggett，H.C，T.W.Hennessy,K.Rudolph，D.Bruden，A.Reasonover, A.Parkinson，R.Sparks，R.M.Donlan，P.Martinez,K.Mongkolrattanothai 和 J.C.Butler.2004.Community-onset methicillin-resistantStaphylococcus aureus associated with antibiotic use and the cytotoxinPanton-Valentine leukocidin duringa furunculosis outbreak in rural Alaska.J Infect Disl89:1565-73 ;Gilbert，M.，J.MacDonald，D.Gregson，J.Siushansian,K.Zhang, S.Elsayed，K.Laup I and, T.Louie，K.Hope，M.Mulvey, J.Gillespie，D.Nielsen，V.Wheeler, M.Louie, A.Honish, G.Keays 和 J.Conly.2006.0utbreak in Albertaof community-acquired(USA300)methici11 in-resistant Staphylococcus aureusin people with a history of drug use，homelessness orincarceration.CanadMed Assoc J175:149—54 ；Kazakova, S.V.，J.C.Hageman, M.Matava，A.Srinivasan，L.Phelan，B.Garfinkel, T.Boo, S.McAllister, J.Anderson, B.Jensen，D.Dodson,D.Lonsway, L K.McDougal，M.Arduino，V.J.Fraser，G.Killgore，F.C.Tenover, S.Cody 和D.B.Jernigan.2005.A clone of methici11 in-resistantStaphylococcus aureus amongprofessionalfootball players.N Engl J Med352:468-75)。不僅金黃色葡萄球菌對甲氧西林的耐藥性變得更為普遍，而且已經報道了對萬古霉素的敏感性降低的多種分離株。已經在美國分離出攜帶vanA并對萬古霉素具有完全耐性的金黃色葡萄球菌的7種臨床分離株。這些分離株也是耐甲氧西林的(Chang, S.，D.M.Sievert, J.C.Hageman, M.L.Boulton, F.C.Tenover, F.P.Downes,S.Shah, J.T.Rudrik, G.R.Pupp, W.J.Brown, D.Cardo 和 S.K.Fridkin.2003.1nfectionwithvancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistancegene.New Engl J Med348:1342-7)。由于金黃色葡萄球菌并不能總是被抗生素所控制，并且MRSA分離株在社區中變得日益流行，因而急切地需要其他控制策略，例如疫苗。金黃色葡萄球菌莢膜 多糖涉及感染。多種毒性因子促成了葡萄球菌感染的發病機理，包括表面相關粘附物、分泌的外蛋白和毒素、以及免疫逃避因子(Foster，T.J.2005.1mmune evasion by staphylococc1.Nature Reviews Microbiology3:948—58)。像很多侵襲性細菌病原體一樣，金黃色葡萄球菌產生莢膜多糖(CP)(圖4)，其通過宿主先天免疫防御來增強對清除的抗性。金黃色葡萄球菌的大多數臨床分離株是包具有莢膜的，并且血清型 5 和 8 菌株占主導地位(Arbeit，R.D.，W.W.Karakawa, W.F.Vann 和 J.B.Robbins.1984.Predominance of two newly described capsular polysaccharide types amongclinical isolates of Staphylococcus aureus.Diagn Microbiol Infect Dis2:85_91)。5型(CP5)和8型(CP8)莢膜糖蛋白具有相似的三糖重復單元，該三糖重復單元包含N-乙酰氨基甘露糖醛酸(ManNAcA)、N-乙酰L-巖藻糖胺(L-FucNAc)JP N-乙酰D-巖藻糖胺(D-FucNAc) (Jones, C.2005.Revised structures for the capsular polysaccharidesfrom Staphylococcus aureus types5and8， components of novel glycoconjugatevaccines.Carbohydr Res340:1097-106。CP5和CP8在血清學上是不同的，這歸因于糖之間的連接和O-酰基化位點的不同(圖4)。之前的研究已經將金黃色葡萄球菌莢膜產生與體外吞噬細胞攝取和殺死關聯起來(Fattom，A.，R.Schneerson, S.C.Szu，W.F.Vann, J.Shiloach，W.W.Karakawa 和J.B.Robbins.1990.Synthesis and immunologic properties in mice of vaccinescomposed of Staphylococcus aureus type5and type8capsular polysaccharidesconjugated to Pseudomona s aeruginosa exotoxin A.1nfect Immun58:2367—74 ；Thakker, M.， J.-S.Park， V.Carey 和 J.C.Lee.1998.Staphylococcus aureusserotype5capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterialvirulence in a murine bacteremia model.1nfect Immun66:5183-5189 ；Watts, A.,
D.Ke, Q.Wang, A.Pillay, A.Nicholson-Weller 和 J.C.Lee.2005.Staphylococcus aureusstrains that express serotype5or serotype8capsular polysaccharides differ invirulence.1nfect Immun73:3502_ll)。人類嗜中性粒細胞在具有補體活性的非免疫血清存在下吞噬莢膜陰性突變體，而莢膜包被的分離株需要莢膜特異性抗體和補體兩者用于最優化調理吞嗷殺除(opsonophagocytic killing) (Bhasin，N.，A.Albus，F.Michon，P.J.Livolsi, J.-S.Park 和 J.C.Lee.1998.1dentification of a gene essentialfor0-acetylation of the Staphylococcus aureus type5capsularpoIysaccharide.MolMicrobiol27:9-21 ；Thakker, M.，J.-S.Park, V.Carey 和 J.C.Lee.1998.Staphylococcusaureus serotype5capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhancesbacterial virulence in a murine bacteremia model.1nfect Immun66:5183—5189 ;Watts, A.，D.Ke, Q.Wang, A.Pi I lay，A.Nicholson-Weller 和 J.C.Lee.2005.Staphylococcusaureus strains that express serotype5or serotype8capsular polysaccharidesdiffer in virulence.1nfectImmun73:3502-11)。Nilsson 等人(Nilsson，1.-M.,J.C.Lee, T.BremelI, C.Ryden 和 A.Tarkowsk1.1997.The role of staphylococcalpolysaccharide microcapsule expression in septicemia and septic arthritis.1nfect Immun65:4216-4221)報道了與親代菌株Reynolds相比，來自小鼠的腹膜巨噬細胞顯著地吞噬更大數量的CP5-陰性突變株。被吞噬后，CP5-陽性株比突變株在細胞內存活更長時間。Cunnion 等 ACCunnion, K.M.，J.C.Lee 和 Μ.M.Frank.2001.Capsuleproduction and growth phase influence binding of complement to Staphylococcusaureus.1nfect Immun69:6796-6803)比較了同基因金黃色葡萄球菌株的調理作用，并證明了 CP5-陽性株比莢膜突變體結合少42%的血清補體(C’)。金黃色葡萄球菌疫苗的開發常規地涉及莢膜作為靶標。由于人類中金黃色葡萄球菌感染的變化無常的表現和臨床復雜性，因此保護對抗葡萄球菌疾病的疫苗設計變得十分復雜。許多金黃色葡萄球菌疫苗候選物已經在被感染的動物模型中得到研究，但是據報道僅有兩種免疫治療方案完成了 III期臨床試驗(Schaffen A.C和J.C.Lee.2008.Vaccination and passive immunisation against Staphylococcus aureus.1nt JAntimicrob Agents32Suppll: S71-8)。第一種疫苗是基于在金黃色葡萄球菌的臨床菌株中最為流行的兩種莢膜多糖(CP)(圖4)。Fattom等人(Fattom，A.R.Schneerson，S.C.Szu, W.F.Vann, J.Shiloach，W.W.Karakawa 和 J.B.Robbins.1990.Synthesis andimmunologic properties in mice of vaccines composed of Staphylococcus aureustype5and type8capsular polysaccharides conjugated to Pseudomonas aeruginosaexotoxin.1nfect Immun58:2367-74)將血清型 5 (CP5)和血清型 8 (CP8)多糖綴合至非毒性重組銅綠色假單胞菌(P.aeruginosa)的外蛋白A (rEPA)0該綴合物疫苗在小鼠和人類中有免疫原性，并且其誘導調理素的抗體，后者顯示出在保護嚙齒動物免受致死和非致死葡萄球菌感染的效力(Fattom，A.R.Schneerson, S.C.Szu, W.F.Vann, J.Shiloach，W.W.Karakawa 和 J.B.Robbins.1990.Synthesis and immunologic properties inmice of vaccines composed of Staphylococcus aureus type5and type8capsularpolysaccharides conjugated to Pseudomonas aeruginosa exotoxin.1nfectImmun58:2367-74 ;Fattom，A.，R.Schneerson，D.C.Watson, W.W.Karakawa, D.Fitzgerald,1.Pastan，X.Li，J.Shiloach，D.A.Bryla 和 J.B.Robbins.1993.Laboratory and clinicalevaluation of conjugate vaccines composed of S.aureus type5and type8capsularpolysaccharides bound to Pseudomonas aeruginosa recombinant exoprotein A.1nfectImmun61:1023-32 ;Fattom，A.1.，J.Sarwar, A.0rtiz 和 R.Nas0.1996.A Staphylococcusaureus capsular polysaccharide (CP) vaccine and CP-specific antibodies protectmice against bacterial challenge.1nfect Immun64:1659—65 ;Lee，J.C, J.S.Park,S.E.Shepherd, V.Carey 和 A.Fattom.1997.Protective efficacy of antibodies tothe Staphylococcus aureus type5capsular polysaccharide in a modified model ofendocarditis in rats.1nfect Immun65:4146-51 )。被動免疫研究表明，CP5-和 CP8-特異性抗體使得金黃色葡萄球菌乳腺炎的鼠科動物模型中的感染顯著降低(Tuchscherr，L.P.，F.R.Buzzola, L.P.Alvarez, J.C.Lee 和 D.0.Sordell1.2008.Antibodies to capsularpolysaccharide and clumpingfactor A prevent mastitis and the emergence ofunencapsulated and smal1-colony variants of Staphylococcus aureus in mice.1nfectImmun76:5738-44)。組合的CP5-和CP8-綴合物疫苗在人類中顯示安全，并產生顯示出調理吞噬活性的抗體。金黃色葡萄球菌疫苗的開發也涉及表面蛋白作為靶標。第二種金黃色葡萄球菌臨床疫苗的試驗是基于對葡萄球菌粘附物的抗體對預防葡萄球菌感染的保護有效性。金黃色葡萄球菌聚集因子A 是細胞壁錨定的蛋白，其在表面被表達，介導葡萄球菌粘附至纖維蛋白原(Foster，T.J.和 M.Hook.1998.Surface protein adhesins ofStaphylococcus aureus.Trends Microbio 16:484-8)，并促進金黃色葡萄球菌附著至生物材料表面(Vaudaux, P.E.，P.Francois, R.A.Proctor, D.McDevitt，T.J.Foster,R.M.Albrecht, D.P.Lew, H.Wabers 和 S.L Cooper.1995.Use of adhesion-defectivemutants of Staphylococcus aureus to define the role of specific plasmaproteins in promotingbacterial adhesion to canine arteriovenous shunts.1nfection&Immunity63:585-90)、血液凝塊、和損傷的內皮表面(Moreillon，P.，J.M.Entenza, P.Francioli, D.McDevitt, T.J.Foster, P.Francois 和 P.Vaudaux.1995.Role of Staphylococcus aureus coagulase and clumpingfactor in pathogenesisof experimental endocarditis.1nfection&Immunity63:4738_43)0 ClfA 的纖 維蛋白原結合結構域位于全長蛋白的區域A內(McDevitt，D.，P.Francois, P.Vaudaux和 Τ.J.Foster.1995.1dentification of the ligand-binding domain of thesurface-locatedbrinogen receptor(clumpingfactor)of Staphylococcus aureus.Molecular Microbiology 16:895-907)D ClfA在金黃色葡萄球菌結合至血小板時起到重要作用，該結合在導管誘導的葡萄球菌心內膜炎的動物模型中是危險性的(Sullam，P.M.，A.S.Bayer, W.M.Foss 和 A.L Cheung.1996.Diminished platelet binding in vitro byStaphylococcus aureus is associated with reduced virulence in a rabbit model ofinfective endocarditis.1nfection&Immunity64:4915-21)。Nanra等人報道了針對ClfA的抗體誘導體外金黃色葡萄球菌的調理吞噬殺死(Nanra，J.S.，Y.Timofeyeva, S.M.Buitrago，B.R.Sellman，D.A.Dilts，P.Fink,L Nunez, M.Hagen, Y.V.Matsuka，T.Mininni，D.Zhu, V.Pavliak，B.A.Green，K.U.Jansen和 A.S.Anderson.2009.Heterogeneous in vivo expression of clumpingfactor A andcapsular polysaccharide by Staphylococcus aureus:1mplications for vaccinedesign.Vaccine27:3276-80)o此外，用ClfA的結合區域A的重組形式免疫的小鼠顯示了金黃色葡萄球菌誘導的關節炎和致死率的降低(Josefsson，E.，0.Hartford，L.0’Brien，J.M.Patti 和 T.Foster.2001.Protection against experimental Staphylococcusaureus arthritis by vaccination with clumpingfactor A， a novel virulencedeterminant.Journal of Infectious Diseasesl84:1572-80)。在兔中進行的被動免疫實驗獲得了人多克隆免疫球蛋白制劑，其包含對ClfA的特異性水平更高的抗體(Vemachio，J.，A.S.Bayer, T.Le, Y.L Chai，B.Prater，A.Schneider，B.Ames, P.Syribeys, J.Robbins，J.M.Patti, J.Vernachio，A.S.Bayer, T.Le, Y.-L Chai，B.Prater，A.Schneider，B.Ames,P.Syribeys, J.Robbins 和 J.M.Patt1.2003.Ant1-clumpingfactor A immunoglobulinreduces the duration of methicillin-resistant Staphylococcus aureusbacteremia in an experimental model ofinfective endocarditis.AntimicrobialAgents&Chemotherapy47:3400-6)□與萬古霉素單獨處理組相比，組合療法使得具有導管誘導的金黃色葡萄球菌心內膜炎的兔的血液具有更好的細菌清除。另外，ClfA特異性抗體的被動傳輸使得金黃色葡萄 球菌乳腺炎的鼠科模型中的感染顯著降低(Tuchscheir，L.P.，F.R.Buzzola, L.P.Alvarez, J.C.Lee 和 D.0.Sordell1.2008.Antibodies to capsularpolysaccharide and clumpingfactor A prevent mastitis and the emergence ofunencapsulated and smalI—colony variants ofStaphylococcus aureus in mice.1nfectImmun76:5738-44)。
據報道，設計了 III期臨床試驗以在2000例低出生體重的早產新生兒中保護其免于患上膿血癥。嬰兒接受多達4次給藥Veronate，Veronate是一種從供體匯集的人免疫球蛋白制劑，具有針對ClfA和SdrG的高抗體滴度。盡管來自相似的II期臨床試驗獲得了有希望的結果，但該預防性療法導致了新生兒中葡萄球菌感染的頻率并沒有降低(Dejonge，Μ.，D.Burchfield, B.Bloom，M.Duenas, W.Walker, Μ.Polak，E.Jung，D.Millard，R.Schelonka，F.Eyal, A.Morris，B.Kapik，D.Roberson，K.Kesler, J.Patti 和S.Hetherington.2007.Clinical trial of safety and efficacy of INH_A21for theprevention of nosocomial staphylococcal bloodstream infection in prematureinfants.J Pediatrl51:260-5)。已經顯示在原核生物中發生蛋白的糖基化，但很少如此天然地發生。另一方面，N-連接的蛋白糖基化是在真核生物的內質網中發生的基本的和保守的過程。其對蛋白折疊、寡聚化、穩定性、質量控制、分泌器官的選擇和轉運以及膜蛋白都是很重要的(Helenius，A.和 Aebi，Μ.(2004).Roles of N-1inked glycans in the endoplasmicreticulum.Annu.Rev.Biochem.73，1019-1049)。蛋白糖基化對蛋白的抗原性、穩定性和半衰期都有很大的有利影響。另外，糖基化能夠輔助蛋白通過色譜來純化，例如，利用凝集素配體結合至與蛋白的糖基化部分相互作用的固相而進行的親和色譜。從而實現了在真核細胞中重組生產大量糖基化蛋白，以提供生物學和醫學上有用的糖基化模式。綴合物疫苗已經成功用 于保護免受細菌感染。抗原性多糖與蛋白載體的綴合物是保護性記憶應答所需要的，因為多糖是T細胞非依賴性抗原。多糖利用多糖和蛋白載體中的活性反應基團通過不同化學方法綴合至蛋白載體。(Qian，F.，Y.Wu, 0.Muratova，H.Zhou, G.Dobrescu，P.Duggan，L.Lynn, G.Song，Y.Zhang, K.Reiter，N.MacDonald，
D.L Narum, C.A.Long，L H.Miller, A.Saul 和G.E.Mullen.2007.Conjugating recombinantproteins to Pseudomonas aeruginosa ExoProtein A:a strategy for enhancingimmunogenicity of malaria vaccine candidates.Vaccine25:3923—3933 ；Pawlowski,A.，G.Kallenius 和 S.B.Svenson.2000.Preparation of pneumococcal capsularpolysaccharide-protein conjugates vaccines utilizing newfragmentation andconjugation technologies.Vaccinel8:1873-1885 ;Robbins，J.B.，J.Kubler—Kielb，
E.Vinogradov，C.Mocca，V.Pozsgay，J.Shi loach 和 R.Schneerson.2009.Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei0-specific oligosaccharide-core-protein conjugates.Proc Natl Acad Sci U SA106:7974-7978)o可以對兒童給藥綴合物疫苗以保護他們免受細菌感染，并且能夠為成人提供長期的免疫應答。本發明的構建提已經發現在動物中產生IgG應答。相信多糖(即，糖殘基)引起糖特異性的短期免疫應答。實際上，人類免疫系統產生對細菌的特異性多糖表面結構的強烈應答，例如O-抗原和莢膜多糖。然而，由于對多糖的免疫應答是IgM依賴性的，因此免疫系統不會形成記憶。然而，攜帶有多糖的蛋白載體引起T細胞依賴性并提供長期保護的IgG應答，這是因為免疫系統具有記憶性。由于該原因，在疫苗的開發過程中，將其作為蛋白載體-多糖綴合物來開發是有利的。原核生物很少產生糖基化蛋白。然而，已經證明了一種細菌，即食物源病原體空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)能夠糖基化其蛋白(Szymanski 等人(1999).Evidencefor a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejun1.Mol.Microbiol.32，1022-1030)。糖基化所需要的機制是由在pgl位點成簇的12個基因編碼的。糖基化的破壞影響空腸彎曲菌(C.jejuni)的侵襲和致病性，但并不像大多真核動物中那樣是致死的(Burda P.和 M.Aebi，(1999).The dolichol pathway of N-1inkedglycosylation.Biochim Biophys Actal426 (2): 239-57)。已經顯不 pgl 位點是彎曲桿菌中N-連接的蛋白糖基化的原因，并且通過在大腸桿菌中同時重組表達pgl位點和受體糖蛋白而重建空腸彎曲菌蛋白的N-糖基化是可能的(Wacker，Μ.，D.Linton, P.G.Hitchen，M.Nita-Lazar, S.M.Haslam，S.J.North, M.Panico，H.R.Morris, A.Dell，B.W.Wren 和M.Aeb1.2002.N-1inked glyco sylation in C.jejuni and its functional transferintoE.col1.Science298:1790-3)。彎曲桿菌的N-連接的蛋白糖基化生物合成途徑與細菌中的多糖生物合成途徑具有顯著的相似性(Bugg，T.D.和 P.E.Brandish.1994.From peptidoglycan toglycoproteins:commonfeatures of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis.FEMS Microbiol Lettll9:255_62)。基于這樣的認識，即細菌的抗原性多糖和彎曲桿菌的寡糖都在載體脂十一異戊二烯焦磷酸(UndPP)上合成，這兩個途徑在大腸桿菌中被合并(Feldman，M.F.，M.Wacker, Μ.Hernandez, P.G.Hitchen, C.L Maro I da,M.Kowarik, H.R.Morris，A.Dell，M.A.Valvano 和 M.Aeb1.2005.Engineering N-1inkedprotein glycosylation with diverse 0 antigen Hpopolysaccharide structuresin Escherichiacol1.Proc Natl Acad Sci U S A102:3016-21 )。已經證明了 PglB 不具有對脂連接的糖底物的嚴格特異性。在UndPP上聚集的抗原性多糖由PglB在周質中被捕獲并轉移至蛋白載體(Feldman，M.F.，M.Wacker, Μ.Hernandez, P.G.Hitchen,C.L MaroIda，M.Kowarik，H.R.Morris，A.Dell, M.A.Valvano 和 M.Aeb1.2005.EngineeringN-1 inked protein glycosylation with diverse 0 antigen Hpopolysaccharidestructures in Escherichia col1.Proc Natl Acad Sci U S A102:3016_21 ；Wacker, M.，M.F.Feldman，N.Callewaert，M.Kowarik, B.R.Clarke，N.L Pohl, M.Hernandez, E.D.Vines,M.A.Valvano, C.W hitfield 和 Μ.Aeb1.2006.Substrate specificity of bacterialoligosaccharyItransferase (OTase) suggests a common transfer mechanism for thebacterial and eukaryotic systems.Proc Natl Acad Sci U S A103:7088-93)。顯不了如果在還原端含有N-乙酰化己糖胺，彎曲桿菌PglB就會轉移不同排列的UndPP連接的寡糖(Wacker等人(2006) )，N_乙酰化己糖胺使得抗原性多糖能夠通過N-糖苷鍵連接綴合至選中的蛋白。盡管這可能為綴合物疫苗的體內生產提供了理論基礎，但仍需要克服許多不同的挑戰來認識這種理論的可能性。基于之前的發現，即空腸彎曲菌含有通常的N-連接的蛋白糖基化系統，大腸桿菌被修飾為包括空腸彎曲菌的N-連接的蛋白糖基化機制。通過該途徑，在大腸桿菌宿主中產生了空腸彎曲菌自身蛋白的糖基化形式。進一步顯示了該過程能夠被用于在修飾的大腸桿菌宿主中生產來自不同生物體的糖基化蛋白以用于疫苗制品。通過大腸桿菌來生產是有利的，因為這樣修飾的大腸桿菌宿主可以進行大規模培養，生產大量的有用疫苗。利用該過程在修飾的大腸桿菌宿主中生產糖基化蛋白以用做對金黃色葡萄球菌的疫苗產品遇到了曾經認為是不能克服的問題。首先，大腸桿菌是革蘭氏陰性細菌，其糖生物合成途徑在聚合步驟之后與革蘭氏陽性細菌例如金黃色葡萄球菌有很大不同。另外，像之前的技術那樣通過基因加工大腸桿菌以直接生產金黃色葡萄球菌莢膜多糖是不可行的。例如，金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性生物，其莢膜合成與細胞被膜結構和細胞外殼的構造相關。產生莢膜的生物合成機制被特別設計為將莢膜多糖(PS)設置在細胞及其細胞壁的外側。這是非常困難的，至少是因為以下的原因，即在修飾的大腸桿菌生物體中產生該莢膜是高度資源緊缺的，因為大腸桿菌的細胞被膜是以根本上不同的方式構建的。從PS前體到莢膜裝配的生物合成機制將由于不同的環境而變得無能為力。金黃色葡萄球菌莢膜必須穿過(transit)單層膜，而在大腸桿菌中存在需要穿過以到達可靠的莢膜的最終位置所需要的另一層膜。而且，由于金黃色葡萄球菌莢膜非常大，因此相信在大腸桿菌的兩層膜之間形成如金黃色葡萄球菌莢膜那么大的莢膜是不可行的。之前已經顯示了以下原則，即來自不同生物體的酶可以一起工作(例如，Rubires,X., F.Saigi, N.Pique, N.Climent, S.Merino, S.Alberti, J.M.Tomas 和 M.Regue.1997.Agene(wbbL)from Serratia marcescens N28b(04)complements the rfb-50mutation ofEscherichia coli K-12derivatives.J.Bacterioll79 (23): 7581-6)。然而，相信并沒有來自革蘭氏陽性生物體的修飾的LPS多糖已經在革蘭氏陰性生物體內生產。

發明內容
我們現在出人意料地發現了一種新的金黃色葡萄球菌生物綴合物疫苗。這種新的金黃色葡萄球菌疫苗基于以下新的和意外的發現，即具有一個革蘭氏株的原核生物的寡糖或多糖能夠在具有不同的革蘭氏株的宿主原核生物中使蛋白糖基化。本發明的進一步的新的和意外的特點包括而不限于如下所述的實施方式。更通常地，本發明涉及生物綴合物疫苗例如革蘭氏陽性疫苗，其包含包含插入的核酸共有序列的蛋白載體；至少一種來自細菌例如革蘭氏陽性細菌的寡糖或多糖連接至共有序列，以及可選地包含佐劑。進一步，本發明涉及革蘭氏陽性細菌疫苗，例如金黃色葡萄球菌疫苗，或其他細菌疫苗，其通過糖基化系統利用修飾的LPS生物合成途徑來形成，包含生產修飾的莢膜多糖或LPS。本發明還涉及重組N-糖基化蛋白，其包含蛋白，所述蛋白包含至少一個插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；以及連接至所述共有序列的至少一種來自細菌例如革蘭氏陽性細菌的寡糖或多糖。本發明進一步涉及金黃色葡萄球菌的修飾的莢膜多糖與來自相同生物體通過N-糖苷鍵連接的蛋白抗原的結合。本發明進一步涉及包含核苷酸序列的宿主原核生物，所述核苷酸序列編碼第一原核物種例如革蘭氏陽性類型的一種或多種糖基轉移酶；不同原核物種例如革蘭氏陰性類型的一種或多種糖基轉移酶；編碼蛋白的核苷酸序列；和編碼OTase的核苷酸序列。本發明另外還涉及工程化的宿主原核生物，其包含引入的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼僅由革蘭氏陽性原核生物自身產生的糖基轉移酶；編碼蛋白的核苷酸序列；和編碼OTase的核苷酸序列。 本發明進一步涉及在包含核酸的宿主原核生物中生產生物綴合物疫苗的方法，所述核酸編碼來自第一種原核物種例如革蘭氏陽性類型(例如金黃色葡萄球菌)的一種或多種糖基轉移酶；第二原核物種的一種或多種糖基轉移酶，一種蛋白；以及OTase。另外，本發明涉及通過在革蘭氏陰性細菌中產生修飾的莢膜多糖來生產生物綴合物疫苗，其可以通過WaaL被轉移至脂質A核心和/或通過OTase被連接至選定的載體。本發明進一步涉及在包含核苷酸序列的宿主原核生物中生產糖基化蛋白的方法，所述核苷酸序列編碼第一原核生物自身的糖基轉移酶并且也編碼與第一種原核生物不同的第二原核生物自身的糖基轉移酶。本發明還涉及用革蘭氏陽性細菌的莢膜多糖N-糖基化的蛋白的生產，其通過來自不同生物的不同糖基轉移酶的組合而合成。本發明進一步涉及在宿主原核生物中生產糖基化蛋白，所述宿主原核生物包含引入的核苷酸序列，該核苷酸序列編僅由碼革蘭氏陽性原核生物自身產生的糖基轉移酶。本發明還涉及質粒，例如，包含SEQ.1D NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4中的一個或多個的質粒。本發明也包括包含SEQ.1D NO:6 ；SEQ.1D NO:7 ；SEQ.1D NO:8 SEQ.1DNO: 16中的一個或多個的質粒。本發明還涉及包含SEQ.1D NO: 10 ；SEQ.1D NO: 11 jPSEQ.1DNO: 12中的一個或多個的質粒。此外，本發明涉及包含SEQ.1D NO: 13 ；SEQ.1D NO: 15 ；SEQ.1D NO:15 ；SEQ.1D NO:17 ；SEQ ID NO:18 ；SEQ.1D NO:19 ；SEQ.1D NO:20 ；SEQ.1D NO:21和SEQ.1D NO:27中的一個或多個的質粒。本發明另外還涉及轉化的細菌細胞,例如,用質粒轉化的細菌細胞,所述質粒包含SEQ.1D N0.2 ；SEQ.1D NO:3 ；SEQ.1D NO:4 ；SEQ.1D NO: 17 ；SEQ.1D NO: 18 ；SEQ.1D NO: 19和SEQ.1D NO:20 ；SEQ.1D N0:21和SEQ.1D NO:27中的一個或多個。本發明進一步涉及用質粒轉化的細菌細胞，所述質粒包含SEQ.1D NO:5 ；SEQ.1D NO:8 ；SEQ.1D NO:9 ；SEQ.1DNO:10 ；SEQ.1D NO:11 ；SEQ.1D NO:12 ；SEQ.1D NO:13 ；SEQ.1D NO:14 ；SEQ.1D NO:15和SEQ.1D NO: 16中的一個或多個。該發明進一步涉及在哺乳動物中誘導針對由革蘭氏陽性細菌和其他細菌引起的感染的免疫應答的方法。在一種實施方式中，該方法包括向所述哺乳動物給藥有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含:包含至少一個插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的蛋白，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；和一個或多個寡糖或多糖，其中的一個或多個寡糖或多糖彼此相同或不同，來自革蘭氏陽性細菌并連接至所述共有序列。在另一個方面，本發明披露了鑒別靶標多肽的方法，其中所述靶標多肽用于以所述靶標多糖使蛋白整體或部分糖基化。包含靶標多糖的所述糖基化蛋白可以用于，例如，疫苗組合物。在一種實施方式中，鑒別靶標多糖的方法包括:鑒別革蘭氏陽性細菌，例如金黃色葡萄球菌，作為靶標；鑒別由所述革蘭氏陽性細菌產生的多糖的第一重復單元，所述第一重復單元包含至少三個單體；鑒別由革蘭氏陰性類型的細菌產生的多糖，其包含第二重復單元，所述第二重復單元包含兩個與所述第一重復單元相同的單體。本發明還涉及修飾第一細菌物種例如革蘭氏陰性類型的細菌的方法。在一種實施方式中，該方法包括:鑒別革蘭氏陽性類型例如金黃色葡萄球菌的多糖的第一重復單元，所述第一重復單元包含三個單體；鑒別第二革蘭氏陰性類型的細菌產生的多糖，其包含另外的重復單元，所述重復單元包含兩個與第一重復單元相同的單體；向第一個革蘭氏陰性類型的所述細菌插入一個或多個編 碼裝配三糖的糖基轉移酶的核苷酸序列，所述三糖包含:a)所述第二重復單元；和b)不包含在所述第二重復單元中的所述第一重復單元的單體；插入編碼蛋白的核苷酸序列；以及插入編碼OTase的核苷酸序列。


圖1描繪了 wzx/wzy依賴性O-抗原生物合成的途徑，以銅綠色假單胞菌0110-抗原生物合成為例。展示的反應的蛋白名稱在箭頭上方或下方顯示，包括尿苷二磷酸(UDP)和尿苷單磷酸(UMP)。圖2描繪了在大腸桿菌中的工程化金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型5 (CP5)的生物合成的建議途徑。銅綠色假單胞菌011的O-抗原簇提供的酶在圖1中示出。來自金黃色葡萄球菌CP5的酶顯示為Cap5(對照圖6)。WecB和WecC是生產UDP-ManNAcA所需的大腸桿菌酶。其他描述的蛋白和酶包括尿苷二磷酸(UDP)、尿苷單磷酸(UMP)、和輔酶A (CoA)0圖3描繪了工程化的金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型8 (CP8)生物合成的議議途徑。基因名稱以箭頭指示(對照圖1、圖2和圖6)。UDP，UMP:尿苷二磷酸，尿苷單磷酸。CoA:輔酶A。圖4描繪了莢膜金黃 色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌O-抗原重復單元(RU)結構的
結構重疊。圖5A描繪了通過金黃色葡萄球菌酶來延長不完整0110-抗原RU (重復單元)的SDS-PAGE 分析。圖5B描繪了通過金黃色葡萄球菌酶來延長不完整0110-抗原RU的免疫檢測。圖6描繪了本發明的一種實施方式中構建嵌合0H/CP5和0H/CP8基因簇的策略。圖7A描繪了本發明的一種實施方式中在大腸桿菌脂質提取物中檢測的多聚CP5LPS。圖7B描繪了本發明的一種實施方式中在大腸桿菌脂質提取物中檢測的多聚CP8LPS。圖8A描繪了本發明的一種實施方式中重組CP5LPS的生產，通過SDS-PAGE以銀染色并根據含有W3110 AwecA細胞內的嵌合簇的pLAFR質粒上的抗生素抗性基因來進行分析。圖8B描述了本發明的一種實施方式中重組CP5LPS的生產，通過SDS-PAGE以銀染色以及免疫檢測并根據含有W3110 AwecA細胞內的嵌合簇的pLAFR質粒上的抗生素抗性基因來進行分析。圖9描述了本發明的一種實施方式中重組CP5LPS的生產，通過免疫檢測并根據W3110 AwecA細胞內的嵌合簇之前的啟動子來進行分析。圖1OA示出了利用嵌合CP5簇(SEQ ID:2)產生的本發明的CP5的重組RU的一種實施方式的HPLC分析結果。圖1OB示出了利用缺少cap8I聚合酶的嵌合CP8簇產生的本發明的CP8的重組RU的一種實施方式的HPLC分析結果。圖1lA不出了通過在大腸桿菌中表達本發明的嵌合CP5簇的一種實施方式而產生的在圖1OA中在第37分鐘時洗脫的特定峰的MALD1-MS/MS分析結果。圖1lB顯示了通過在大腸桿菌中表達本發明的嵌合CP5簇的一種實施方式而產生的在圖1OA中在第40分鐘時洗脫的特定峰的MALD1-MS/MS分析結果。
圖1lC示出了通過在大腸桿菌中表達本發明的嵌合CP8簇的一種實施方式而產生的在圖1OB中在第32分鐘時洗脫的特定峰的MALD1-MS/MS分析結果。圖1lD不出了通過在大腸桿菌中表達本發明的嵌合CP8簇的一種實施方式而產生的在圖1OB中在第38分鐘時洗脫的特定峰的MALD1-MS/MS分析結果。圖1lE不出了通過在大腸桿菌中表達本發明的嵌合CP8簇的一種實施方式而產生的在圖1OB中在第45分鐘時洗脫的特定峰的MALD1-MS/MS分析結果。圖1lF示出了聚糖結構優化的一種實施方式的HPLC分析結果。圖1lG (包括圖11G-1)示出了在本發明的一種實施方式中在大腸桿菌細胞中的UndPP中的全部CP5聚糖部分的HPLC分析結果。圖1lH示出了本發明的一種實施方式中脫乙酰CP5聚糖和RU同源性的HPLC分析結果。圖1lI提供了本發明的一種實施方式中在大腸桿菌細胞中UndPP上存在的CP8聚糖部分的HPLC分析結果。圖1lJ示出了本發明的一種實施方式中脫乙酰CP8聚糖和RU同源性的HPLC結果。圖1lK示出了 HPLC結果，其顯示本發明的一種實施方式中由wzz07與CP8嵌合簇共表達誘導的RU多聚化的減少和LLO的增加。圖12示出了本發明的一種實施方式中來自不具有和具有金黃色葡萄球菌翻轉酶基因cap5K (SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3)的細胞，經Ni2+親和色譜純化的EPA-CP5生物綴合物的SDS-PAGE分析結果。圖13A示出了根據本發明的一種實施方式的經Ni2+親和色譜和離子交換色譜純化的CP5-EPA生物綴合物的分析。圖13B描繪了根據本發明的一種實施方式，N-糖苷鍵連接至0-乙酰化RU質量(m/z=2088([M+H]+))的胰蛋白酶化肽DNNNSTPTVISHR中發現的糖基化位點的M/Z質量。插入物示出了連接于肽的RU結構。圖13C描繪了根據本發明的一種實施方式，N-糖苷鍵連接至0-乙酰化RU質量(m/z=1165([M+H]+))的胰蛋白酶化肽DQNR中發現的糖基化位點的M/Z質量。插入物示出了連接于肽的RU結構。圖13D描繪了根據本發明的一種實施方式，Ni2+親和色譜和陰離子交換色譜純化的CP8-EPA生物綴合物的分析。圖13E描繪了根據本發明的一種實施方式中來自含有用于糖綴合物生產的3個(左側泳道)或2個質粒(右側泳道)的細胞的純化的CP5-EPA生物綴合物。圖13F描繪了根據本發明的一種實施方式的Ni2+親和色譜純化的CP8-EPA生物綴合物的分析。圖14A示出了利用圖13A的3質粒系統產生的本發明一種實施方式中的純化CP5-EPA生物綴合物的高質量MALDI分析。圖14B示出了利用圖13A的3質粒系統產生的本發明本發明的一種實施方式中的CP5-EPA生物綴合物的大小排阻色譜表征。圖14C示出了根據本發明一種實施方式的純化CP5_Hla生物綴合物的SDS-PAGE分析和免疫檢測。
圖14D示出了根據本發明的一種實施方式的純化的CP5_AcrA生物綴合物的結果。圖14E示出了根據本發明的一種實施方式的純化的CP5_ClfA生物綴合物的結果。圖15A示出了根據本發明的一種實施方式在小鼠中由CP5-EPA引起的特異性抗CP5抗體。圖15B示出了根據本發明的一種實施方式在兔中由CP5-EPA引起的特異性抗CP5抗體。圖16A示意性示出了根據本發明的一種實施方式，由CP5-EPA免疫兔引起的CP5特異性抗體的體外調理吞噬活性(針對金黃色葡萄球菌Reynolds)。圖16B示意示出了根據本發明的一種實施方式，由CP5-EPA免疫兔引起的CP5特異性抗體的體外調理吞噬活性(針對金黃色葡萄球菌USA100)。圖17A描繪了根據本發明的一種實施方式利用抗CP5-EPA抗體被動免疫的結果，在小鼠中用約3.6 X IO7CFU的金黃色葡萄球菌菌株Reynolds進行1.p.激發。圖17B描繪了根據本發明的一種實施方式利用抗CP5-EPA抗體被動免疫的結果，在小鼠中注射2mg CP5-EPA IgG。圖17C描繪了根據本發明的一種實施方式利用抗CP5-EPA抗體被動免疫的結果，在小鼠中注射300 u gCP5-EPA IgG。圖18描繪了根據本發明的一種實施方式，利用不同劑量的CP5-EPA作為疫苗并且利用小鼠菌血癥模型進行激發的活性免疫分析結果。
具體實施例方式根據本發明的一種實施方式，來自革蘭氏陽性生物的LPS多糖現在顯示在革蘭氏陰性生物中表達。我們相信這是一個新的成果，與現有技術相比，其表現出重要的和顯著的差另1J。本發明的范圍之內的核酸由包含在序列表中的本發明的核酸來示例示出。能夠在宿主細胞中表達的編碼免疫原性組分的任何核酸或其部分均可以用于本發明。提供下面的序列描述是為了有助于理解在本申請全文中使用的某些術語，為不應被解釋為本發明的限制性實施方式。SEQ ID N0:1 描述了 pLAFRl (Gene Bank Accession AY532632.1)，其包含來自銅綠色假單胞菌PA0103的在EcoRI位點的0110-抗原序列，互補鏈(部分來自于Gen BankAccession AF236052)。SEQ ID N0:2描述了包含CP5嵌合簇的pLAFRl，其對應于pLAFRl-011，其中cap5HIJ基因通過同源重組替代wbjA-wzy。插入序列還包含用于選擇同源重組克隆的cat
表達盒。SEQ ID N0:3描述了包含具有cap5K翻轉酶基因的CP5嵌合簇的pLAFRl，其對應于pLAFRl-011,其中cap5HIJ基因通過同源重組替代wbjA-wzy,并且cap5K克隆在cap5J和cat表達盒之間。

SEQ ID N0:4描述了包含包括翻轉酶的CP8嵌合簇的pLAFRl，其對應于pLAFRl-011，其中cap8KHIJ基因替代wbjA-wzy。插入序列還包含用于選擇同源重組克隆的cat表達盒。
SEQ ID NO:5描述了用于Hla H35L生產的表達質粒。編碼Hla H35L的ORF克隆被到 pEC415 中的 Ndel/SacI 中。SEQ ID N0.6描述了用于Hla_H35L位點202生產的表達質粒。ORF編碼來自大腸桿菌的N-端DsbA信號肽、氨基酸位點202附近的糖基化位點和C-端HIS標簽。該構建體被克隆到PEC415上的Nhel/Sall中。SEQ ID勵:7描述了用于111&-11351位點238生產的表達質粒。ORF編碼來自大腸桿菌的N-端DsbA信號肽、氨基酸位點238附近的糖基化位點和C-端HIS標簽。上述構建體被克隆到PEC415上的Nhel/Sall中。SEQ ID N0:8描述了用于Hla_H35L位點272生產的表達質粒。ORF編碼來自大腸桿菌的N-端DsbA信號肽、氨基酸位點272附近的糖基化位點和C-端HIS標簽。上述構建體被克隆到PEC415上的Nhel/Sall中。SEQ ID N0:9描述了用于ClfA生產的表達質粒。該基因是化學合成的并且被克隆到pEC415表達載體的Ndel/SacI中。SEQ ID NO: 10描述了用于ClfA位點290生產的表達質粒。ORF編碼來自大腸桿菌的N-端DsbA信號肽、氨基酸位點290附近的糖基化位點和C-端HIS標簽。上述構建體被克隆到PEC415上的Nhel/SslI中。SEQ ID NO: 11描述了用于ClfA位點327生產的表達質粒。ORF編碼來自大腸桿菌的N-端DsbA信號肽、氨基酸位點327附近的糖基化位點和C-端HIS標簽。上述構建體被克隆到PEC415上的Nhel/Sall中。SEQ ID NO: 12描述了用于ClfA位點532生產的表達質粒。ORF編碼來自大腸桿菌的N-端DsbA信號肽、氨基酸位點532附近的糖基化位點和C-端HIS標簽。上述構建體被克隆到PEC415上的Nhel/Sall中。SEQ ID NO: 13描述了重組的、遺傳減毒的EPA的氨基酸序列，其具有信號序列并且在位置260和402處具有兩個糖基化位點。SEQ ID NO: 14描述了重組的、遺傳減毒的EPA的氨基酸序列，其沒有信號序列并且在位置241和383處具有兩個糖基化位點。SEQ ID NO: 15 描述了編碼 AcrA 的 0RF，其經由 Nhel/Sall 克隆到 pEC415 中。SEQ ID勵:16描述了用于111&-11351位點130生產的表達質粒。ORF編碼來自大腸桿菌的N-端DsbA信號肽、氨基酸位點130附近的糖基化位點和C-端HIS標簽。上述構建體被克隆到PEC415上的Nhel/Sall中。SEQ ID NO: 17描述了生產具有cap5K翻轉酶的基因簇的CP5，隨后是由大腸桿菌血清型0121的galF和wbqA之間的基因間DNA序列和pglBORF組成的pglB表達盒。該插入物被克隆到PLAFRl的EcoRI位點中。SEQ ID NO: 18描述了生產具有cap8K翻轉酶的基因簇的CP8，隨后是由大腸桿菌血清型(serotype)0121的galF和wbqA之間的基因間DNA序列和pglBORF組成的pglB表達盒。該插入物被克隆到pLAFRl的EcoRI位點中。SEQ ID NO: 19描述了生產具有cap8K翻轉酶的基因簇的CP8，隨后是由大腸桿菌血清型0121的galF和wbqA之 間的基因間DNA序列和pglBORF組成的pglB表達盒，另外該序列還具有大腸桿菌血清型(serovar)07的wzz克隆到SfaAI/BspTI中，即，在銅綠色假單胞菌oil的WZX和cap8H之間。該插入物被克隆到pLAFRl的EcoRI位點中。SEQ ID NO: 20描述了 EPA和wzz的表達質粒。骨架是pACT3，其中的抗性盒被替
換(將卡那霉素替換成氣霉素)。SEQ ID N021描述了被克隆到pext21Eco/Sal中的大腸桿菌血清型07的wzz。SEQ ID N022描述了實施例中提及的肽序列。SEQ ID N023描述了實施例中提及的肽序列。SEQ ID N024描述了蛋白共有序列，D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除了脯氨酸之外的任何天然氨基酸。SEQ ID N0:25描述了糖基化位點。SEQ ID N0:26描述了糖基化位點。SEQ ID NO:27描述 了含有克隆到EcoRI/BamHI位點中的pglB ORF的表達質粒。下面列出了說明書中所用的術語和縮寫的描述，并與本領域普通技術人員已知的使用方法一致。提供這些描述是為了有利于理解這樣的術語和縮寫，并而不應將其解釋為本發明的限制性實施方式。AcrA是指一種來自空腸彎曲菌的糖蛋白。自動免疫是指暴露于抗原之后誘導的免疫性(抗體)。APC是指抗原呈遞細胞。Amp是指氨芐青霉素。菌血癥是指循環血中存在活細菌。C’是指補體。CapA是在金黃色葡萄球菌CP5中被認為鏈長度確定的酶。CapB是在金黃色葡萄球菌CP5中被認為是多糖鏈長度的調節子的酶。CapC是在金黃色葡萄球菌CP5中被認為編碼轉運蛋白的酶。CapD是在金黃色葡萄球菌CP5中具有4，6_脫氫酶活性并將前體UDPGlcNAc轉化為UDP-2-乙酰氨基-2，6- 二脫氧-D-木糖-4-己酮糖的酶。CapE是4，6-脫氫酶3，5-差向異構酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中催化UDP-D-GlcNAc差向異構化為UDP-2-乙酰氨基_2，6- 二脫氧-D-來蘇糖-4-己酮糖。CapF是還原酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中將還原形式的UDP-2-乙酰氨基-2，6- 二脫氧-D-來蘇糖-4-己酮糖催化為UDP-L-6dTalNac。CapG是2-異構酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中將異構形式的UDP-L_6dTalNAc催化為 UDP-LFucNac。CapH在金黃色葡萄球菌CP5中是0_乙酰轉移酶。CapH在CP8中是轉移酶，類似于來自金黃色葡萄球菌CP5的CapI。CapI在金黃色葡萄球菌CP5中是糖基轉移酶，其催化UDP-ManNAcA轉移至載體脂質-D-FucNAc-L-FucNAc,從而產生載體脂質-D-FucNAc-L-FucNAc-ManNAcA。CapI在CP8中是聚合酶，類似于金黃色葡萄球菌CP5中的CapJ。CapJ在金黃色葡萄球菌CP5中是聚合酶。CapJ在CP8中是0_乙酰轉移酶，類似于在金黃色葡萄球菌CP5中的CapH。CapK在金黃色葡萄球菌CP5中是翻轉酶。
CapK在金黃色葡萄球菌CP8中是翻轉酶，類似于CP5中的CapK。CapL是轉移酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中催化UDP-L-FucNAc轉移至D-FucNAc-載體脂質上，以產生載體脂質-D-FucNAc-L-FucNAc。CapM是轉移酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中催化UDP-D-FucNAc轉移至載體脂質上，以產生載體脂質-D-FucNAc。CapN是4-還原酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中催化UDP-2-乙酰氨基_2，6_ 二脫氧-D-木糖-4-己酮糖還原為UDP-D-FucNAc。 CapO是脫氫酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中催化UDP-D-ManNAc轉化為UDP-ManNAcA。CapP是2-差向異構酶，其在金黃色葡萄球菌CP5中催化UDP-D_GlcNAc差向異構化為 UDP-D-ManNAc。CFU是指克隆形成單位。ClfA是指金黃色葡萄球菌聚集因子A (clumpingfactor A),其是一種細胞壁錨定蛋白。 綴合物疫苗是指通過將多糖抗原共價連接至載體蛋白而產生的疫苗。綴合物疫苗引起抗細菌免疫應答和免疫記憶。如果這些抗原與誘導T細胞依賴性應答的蛋白綴合，則其能夠在嬰兒和老年人中誘導針對多糖抗原的保護性免疫應答。共有序列是指氨基酸序列-D/E-X-N-Z-S/T-，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸，其中發現連接至N-連接的糖蛋白的糖連接位點。莢膜多糖，具有其天然存在的形式，是指多糖的厚的、黏液樣的層，其是水溶性的，并通常是酸性的。天然存在的莢膜多糖由一個至若干個單糖/單體的規則重復單元組成。CP5是指金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖或血清型5莢膜多糖。CP8是指金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖或血清型8莢膜多糖。D-FucNAc是指N-乙酰D-巖藻糖。ECA是指腸道菌共同抗原。ELISA是指酶聯免疫吸附分析，其是一種在免疫學中主要用于檢測樣品中抗體或抗原存在的生物化學技術。EPA或EPAr是指非毒性重組銅綠色假單胞菌外蛋白A。糖綴合物疫苗是指包含連接至抗原性或免疫原性寡糖的蛋白載體的疫苗。糖基轉移酶是指這樣的酶，其作為單糖單元從活化的核苷糖轉移至糖基受體分子的催化劑。革蘭氏陽性菌株是指用革蘭氏染色(一種有用的診斷工具)呈紫色的細菌菌株。革蘭氏陽性細菌具有由肽聚糖組成(大約50-90%的細胞壁)的較厚網狀細胞壁。革蘭氏陰性菌株是指具有較薄層(約10%的細胞壁)并且被染色呈粉色的細菌菌株。革蘭氏陰性細菌還具有另外的外膜，其包含脂質，并被周質空間(periplasmic space)與細胞壁分開。Hla ( a毒素)是指a溶血素，它是一種分泌的孔形成毒素，并且是金黃色葡萄球菌的必要毒力因子抗原。Hla H35L是指來自金黃色葡萄球菌的Hla非毒性a -毒素突變體。
組氨酸標簽，或者多組氨酸標簽，是蛋白中由至少5個組氨酸(His)殘基組成的氨基酸基序，通常位于蛋白的N-端或C-端，并用于通過特異性結合至鎳親和柱而以簡單快速的方式來純化。IV指靜脈內。kDa指千道爾頓，是原子質量單位。L-FucNAc是指N-乙酰L-巖藻糖胺。LPS是指脂多糖。脂多糖(LPS)也被稱為脂聚糖，是由脂質和多糖通過共價鍵結合而成的大分子；其通常位于革蘭氏陰性細菌的外膜中，作為外毒素并在動物中引起強烈的免疫應答。ManNAcA是指N-乙酰甘露糖胺醒酸。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株(MRSA)是指與長期住院和在加護病房中更多感染相關的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株，其導致更多的抗生素給藥。

N-聚糖或N-連接的寡糖是指各種組成的單糖、寡糖或多糖，其通過N-糖苷鍵連接至蛋白中的天冬氨酸殘基的e-酰胺氮。N-連接的蛋白糖基化是指共價連接“聚糖”(單糖、寡糖或多糖)至革巴標蛋白的天冬酰胺(N)側鏈的氮的過程或途徑。0-抗原或0-多糖是指LPS內包含的重復性聚糖多聚體。0抗原結合至核心寡糖，并包含LPS分子的最外側結構域。寡糖或多糖是指通過共價結合碳水化合物(單糖)而形成的均聚物或雜聚物，并包括但不限于通過糖苷鍵連接在一起的重復單元(單糖、二糖、三糖，等等)。調理吞噬活性是指在補體和特異性抗體存在下病原體的細胞吞噬。血清抗體的體外調理吞噬活性(POA)被認為代表了抗體在體內的功能活性并從而與保護性免疫相關。OTase或OST是指寡糖基轉移酶，其催化寡糖或多糖以獨特機制并選擇性轉移(糖基化)至新生的或折疊的蛋白的共有序列的天冬酰胺(N)殘基。被動免疫是指以已經產生的抗體的形式從一個個體轉移至另一個的轉移的活性體液免疫。周質空間是指革蘭氏陰性細菌的內部胞質膜和外部的外膜之間的空間。PMN是指多形核嗜中性白細胞，它是人類和多種(雖然不是全部)哺乳動物的外周血中最豐富的白細胞。蛋白載體是指包含共有序列的蛋白，其中寡糖或多糖結合至所述共有序列。RU是指包含特定多糖的重復單元，其中的特定多糖通過將個體單糖裝配到寡糖或多糖中而合成。信號序列是指在蛋白的N-末端的短(例如，長度為約3-60個氨基酸)肽，其引導蛋白至不同的定位。UDP-D-ManNAc 是 UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺。UDP-D-ManNAcA 是 UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺醛酸。 UDP-D-QuiNAc 是 UDP-N-乙酰-D-雞納糖胺。UDP-L-FucNAc 是 UDP-N-乙酰-L-巖藻糖胺。UDP-L_6dTalNAc 是 UDPN-乙酸-L-塔洛糖(UDPN-acetyl-L-pneumo samine)。
Und是指由11個異戊烯醇單元組成的十一戊烯基或十一異戊烯醇脂。UndP是指^--異戍烯基磷酸酯(undecaprenyl phosphate),它是一種輸出至細菌
細胞被膜的碳水化合物聚合物的聚糖生物合成中間體的通用脂載體(衍生自Und)。UndPP是指i^一異戊烯基焦磷酸酯，它是UndP的磷酸化形式。wbjA是銅綠色假單胞菌011中的糖基轉移酶。wbjB是一種推定的翻轉酶，類似于金黃色葡萄球菌中CP5和CP8的莢膜生物合成所需的酶。wbjC是一種銅綠色假單胞菌011中的推定的差向異構酶。wbjD是一種銅綠色假單胞菌011中的推定的差向異構酶。wbjE是一種銅綠色假單胞菌011中的推定的差向異構酶。wbjF是一種銅綠色假單胞菌011中的推定的糖基轉移酶。wbpL是一種糖基轉移酶，其參與銅綠色假單胞菌011中的LPS生物合成。wbpM是一種糖基轉移酶，其參與銅綠色假單胞菌011中的LPS生物合成。本發明的實施方式至少部分地是基于這樣的發現，即空腸彎曲菌含有通常的N-連接的蛋白糖基化系統，這是原核生物的不尋常的特征。空腸彎曲菌的多種蛋白顯示被七糖所修飾。該七糖 在內膜的細胞質一側在特定的糖基轉移酶催化下通過逐步添加核苷活化的單糖在載體脂UndPP上組裝。然后，脂連接的寡糖通過翻轉酶例如PglK翻轉進入(SP，橫向擴散)間質空間。在N-連接的蛋白糖基化的最終步驟，OTase (例如，PglB)催化寡糖從載體脂轉移至共有序列 Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr (即，D/E-X-N-Z-S/T)內的 Asn殘基，其中Xaa和Zaa可以是除了 Pix)之外的任何氨基酸。我們已經成功地將七糖的糖基化簇轉移至大腸桿菌中，并且能夠產生彎曲桿菌屬(Campylobacter)的N-連接的糖蛋白。已經開發出一種新穎的和創造性的方法以修飾革蘭氏陰性宿主細菌，例如大腸桿菌，以生產用作針對革蘭氏陽性細菌例如金黃色葡萄球菌的疫苗產品的糖基化蛋白。這種方法的發展需要克服重大的并且在很多方面難以預料的困難，并且實質上區別于傳統知識和現有技術。在這種新穎的和創造性的方法中，鑒別了另一種產生多糖的革蘭氏陰性細菌，所述多糖與感興趣的靶標生物例如金黃色葡萄球菌的多糖具有結構相似性。為了本發明的目的，結構相似性表明其自身作為靶標(例如，金黃色葡萄球菌)的多糖中的重復單元，與所鑒別的其他革蘭氏陰性細菌中的多糖的重復單元部分地相同。由于后一種細菌是革蘭氏陰性的，其本身就是宿主，例如大腸桿菌，因此我們最初假定(并且之后通過下文所述的實驗驗證)在修飾的大腸桿菌中利用其生物合成途徑將能夠實現生物合成構建的RU抗原并且其從細胞質翻轉進入修飾的大腸桿菌的周質內。進一步地，我們假定(并且之后通過下文所述的實驗證實)通過該生物合成途徑產生的多糖的大小將比通過革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的生物合成途徑產生的多糖小得多。結果，如下文所討論，我們所開發的新穎的和創造性的方法解決了前述的難題。進一步地，如下文所述，我們出人意料地發現革蘭氏陰性生物中的LPS通路的方面能夠用于生產多糖，所述多糖含有一些與革蘭氏陽性細菌例如金黃色葡萄球菌自身的莢膜多糖相同的重復單元。因此，在制造金黃色葡萄球菌的糖基化蛋白疫苗的多糖部分的時候，一種出人意料的解決辦法是構建至少部分地基于與革蘭氏陰性細菌(例如大腸桿菌)自身產生的多糖來構建多糖部分。我們進一步發現，為了這樣做，尋找產生與金黃色葡萄球菌產生的感興趣的多糖盡可能相似的多糖的細菌顯然是非常重要的。銅綠色假單胞菌是這樣的細菌。圖1提供了通過在0-抗原簇中提供的酶或者通過革蘭氏陰性宿主細胞的管家酶(house keeping enzyme)在細胞質中制備核苷活化的單糖的實施方式的逐步描述,對于本領域技術人員而言，根據本說明書的記載，這是顯然的。該過程的步驟在圖1的描述中從左至右進行。在圖1描述的實施方式中，糖基磷酸轉移酶(WbpL)將D-FucNac磷酸添加至UndP,形成UndPP-FucNAc。然后特異性糖基轉移酶進一步通過添加形成重復單元(RU)寡糖的單糖(WbjE，WbjA)來延長UndPP-FucNAc分子。然后RU通過Wzx蛋白翻轉進入周質空間中。Wzy酶聚合周質RU以形成0-抗原多糖。聚合物長度由Wzz蛋白控制。很多細菌寡糖和多糖在UndPP上裝配，然后被轉移至其他分子。也就是說，UndPP是細菌中常規的糖建設平臺。在大腸桿菌和據信大多數其他革蘭氏陰性細菌中，0-抗原通過大腸桿菌酶WaaL從UndPP轉移至脂質A核心以形成脂多糖(LPS)。圖2描繪了通過在銅綠色假單胞菌011的0-抗原簇中提供的酶、通過革蘭氏陰性宿主細胞的管家酶、以及通過已知UDP-ManNAcA生物合成所需的金黃色葡萄球菌和/或大腸桿菌酶(Cap50P和/或WecBC)在細胞質中制備核苷活化的單糖的實施方式，對本領域技術人員而言，根據本說明書的記載，這是顯然的。該過程的步驟在圖2的描述中從左至右進行。在011生物合成中，WbpL和WbjE合成核心二糖。然后，金黃色葡萄球菌糖基轉移酶Cap51添加D-ManNAcA。Cap5H將乙酰基團添加至第二 FucNAc殘基。如圖2所示，乙酰化可以是RU合成的最終步驟。在該系統中，翻轉可以通過Wzx蛋白的一種或全部進行，這是重組表達的銅綠色假單胞菌的Wzx或Cap5K，或內源性表達的Wzx樣酶，例如在大腸桿菌染色體中編碼的ECA簇。聚合是在UndPP上形成CP5多糖的Cap5J聚合酶的專有活性。像其他結合UndPP的多糖一樣，CP5糖被大腸桿菌酶WaaL轉移至脂質A核心以形成重組LPS (LPS莢膜)。圖3描繪了通過通過在銅綠色假單胞菌011的0-抗原簇中提供的酶、通過革蘭氏陰性宿主細胞的管家酶、以及通過已知UDP-ManNAcA生物合成所需的金黃色葡萄球菌和/或大腸桿菌酶(Cap80P和/或WecBC)在細胞質中制備核苷活化的單糖，對于本領域技術人員而言，根據本說明書的記載，這是顯然的。該過程的步驟在圖3的描述中從左至右進行。在011生物合成中，WbpL和WbjE合成核心二糖。然后，金黃色葡萄球菌糖基轉移酶Cap8H添加D-ManNAcA。Cap8J將乙酰基團添加至第二 FucNAc殘基。尚不知道乙酰化發生在活化的糖上還是脂質結合的RU上。在該系統中，翻轉可以通過Wzx蛋白的一種或全部進行，其是重組表達的銅綠色假單胞菌的Wzx或Cap8K,或內源性表達的Wzx樣酶,例如在大腸桿菌染色體中編碼的ECA簇。聚合是在UndPP上形成CP8多糖的Cap8I聚合酶的專有活性。然后，CP8糖在大腸桿菌中被酶WaaL轉移至脂質A核心。圖4示出了 011、CP5和CP8多糖的不同結構。圖4中示出了 RU共享相同的主干結構，該主干結構由UndPP和二糖a-D-FucNAc-(I，3)-L-FucNAc組成。金黃色葡萄球菌RU部分地在中間的L-FucNAc或ManNAcA殘基上以單獨的0-乙酰基團修飾，這是金黃色葡萄球菌RU的特征。金黃色葡 萄球菌RU中的第二個和第三個糖的連接，以及聚合的RU之間的連接彼此之間是不同的。在右邊，糖結構以不同的表現方式示出。黑色箭頭表示的數字(CP5和CP8)代表用O-乙酰基團修飾的碳的位置。RU結構的一種可替代表現方式示于左下方。如圖4中所示，作為銅綠色假單胞菌自身產生的多糖的部分的011抗原中的RU和葡萄球菌屬各菌株的CP5和CP8莢膜的RU之間有很大的重復。尤其是，如圖4所示，RU中的L-FucNAc>D-FucAc部分在兩者中是相同的。在另一個方面，本發明描述了鑒別靶標多糖的方法，其用于用所述靶標多糖的全部或部分來糖基化蛋白。包含靶標多糖的所述糖基化蛋白可以用于，例如，疫苗組合物。鑒別靶標多糖的方法包括:鑒別革蘭氏陽性細菌，例如金黃色葡萄球菌，作為靶標；鑒別由所述革蘭氏陽性細菌產生的多糖的第一重復單元，其包含至少三個單體；鑒別包含第二重復單元的革蘭氏陰性類型的細菌生產的多糖，所述第二重復單元包含至少兩個與所述第一重復單元的單體相同的單體。因此，在本發明的一種實施方式中，修飾第一革蘭氏陰性類型的細菌的方法包括:鑒別革蘭氏陽性細菌，例如金黃色葡萄球菌，作為靶標；鑒別由所述革蘭氏陽性細菌產生的多糖的第一重復單元，其包含至少三個單體；鑒別由包含第二重復單元的第二革蘭氏陰性類型的細菌產生的多糖，所述第二重復單元包含至少兩個與所述第一重復單元的單體相同的單體；向所述第一革蘭氏陰性類型的細菌插入一個或多個編碼裝配三糖的糖基轉移酶的核苷酸序列，所述三糖包含:a)所述第二重復單元；和B)在所述第二重復單元中不存在的所述第一重復單元的單體；插入編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白例如包含至少一個插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；以及插入編碼OTase的核苷酸序列。在本發明的一種實施方式中，該方法進一步包含向宿主革蘭氏陰性細菌中插入一個或多個編碼裝配三糖的糖基轉移酶的核苷酸序列，所述三糖包含在第二重復單元中不存在的第一重復單元并且裝配第二重復單元的單體。本發明的一個另外的實施方式涉及插入一個或多個來自革蘭氏陰性細菌的糖基轉移酶，其裝配至少一個來自第一重復單元的單體單元，和一個或多個來自革蘭氏陽性細菌(例如金黃色葡萄球菌)的糖基化轉移酶，其裝配至少兩個來自第二重復單元的單體。該方法還包含向革蘭氏陰性宿主細菌中插入編碼蛋白的核苷酸序列和編碼OTase的核苷酸序列。在本發明的至少一種實施方式中，宿主大腸桿菌菌株產生為攜帶編碼金黃色葡萄球菌的CP5和CP8菌株的需要的酶的相應核酸，其將建立、翻轉并聚合所構建的重復單元。在一種實施方式中，所需的特異性糖基轉移酶符合形成銅綠色假單胞菌自身產生的L-FucNAc—〉D-FucNAc RU的那些，并且對應于添加D-ManNAcA單糖以完成金黃色葡萄球菌的CP5和CP8菌株分別自身產生的RU的糖基轉移酶。這樣的實施方式可進一步包括利用質粒以將核酸注入到宿主細胞中。一種另外的實施方式涉及在一個質粒中利用編碼對應于L-FucNAc—〉D-FucNAc的糖基轉移酶的核酸，以及在不同的質粒中利用編碼對應于D-ManNAcA的糖基轉移酶的核酸。這樣的實施方式的一個好處是，以現有技術的觀點出人意料的是，經修飾的銅綠色假單胞菌的LPS生物合成途徑，現在為產生構建的金黃色葡萄球菌莢膜的RU聚合體的原因，使得其結構比金黃色葡萄球菌的莢膜小得多。本發明另外涉及重組N-糖基化蛋白，包含至少一個插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可 以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；并且來自革蘭氏陽性細菌的至少一個寡糖或多糖連接至所述共有序列。在其他實施方式中，重組N-糖基化蛋白包含兩個或多個所述插入的共有序列。在另外一種實施方式中，重組N-糖基化蛋白包含兩個或多個所述金黃色葡萄球菌寡糖或多糖。在又一種的實施方式中，重組N-糖基化蛋白包含兩個或多個所述插入的共有序列和來自不同的金黃色葡萄球菌菌株的寡糖或多糖，例如，來自金黃色葡萄球菌莢膜多糖5菌株和莢膜多糖8菌株。本發明進一步涉及金黃色葡萄球菌的修飾的莢膜多糖與來自相同生物的蛋白抗原通過N-糖苷鍵連接的組合物。本發明的實施方式包括天然糖基化的蛋白。這樣的天然糖基化蛋白(例如，空腸彎曲菌蛋白)含有天然的共有序列而不包含任何其他(即，引入的)優化共有序列。天然糖基化蛋白包括原核蛋白和真核蛋白。本發明的實施方式進一步包括重組N-糖基化蛋白，包含一個或多個下述N-糖基化局部氨基酸序列:D/E-X-N-Z-S/T，(優化的共有序列)其中X和Z可以是除Pro之外的任何天然氨基酸，并且其中至少一個所述N-糖基化局部氨基酸序列是引入的。將特定的局部氨基酸序列(優化的共有序列)引入蛋白使得蛋白在引入位點被OTase有效地N-糖基化,例如,來自彎曲菌(campylobocter spp.)的OTase,例如,來自空腸彎曲菌的OTase。在本發明的上下文中使用的術語“局部氨基酸序列”也指“優化的共有序列”或“共有序列”。優化的共有序列被OTaseN-糖基化，例如來自彎曲菌的OTase，例如，來自空腸彎曲菌的OTase。根據國際上接受的氨基酸單字母編碼，縮寫D、E、N、S和T分別表示天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、和蘇氨酸。優化的共有序列的引入可以通過添加、刪除和/或取代一個或多個氨基酸來實現。以引入優化的共有序列為目的添加、刪除和/或取代一個或多個氨基酸可以通過本領域技術人員已知的化學合成策略例如固相輔助化學肽合成來實現。可替代地，并且對于更大的多肽優選地，本發明的蛋白可以通過標準重組技術通過將編碼一個或多個優化的共有序列的核酸添加進入起始蛋白的核酸序列中而制備，所述起始蛋白可以是天然糖基化的蛋白或者可以是沒有天然糖基化的蛋白。在一種優選的實施方式中，本發明的蛋白可以包含一個或多個，優選至少兩個或至少三個，更優選至少五個所述引入的N-糖基化的優化的氨基酸序列。本發明蛋白中的一個或多個N-糖基化的優化的氨基酸序列的存在有利于增加其抗原性、增加其穩定性、影響其生物活性、延長其生物半衰期和/或簡化其純化。優化的共有序列在位點X和Z處可以包括除脯氨酸之外的任何氨基酸。術語“任何氨基酸”意指包含常見的和稀有的天然氨基酸以及合成的氨基酸衍生物和類似物，其仍然能夠使得優化的共有序列被OTase N-糖基化。對于X和Z而言，天然存在的常見和稀有氨基酸是優選的。X和Z可以是相同或不同的。注意到在根據本發明的蛋白的每個優化的共有序列中X和Z可以不同。當在脂載體上通過OTase轉移來裝配寡糖時，結合于優化的共有序列的N-聚糖將通過特定的糖轉移酶及其相互作用來確定。本領域技術人員能夠通過改變期望的宿主細胞中存在的特定糖基轉移 酶的類型和量來設計N-聚糖。(Raetz&Whitfield，Lipopolysaccharide Endotoxins, NIH-PA Author Manuscriptl-57,19-25 (作為以下的最終編輯形式出版:Annua I Rev.Biochem., 71:635-700 (2002) ) ；Reeves 等人，Bacterial Polysaccharide Synthesis and Gene Nomenclature, Trendsin Microbi0.4(3):495-503,497-98(1996 年 12 月)；以及 Whitfield，C.和1.S.Roberts.1999.Structure, assembly and regulation of expression of capsulesin Escherichia col1.Mol Microbiol31 (5):1307-19)。如本文所用的，“多糖”包括包含至少兩個單糖的糖。多糖包括寡糖、三糖、包含一個或多個單糖(或單體)的重復單元、和本領域技術人員認為是多糖的其他糖。N-聚糖在本文中被定義為可變組成的單糖、寡糖或多糖，其通過N-糖苷鍵連接于蛋白中的天冬酰胺殘基的e _氣基氣。本發明的實施方式的多糖包括但不限于金黃色葡萄球菌多糖例如CP5和PC8。本發明的實施方式進一步包括靶向細菌的金黃色葡萄球菌多糖，例如靶向耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌株的多糖。當本文提及多糖靶向細菌菌株時，這樣的多糖包括來自期望發生針對它的免疫或抗原應答，并進一步包括與之相同、基于、來源于、其自身產生的、或者由這樣的細菌加工的、期望發生針對它的免疫或抗原應答的細菌的多糖。對本發明的重組蛋白的來源沒有限制。在一種實施方式中，所述蛋白來自哺乳動物、細菌、病毒、真菌或植物蛋白。在進一步的實施方式中，該蛋白來自哺乳動物，最優選人蛋白。為了制備根據本發明的抗原重組蛋白，優選為了用作疫苗中的活性組分，優選鈣重組蛋白來自細菌、病毒或真菌蛋白。各種來源的蛋白的糖基化是本領域技術人員公知的。Kowarik 等人〃Definition of the bacterial N-glycosylation site consensussequence"EMB0J.(2006)1-10。在一種實施方式的實例中，遺傳減毒的銅綠色假單胞菌外毒素(EPA)是合適的蛋白載體。為了產生可以被糖基化的EPA形式，編碼EPA的核酸需要通過插入如前所述的糖基化位點來進行修飾。想要用于 本發明的實施方式的蛋白載體應該優選具有某些免疫學和藥理學特征。以免疫學的觀點來看，優選地，蛋白載體應當:(1)具有T細胞表位；(2)能夠將抗原遞送至免疫系統中的抗原呈遞細胞(APC) ; (3)是有效的和持久的；以及(4)能夠產生抗原特異性系統性IgG應答。以藥理學的觀點來看，蛋白載體應當優選:(1)是無毒的；且(2)能夠有效遞送抗原穿過完整的上皮屏障。更優選地，除了這些免疫學和藥理學特征，考慮用于生產細菌生物綴合物的蛋白載體應當:(1)易于分泌進入周質空間；且(2)能夠具有易于作為環狀或線性序列引入其中的抗原表位。根據本文公開的內容和本領域普通技術人員的知識，本領域普通從業者可以常規地考慮并鑒別可以用于本發明的特定實施方式的合適的蛋白載體。在本發明的一種實施方式中，彎曲菌蛋白AcrA是蛋白載體。在本發明的進一步的實施方式中，遺傳減毒的銅綠色假單胞菌外毒素(EPA)是蛋白載體，其中期望疫苗的靶標生物是金黃色葡萄球菌。與含有天然糖基化位點的AcrA不同，EPA不含有這樣的天然糖基化位點，而需要通過插入糖基化位點來修飾(例如，將編碼前文所討論的優化的共有序列的核酸插入編碼EPA的核酸序列中)。在一種另外的實施方式中，對進行EPA修飾以引入兩個允許用金黃色葡萄球菌抗原來糖基化的糖基化位點。在另外一種實施方式中，如W02009/104074的實施例10所討論的引入兩個共有序列。在本發明的一種實施方式中，EPA的氨基酸序列被修飾為包含兩個糖基化位點，即SEQ ID NO: 13 (具有信號序列)和SEQ ID NO: 14 (不具有信號序列)。SEQ ID NO: 13中的糖基化位點是DNNNS和DQNRT，位置為260DNNNS和402DQNRT。SEQ ID NO: 14中的糖基化位點是 DNNNS 和 DQNRT，位置為 241DNNNS 和 383DQNRT。蛋白載體例如EPA是這樣的蛋白，可以為了產生細菌的生物綴合物而在其中加入N-糖基化位點。N-糖基化位點需要引入如前所述的共有序列，稱為，D/E-X-N-Z-S/T序列子的插入，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸。我們發現這樣的共有序列優選引入表面環中，通過插入而不是突變，并通過利用額外插入的側翼殘基和通過側翼殘基的突變來優化N-糖基化位點的運轉。一些充分表征的金黃色葡萄球菌的蛋白亞單位抗原是a溶血素(a毒素，Hla)、聚集因子 a (ClfA)、IsdB、和 Panton-Valentine 殺白細胞素(Panton-ValentineLeukocidin, PVL)。Hla是分泌的孔形成毒素，并且是金黃色葡萄球菌肺炎的小鼠模型中MRSA的基本的毒性因子。獨立的金黃色葡萄球菌菌株的Hla表達水平與其毒性直接相關。不能形成孔的Hla的突變形式(Hla H35L，SEQ ID NO:5)的自動免疫(Menzies，B.E ，和D.S.Kernodle.1996.Passive immunization with antiserum to a nontoxic alpha—toxinmutant from Staphylococcus aureus is protective in a murine model.1nfectTmmun64:1839-41 ；Jursch,R.,A.Hildebrand,G.Hobom,J.Tranum-Jensen,R.Ward,M.Kehoe和 S.Bhakd1.1994.Histidine residues near the N terminus of staphylococcalalpha—toxin as reporters of regions that are critical for oligomerizationand poreformation.1nfect Immun62 (6): 2249-56)顯不，產生抗原特異性免疫球蛋白G應答并提供針對葡萄球菌肺炎的保護。Hla特異性抗體的轉移保護了幼體動物對抗金黃色葡萄球菌的激發并防止在感染期間人肺上皮細胞的傷害(BubeckWardenburg,J., A.M.Palazzo 1-Bal Iance，M.0tto , 0.Schneewind 和 F.R.DeLe0.2008.Panton-Valentine leukocidin is not a virulence determinant in murine modelsof community-associated methici11 in-resistant Staphylococcus aureus disease.J Infect Dis 198:1166-70)。為了用作疫苗，需要Hla中的H35L突變以消除該蛋白的毒性(Menzies,B.E.和D.S.Kernodle.1994.Site-directed mutagenesis of the alpha-toxingene of Staphylococcus aureus:role of histidines in toxin activity in vitroand in a murine model.1nfect Tmmun62:1843-7) ClfA 包含用于免疫的蛋白酶抗性結構域。在乳腺感染模型中，小鼠用抗-ClfA和抗CP5抗體被動免疫有效地使乳腺無菌化(Tuchscherr, L.P.，F.R.Buzzola, L.P.Alvarez, J.C.Lee 和 D.0.Sordell1.2008.Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitisand the emergence of unencapsulated and smal1-colony variants of Staphylococcusaureus in mice.1nfect Immun76:5738-44)。本發明的進一步實施方式包括與金黃色葡萄球菌自身產生的蛋白例如Hla和ClfA的糖基化。在本發明的另外的實例性實施方式中，可以選擇所用的蛋白載體為Hla蛋白，例如 Hla H35L (例如，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO: 16)。在本發明的另一種實例性實施方式 中，蛋白載體是ClfA蛋白(例如，SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO:11 或 SEQ ID NO:12)。
本發明進一步涉及重組宿主原核生物，其包含:編碼一個或多個第一原核物種例如革蘭氏陽性類型的糖基化轉移酶的核苷酸序列；不同的原核物種例如革蘭氏陰性類型的一種或多種糖基轉移酶；編碼蛋白的氨基酸序列；和編碼OTase的核苷酸序列。本發明另外還涉及重組宿主原核生物，其包含:引入的編碼僅由革蘭氏陽性原核生物自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列；編碼蛋白的核苷酸序列；和編碼OTase的核苷酸序列。本發明還涉及重組的或工程化的宿主原核生物，其包含:編碼第一原核物種自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列，其例如不同于宿主原核生物；編碼第二原核物種自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列，所述第二原核物種不同于所述第一原核生物的物種并且，例如，不同于所述宿主。工程化的原核生物也可以，例如，包含是革蘭氏陽性類型的第一原核物種。工程化的原核生物也可以，例如，包含是革蘭氏陰性類型的第二原核物種。本發明進一步包括重組的或工程化的革蘭氏陰性菌宿主原核生物，其包含:編碼革蘭氏陰性原核物種自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列，所述革蘭氏陰性原核物種例如不同于所述宿主原核物種；編碼金黃色葡萄球菌自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列；編碼蛋白的核苷酸序列；和編碼OTase的核苷酸序列。本發明進一步包括重組的或工程化的大腸桿菌宿主，包含:編碼銅綠色假單胞菌自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列；編碼金黃色葡萄球菌CP5菌株和/或金黃色葡萄球菌CP8菌株自身產生的一種或多種糖基轉移酶的核苷酸序列；編碼銅綠色假單胞菌EPA、金黃色葡萄球菌a溶血素或金黃色葡萄球菌聚集因子A蛋白載體的核苷酸序列；和編碼OTase例如空腸彎曲 菌自身產生的OTase的核苷酸序列。除了在修飾的宿主大腸桿菌生物體內利用其他革蘭氏陰性生物體的生物合成途徑之外，在進一步的實施方式中，宿主大腸桿菌生物體內還包括編碼以下的核酸:(i)用于構建其他革蘭氏陰性生物體的多糖的重復單元結構(其與靶標革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌生物體的感興趣的多糖的重復單元相同)的糖基轉移酶，和(ii)構建靶標革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌生物體的感興趣的多糖的單元的糖基轉移酶，所述單元在其他革蘭氏陰性生物體的相關多糖內沒有被發現，和(iii)翻轉和聚合所構建的靶標革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌生物體的感興趣的RU以形成金黃色葡萄球菌莢膜樣多糖。尤其是，在該實施方式中，編碼(i)的核酸起源于其他革蘭氏陰性細菌，而編碼(ii)和(iii)的核酸起源于靶標革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌生物體。本發明的另一個方面涉及:工程化的宿主原核生物，其包含:i)編碼革蘭氏陽性原核物種自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列；ii)編碼蛋白的核苷酸序列；和iii)編碼OTase的核苷酸序列，其中編碼所述革蘭氏陽性原核物種的轉運體基因的序列被刪除。這樣的實施方式涉及引入的核酸構建體，其僅編碼革蘭氏陽性糖基轉移酶。關于在一種或多種其他實施方式中被插入宿主的其他核酸，除了注入編碼分別來自銅綠色假單胞菌和金黃色葡萄球菌的糖基轉移酶的核酸之外，還向宿主注入編碼蛋白的核酸，例如 AcrA、Hla、ClfA 或 EPA (SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:16 ；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12 ；SEQ ID NO:13、SEQ IDNO: 14)、以及空腸彎曲菌的寡糖轉移酶(SEQ ID N0:27)，它們是該生物提的糖基化機制的一部分。結果，修飾的大腸桿菌生物提能夠用在該生物提中通過來自金黃色葡萄球菌和其他革蘭氏陰性細菌的糖基轉移酶的作用產生的多糖來糖基化AcrA蛋白。本發明的一種實施方式涉及工程化的宿主原核生物，包含:i)編碼不同于宿主原核生物的第一原核物種自身產生的糖基化轉移酶的核苷酸序列；ii)編碼不同于宿主原核生物的第二原核物種自身產生的糖基轉移酶的核苷酸序列，所述第二原核物種為例如，革蘭氏陽性原核物種；iii)編碼蛋白的核苷酸序列；和iv)編碼OTase的核苷酸序列。在本發明的實施方式中，第一原核物種是革蘭氏陰性類型，例如，銅綠色假單胞菌。在本發明的上下文中，宿主細胞是指任何宿主細胞，例如，真核或原核宿主細胞。在其他實施方式中，宿主細胞是原核宿主細胞，例如埃希桿菌屬種(Escherichiassp.)、彎曲菌屬種(Campylobacter ssp.)、沙門氏菌屬種(Salmonella ssp.)、志賀氏菌屬種(Shigella ssp.)、螺桿菌屬種(Helicobacter ssp.)、假單胞菌屬種(Pseudomonasssp.)或芽孢桿菌屬種(Bacillus ssp.)。在進一步的實施方式中，宿主細胞是大腸桿菌(Escherichia Coli)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)等等。本發明進一步涉及產生生物綴合物疫苗的方法，包括向宿主原核生物中引入核酸，所述核酸編碼金黃色葡萄球菌的一種或多種糖基轉移酶；第二原核物種的一種或多種糖基轉移酶；和OTase。另外，本發明涉及通過在革蘭氏陰性細菌中產生修飾的十一異戊烯醇(Und)上的莢膜多糖，并將這些多糖抗原連接至選定的蛋白載體來產生生物綴合物疫苗。本發明進一步涉及在宿主原核生物中生產糖基化蛋白的方法，其中包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼第一原核生物自身產生的糖基轉移酶并且也編碼與不同于第一原核生物的第二原核生物自身產生的糖基轉移酶。本發明另外涉及用革蘭氏陽性細菌的莢膜多糖N-糖基化的蛋白的生產，其通過組合來自不同生物體的不同糖基轉移酶來合成。本發明進一步涉及在宿主原核生物中產生糖基化蛋白，所述宿主原核生物包含引入的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼僅由革蘭氏陽性原核生物自身產生的糖基轉移酶。如本領域所知，不同多糖的生物合成在細菌細胞中是保守的。多糖在細胞質膜上由通常的前體(活化的糖核苷)通過具有確定特異性的不同糖基轉移酶而裝配在載體脂(carrier lipid)上。(Whitfield, C.和1.S.Roberts.1999.Structure,assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia col1.MolMicrobiol31:1307-19)。革蘭氏陰性菌中0-抗原的多糖生產和革蘭氏陽性菌中I型莢膜多糖的生物合成途徑是保守的。該過程利用相同的脂載體，即，UndP，用于多糖裝配。其開始于在膜的細胞質側向載體脂UndP上添加單糖-1-磷酸。抗原通過不同的糖基轉移酶從活化的糖核苷來按順序添加單糖而構建。然后脂連接的寡糖或RU由翻轉酶翻轉通過膜。RU在周質空間中通過酶Wzy而聚合，形成所稱的在革蘭氏陰性菌中的0-抗原或在革蘭氏陽性菌中的莢膜多糖。革蘭氏陰性菌利用Wzz酶來調節聚合物的長度，其然后轉移至脂A核心形成LPS。LPS進一步轉位至外膜，將0-抗原暴露于外側(例如圖1中所描繪的)。相反，革蘭氏陽性細菌從通過利用不同的和特異的酶機制而進一步轉移這些脂結合前體以形成莢膜。這些多糖的生物合成途徑使得能夠在體內通過捕獲周質中的多糖至蛋白載體上而產生生物綴合物。多糖構建的過程不同于莢膜多糖之處在于莢膜多糖在聚合之后從載體脂釋放并輸出至表面。在不含有周質間隔的革蘭氏陽性菌(例如金黃色葡萄球菌)中，抗原的聚合在膜的外側進行。另外，金黃色 葡萄球菌中的長度調節包括在負責莢膜裝配的三種酶的機制中。在該裝配中，多糖從脂載體釋放并通過酶促過程輸出至表面。
在金黃色葡萄球菌的功能性莢膜表達所需的基因簇中發現的遺傳元件(geneticelement)類似于wzy依賴性0_抗原合成簇的遺傳機制(Dean, C.R., C.V.Franklund,J.D.Retief, M.J.Coyne, Jr.，K.Hatano, D.J.Evans, G.B.Pier 和 J.B.Goldberg.1999.Characterization of the serogroup Oil 0—antigen locus of Pseudomonas aeruginosaPA103.J Bacterioll81:4275-4284)。盡管革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的多糖結構之間的差別，但我們仍出人意料發現并驗證了革蘭氏陰性生物體中的LPS途徑能夠用于生產含有一些革蘭氏陽性細菌(例如金黃色葡萄球菌)自身產生的莢膜多糖相同的重復單元的多糖。由于這些多糖通過革蘭氏陰性宿主中的LPS途徑機制產生，因此這樣的多糖的結構與LPS多糖前體是相同的。因而，本發明的革蘭氏陰性系統中產生的這樣的多糖能夠被表征為“修飾的莢膜多糖”或“LPS莢膜”，以用于本發明的目的。進一步地，新合成的表達系統和生物合成途徑，其包含LPS和莢膜生物合成途徑，能夠被表征為“修飾的LPS生物合成途徑”，以用于本發明的目的。在本發明的一種實施方式中，修飾的多糖由修飾的LPS生物合成途徑來生產，其包含:
權利要求
1.一種金黃色葡萄球菌疫苗，包含:包含插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的蛋白，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；連接于所述共有序列的至少一種金黃色葡萄球菌多糖；和，可選地，藥學上可接受的載體或佐劑。
2.根據權利要求1所述的金黃色葡萄球菌疫苗，其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含莢膜多糖5。
3.根據權利要求1所述的金黃色葡萄球菌疫苗，其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含莢膜多糖8。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的金黃色葡萄球菌疫苗,其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖靶向耐甲氧西林的抗性金黃色葡萄球菌菌株。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的金黃色葡萄球菌疫苗，其中，所述蛋白是銅綠色假單胞菌外毒素。
6.根據權利要求1-4中任一項所述的金黃色葡萄球菌疫苗，其中，所述蛋白是金黃色葡萄球菌α溶血素。
7.根據權利要求1-4中任一項所述的金黃色葡萄球菌疫苗，其中，所述蛋白是金黃色葡萄球菌凝集因子Α。
8.根據權利要求5- 7中任一項所述的金黃色葡萄球菌疫苗,其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含以下結構:
9.根據權利要求5-7中任一項所述的金黃色葡萄球菌疫苗,其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含以下結構:
10.根據權利要求1-7中任一項所述的金黃色葡萄球菌疫苗，包含兩個或更多個所述插入的共有序列和兩個或更多個所述金黃色葡萄球菌多糖。
11.根據權利要求10所述的金黃色葡萄球菌疫苗，其中，所述金黃色葡萄球菌多糖包含靶向不同金黃色葡萄球菌菌株的多糖。
12.根據權利要求11所述的金黃色葡萄球菌疫苗，其中，所述金黃色葡萄球菌多糖包含莢膜多糖5和莢膜多糖8。
13.一種重組N-糖基化蛋白，包含:包含至少一個插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的蛋白，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；和連接至所述共有序列的至少一種金黃色葡萄球菌多糖。
14.根據權利要求13所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含莢膜多糖5。
15.根據權利要求13所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含莢膜多糖8。
16.根據權利要求13-15中任一項所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖靶向耐甲氧西林的抗性金黃色葡萄球菌菌株。
17.根據權利要求13-16中任一項所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述蛋白是銅綠色假單胞菌外毒素。
18.根據權利要求13-16中任一項所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述蛋白是金黃色葡萄球菌α溶血素。
19.根據權利要求13-16中任一項所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述蛋白是金黃色葡萄球菌凝集因子Α。
20.根據權利要求17-19中任一項所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含以下結構:
21.根據權利要求17-19中任一項所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述至少一種金黃色葡萄球菌多糖包含以下結構:
22.根據權利要求13-19中任一項所述的重組N-糖基化蛋白，包含兩個或更多個所述插入的共有序列和兩個或更多個所述金黃色葡萄球菌多糖。
23.根據權利要求22所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述金黃色葡萄球菌多糖包含靶向不同金黃色葡萄球菌菌株的多糖。
24.根據權利要求23所述的重組N-糖基化蛋白，其中，所述金黃色葡萄球菌多糖包含莢膜多糖5和莢膜多糖8。
25.—種革蘭氏陰性宿主原核生物，包含:編碼至少一種來自革蘭氏陽性細菌的糖基轉移酶的核苷酸序列；編碼至少一種來自革蘭氏陰性細菌的糖基轉移酶的核苷酸序列；編碼蛋白的核苷酸序列；和編碼寡糖基轉移酶的核苷酸序列。
26.根據權利要求25所述的宿主原核生物，其中，所述革蘭氏陽性細菌是金黃色葡萄球菌。
27.根據權利要求25或26中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述革蘭氏陰性細菌是銅綠色假單胞菌。
28.根據權利要求25-27中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述金黃色葡萄球菌是莢膜多糖5菌株。
29.根據權利要求25-27中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述金黃色葡萄球菌是莢膜多糖8菌株。
30.根據權利要求25-29中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述金黃色葡萄球菌是耐甲氧西林的菌株。
31.根據權利要求25-30中任一項所述的宿主原核生物，包含至少兩種來自不同的革蘭氏陽性細菌菌株的糖基轉移酶。
32.根據權利要求25-31中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述蛋白是銅綠色假單胞菌外毒素。
33.根據權利要求25-31中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述蛋白是金黃色葡萄球菌α溶血素。
34.根據權利要求25-31中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述蛋白是金黃色葡萄球菌凝集因子Α。
35.根據權利要求25-34中任一項所述的宿主原核生物，其中，所述宿主生物是大腸桿菌。
36.一種修飾第一革蘭氏陰性類型的細菌的方法，包括:選擇革蘭氏陽性細菌作為靶標；鑒別由所述革蘭氏陽性細菌產生的多糖的第一重復單元，所述第一重復單元包含至少三個單體；鑒別由第二革蘭氏陰性類型的細菌產生的包含第二重復單元的多糖，所述第二重復單元包含至少兩個與所述第一重復單元相同的單體；向所述第一革蘭氏陰性類型的細菌插入一個或多個編碼糖基轉移酶的核苷酸序列，所述糖基轉移酶裝備含有以下的三糖:a)所述第二重復單元；和b)所述第二重復單元中不存在的所述第一重復單元的單體；插入編碼蛋白的核苷酸序列；和插入編碼寡糖基轉移酶的核苷酸序列。
37.根據權利要求36所述的方法，其中，所述蛋白包含至少一個插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸。
38.根據權利要求36或37所述的方法，其中，所述革蘭氏陽性細菌是金黃色葡萄球菌。
全文摘要
本發明的一種實施方式涉及新的金黃色葡萄球菌生物綴合物疫苗。更通常地，本發明涉及革蘭氏陽性和其他生物綴合物疫苗，包含包含插入的核酸共有序列的蛋白載體；至少一個連接至共有序列的多糖例如莢膜革蘭氏陽性多糖；以及可選地佐劑或藥學上可接受的載體。在進一步的方面，本發明涉及一種生產革蘭氏陽性和其他生物綴合物疫苗的方法。在另一個方面，本發明提供了N-糖基化蛋白，其包含一種或多種多糖，例如革蘭氏陽性多糖。本發明還涉及工程化的原核生物體，其包含編碼第一原核生物體的糖基轉移酶和第二原核生物體的糖基轉移酶的核酸序列。本發明進一步包括質粒和用質粒轉化的原核細胞，所述質粒編碼多糖或生產N-糖基化蛋白和/或生物綴合物疫苗的酶。進一步地，本發明涉及在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包含給藥所述生物綴合物疫苗。
文檔編號A61K39/085GK103079591SQ201180033560
公開日2013年5月1日 申請日期2011年5月4日 優先權日2010年5月6日
發明者M·瓦克, 邁克爾·科瓦里克, 邁克爾·韋特 申請人:格林考瓦因有限公司