免疫原粘附及其制備和使用方法

專利名稱：免疫原粘附及其制備和使用方法
技術領域：
本發明涉及禽蛋抗體形式的微生物粘附抑制劑，其通過抑制免疫原的粘附于動物粘膜的能力，用于充分預防呼吸性疾病綜合征中引起菌落形成疾病的免疫原的粘附或附著，所述動物包括宿主食用動物、高價值非食用動物、動物學動物、伴侶動物、實驗動物或人類，還涉及制備所述粘附抑制劑的方法，及所述抑制劑的用途。
背景技術：
微生物群在動物的呼吸道內形成非常復雜的相互作用。僅舉幾個例子，這些動物可以是奶牛、飼養牛、豬和禽類諸如雞和火雞。盡管所述生物體在不同的動物群之間可以變化，但它們基本上是細菌(諸如巴斯德菌屬(Pasteurellae)、曼氏桿菌屬(Mannhiemae)及嗜血菌屬(Haemophilus))、支原體屬(Mycoplasma)及呼吸道病毒組(諸如牛呼吸道合胞體 病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉(BVD)病毒、副流感(PI3)病毒、傳染性牛鼻氣管炎(IBR)病毒、豬流感(H1NpH3N2)病毒)、真菌和寄生物及它們的組合。這些生物體被視作呼吸道條件致病病原體，可存活于健康動物的上呼吸道中。巴斯德菌屬(Pasteurella)和少部分嗜血菌屬和支原體屬物種可因鼻咽感染之后入侵下呼吸道而造成牛的牛呼吸性疾病綜合征(BRDC)。在奶牛和飼養場牛群中，多種應激情況(諸如運輸、斷奶、病毒感染、惡劣天氣、天氣變化、在飼養場中遷移、營養不良和過度擁擠等)可以削弱動物的免疫系統的反應能力和物理防御及免疫防御。這使更多的微生物從鼻咽部向下呼吸道轉移，再向肺內部轉移。這導致肺呼吸性疾病綜合征，包括牛的航運熱綜合征。動物之間的傳播通常通過空中傳播的微滴或通過食物或水污染物進行。一旦微生物定居于鼻咽部，在吸氣期間，噴霧劑可導致細菌或病毒病原體向下送入下呼吸道。這使生物體附著于支氣管和肺泡細胞并繁殖，從而造成肺炎。呼吸道感染可導致無臨床癥狀的病變，但導致更低的平均日增重。動物可停止進食，迅速病得很重，并可在數小時內死亡。發病率可以非常高，并且一旦一個動物生病，那么畜群的其它動物更容易感染。這是飼養場的一個重要憂慮。類似的爆發發生在豬群和禽類群體(如雞和火雞)中。當前的活疫苗在保護動物免于該綜合征方面取得有限的成功。這可能部分地由于鼻咽部缺乏免疫保護。呼吸道病毒群可使動物虛弱，并降低宿主的免疫應答，細菌菌株(一般為溶血性曼氏桿菌(Mannhiema hemolytica)或多殺巴斯德菌(Pasteurellamultocida))會侵入下呼吸道，從而導致支氣管肺炎(BRD)，后者會造成動物生病和死亡。通過阻斷病毒感染，將會減少細菌感染。在牛的航運熱肺炎和地方性肺炎中，兩類疾病的最終共同特性是細菌因子。牛呼吸性疾病(BRD)現今是飼養場中的疾病相關損失的主要原因。歸因于BRD的財務損失包括死亡、用于治療的藥物、獸醫和勞動成本。一次治療的平均成本為平均每頭8. 80美元。治療過BRD的小母牛具有下降了 37. 9%的發病率評分。從未治療過的動物每頭純收益平均為11. 48美元以上。經治療的和未治療過的動物的平均日增重不同。經治療的動物每頭純利潤平均為57. 48美元以下。已經認為，BRD造成飼養場全部食用牛死亡的20. 6%。豬呼吸性疾病綜合征是影響高達所有豬群中的90%的主要的及類似的疾病類型。豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumonia)是原發病原體,通常與諸如A型和D型多殺巴斯德菌等復雜繼發病原體有關，并造成高熱或生長減緩的臨床征象。這些生物體的組合可導致豬肺炎的嚴重性和持續時間增加。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)可能是豬肺炎的另一個主要原因。僅微小劑量的有毒力的PRRS菌株可導致嚴重的繁殖疾病。豬呼吸性疾病的常見致病因子可包括PRRS病毒、豬流感病毒(H1N1, H3N2)和豬肺炎支原體以及副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、豬嗜血桿菌(Haemophilus suis)、胸膜肺炎嗜血桿菌(Haemophilus planopneumonia)、溶血性巴氏(曼氏)桿菌(Pasteurella(Mannhiema)haemolytica)和多殺巴斯德菌(A型和D型)。很難估計對這些動物健康的總的經濟影響。肺炎性肺損傷可能造成畜群呼吸道健康不良，并可能影響畜群中高達70%的豬。需要病毒疫苗接種與細菌藥物治療的組合，以幫助控制這些問題——接種疫苗的時機總是重要的。必須在適當的時間施用藥物，以使成本和對動物的損傷最小。
性肺炎”(SEP)的重要慢性呼吸性疾病的原因。該生物體可單獨地在豬中產生嚴重肺炎，并且仍然是養豬產業的重大威脅。胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)會造成“豬胸膜肺炎”，從而導致嚴重的經濟損失和死亡。盡管已經研制出疫苗，但仍未證明相應的保護作用。在過去的幾年中，全世界已鑒定出14種血清型和2種生物型。為了保護畜群，必須給生長豬和肥育豬都接種疫苗。呼吸性疾病對豬群的主要影響在于減少攝食量從而導致生長減緩。這會導致豬的均勻性變差、死亡率更高、平均日增重減少，并且每窩產豬減少。生產者公布稱，所有畜群布置中的約14. 4%發生呼吸性疾病。注射疫苗和藥物治療的成本增加，而總效能降低。據估計，每日增重的減少和用于治療疾病的抗生素每年造成養豬業的4. 67億美元成本。成長-肥育豬的所有死亡中的超過39%已經歸因于豬的呼吸性疾病。現有技術用于診斷或治療特定病癥的禽蛋抗體的生產是已知的。沒有提示用于抑制生物體，尤其是生物體的群集，和造成疾病的免疫原在動物呼吸道中的粘附及群集的禽蛋抗體的生產。代表性的現有技術專利包括下述的Poison,美國專利號 4，550，019Stolle 等人，美國專利號 4，748，019Tokoro,美國專利號 5，080，895Carroll,美國專利號 5，196，193Lee,美國專利號 5，367，054Coleman,美國專利號 5，585，098Stolle 等人，美國專利號 5，753，268Poison,美國專利號4，550，019涉及禽蛋黃抗體的制造和用途,所述抗體用于制備用于動物(包括人類)的被動免疫接種的免疫學試劑，所述免疫學試劑用作免疫吸附法的免疫試劑，特別是用于定量分析實驗，尤其是用于診斷研究、病理研究、法醫研究和藥代動力學研究的微量分析。
Stolle等人，美國專利號4，748，018涉及哺乳動物的被動免疫的方法，使用針對多種抗原中的任一種的禽蛋黃抗體，在多種條件下利用多種給藥方法，并采用多種合并抗體的組合物，之后首先在哺乳動物體內形成針對該抗體的耐受性。Tokoro,美國專利號5，080，895涉及含有來自蛋物質的特異性抗體、其制備方法和用于治療傳染性或其它疾病的用途，及作為家畜和家禽食物、化妝品和藥物中的添加劑的用途，和在血清診斷領域中的用途。盡管未明確說明，但顯而易見，蛋抗體在飼料中的應用，是為了提供所述抗體的口服給藥的簡易方法，所述抗體用于治療家畜或家禽的腸感染。美國專利號5，196，193和和分案美國專利號5，443，976涉及含有馬抗體或禽蛋黃抗體的抗毒液組合物，其用于中和蛇、蜘蛛、蝎子或水母毒液。Lee,美國專利號5，367，054涉及大規模純化蛋免疫球蛋白以降低泌乳反芻動物的乳汁中的體細胞數目的方法。Stolle等人，美國專利號5，753，268涉及抗膽固醇蛋疫苗及其制備方法和用作飲·食添加物的用途，所述飲食添加物用于治療人類和其它動物的血管障礙。

發明內容
概括而言，本發明涉及一種用于制備微生物粘附抑制劑的方法，所述抑制劑用于對動物給藥，諸如宿主食用動物、高價值非食用動物、動物學動物、伴侶動物或人類，以抑制或充分預防菌落形成免疫原和/或致病病毒在呼吸道中的粘附。可以如下制備微生物粘附抑制劑首先，用特定靶免疫原接種處于或將達到它們的產蛋齡的雌性禽類。然后，在足以允許禽類產生針對靶免疫原的抗體的時間段以后，收集禽類所產的蛋。從殼中分離出蛋中含有抗體內容物的蛋黃和蛋清。蛋中含有抗體的內容物可直接使用，置于增量劑上，或與載體材料混合。可將抗體摻入液體中，混合在舔食盆中，噴灑或噴射到有動物的環境中。還可以將抗體摻入鼻腔或口腔噴霧劑中，該噴霧劑可以給藥入鼻咽氣道中或口服給藥。還可以將抗體摻到條帶上，當該條帶置于嘴中時溶解以將抗體釋放進嘴中。所述蛋抗體粘附抑制物質可根據需要儲存或運輸備用。通過直接分布抗體物質或引入夾帶在空氣中的抗體物質，可將摻有對靶免疫原特異性的抗體的蛋內容物給藥動物或人類。通過鼻內施用，可將物質引入動物的鼻咽部。可制成噴霧劑混合物，并在動物的頭和鼻孔的上面作為霧給藥。另一替代方案是，將物質與載體混合，并作為飼料的“頂肥”給藥。通過將物質加入水中并讓動物或人類飲用所得溶液，可以滿足特殊需要。可將活性物質加入松散的舔食或飼料籃中來輸送。使用通常的動物飼料混合物，可以制成凝膠樣混合物，并將其倒入“舔食盆”(飼料添加劑散裝盆)中。可采用其它遞送系統將活性物質遞送到呼吸道。一方面，本發明涉及一種用于預防或減少呼吸道疾病的組合物。該組合物包括雌性禽類所產蛋中產生的粘附抑制物質，其中禽類被接種了一種以上引起呼吸道疾病的病毒或病毒抗原。粘附抑制物質被配制用于分散進呼吸道以預防或減少引起呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘I吳的粘附。另一方面，本發明涉及一種預防或減少動物的由病毒引起的呼吸道疾病的發病的方法。該方法包括分配一種組合物，該組合物包含在雌性禽類所產蛋中產生的粘附抑制物質，其中禽類被接種了一種以上引起呼吸道疾病的病毒或病毒抗原，該組合物被配制用于分散進呼吸道以預防或減少引起呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘膜的粘附。在本文中提及的“粘附抑制”是指微生物的粘附的抑制，這會預防或減少呼吸道中的菌落和/或蝕斑形成。在一些實施例中，粘附抑制劑阻止或降低諸如細菌等微生物的粘附粘膜和形成菌落的能力。在另一些實施例中，粘附抑制劑阻止或降低諸如病毒等微生物的附著和進入細胞的能力，從而阻止或減少其它病毒顆粒的形成。
具體實施例方式本發明預測一種抑制菌落形成微生物粘附到動物呼吸道的粘膜和支氣管及肺泡細胞上的能力從而預防所述微生物群集的方法，該微生物諸如溶血性巴氏(曼氏)桿菌、多殺巴斯德菌和睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、豬流感病毒、牛分枝桿菌(Mycoplasmabovis)或豬肺炎支原體(M. hypopneumoniae)。微生物無法群集會使動物在遭受應激誘發環境時仍具有免疫防御。結果是動物具有更少的肺呼吸性疾病，包括導致受感染動物的高死亡率的航運熱。 在一些實施例中，本發明可以用于抑制人類和動物中的引起呼吸性疾病的病毒，特別是流感病毒。致病病毒可以是，例如，傳染性牛鼻氣管炎(皰疹病毒科)；牛腺病毒1-7 (腺病毒科)；牛呼吸道冠狀病毒(冠狀病毒科)；牛呼吸道合胞病毒(副粘液病毒科)；牛副流感病毒3 (副粘液病毒科)。所有哺乳動物和禽類都會提供相似類型的保護作用，這為它們的非常幼小的后代提供即時的免疫應答，直到它們也獲得產生自身抗體的能力。更明確地稱為被動抗體保護，這種防御機制通過胎盤、母乳或二者傳遞給幼小的哺乳動物。但是，幼禽通過在蛋中儲存的抗體來獲得它們的被動抗體保護，幼禽在蛋中從胚胎階段發展而來。具體地，禽類在形成時具有“裝載”它們的蛋的能力，蛋中具有與母體血清中相比非常大量的濃縮抗體。另外，與哺乳動物抗體相比，禽抗體更加穩定且更能抵抗消化滅活，在不利的條件下尤其如此。一旦被免疫，雌禽在蛋黃中儲存IgY型免疫球蛋白，同時在蛋清中儲存IgM和IgA免疫球蛋白。蛋清有助于增加全蛋制品的穩定性，并有助于保護禽抗體。蛋黃中的禽IgY免疫球蛋白緊密連結、涂敷、覆蓋并清除掉將它們本身附著到其宿主上的粘附素。在蛋清中的IgM和IgA免疫球蛋白會增加呼吸道粘液組織中含有抗體的物質的連結。這可以提供含有抗體物質更長的持續效應。更大的含有抗體分子可以更有效地預防動物或人類的呼吸道中的目標免疫原的粘附。蛋清是一種保護IgY免疫球蛋白活性從而增加它們在呼吸道中的活性壽命的蛋白質。此外，雌禽保存在蛋中的大部分抗體是針對雌禽的最近抗原攻擊。所有這些導致禽蛋作為用于大量經濟地生產高特異性的且穩定的抗體的最理想來源。盡管通過用雞生產禽抗體來例證本發明，也可以使用其它禽類，包括火雞、鴨、鵝、鴕鳥、鴯鹋、雉雞、鴿子、鵪鶉等，或它們的組合。具體地，獲得幼小母雞的群組，通常為羅得島紅雞(Rhode Island Reds)、白色來亨雞(White Leghorns)、伴性雜交(sex-linked hybrid crosses)品種或其它適合大蛋尺寸、高容量蛋生產且易于操作的經過約16-19個周將達到產蛋齡的品種，根據通過所需最終產物的量和時間預先確定的計劃，從而產生穩定的連續生產流。經過2-4周的隔離和適應環境的適宜時間段，每個群組將進入接種項目，其中使用所需抗體針對的特定抗原(免疫原)的專有制劑。微生物的培養物可從商業來源得到，諸如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC),或從野生型分離物得到。該培養物可用于分離抗原。這種抗原可制備成制備好的免疫原，并可肌肉內注射，但優選皮下注射。在大約四周到五周內，所收集的普通蛋將含有大量處于易于使用且穩定形式的所需特異性抗體。在整個產蛋期間，可用靶免疫原再次接種所述雞，以維持高抗體水平。將來自預定雞群組中的成批蛋破裂，從殼中分離出內容物并混合，并優選地進行巴氏消毒以消除潛在的病原微生物。使用標準的試驗操作，諸如ELISA、凝集反應等，監測抗體活性。然后將典型批與其它普通生產水平的雞群組批次摻和，從而得到大量標準化的活性成分。該蛋抗體微生物抑制劑物質可以在諸如大豆油、大丸藥和/或片劑的載體材料上儲存和運輸。根據配制者和最終消費者的需要和規范，最終的抗體產物可包括某類無害的添加劑，諸如干燥的乳清或大豆外殼、酒糟、糖蜜、大豆或稻殼等來與飼料定量調配。還可以純化、干燥和低壓凍干該抗體以貯存以便以后使用。這種方法首次提供了一種用于控制引起呼吸道疾病的生物體的經濟、安全且有效的手段，該生物體存在于肉用牛和奶牛畜群、豬、雞、火雞、伴侶動物、高價值非食用動物、動物學動物和人類中。免疫原粘附抑制劑及其制備和產生對所列微生物物種特異性的免疫原的用途。免疫原用于免疫產蛋禽類動物。經過免疫的雌禽將產出這樣的蛋在蛋清中含有IgM和IgA型的特異性抗體，且在蛋黃中含有IgY型的特異性抗體。收集所述蛋，并將來自整個破裂蛋的物質以合適的濃度與載體混合物(諸如糖蜜、大豆油、DMS0、PBS緩沖液和維生素E溶液)混合。優化該溶液，使其可噴灑、噴射、鼻內注射、成為凝膠體或用作在飼料上的頂肥和用于舔食盆中。在喂食期間，可將保護性物質噴灑到在圍欄或飼養場中的動物上，通常早上一次和晚上一次。噴灑的次數通過測試確定。由于所述物質是無毒的，可以根據需要施用，并與給定圍欄所需要的一樣多來施用。優選方法是，通過使用每鼻孔1/2劑量的噴霧劑直接鼻內注射，或通過直接鼻噴霧與頂部加料、舔食盆、噴射涂藥器的組合。所述產物是一種全天然制劑，其含有對靶免疫原特異性的禽抗體。當附著到細胞壁外表面、粘附素受體、菌毛或基柱結構和被膜或病毒衣殼時，這些抗體將不允許生物體附著到粘膜。該微生物將不能繁殖或群集。這將阻止微生物沿呼吸道向下移動，并消除在下呼吸道中引起疾病的能力。通過噴灑該物質，噴霧將覆蓋鼻咽部，并防止細菌、病毒或其它微生物在水滴中被傳播。該噴霧也將覆蓋在所述區域中的飼料和水，進而阻斷生物體的病原體在動物之間傳播的能力。本發明的方法在不使用抗生素的情況下使飼養場和圍欄中動物疾病和死亡大幅下降。通過減少呼吸道生物體，可以減少肺損害，減少二次感染，提高日增重，提高性能，提高進食效率，并減少成本。控制動物中的肺炎將提高生長性能和生命質量，以及降低呼吸道生物體的潛在傳播。相似的實例可在伴侶動物或人類中獲得。顯而易見的，在不背離其精神和范圍下可以做出前文所闡明的本發明的許多修改和變化。僅通過實例給出所述的具體實施方案，本發明僅由所附權利要求項限制。 最成功的群集微生物、細菌、病毒和寄生物等都已經在其表面上逐步形成出許多不同類型的稱為“粘附素(adherin或intimin) ”的分子，所述表面可非常緊密地粘附到一種以上類型的特異性分子，該分子是宿主各種表面的一部分。粘附抑制劑是具有極高特異性活性的禽抗體，其可非常緊密地結合、涂敷、覆蓋和清除這些粘附素，這些粘附素以鎖和鑰匙類型的與非常獨特的化學結構的配合將自身附著到它們的宿主上。蛋黃中的禽IgY免疫球蛋白會緊密地結合、涂敷、覆蓋和消除將其自身附著到宿主上的粘附素。蛋清的IgM和IgA免疫球蛋白會增加在含有抗體的物質的呼吸道粘液組織中的結合，這會提供含有抗體物質更長的持續效應。更大的含有抗體的分子可更有效地預防動物或人類的呼吸道中的靶免疫原的粘附。蛋清是一種保護IgY免疫球蛋白活性從而增加它們在呼吸道中的活性壽命的蛋白質。除了該直接攻擊以外，在大部分生物流體(諸如血液、淋巴液、唾液、眼淚和某種程度上的腸分泌物)中所包含的補體系統的組分會將抗體附著識別為它們的許多類型的防御活動的觸發劑。因此，與許多其它細胞防御系統的極有可能的動員相組合的特異性抗體附著和包被，會快速達到化學滅活，并最終破壞靶微生物。在一些實施例中，免疫原粘附抑制劑可以針對流感病毒和可能在動物和/或人類中弓I起呼吸性疾病的其它微生物的抗原。所述病毒可以是，例如，正粘病毒科，特別是流感病毒、H1NpH5NpH3N2或其組合,或通常通過H數目和N數目鑒別的其它類型的血凝素⑶和神經氨酸酶(N)組合，和它們的突變株；皰疹病毒科，特別是傳染性牛鼻氣管炎病毒I和5 ;副粘液病毒科，特別是BRSV和PI3 ;動脈病毒科，特別是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSv)，和腺病毒科，特別是牛腺病毒1、3、5、6、7。免疫原粘附抑制劑可以包括蛋衍生的抗體以及藥學上適當的載體和粘膜生物粘附劑。免疫原粘附抑制劑可以作為鼻腔噴霧劑每天遞送幾次(取決于預期的暴露)，以·提供更長期或更強烈的保護。例如，在流感季節中，可以由預期會暴露于病毒的個體攜帶含有免疫原粘附抑制劑的涂藥器。例如，在飛機(特別是長途飛機航班)上飛行的個體可以攜帶鼻腔噴霧劑，并在飛行期間多次給藥噴霧劑，以減少感染一種以上病毒的機會。在預期的暴露之前，通過簡單的鼻腔噴霧的方法，個體可以容易地施用特異性的抗體(即免疫原粘附抑制劑)到他們的上氣道。這些抗體將充當粘膜保護劑，以防止人類或動物宿主中靶病毒或其它微生物的粘附、群集和復制。鼻腔噴霧劑可以以多種微滴大小遞送含有免疫原粘附抑制劑的藥物組合物。在鼻腔噴霧劑中的特定藥物組合物的微滴大小可以取決于呼吸道中靶微生物預期群集的位置。例如，與更典型的季節性H3N2流感病毒相比，流感病毒H5N1通常群集在呼吸道的更深處。因而，在優選的實施例中，可以以更小的微滴大小來遞送針對H5N1的免疫原粘附抑制劑，以確保遞送在呼吸道更深處的保護。用于遞送免疫原粘附抑制劑的替代方法也可以包括口腔清洗劑或漱口劑。設計成在嘴中溶解以釋放抗體的用免疫原粘附抑制劑浸潰的條帶，可以用于用含有所述免疫原粘附抑制劑的組合物包被上氣道。可以每年或在流感季節以前的其它定期時間范圍內制備針對流感病毒的免疫原粘附抑制劑。給藥的免疫原粘附抑制劑可以基于循環中的病毒株。隨著循環株發生變化或新的流行性病毒的威脅出現，可以通過簡單地用最新的目標株免疫新雞更新產品。禽類可能在免疫接種后少至2周就開始將對最新株特異性的抗體保存在它們的蛋中。相比而言，現有技術方法需要遠遠更長的時間范圍來生產、測試和得到對新疫苗的管理批準。以下實施例進一步例證本發明實施例I :產蛋雌禽的選擇產蛋雌禽的品種可以隨需要和用途而變化。任何產蛋雌禽都可被免疫，包括雞、火雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、鴕鳥、鴯鹋或任何其它禽類。普通品種的產蛋雞是優選的，而且通常根據每年產蛋的數目、蛋的大小和舍飼容易性進行選擇。羅得島紅雞、白色來亨雞和紅伴性混種(Red Sex Linked hybrids)是基于蛋大小(大到超大，50_65克)選擇的動物,并且用于免疫接種計劃。觀察處理所述動物的容易度及蛋的大小和一致性，以及每只雞每年的產蛋數目。盡管可使用任何禽類產蛋雌禽，由于成本和易于使用，這些雞被證明具有最好的表現。白色來亨雞、W98混種具有最好的一致性，且每只動物產生更大數目的蛋。這些動物產生大到超大級的蛋(50-65克)，且每只母雞年產蛋高達300個。實施例2 :用于免疫原的PM抗原的制備將多殺巴斯德菌(ATCC 15743)用作模型細菌。從牛分離該生物體。用于再水化儲備物的ATCC方法如下。在I. OmL TSB中再水化細菌。使用腦心浸液(BHI，Acumedia)刺激細菌上的PM抗原。將儲備物TSB接種進BHI肉湯中，并在37°C孵育18-24小時。這會刺激細菌上的體漿和附著抗原形成。用BHI肉湯培養物接種含有BHI肉湯的燒瓶。在緩慢攪拌的同時，在37°C孵育燒瓶。將血液瓊脂平板劃線以分離菌落確認形態。在22小時之 后看到良好的生長。合并燒瓶，并使用無菌鹽水(0.9%)在大約3000rpm離心30分鐘收集所得物質。將收獲物收集在試管中。使用分光光度計計數和McFarland比濁計標準品檢查 密度。將物質稀釋至大約lX109/mL。加入與O. 9%無菌鹽水中的培養液成1:1比例的百分之四(4%)脫氧膽酸鈉(Difco)溶液(Herzberg, 1972)，并在室溫(22。。到24°C )攪拌大約18小時。將物質離心以除去完整細胞。上清液用作PM抗原的儲備物。測定干重為大約14. 9mg/mL。將產物在無菌PBS (pH 7. 4)中稀釋至lmg/mL，用于PM免疫原。實施例3 :用于免疫原的PH抗原的制備將溶血性巴氏桿菌儲備物(ATCC 14000)用于PH抗原。從牛分離所述生物體。遵循用于再水化儲備物的ATCC方法。在I. OmL的TSB中再水化細菌。將腦心浸液(BHI，Acumedia)用于刺激細菌上的PM抗原。將儲備物TSB接種進BHI肉湯中，并在37°C孵育18-24小時。這會刺激細菌上的體漿和附著抗原形成。用BHI肉湯培養物接種含有BHI肉湯的燒瓶。在緩慢攪拌的同時，在37°C孵育燒瓶。在22小時之后看到良好的生長。將血液瓊脂平板劃線以分離菌落確認形態。合并燒瓶，并使用無菌鹽水(0.9%)在大約3000rpm離心30分鐘收集所得物質。將收獲物收集在試管中。使用分光光度計計數和McFarland比濁計標準品檢查密度。將物質稀釋至大約lX109/mL。加入與O. 9%無菌鹽水中的培養液成1:1比例的百分之四(4%)脫氧膽酸鈉(Difco)溶液(Herzberg，1972)，并在室溫(22°C到24°C )攪拌大約18小時。將物質離心以除去完整細胞。上清液用作PH抗原的儲備物。測定干重。將產物在無菌PBS(pH 7.4)中稀釋至lmg/mL，用于PH免疫原。實施例4 :用于免疫原的HS抗原的制備將睡眠嗜血桿菌儲備物(ATCC 43626)用作HS抗原的細菌培養物儲備物。從牛分離所述生物體。遵循用于再水化儲備物的ATCC方法。在I. OmL TSB中再水化細菌。ATCC培養基814GC培養基用于刺激細菌上的HS抗原。將儲備物TSB接種進814GC培養基中，并在37°C和5%C02孵育18-24小時。這會刺激細菌上的體漿和附著抗原形成。在22-48小時之后看到良好的生長。將血液瓊脂平板劃線以分離菌落確認形態。合并燒瓶，并使用無菌鹽水(O. 9%)在大約3000rpm離心30分鐘收集所得物質。將收獲物收集在試管中。使用分光光度計計數和McFarland比濁計標準品檢查密度。將物質稀釋至大約lX109/mL。加入與O. 9%無菌鹽水中的培養液成1:1比例的百分之四(4%)脫氧膽酸鈉(Difco)溶液(Herzberg, 1972)，并在室溫(22°C到24°C )攪拌大約18小時。將物質離心以除去完整細胞。上清液用作HS抗原的儲備物。測定干重。將產物在無菌PBS(pH 7.4)中稀釋至lmg/mL，用于HS免疫原。實施例5 :用于免疫原的HSa抗原的制備將豬嗜血桿菌儲備物(ATCC 19417，H. parasuis)用作HSa抗原的儲備物。從豬分離所述生物體。遵循用于再水化儲備物的ATCC方法。在I. OmL TSB中再水化細菌。ATCC培養基5129 :嗜血桿菌實驗培養基用于刺激細菌上的HSa抗原。將儲備物TSB接種進#5129肉湯中，并在37°C孵育24-48小時。這會刺激細菌上的體漿和附著抗原形成。用肉湯培養物儲備物接種含有#5129肉湯的燒瓶或含有#814培養基的平板。在37°C和5%C02孵育燒瓶。在48小時之后看到良好的生長。將血液瓊脂平板劃線以分離菌落確認形態。合并燒瓶，并使用無菌鹽水(O. 9%)在大約3000rpm離心30分鐘收集所得物質。將收獲物收集在試管中。使用分光光度計計數和McFarland比濁計標準品檢查密度。將物質稀釋至大約lX109/mL。加入與O. 9%無菌鹽水中的培養液成1:1比例的百分之四(4%)脫氧膽酸鈉 (Difco)溶液(Herzberg, 1972)，并在室溫(22。。到24°C )攪拌大約18小時。將物質離心以除去完整細胞。上清液用作HSa抗原的儲備物。測定干重。將產物在無菌PBS(pH 7.4)中稀釋至lmg/mL,用于HSa免疫原。實施例6 :使用PH、PM、HS和HSa抗原制備ELISA平板，用于監測蛋雞和飼料中的抗體PH、PM、HS和HSa ELISA :使用100 μ L/mL的在碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6)中的不同濃度的抗原(10 μ g-200 μ g/ml)包被96孔試驗板(平底Costar)。將板在22°C到37°C之間孵育最多18小時。抽吸孔以防止交叉污染。用390 μ L/孔的O. 5%BSA封閉板，并在37°C孵育I小時。使用替代性的陽性或陰性行包被板以供對照。將板用含有吐溫20的洗滌緩沖液沖洗一次。向一式兩份孔中添加每孔100微升的稀釋樣品，并在37°C孵育I小時。添加山羊抗-雞IgG與辣根過氧化物酶的綴合物(Kirkegard and Perry Laboratories ；1:1000到1:3000)。孵育I小時之后，根據生產商的說明書加入底物(TMB，KPL)，并在10分鐘之后用O. IM磷酸終止反應。用Dynatech ELISA讀數器在450nm測定孔的光密度，并記錄信息以供進一步數據分析。實施例7 :隨時間分析個別蛋和血清在免疫接種期間的不同時期選擇蛋用于監測對特定抗原的抗體應答。在第O天監測所選擇的雞，并在第4個月之后，每月繼續監測。從蛋殼中收集完整的蛋，然后取出ImL樣品。然后用緩沖液萃取該樣品以分析抗體內容物。使用PH、PM、HS和HSa免疫原的標準ELISA進行分析。從OD讀數中減去負讀數。實施例8 :用PH免疫原免疫接種雞給所選擇的大約19周齡產蛋母白色來亨雞注射PH免疫原儲備物。一周分四次注射(500 ygUOOy g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清樣品。如果需要加強劑量，則在每個加強劑量中施用IOOyg(每6個月)。在四周內，所有母雞所產蛋中都產生優良的抗體。ELISA PH讀數均值為I. 000D(對于1:300稀釋度)和O. 2650D(對于1:1，200稀釋度)。實施例9 :用PM免疫原免疫接種雞
給所選擇的大約19周齡產蛋母白色來亨雞注射PM免疫原儲備物。一周分四次注射(500 μ g、100 μ g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清樣品。如果需要加強劑量，則在每個加強劑量中施用IOOyg(每6個月)。在四周內，所有母雞所產蛋中都產生優良的抗體。ELISA PM讀數均值為I. 420D (對于1:300稀釋度)和O. 680D (對于1:1，200稀釋度)。實施例10 :用HS免疫原免疫接種雞給所選擇的大約19周齡產蛋母白色來亨雞注射HS免疫原儲備物。一周分四次注射(500 ygUOOy g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清樣品。如果需要加強劑量，則在每個加強劑量中施用IOOyg(每6個月)。在四周內，所有母雞所產蛋中都產生優良的抗體。ELISA HS讀數均值為O. 950D (對于1:300稀釋度)和O. 2500D (對于1:1，200稀釋度)。實施例11 :用HSa免疫原免疫接種雞給所選擇的大約19周齡產蛋母白色來亨雞注射HSa免疫原儲備物。一周分四次注·射(500 μ g、100 μ g、200 μ g和250 μ g)。在最后一次初始注射以后2周收集血清樣品。如果需要加強劑量，則在每個加強劑量中施用IOOyg(每6個月)。在四周內，所有母雞所產蛋中都產生優良的抗體。ELISA HSa讀數均值為I. 400D (對于1:300稀釋度)和O. 5760D (對于1:1，200稀釋度)。實施例12 :儲備物生產全蛋試劑的制備從所有四個免疫原群組中組合所選擇的母雞，用于生產全蛋試劑的批量生產。Sterling(美國專利號5，753，228)就蛋的選擇和其貯存的用途進行了精彩評述。將所述蛋隨機化，并除去殼。將全蛋混合均勻，并使用標準條件(60°C (140° F)，3. 5分鐘)進行巴氏消毒(Charley, H.和 C. Weaver,第 3版，Foods: a scientific approach, Merril-PrenticeHall,第350頁，1998年)。巴氏消毒后，測試樣品的活性并在4°C下儲存直到干燥，或噴灑到載體上。分析250 μ L樣品。ELISA的結果實施例如下經過巴氏消毒的全蛋ΡΜ、PH、HS、HSa混合物
免疫原稀釋度O.D.
"PM5000.532
PM25000.113
PH5000.466PH25000.115
HS5000.338
HS25000.128
HSa5000.588
HSa25000.155實施例13 :分析飼料添加劑的抗體活性從三批收集所述物質的樣品。使用ELISA系統分析樣品的PH、PM、HS和HSa免疫原以監測巴氏消毒和儲存后的活性。全蛋批次加工之后記錄良好的抗體應答。來自實施例20生產方法的三批的數據見下表

權利要求
1.一種用于預防或減少呼吸道疾病的組合物，所述組合物包括在雌性禽類所產的蛋中生產的粘附抑制物質，其中所述禽類被接種了一種以上造成所述呼吸道疾病的病毒或病毒抗原，所述粘附抑制物質被配制用于分散進呼吸道中從而預防或/和減少造成所述呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘膜的粘附。
2.根據權利要求I所述的組合物，其中在從蛋殼分離以后，所述蛋的內容物包含所述粘附抑制物質，所述蛋內容物被配制在所述組合物中。
3.根據權利要求I所述的組合物，其中所述粘附抑制物質是抗體。
根據權利要求I所述的組合物，其中所述組合物被配制用于鼻腔噴霧劑。
4.根據權利要求I所述的組合物，其中所述組合物被配制用于口腔噴霧劑。
5.根據權利要求I所述的組合物，其中所述組合物另外包含粘膜生物粘附劑。
6.根據權利要求I所述的組合物，其中所述組合物另外包含藥用載體。
7.根據權利要求I所述的組合物，其中所述組合物被配制用于分散進呼吸道的鼻咽部中。
8.根據權利要求I所述的組合物，其中所述組合物被配制用于安置在口腔條帶上，其中當所述口腔條帶被置于動物嘴中時，會釋放所述粘附抑制物質。
9.一種口腔噴霧劑，其包含根據權利要求I所述的組合物。
10.一種鼻腔噴霧劑，其包含根據權利要求I所述的組合物。
11.一種口腔條帶，其包含根據權利要求I所述的組合物。
12.—種口腔清洗劑，其包含根據權利要求I所述的組合物。
13.根據權利要求I所述的組合物，其中所述呼吸道疾病包括流感或其它病毒誘發的呼吸性疾病。
14.根據權利要求I所述的組合物，其中所述病毒或病毒抗原包括H1NpH5N1, H3N2、傳染性牛鼻氣管炎病毒I和5、BRSV和PI3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSv)、牛腺病毒1、3、5、6、7和它們的組合。
15.根據權利要求I所述的組合物，其中所述呼吸道疾病是在人類中。
16.根據權利要求I所述的組合物，其中所述呼吸道疾病是在食用動物中。
17.一種預防或減少由動物中病毒造成的呼吸道疾病的發病率的方法，所述方法包括 分散組合物，所述組合物包含在雌性禽類所產的蛋中生產的粘附抑制物質，其中所述禽類被接種了一種以上造成所述呼吸道疾病的病毒或病毒抗原，所述組合物被配制用于分散進呼吸道中，以預防或減少造成所述呼吸道疾病的病毒向呼吸道粘膜的粘附。
18.根據權利要求18所述的方法，其中所述組合物被配制為鼻腔噴霧劑，且所述分散包括將鼻腔噴霧劑的內容物噴灑進呼吸道中。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述組合物被配制為口噴霧劑，且所述分散包括將口噴霧劑的內容物噴灑進動物的嘴中。
20.根據權利要求18所述的方法，其中所述組合物被安置在口腔條帶上，且所述分散包括將所述口腔條帶放入動物的嘴中。
21.根據權利要求18所述的方法，其中口腔清洗劑包括所述組合物，且所述分散是通過用口腔清洗劑漱口。
22.根據權利要求18所述的方法，其中所述分散包括包被呼吸道的鼻咽部。
23.根據權利要求18所述的方法，其中所述呼吸道疾病包括流感或其它病毒誘發的呼吸性疾病。
24.根據權利要求18所述的方法，其中所述病毒或病毒抗原包括E1NpH5NpH3N2、傳染性牛鼻氣管炎病毒I和5、BRSV和PI3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSv)、牛腺病毒1、3、5、6、7和它們的組合。
25.根據權利要求18所述的方法，其中所述呼吸道疾病是在人類中。
26.根據權利要求18所述的方法，其中所述呼吸道疾病是在食用動物中。
全文摘要
本發明公開了禽蛋抗體形式的微生物粘附抑制劑、以及制備它的方法和使用它的方法。所述抑制劑通過充分預防菌落形成免疫原在宿主動物和人類的呼吸道中的附著或粘附而起作用。如下制備所述抑制劑用免疫原接種雌性禽類，收獲含有針對所述免疫原的抗體的蛋，并從所述蛋的殼中分離出蛋黃和蛋清。通過直接分配所述內容物，或引入夾帶在空氣中的所述內容物，將所述蛋黃和蛋清內容物施用給動物或人類。可以將所述粘附抑制物質配制成以多種方式使用，諸如口噴霧劑或鼻噴霧劑。這些制劑可以有效地預防或減少動物和人類的呼吸道疾病。
文檔編號A61K9/12GK102933232SQ201180023053
公開日2013年2月13日 申請日期2011年5月9日 優先權日2010年5月7日
發明者布拉德利·M·米特內斯, 康妮·菲利浦斯 申請人:卡馬斯股份有限公司