專利名稱：在用于增加神經組織的神經發生的方法中使用的乙酰基-肉堿的制作方法
技術領域：
本發明涉及烷酰基L-肉堿用于增加神經發生的用途。具體地，本發明涉及乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽用于增加神經發生的用途。
背景技術：
認為神經發生或新神經元細胞的產生僅發生在發育中的生物體中。但是，近期的研究已經證實，在脊椎動物和無脊椎動物生物體中，神經發生實際上持續至成年生命 并貫穿其中。神經干細胞(NSC)是哺乳動物中樞神經系統(CNS)中的新神經元的來源。NSC位于襯在側腦室里的室管膜區和/或室下區(SVZ)內(Cell 1999; 97:703-716; Cell1999; 96:25-34)，且位于海馬結構的齒狀回中(J. Neurobiol. 1998; 36:249-266)。研究已經揭示了 NSC在成年CNS內的幾個其它位置的潛力(J. Neurosci. 1999;19:8487-8497)。NSC的不對稱分裂會維持它們的起始數目，同時產生一群快速分裂的前體或祖細胞(Cell1999;96:25-34)。所述祖細胞對許多信號做出響應，所述信號決定它們的增殖程度和它們的命運，二者都是以分化和定位的方式。成年人的腦室系統的NSC可能是襯在神經管里的胚胎腦室帶干細胞的副本。這些胚胎細胞的后代遷移離開，以形成CNS，成為分化的神經元和神經膠質(DevelopmentalNeurobiology. 1991 ;第401-451頁)。NSC存留在成年側腦室壁(LVW)中，從而產生神經元祖細胞，所述祖細胞沿著嘴側遷移流向下遷移至嗅球。在那里，它們分化成顆粒細胞和球旁神經元(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:2074-2077)。大量神經元死亡發生在嗅球中，從而造成對喪失的神經元的持續替代的需求，從LVW衍生出的遷移祖細胞滿足了該需求(Neurosci. Lett. 2000;291:17-20)。另外，有人指出，來自其它腦區的喪失的神經元可以被來自LVW的祖細胞替代，后者分化成具有適當的神經元突出物和突觸的喪失的神經元的表型，它們具有正確的靶細胞類型(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:11663-11668; Nature2000;405:951-955)o已經確立了體外培養技術，以鑒別在NSC增殖和分化的調節中涉及的外部信號(Cell 1999 ;96:25-34; Exp. Cell Res. 1999; 253:733-736)。促分裂原 EGF 和基礎 FGF 允許分離自腦室壁和海馬的神經祖細胞的細胞培養繁殖(Science 1997; 276:66-71; Exp.Cell Res. 1999;253:733-736)。這些分裂中的祖細胞保持在未分化狀態，并生長成稱作神經球的大細胞克隆。在撤去促分裂原并加入血清以后，所述祖細胞會分化成神經元、星形膠質細胞和少突神經膠質細胞，它們是腦的3個細胞譜系(Cell 1999;97:703-716;Cell1999;96:25-34)。可以加入特異性的生長因子，以改變形成的每種細胞類型的比例。例如，CNTF的作用是，指導神經祖細胞具有星形細胞命運(Genes Dev. 1996; 10:3129-3140; J.Neurosci. 1998;18:3620-3629)。甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸(T3)會促進少突神經膠質細胞分化(Genes Dev. 1996; 10:3129-3140)，而I3DGF會增強祖細胞的神經元分化(GenesDev. 1996; 10:3129-3140;Neuron 1997;18:553-562)。最近已經證實，成年人再生的神經元實際上整合進現存的腦回路中，并繼續改善神經性缺乏(Cell 2002; 110:429441)。令人感興趣地，觀察結果還已經表明，神經發生不僅發生在嗅球和海馬的水平。在這方面，已經提示，該過程也可以發生在成年小鼠黑質中，這開啟了帕金森病治療研究的一片新天地(Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2003;100:7925-7930)。繁殖神經祖細胞和操縱它們的細胞命運的能力，對于神經學疾病(其中喪失特定細胞類型)的移植療法而言具有深遠影響。例如，帕金森病(PD)的特征在于，黑質中的多巴胺能神經元的退化。ro患者的先前移植治療已經使用取自中腦腹側的胎兒組織(在黑質多巴胺能神經元正發生終末分化時)(Prog. Neurobiol. 1994;44:1-35)。已經將這些細胞移植到紋狀體上，它們在此處形成與宿主紋狀體神經元(它們的通常突觸靶物)的突觸接觸。這會恢復多巴胺周轉，并釋放至正常水平，對患者具有顯著的功能益處(Prog.Neurobiol. 1994;44:1-35)。但是，胎兒組織的移植受到倫理考慮和供體組織缺乏的限制。 成年NSC的繁殖和操縱可以潛在地提供許多確定地表征的細胞，用于諸如H)等神經變性疾病的基于移植的策略。為此目的，掌控神經細胞類型的增殖和分化的因素和途徑的鑒別，是根本性地重要的。研究已經表明，EGF和基礎FGF的心室內輸注都會誘導成年腦室壁細胞群的增殖。在EGF的情況下，已經觀察到祖細胞向鄰近的紋狀體實質中的廣泛遷移(J. Neurosci1996; 16:2649-2658; J. Neurosci 1997; 17:5820-5829)。EGF 會增加向神經膠質譜系的分化，并減少神經元的產生(J. Neurosci 1997;17:5820-5829)。另外，BDNF在成年大鼠中的心室內輸注會增加在嗅球和嘴側遷移流中和在實質結構(包括紋狀體、隔膜、丘腦和下丘腦)中新產生的神經元的數目(J. Neurosci. 2001;21:6706-6717)。因而，幾項研究已經表明，可以刺激在LVW的SVZ內的祖細胞的增殖，且可以引導它們的譜系成為神經元或神經膠質命運。然而，已知會影響體內神經發生的因素的數目較小，且它們的作用是不利的或有限的。如上所述，掌控神經細胞類型的增殖和分化的因素和途徑的鑒別，在醫學領域中是根本性地重要的。乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿在醫學領域中的應用是已知的。US 4346107涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理大腦代謝受損的患者(例如在老年和老年前期精神運動涉及狀態，和在老年和老年前期癡呆中)的用途。US 4343816涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理具有周圍血管疾病(諸如通常，雷諾病)的患者的用途。WO 9857629涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理遭受情緒障礙的年輕個體的用途，基于DMS IV和AXIS II分類，所述情緒障礙可分類為心境惡劣(DMS IV)和抑郁的、易發怒的、循環型情感性人格或性情，包括精神藥品的明確濫用。WO 03066041涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理具有嚴重抑郁障礙的非癡呆型老年受試者(NDG-MDD)的抑郁癥的用途。EP 0256999涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理受急性或慢性周圍神經病影響的患者的用途。
EP 0498144涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理傷損昏憒的用途。在該公開中還報道稱，乙酰基L-肉堿能夠增加大腦血流量(CBF)，這借助于SPECT (單光子發射計算機體層攝影術)測得。EP 0793962涉及丙酰基L-肉堿用于治療具有嚴重失能型間歇性跛行的患者的慢性閉塞性動脈硬化的用途。已經公認，在整個生命中，由神經干細胞/祖細胞(NSC)在成年海馬中產生新神經元。神經發生是對外界刺激響應性的再生過程，涉及學習、記憶和情緒調節。因此，認為神經發生是神經再生的一種重要形式，這使生物體能夠在整個生命中適應環境變化。海馬神經發生的速率隨生理性或病理性影響(諸如體育活動、環境強化、應激、情緒障礙、老化和神經變性障礙)顯著地變化。實際上，在老化過程中，在成年人神經發生中存在年齡相關的下降。該下降主要與減少的增殖有關，與對老化腦中的增殖的刺激減少有關。天然的或刺激性的海馬神經發生在抗抑郁藥的臨床效果中起重要作用，且可能減少的神經發生可能涉入與抑郁癥有關的腦區(包括海馬)萎縮。在阿爾茨海默氏病(AD)中，也存在減少的神經發生(其伴隨該疾病的神經元損失特征)的證據。在醫學領域，認知到具有可獲得的新化合物或已知化合物的新用途的需要，所述化合物可用于刺激神經發生，用于預防在腦的正常或病理過程中的神經元損失。
圖I表明，ALC對干細胞/成年祖細胞向成熟的和未成熟的神經元的分化具有濃度依賴性的強化作用。實際上，ALC具有顯著的濃度依賴性的海馬神經發生活性，正如培養物中MAP-2陽性細胞(即新神經元)的百分比的增加所證實的。圖2顯示了通過免疫熒光染色通過培養的神經元中的MAP-2染色評價的ALC的海馬神經發生活性(MAP2-陽性細胞)。細胞核被Draq5染色。圖3和4表明，ALC的神經發生活性與神經保護活性無關。實際上，在誘導神經發生的濃度，ALC (100μΜ;300μΜ或ImM)沒有降低凋亡細胞核的百分比(圖3)或甚至LDH酶的活性(壞死的一項指標)(圖4)。在圖5中顯示了 ALC對處于不同分化階段的細胞的特異性效應。為了更好地理解圖5，重要的是澄清，使用“巢蛋白”(主要由神經干細胞表達的一種中間絲蛋白)作為特異性標志物。實際上，當置于神經干細胞所用的培養條件中時，僅巢蛋白陽性的(巢蛋白+)細胞形成球。具體地，成熟的神經元是ΜΑΡ2陽性的和巢蛋白陰性的，未成熟的神經元是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陽性的，干祖細胞是ΜΑΡ2陰性的和巢蛋白陽性的，祖細胞是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陰性的(參見圖5)。在圖6中表明，PLC和ALC是NPC神經元分化的活化劑。實際上，PLC會增加成熟的神經元和未成熟的神經元的數目，并減少未分化的干/神經祖細胞的亞群的數目，盡管與ALC相比是在更低的程度上。相反，LC不具有作用。此外，結果證實，ALC和PLC對NPC分化的影響不是由于對新產生的未成熟的或成熟的神經元的神經保護作用。·(同義詞乙酰基L-肉堿=ALC=ALCAR=L_acet ;丙酰基 L-肉堿=PLC=L-Prop ；LC=L-肉喊=L_car )。
發明描述本發明涉及用于增加神經組織的神經發生的烷酰基L-肉堿或其鹽。因此，本發明的一個目的是，用于增加神經組織的神經發生的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽。 本發明的另一個目的是，用作用于增加神經組織的神經發生的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿；其中所述增加的神經發生可用于預防中樞神經系統障礙。本發明的另一個目的是，用作用于增加神經組織的神經發生的藥物或食品添加物 的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿；其中所述增加的神經發生可用于預防由老化或遺傳傾向導致的中樞神經系統障礙。本發明的另一個目的是，用作用于預防中樞神經系統疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿，其中所述疾病或紊亂的原因是由老化或遺傳傾向導致的神經元損失。本發明的另一個目的是，用作用于預防中樞神經系統疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿，其中所述疾病或紊亂對增加的神經發生有響應。本發明的另一個目的是，乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于增加神經組織的神經發生；其中所述增加的神經發生可用于預防中樞神經系統障礙。本發明的另一個目的是，乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于增加神經組織的神經發生；其中所述增加的神經發生可用于預防由老化或遺傳傾向導致的中樞神經系統障礙。本發明的另一個目的是，乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于預防中樞神經系統疾病或紊亂，其中所述疾病或紊亂的原因是由老化或遺傳傾向導致的神經元損失。本發明的另一個目的是，乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于預防中樞神經系統疾病或紊亂，其中所述疾病或紊亂對增加的神經發生有響應。本發明的另一個目的是，一種用于預防中樞神經系統障礙的方法，其中給有此需要的患者施用適用于增加神經發生的量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿。本發明的另一個目的是，一種用于預防由老化或遺傳傾向導致的中樞神經系統障礙的方法，其中給有此需要的患者施用適用于增加神經發生的量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉喊。本發明的另一個目的是，一種用于增加神經發生的方法，其中給有此需要的患者施用適用于預防中樞神經系統障礙的量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿。本發明的另一個目的是，一種用于增加神經發生的方法，其中給有此需要的患者施用適用于預防由老化或遺傳傾向導致的中樞神經系統障礙的量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉喊。本發明的另一個目的是，一種用于增加神經發生的方法，其中所述增加的神經發生可用于預防中樞神經系統障礙，其中給有此需要的患者長期施用合適量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿。本發明的另一個目的是，一種用于增加神經發生的方法，其中所述增加的神經發生可用于預防由老化或遺傳傾向導致的中樞神經系統障礙，其中給有此需要的患者長期施用合適量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿。根據本發明可以預防的由遺傳傾向導致的和/或與老化相關的疾病或紊亂選自神經變性障礙、帕金森病和帕金森障礙、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、多發性硬化、肌萎縮側索硬化、Shy-Drager綜合征、Lewy體病、脊椎缺血、缺血性中風、腦梗死、老年癡呆、其它認知損害和抑郁癥。顯然，根據本發明，不包括具有神經(例如受損神經)或CNS (例如傷損昏憒)的創傷性紊亂的患者。“神經發生”在本文中被定義為，神經細胞在體內或在體外的增殖、分化、遷移或存活。在一個優選的實施方案中，所述神經細胞是成年人的、胎兒的或胚胎的神經干細胞或祖細胞。神經發生也表示細胞數目的凈增加或細胞存活的凈增加。本文使用的“NSC”至少包括，所有腦干細胞、所有腦祖細胞和所有腦前體細胞。在本公開內容中，術語疾病或障礙應當具有相同的含義。乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿可以全身性施用，或直接施用進患者的CNS中。施用途徑包括口服、皮下的、透皮的、腹膜內的、肌肉內的、靜脈內的、腦室內的、實質內的、鞘內的、顱內的、經頰的、粘膜的、鼻的、經肺的和直腸的施用，或通過脂質體遞送系統施用。優選地，所述藥物組合物用于通過刺激神經發生(B卩，細胞生長、增殖、遷移、存活和/或分化)而預防疾病。就預防而言，本發明的方法包括在O. Ig/天至4. OOg/天的劑量范圍內，優選地在1-2. OOg/天的劑量范圍內，最優選地以I. 5g/天,在單次或多次劑量中， 給受試者施用有效量的包括乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿的藥物組合物。本發明的組合物可以另外包含生理上可接受的載體。根據本發明，生理上可接受的載體可以是本領域已知適用于制藥(即，局部的、口服的和腸胃外的)用途的任何載體。合適的藥用載體和制劑描述在，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 19 版)(Genarro 編(1995)Mack PublishingCo. , Easton, Pa.)。本發明的任意方法可以用于預防神經學疾病或障礙的征狀，諸如帕金森病(震顫麻痹)，包括原發性帕金森病、繼發性帕金森綜合征和腦炎后帕金森綜合征；藥物誘發的運動障礙，包括帕金森綜合征、急性張力失常、遲發性運動障礙和神經安定藥惡性綜合征；亨廷頓病(亨廷頓舞蹈病；慢性進行性舞蹈病；遺傳性舞蹈病)；譫妄(急性精神混亂狀態)；癡呆；阿爾茨海默氏病；非阿爾茨海默氏癡呆，包括Lewy體癡呆、血管性癡呆、賓斯旺格癡呆(皮層下動脈硬化性腦病)、拳擊員癡呆、正常壓力腦積水、全身輕癱、額顳癡呆、多發梗塞性癡呆和AIDS癡呆；年齡相關的記憶病損(AAMI);遺忘癥，諸如逆行性遺忘癥、順行性遺忘癥、完全性遺忘癥、情態特異性的遺忘癥、短暫性遺忘癥、穩定性遺忘癥和進行性遺忘癥；和科爾薩科夫病。其它疾病和障礙包括特發性直立性低血壓、Shy-Drager綜合征、進行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski綜合征)；小腦結構損傷，諸如與梗塞、出血或腫瘤有關的那些；脊髓小腦退化，諸如與弗里德賴希共濟失調有關的那些，無β脂蛋白血癥(例如，Bassen-Kornzweig綜合征,維生素E缺乏)、雷夫蘇姆病(植燒酸忙積病)、小腦性共濟失調、多系統萎縮(橄欖體腦橋小腦萎縮)、共濟失調-毛細管擴張和線粒體多系統障礙；急性播散性腦脊髓炎(感染后腦脊髓炎)；腎上腺腦白質營養不良和腎上腺髓質神經病；萊貝爾遺傳性視神經萎縮；HTLV-相關的脊髓病；和多發性硬化；運動神經元障礙，諸如肌萎縮側索硬化、進行性延髓麻痹、進行性肌萎縮、原發性側索硬化和進行性假性延髓麻痹和脊髓性肌萎縮，諸如I型脊髓性肌萎縮(Werdnig-Hoffman病)、II型(中間)脊髓性肌萎縮、III型脊髓性肌萎縮(Wohlfart-Kugelberg-Welander病)和IV型脊髓性肌萎縮。本發明的方法可以用于治療任意哺乳動物，包括人類、牛、馬、狗、綿羊和貓。優選地，本發明的方法被用于治療人類。在一個方面，本發明提供了神經障礙的再生性預防，其中刺激細胞(例如，干細胞)生長、增殖、遷移、存活和/或分化，以替代已經喪失或破壞的神經細胞。通過在適當制劑中給細胞局部地施用(通過任意途徑)本發明的神經發生調節劑，可以實現這樣的細胞(例如，干細胞)的體內刺激。適合用于本發明中的藥物組合物包括這樣的組合物其中含有實現它的預期目的 有效量的活性成分。更具體地，治療有效量是指，最佳地刺激(例如，干細胞或祖細胞)增殖的有效量。應當理解，在每個劑型的單個劑量中包含一種或多種活性成分的單位含量不需要自身構成有效量，因為通過施用多個劑量單位(諸如膠囊劑或片劑或其組合)可以達到需要的有效量。另外，應當理解，在某些劑量水平，有效量可能在使用I周、I個月、3個月、6個月或I年或更久以后不會表現出任何可測量的效應(所述可測量的效應可以是衰退的缺少)。有效量的確定屬于本領域技術人員的能力。任何特定用戶的具體劑量水平將取決于多種因素，包括年齡、體育活動水平、一般健康和要預防的障礙的嚴重性。對于任意化合物，最初可以在細胞培養試驗中或在動物模型(通常小鼠或大鼠)中估測治療有效劑量。所述動物模型也可以用于確定適當的濃度范圍和給藥途徑。這樣的信息然后可以用于確定對于在人類中施用而言有用的劑量和途徑。對于人受試者而言，精確有效劑量取決于疾病狀態的嚴重性，受試者的一般健康，受試者的年齡、體重和性別，飲食，給藥時間和頻率，對治療的反應敏感性和耐受性/應答。該量可以通過例行試驗來確定，且由臨床醫師判斷。乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿的鹽是，與不會產生毒副作用的酸形成的任意鹽。這樣的鹽的非限制性實例是氯化物、溴化物、乳清酸鹽、天冬氨酸鹽、酸性天冬氨酸鹽、酸性檸檬酸鹽、檸檬酸鎂、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、富馬酸鹽和酸性富馬酸鹽、富馬酸鎂、乳酸鹽、馬來酸鹽和酸性馬來酸鹽、草酸鹽、酸性草酸鹽、撲酸鹽、酸性撲酸鹽、硫酸鹽、酸性硫酸鹽、磷酸葡萄糖、酒石酸鹽和酸性酒石酸鹽、甘油磷酸鹽、粘酸鹽、酒石酸鎂、2-氨基-乙磺酸鹽、2-氨基-乙磺酸鎂、甲磺酸鹽、酒石酸膽堿、三氯乙酸鹽和三氟乙酸鹽。在出版物Int. J. of Pharm. 33 (1986)，201-217中，給出了 FDA批準的藥學上可接受的鹽的列表。乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿是已知的化合物，它們的制備方法描述在US4，254，053中。它們的獲得因此是非常容易的，因為這些產品目前已經長時間面市，且具有適合人類施用的等級。如在下面報道的實驗部分中所證實的，根據本發明的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿的神經發生活性與它們的神經保護活性無關。實際上，在誘導神經發生的濃度，乙酰基L-肉堿和丙酰基L-肉堿沒有降低凋亡細胞核的百分比或LDH酶的活性(壞死的一項指標)。下面的非限制性實施例進一步例證了本發明。實施例IALC在體外調節取自小鼠海馬的成年神經祖細胞的神經元分化。前言甚至在成年期中，發生與細胞增殖、分化、遷移和存活有關的復雜的事件集合，所述事件表征從神經干細胞開始的成年神經發生。這些事件主要發生在腦中的2個分開的區 域中海馬齒狀筋膜的顆粒下區(顆粒下區，SGZ)和側腦室壁中的室下區(室下區，SVZ)，認為這些區域是使干細胞能存活和定期地且不對稱地分裂的有利微環境(小生境)，從而產生快速分裂的祖細胞，其中的一些向神經元分化前進。材料和方法動物和培養的海馬神經球的制備。如以前在Denis-Donini S.等人J. Neuroscience, 2008中所述,制備來自小鼠海馬的成年干細胞，并以神經球的形式維持培養。具體地，根據動物實驗法律，使用3-5個月齡的雄性CDl小鼠。干細胞/成年神經祖細胞的增殖。解離4-12代的神經球，以IXlO5細胞/ml的密度鋪板在96-孔板內的不同濃度的ALC (O. l_2mM)或媒介物中。在24、48、72和96小時以后，使用CellTiter-GlowTM發光的試劑盒(Promega)處理所述細胞，以測量存在的細胞ATP的量。干細胞/成年神經祖細胞的分化。為了分化，解離從4-12代的海馬神經球衍生出的細胞，以約40，000細胞/cm2的密度，鋪板在預先用小鼠層粘連蛋白(2. 5 μ g/cm2, Sigma)包被的Lab-Tek 8_孔permanox室載玻片(Nunc, Wiesbaden,德國)上。分化培養基的組成是Neurobasal_A、添加物B27、谷氨酰胺2mM、100U/100 μ g/ml青霉素/鏈霉素。將ALC (O. l_2mM)或媒介物加入所述培養基中。在24小時以后，洗滌細胞，在4%低聚甲醛中固定20min，隨后使用免疫熒光進行分析。使用免疫熒光的分析。在PBS中洗滌在有ALC、媒介物或參照藥物存在下分化以后固定的細胞3次，通過與補充了 0.48% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma)的 PBS—起在室溫溫育 5min,進行滲透化處理。隨后，與下述第一抗體一起溫育細胞抗-巢蛋白小鼠單克隆抗體，1:1200, Abeam, Cambridge, MA);抗-MAP-2 (兔多克隆抗體，1:600，Chemicon)。在含有8% (vol/vol)山羊血清的溶液中，在第一抗體中在室溫溫育所述細胞150min。使用的第二抗體是:Alexa Fluor 594-綴合的驢抗-小鼠抗體(1:1400，Molecular Probes)、AlexaFluor 488-綴合的驢抗-兔(1:1600，Molecular Probes),在含有 16% (vol/vol)驢血清的溶液中。然后用在PBS中制備的Draq5 (1:2000, Alexis Biochemicals)對細胞核進行復染色。使用突光封固劑(DakoCytomation, Glostrup),裝配載玻片。在每個實驗中，如果用于辨別它們的一種或多種表現型標志物是陽性的，那么定量至少5個視野/孔的細胞(與約150個細胞相對應):未分化的干祖細胞、未成熟的神經元、成熟的神經元。由操作人員(不知曉細胞經歷的處理的性質)使用具有60X透鏡的ECLIPSEE600熒光顯微鏡(NIKON，Calenzano，意大利)，計數細胞。所有實驗在至少5個細胞制品上進行，一式三份地制作每個實驗點。評估和細胞存活。在有ALC、媒介物或參照藥物存在下分化以后，收集培養基，使用細胞毒性檢測試劑盒LDKRoche Applied Science)，按照生產商的說明書，測定LDH酶的活性，以定量由壞死導致的死亡。平行地，也為了評估凋亡性死亡，在固定以后，用在PBS中稀釋的O. 8ng/mlHoechst (Sigma-Aldrich)標記細胞核。由操作人員(不知曉細胞經歷的處理的性質)使用具有60X透鏡的ECLIPSE E600熒光顯微鏡(NIKON, Calenzano,意大利)，計數凋亡細胞核。所有實驗在至少5個細胞制品上進行，一式三份地制作每個實驗點。結果在該研究中，使用微管相關蛋白2 (MAP2)作為神經元特異性的標志物。MAP-2是腦組織的主要微管相關蛋白。有人指出，MAP2在某些類型的神經元中的表達水平高于在其它類型的神經元中。已知MAP2會促進微管裝配，并在微管上形成側臂，這是神經發生的一個必需步驟。它也會與神經絲、肌動蛋白和細胞骨架的其它元件相互作用。在來自小鼠海馬的成年神經球中，與丙戊酸(VPA，一種陽性的神經發生調節劑)相t匕，已經證實,ALC對干細胞/成年祖細胞分化成成熟的和未成熟的神經元具有劑量依賴性的強化作用(圖I)。實際上，ALC具有顯著的濃度依賴性的海馬神經發生活性，正如培養物中MAP-2陽性細胞的百分比的增加所證實的。還通過免疫熒光染色，通過培養的神經元中的MAP-2染色(綠色)評價了 ALC的海馬神經發生活性。細胞核被Draq5染色(圖2)。ALC的神經發生活性與神經保護活性無關。實際上，在誘導神經發生的濃度，ALC(100 μ M; 300 μ M或ImM)沒有降低凋亡細胞核的百分比(圖3)或甚至沒有降低培養基中的LDH酶的活性(壞死的一項指標)(圖4)。使用巢蛋白(主要由神經干細胞表達的一種中間絲蛋白)作為特異性標志物。實際上，當置于神經干細胞所用的培養條件中時，僅巢蛋白陽性的細胞形成球。具體地，成熟的神經元是ΜΑΡ2陽性的和巢蛋白陰性的，未成熟的神經元是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陽性的，干/祖細胞是ΜΑΡ2陰性的和巢蛋白陽性的，祖細胞是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陰性的(圖5)。ALC處理會增加成熟的神經元的數目(以濃度依賴性的方式)以及未成熟的神經元的數目；ALC對干/祖細胞的數目沒有影響，并減少了祖細胞的數目。在圖1-6中報告的實驗數據表明，ALC和PLC能夠促進成年小鼠海馬神經祖細胞的神經元分化。具體地，ALC會增加成熟的神經元和未成熟的神經元的數目；減少未分化的干/神經祖細胞的亞群的數目；并實現不是歸因于它的神經保護作用的活性。實施例2ALC、PLC和LC對取自小鼠海馬的成年神經祖細胞的神經元分化的調節的體外對t匕在實施例2中，通過使用與實施例I相同的實驗規程，已經在成年神經祖細胞的體外模型中將ALC (ImM)作為成年海馬神經發生的調節劑的活性與丙酰基-L-肉堿(PLC)(O. 3-lmM)和L-肉堿(LC) (O. 3_lmM)的活性進行了對比。如圖6所示，與ALC相比，PLC似乎是NPC神經元分化的效力更低的活化劑。實際上，PLC會增加成熟的神經元和未成熟的神經元的數目，并減少未分化的干/神經祖細胞的亞群的數目，盡管與ALC相比是在更低的程度上。相反，LC不具有 作用。此外，結果證實，ALC和PLC對NPC分化的影響不是由于對新產生的未成熟的或成熟的神經元的神經保護作用。
權利要求
1.用于增加神經組織的神經發生的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽。
2.用作用于增加神經組織的神經發生的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿；其中所述增加的神經發生可用于預防中樞神經系統障礙。
3.用作用于增加神經組織的神經發生的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿；其中所述增加的神經發生可用于預防由老化或遺傳傾向導致的中樞神經系統障礙。
4.用作用于預防中樞神經系統疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿，其中所述疾病或紊亂的原因是由老化或遺傳傾向導致的神經元損失。
5.用作用于預防中樞神經系統疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿，其中所述疾病或紊亂對增加的神經發生有響應。
6.根據前述權利要求中任一項所述的用途，其中乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿的鹽選自氯化物、溴化物、乳清酸鹽、天冬氨酸鹽、酸性天冬氨酸鹽、酸性檸檬酸鹽、檸檬酸鎂、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、富馬酸鹽和酸性富馬酸鹽、富馬酸鎂、乳酸鹽、馬來酸鹽和酸性馬來酸鹽、草酸鹽、酸性草酸鹽、撲酸鹽、酸性撲酸鹽、硫酸鹽、酸性硫酸鹽、磷酸葡萄糖、酒石酸鹽和酸性酒石酸鹽、甘油磷酸鹽、粘酸鹽、酒石酸鎂、2-氨基-乙磺酸鹽、2-氨基-乙磺酸鎂、甲磺酸鹽、酒石酸膽堿、三氯乙酸鹽或三氟乙酸鹽。
7.根據前述權利要求中任一項所述的用途，其中以O.1-4. OOg/天的劑量，優選地以1-2. OOg/天的劑量，最優選地以I. 5g/天的劑量，在單次或多次劑量中，施用乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿。
8.根據前述權利要求中任一項所述的用途，其中通過選自下述的腸內途徑或腸胃外途徑，施用乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿口服、皮下的、透皮的、腹膜內的、肌肉內的、靜脈內的、腦室內的、實質內的、鞘內的、顱內的、經頰的、粘膜的、鼻的、經肺的、直腸的途徑，或脂質體給藥。
9.根據前述權利要求中任一項所述的用途，其中根據本發明可以預防的由遺傳傾向導致的和/或與老化相關的疾病或紊亂選自神經變性障礙、帕金森病和帕金森障礙、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、多發性硬化、肌萎縮側索硬化、Shy-Drager綜合征、Lewy體病、脊椎缺血、缺血性中風、腦梗死、老年癡呆、其它認知損害和抑郁癥。
10.用于預防中樞神經系統障礙的方法，其中給有此需要的患者施用適用于增加神經發生的量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述中樞神經系統障礙是由于老化或遺傳傾向導致的。
12.用于增加神經發生的方法，其中給有此需要的患者施用適用于預防中樞神經系統障礙的量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述中樞神經系統障礙是由于老化或遺傳傾向導致的。
14.用于增加神經發生的方法，其中所述增加的神經發生可用于預防中樞神經系統障礙，其中給有此需要的患者長期施用合適量的乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述中樞神經系統障礙是由于老化或遺傳傾向導致的。
全文摘要
本文描述的發明涉及乙酰基L-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于增加神經組織的神經發生；其中所述增加的神經發生可用于預防由老化或遺傳傾向導致的中樞神經系統障礙。
文檔編號A61P25/16GK102939084SQ201180029252
公開日2013年2月20日 申請日期2011年6月10日 優先權日2010年6月16日
發明者M·戈雷里, P·L·卡諾尼克, A·科沃里奇 申請人:希格馬托制藥工業公司