自體真皮成纖維細胞的劑量單位調(diào)配物的制作方法

專利名稱：自體真皮成纖維細胞的劑量單位調(diào)配物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明關于經(jīng)過分離和制備的自體真皮成纖維細胞的劑量單位調(diào)配物，其用于在一個部位注射以供修復和/或長期改善人類個體的皮膚和軟組織缺陷。
背景技術：
如美國專利第5，591，444 號、第 5，660，850 號、第 5，665，372 號以及第 5，858，390號中所述，個體皮膚中的美容和審美缺陷可以通過將自體真皮成纖維細胞的懸浮液注射到 較鄰近于缺陷的真皮和皮下組織中來矯正?？梢酝ㄟ^此方法矯正的典型缺陷包括皺皮、萎縮紋、凹陷性瘢痕、非外傷來源的皮膚凹陷、由尋常痤瘡引起的瘢痕以及唇部發(fā)育不全。所述細胞與個體組織相容，優(yōu)選地通過培養(yǎng)從個體獲取的活檢標本而得到，并且已通過在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中繼代培養(yǎng)而擴增。將材料(“注射物(injectate)”)注射到體內(nèi)并且尤其注射到面部以產(chǎn)生美學效果從接近十九世紀開始。舉例來說，注射石蠟來矯正面部輪廓缺陷在第I次世界大戰(zhàn)之前多年中享有一段短暫的接受期。然而，并發(fā)癥和長期結果不能令人滿意的性質(zhì)導致放棄了實施?？勺⑸涔柰目捎眯允沟眠@些事件在I960年代早期開始實質(zhì)上重現(xiàn)。專門制造的“醫(yī)用級”硅酮溶液，例如道康寧(Dow Corning) MDX 4. 4011，已在美國的許多經(jīng)過批準的測試中心在實驗的基礎上加以使用。并發(fā)癥，如對硅酮的局部和全身反應、注射物遷移以及局部組織崩塌，限制了硅酮注射液的使用。通過注射非生物性材料而獲得的不良結果促使嘗試使用外來蛋白質(zhì)(尤其牛膠原蛋白)作為注射物。雖然未經(jīng)過加工的牛膠原蛋白對于注射到人體內(nèi)來說具有過度免疫原性，但是通過酶促降解而去除牛膠原蛋白的C端和N端肽會得到一種材料(“去端肽膠原蛋白(atelocollagen)”)，如果患者經(jīng)過預篩選以排除那些具有免疫反應性的患者，那么所述材料可按有限量使用。雖然被廣泛使用，但是所述材料與約90%的個體中產(chǎn)生抗?？贵w以及約1-3%的個體中的明顯免疫并發(fā)癥相關聯(lián)。德魯斯特F. (DeLustro, F.)等人，1987，整形與改造外科學(Plastic and Reconstructive Surgery)79:581。呈溶液形式的去端肽膠原蛋白經(jīng)證實不能完全令人滿意，這是因為所述材料在相對較短時間內(nèi)被個體從注射部位吸收而不被主體材料替換。通過戊二醛交聯(lián)、隨后通過細篩過濾并剪切來延長在體內(nèi)的滯留。然而，增加以及不規(guī)律的粘度使得所述材料難以使用。完全來源于個體自身組織樣品的注射用的人類膠原蛋白是可用的，但是沒有證據(jù)表明人類膠原蛋白注射液比牛膠原蛋白注射液更持久。這些問題通過開發(fā)自體成纖維細胞制劑來解決。然而，有了問題的解決方案并不代表有了已通過反復試驗驗證并通過臨床試驗確認，并且已遵照美國食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration)的要求制造并包裝,按規(guī)定劑量穩(wěn)定存儲的產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的一個目標在于提供自體真皮成纖維細胞的規(guī)定劑量單位調(diào)配物，用于注射到患者體內(nèi)以供修復和長期改善皮膚缺陷。本發(fā)明的另一個目標在于提供含有干細胞、前驅細胞或部分分化的細胞的劑量單位調(diào)配物，其可用于修復和長期改善皮膚缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
劑量單位由自體細胞療法產(chǎn)品組成，所述產(chǎn)品由針對待治療的每個個體所生長的成纖維細胞構成。使用現(xiàn)行良好制造規(guī)范(CGMP)和標準組織培養(yǎng)程序從每個個體自身皮膚的活檢體生長的自體成纖維細胞的懸浮液在含有具有至少98%成纖維細胞純度以及至少85%成活力的低溫保存的成纖維細胞或其前驅體的小瓶中供應，用于以I. 0-2. OX IO7個細胞/毫升的濃度分三次，約間隔五周投予I到6mL、優(yōu)選2mL的細胞，每線性厘米長度注射O. 05到O. 5mL。通過在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培育經(jīng)過擴增的成纖維細胞一段時間，使得經(jīng)過繼代培養(yǎng)的真皮成纖維細胞實質(zhì)上不含培養(yǎng)基中所存在的免疫原性蛋白質(zhì)。當注射到鼻唇溝皺紋(鼻側上延伸到嘴角的皺褶)中時，認為自體成纖維細胞會增加細胞外基質(zhì)組分(包括膠原蛋白)的合成，從而減輕這些皺紋的嚴重程度。已證實投藥劑量和時機對達成臨床上顯著的成果至關重要。雖然在美國(US)有若干種經(jīng)過批準的療法用于治療鼻唇溝皺紋，如Restylane'JuWderm 以及RadieSSes\但是成纖維細胞懸浮液并不屬于與這些產(chǎn)品相同的藥理學類 另O。這些產(chǎn)品是注射到面部組織中以通過暫時為面部組織增加體積來平復皺紋和溝的結構填充劑。成纖維細胞劑量調(diào)配物通過一種極為不同的提議作用機理而起作用。本文所述的劑量調(diào)配物單位適用于治療皺皮、鼻唇和唇頰溝、口周紋、外眼角紋、眶周紋以及眉間紋。成纖維細胞劑量調(diào)配物還適用于提供用于組織修復和再生的多能細胞。


圖I為標準化制造工藝流程圖。圖2為來自伯恩(Byrne) 2008人類分子遺傳學(Hum. Mol. Gen. ) 17:R37_R41的示意圖，其展示使用外遺傳重編程可使源自皮膚的成纖維細胞去分化成多能干細胞的方式，所述多能干細胞接著可分化成神經(jīng)細胞、心肌細胞、β胰島細胞以及造血細胞。圖3為可使成纖維細胞去分化成多能細胞的方法的示意圖細胞融合(科文(Cowan)等人，2005)、直接重編程(高橋(Takahashi)等人，2007)以及體細胞核轉移(伯恩(Byrne)等人,2007)。圖4為用于醫(yī)師客觀評估的痤瘡瘢痕嚴重程度的活動期分級，即“評估者活動期痤瘡癒痕評估量表(Evaluator Live Acne Scar AssessmentScale)”中的圖解,所述量表采用在直接和切線照明下相對瘢痕外觀的比較性評估。
具體實施例方式已開發(fā)出一種自體成纖維細胞產(chǎn)品。所述細胞療法產(chǎn)品是由使用標準組織培養(yǎng)程序從每個個體自身皮膚的活檢體生長的自體成纖維細胞的懸浮液構成。從患者耳后區(qū)域提取皮膚組織(真皮和表皮層)的活檢體并且經(jīng)由次日送達在2-8°C下運送到制造設施。將經(jīng)由酶消化從組織分離的成纖維細胞擴增到足以注射到患者的目標治療區(qū)域中的量。細胞療法產(chǎn)品由經(jīng)過擴增的成纖維細胞組成，這些成纖維細胞被調(diào)配成目標細胞療法產(chǎn)品的細胞濃度且在冷凍小瓶中低溫保存，稱為冷凍小瓶裝散裝原料藥。最終細胞療法產(chǎn)品由解凍的散裝細胞療法產(chǎn)品-經(jīng)過解凍、洗滌并且準備用于患者注射的冷凍小瓶細胞組成。
最初銷售批準是用于治療中度到重度鼻唇溝皺紋。當前臨床開發(fā)集中于治療真皮輪廓畸形、聲帶瘢痕、牙齦退縮、限制性燒傷瘢痕以及痤瘡瘢痕。如下文所論述，視待治療的病狀而定，劑量和投藥方案有所不同。雖然確切機理未知，但是認為構成成纖維細胞劑量調(diào)配物的活性組分的自體成纖維細胞當注射到患者皮膚中時會增加細胞外基質(zhì)組分(如膠原蛋白)的合成，由此增強皮膚完整性并且最終使得細紋和皺紋減少。本文中使用以下定義ATM分析測試法AZFICEL-T自體培養(yǎng)的成纖維細胞的USAN名稱散裝收集物(BULK HARVEST)在最終收集之后、在低溫保存培養(yǎng)基中調(diào)配之前的材料CGMP現(xiàn)行良好制造規(guī)范 CS細胞堆疊DMEM 達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modification ofEagle’ sMedium)DMSO 二甲亞砜注射用藥品(DRUG PR0DUCT-INJECTI0N)經(jīng)過洗滌并于DMEM中重新調(diào)配、裝入小瓶并且準備運送到臨床場所的材料冷凍小瓶裝原料藥(DRUG SUBSTANCE-CRYOVIAL)在低溫保存培養(yǎng)基中調(diào)配并且等分裝入冷凍小瓶中的材料EDTA乙二胺四乙酸FACS 突光激活細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting)FBS胎牛血清GA 慶大霉素(Gentamicin)和兩性霉素 B (Amphotericin B)IMDM 伊斯科夫改良達爾伯克培養(yǎng)基(Iscove’s ModifiedDulbecco's Medium)IND新藥研究申請PBS磷酸鹽緩沖鹽水PCA個人細胞分析QC質(zhì)量控制USP 美國藥典(United States Pharmacopeia)I.劑量單位調(diào)配物A細胞來源I.自體真皮成纖維細胞調(diào)配物中的細胞當以培養(yǎng)的單層形式生長時展示典型的成纖維細胞形態(tài)。具體來說，細胞可展示具有細長延伸的狹長的梭狀或紡錘狀外觀，或細胞可表現(xiàn)為可具有細胞質(zhì)前導邊緣的較大的扁平狀星形細胞。還可以觀察到這些形態(tài)的混合物。所述細胞表達正常成纖維細胞的特征性蛋白質(zhì)，包括成纖維細胞特異性標志物CD90 (Thy-l)、35kDa細胞表面糖蛋白以及細胞外基質(zhì)蛋白(膠原蛋白)。成纖維細胞劑量調(diào)配物是由使用標準組織培養(yǎng)程序從每個個體自身皮膚的活檢體生長的自體成纖維細胞的懸浮液構成的自體細胞療法產(chǎn)品。從患者耳后區(qū)域提取皮膚組織(真皮和表皮層)的活檢體。
2.前驅細胞成纖維細胞還可以用于產(chǎn)生供組織修復或再生用的其他細胞類型。通過體細胞核轉移(SCNT)衍生遺傳上與患者相同的胚胎干(ES)細胞保持了治愈或減輕許多退化性疾病的癥狀的潛力，同時避免了關于被宿主免疫系統(tǒng)排斥的問題。伯恩(Byrne)等人，自然(Nature) 2007年11月22日；450(7169) :497-502使用經(jīng)過修改的SCNT方法從成人皮膚成纖維細胞產(chǎn)生恒河猴(rhesus macaque)胚泡，并且從這些胚胎中成功分離出兩個ES細胞系。DNA分析確認了細胞核DNA與供體體細胞相同并且線粒體DNA來源于卵母細胞。兩個細胞系都展現(xiàn)正常的ES細胞形態(tài)，表達關鍵的干細胞標志物，在轉錄方面類似于對照ES細胞且在試管內(nèi)和活體內(nèi)分化成多種細胞類型。還參看斯丕曼(Sparman)等人，干細胞(Stem Cells)2009;27(6) : 1255-64。圖 2 為來自伯恩(Byrne)2008 人類分子遺傳學(Hum.Mol. Gen. ) 17:R37-R41的示意圖，其展示使用外遺傳重編程可使源自皮膚的成纖維細胞去分化成多能干細胞的方式，所述多能干細胞接著可分化成神經(jīng)細胞、心肌細胞、β胰島細胞以及造血細胞。參看霍切林格(Hochedlinger)等人，發(fā)育(Development. ) 2009年2月;136 (4) : 509-23以及卡納瓦蒂(Kanawaty)等人，生物學論文集(Bioessays· ) 2009年
2月;31(2):134-8。圖3為可使成纖維細胞去分化成多能細胞的方法的示意圖細胞融合(科文(Cowan)等人，科學(Science. ) 2005 年 8 月 26; 309 (5739) : 1369-73)、直接重編程(高橋(Takahashi)等人，細胞(Cell. )200730; 131 (5) : 861-72)以及體細胞核轉移(伯恩(Byrne)等人，2007)。高橋(Takahashi)等人展示了從具有以下相同的四個因子的成人真皮成纖維細胞中產(chǎn)生iPS細胞0ct3/4、Sox2、Klf4以及c_Myc。人類iPS細胞在形態(tài)、增殖、表面抗原、基因表達、多能細胞特異性基因的外遺傳狀態(tài)以及端粒酶活性方面類似于人類胚胎干(ES)細胞。此外，這些細胞可在試管內(nèi)以及在畸胎瘤內(nèi)分化成具有三個胚層的細胞類型。這些發(fā)現(xiàn)展示了 iPS細胞可從成人成纖維細胞產(chǎn)生。B.制備細胞原料藥中的自體成纖維細胞是通過從接受者自身皮膚的活檢體中長出，隨后使用標準細胞培養(yǎng)技術在培養(yǎng)基中擴增而得到。從個體耳后區(qū)域提取皮膚組織(真皮和表皮層)的活檢體。初始材料由使用標準無菌規(guī)范收集的三個3mm打孔皮膚活檢體構成。所述活檢體是由治療醫(yī)師收集，放置到含有無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的小瓶中。活檢體在2-8°C下冷藏的運送器材中運送回制造設施。在抵達制造設施之后，檢查活檢體并且在驗收后直接轉移到制造區(qū)域。在工藝開始之后，接著洗滌活檢體組織，隨后進行酶消化。洗滌之后，在未切碎的情況下加入釋放酶消化酶溶液(Liberase DigestiveEnzyme Solution),并且在37. 0±2°C下培育活檢體組織一小時。活檢體組織消化的時間是一個關鍵的工藝參數(shù)，它會影響培養(yǎng)中的細胞的成活力和生長速率。釋放酶是一種膠原蛋白酶/中性蛋白酶混合物，它是從龍沙沃克斯維爾公司(Lonza ffalkersville, Inc.)(沃克斯維爾(Walkersville),馬里蘭州(MD))以調(diào)配形式獲得，以及從羅氏診斷公司(Roche Diagnostics Corp.)(印第安納波利斯(Indianapolis),印第安納州(IN))以未調(diào)配形式獲得。或者，可使用其他可商購的膠原蛋白酶，如賽瓦膠原蛋白酶 NB6 (Serva Collagenase NB6)(海德堡(Helidelburg),德國(Germany))。消化之后，加入起始生長培養(yǎng)基(MDM，GA，10%胎牛血清(FBS))來中和所述酶，通過離心使細胞集結并且再懸浮于5. OmL起始生長培養(yǎng)基中。或者，不進行離心，僅僅通過加入起始生長培養(yǎng)基就使酶完全滅活。加入起始生長培養(yǎng)基，隨后將細胞懸浮液接種到T-175細胞培養(yǎng)燒瓶中以起始細胞生長并擴增?？墒褂肨-75、T-150、T-185或T-225燒瓶代替T-75燒瓶。在37±2. (TC以及5. 0±1. 0%C02下培育細胞并且每三到五天供給新鮮的完全生長培養(yǎng)基。工藝中的所有供料都是通過去除一半的完全生長培養(yǎng)基并且用新鮮培養(yǎng)基替換相同體積來進行的?；蛘撸蛇M行完全供料。細胞在繼代培養(yǎng)之前在T-175燒瓶中所保持的時間不應超過30天。在整個工藝中監(jiān)控匯合以確保在培養(yǎng)分裂(culture splitting)期間有足夠的接種密度。當在T-175燒瓶中細胞匯合度大于或等于40%時，通過去除耗盡的培養(yǎng)基，洗滌細胞并且用胰蛋白酶-EDTA處理以將燒瓶中的粘附細胞釋放到溶液中來對細胞進行繼代培養(yǎng)。接著對細胞進行胰蛋白酶處理并且接種到T-500燒瓶中以進行連續(xù)的細胞擴增?；蛘?，可使用一個或兩個T-300燒瓶、一層細胞堆疊(1CS)、一層細胞工廠(ICF)或兩層細胞堆疊(2CS)代替T-500燒瓶。在每個繼代中并在收集之前評估形態(tài)以監(jiān)控整個工藝中的培養(yǎng)物純度。通過比較所觀察的樣品與目測標準物對細胞培養(yǎng)物進行形態(tài)檢查來評估形態(tài)。所述細胞當以培養(yǎng)的 單層形式生長時展示典型的成纖維細胞形態(tài)。細胞可展示具有細長延伸的狹長的梭狀或紡錘狀外觀，或表現(xiàn)為可具有細胞質(zhì)前導邊緣的較大的扁平狀星形細胞。還可以觀察到這些形態(tài)的混合物。在匯合度較小的區(qū)域中的成纖維細胞可具有類似形狀，但隨機定向。還評估細胞培養(yǎng)物中角化細胞的存在。角化細胞似乎呈圓形以及不規(guī)則形狀，并且在較高匯合度下它們似乎組織成鵝卵石構形。在較低匯合度下，角化細胞可在小群落中觀察到。在37±2. (TC以及5. 0± I. 0%C02下培育細胞并且每三到五天在T-500燒瓶中并且每五到七天在十層細胞堆疊(10CS)中供料。細胞在繼代培養(yǎng)之前在T-500燒瓶中所保持的時間不應超過10天。散裝原料藥安全性的質(zhì)量控制(QC)出廠測試包括無菌和內(nèi)毒素測試。當在T-500燒瓶中細胞匯合度> 95%時，將細胞繼代培養(yǎng)到IOCS培養(yǎng)容器中?；蛘?，可使用兩個五層細胞堆疊(5CS)或十層細胞工廠(10CF)代替10CS。通過去除耗盡的培養(yǎng)基，洗滌細胞并且用胰蛋白酶-EDTA處理以將燒瓶中的粘附細胞釋放到溶液中來進行繼代培養(yǎng)達到10CS。接著將細胞轉移到10CS。加入額外的完全生長培養(yǎng)基來中和胰蛋白酶并且將來自T-500燒瓶的細胞吸移到含有新鮮的完全生長培養(yǎng)基的2L瓶中。將2L瓶的內(nèi)含物轉移到IOCS中且跨越所有層進行接種。接著在37±2. (TC以及5. 0±1. 0%C02下培育細胞并且每五到七天供給新鮮的完全生長培養(yǎng)基。細胞在繼代培養(yǎng)之前在IOCS中所保持的時間不應超過20天。通過在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培育經(jīng)過擴增的成纖維細胞一段時間，使得經(jīng)過繼代培養(yǎng)的真皮成纖維細胞實質(zhì)上不含培養(yǎng)基中所存在的免疫原性蛋白質(zhì)。初級收集當在IOCS中細胞匯合度為95%或更高時，收集細胞。通過去除耗盡的培養(yǎng)基，洗滌細胞，用胰蛋白酶-EDTA處理以將粘附細胞釋放到溶液中，并且加入額外的完全生長培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶來進行收集。通過離心收集細胞，再懸浮，并且進行工藝中QC測試以測定總活細胞計數(shù)以及細胞成活力。對于治療鼻唇溝，總細胞計數(shù)必須為3· 4X IO8個細胞且成活力必須為85%或更高?；蛘?，用于其他適應癥的總細胞產(chǎn)量可在3. 4X IO8至IX IO9個細胞的范圍內(nèi)。收集時的細胞計數(shù)和成活力為用以確保有足夠量的活細胞用于調(diào)配原料藥的關鍵參數(shù)。如果總活細胞計數(shù)足以用于預期治療，那么就測試細胞等分試樣和耗盡的培養(yǎng)基的支原體污染。進行支原體測試。調(diào)配所收集的細胞并且低溫保存。如果從初級IOCS收集接收到細胞計數(shù)結果之后需要額外的細胞，那么就進行額外的繼代培養(yǎng)達到多個細胞堆疊(至多四個10CS)(圖I中的步驟5a)。對于額外的繼代培養(yǎng)，將來自初級收集的細胞加入到含有新鮮的完全生長培養(yǎng)基的2L培養(yǎng)基瓶中。將再懸浮的細胞加入到多個細胞堆疊中且在37 ±2. (TC以及5. O ± I. 0%C02下培育。除了在細胞收集之前細胞匯合度必須為80%或更高以外，如上文所述對細胞堆疊進行供料并收集。收集程序與上文關于初級收集所述相同。從細胞和耗盡的培養(yǎng)基收集支原體樣品，并且如上文關于初級收集所述進行細胞計數(shù)和成活力測定。所述方法減少或消除了免疫原性蛋白質(zhì)，從而避免其從動物源性試劑引入。為減少工藝殘留，將細胞在無蛋白質(zhì)冷凍培養(yǎng)基中低溫保存，接著在準備用于最終注射之前解凍并且洗滌以進一步減少剩余殘留。
如果在完成收集并且低溫保存來自額外繼代培養(yǎng)的細胞(圖I中的步驟5a)之后需要額外的原料藥，那么就解凍經(jīng)過冷凍的冷凍小瓶裝原料藥的等分試樣并且用于接種5CS或IOCS培養(yǎng)容器(圖I中的步驟7a)?；蛘撸墒褂盟膶蛹毎S(4CF)、兩個4CF或兩個5CS代替5CS或10CS。將經(jīng)過冷凍的細胞冷凍小瓶解凍，洗滌，加入到含有新鮮的完全生長培養(yǎng)基的2L培養(yǎng)基瓶中，并且如上文所述進行培養(yǎng)，收集并且低溫保存。加入細胞懸浮液。在細胞收集之前細胞匯合度必須為80%或更高。C.制備細胞懸浮液在完成培養(yǎng)物擴增時，收集細胞并洗滌，接著調(diào)配成含有1.0-2. 7X IO7個細胞/毫升，目標為2. 2X IO7個細胞/毫升。或者，可在調(diào)配物范圍內(nèi)調(diào)整目標以適應不同適應癥劑量。原料藥由懸浮于低溫保存培養(yǎng)基中的活的自體人類成纖維細胞的群體組成，所述低溫保存培養(yǎng)基由伊斯科夫改良達爾伯克培養(yǎng)基(MDM)和Profeeze-CDM (龍沙公司(Lonza)，沃克斯維爾(Walkerville)，馬里蘭州(MD))加7. 5% 二甲亞砜(DMSO)組成?；蛘?，可使用較低DMSO濃度代替7. 5%或CryoStor CS5，或可使用CryoStor CS 10 (美國生物科技公司(BioLifeSolutions),巴薩爾(Bothell),華盛頓州(WA))代替 IMDM/Profreeze/DMS0。冷凍工藝由以下勻變程序的控制速率冷凍步驟組成步驟I :在4. (TC下等待步驟2 1. 0°C /minC/m 到-4. 0°C (樣品探針)步驟3 25. 0°C /minC/m 到 _40°C (腔室探針)步驟4 10. (TC /minC/m 到-12. (TC (腔室探針)步驟5 :1. (TC /minC/m 到 _40°C (腔室探針)步驟6 10. 0°C /minC/m 到 _90°C (腔室探針)步驟7:結束在完成控制速率冷凍步驟之后，將散裝原料藥小瓶轉移到低溫冷凍器中以在蒸氣相中存儲。在低溫冷凍之后，提交原料藥進行質(zhì)量控制測試。原料藥規(guī)格還包括在低溫保存之前進行以及再次針對冷凍小瓶裝原料藥進行的細胞計數(shù)和細胞成活力測試。對于產(chǎn)品出廠，細胞成活力必須為85%或更高。使用自動化細胞計數(shù)系統(tǒng)(加瓦技術公司(GuavaTechnologies))進行細胞計數(shù)和成活力測定，所述系統(tǒng)利用可滲透和不可滲透的熒光DNA嵌入染料的組合來檢測并區(qū)分活細胞和死細胞。或者，可使用采用錐蟲藍排除法的手動細胞計數(shù)分析代替上述自動化細胞法。或者，可使用其他自動化細胞計數(shù)系統(tǒng)來進行細胞計數(shù)和成活力方法，包括Cedex (羅氏伊諾斯AG公司(Roche InnovatisAG),比勒費爾德(Bielefield),德國(Germany))、ViaCell (貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter),貝瑞阿(Brea),加利福尼亞州(CA))、NuceloCounter (新布倫茲威克科學儀器公司(NewBrunswickScientific),埃迪遜(Edison),新澤西州(NJ))、Countless (英杰，生命技術公司分部(Invitrogen, division of Life Technologies),卡爾斯巴德(Carlsbad),加利福尼亞州(CA))或Cellometer (萊科洛生物科學公司(Nexcelom Biosciences),勞倫斯(Lawrence)，馬薩諸塞州(MA))。冷凍小瓶裝原料藥樣品在出廠前必須滿足I. 0-2. 7X IO7個細胞/毫升的細胞計數(shù)規(guī)格。在出廠測試期間還進行無菌和內(nèi)毒素測試。除了細胞計數(shù)和成活力以外，還進行原料藥的純度/身份分析并且必須確認懸浮液含有98%或更多的成纖維細胞。常見細胞污染物包括角化細胞。純度/身份分析采用針對CD90和CD 104 (分別為成纖維細胞和角化細胞的細胞表面標志物)的熒光標記抗體來量化成纖維細胞群體的純度百分比。⑶90 (Thy-I)為35kDa細胞表面糖蛋白。已顯示針對⑶90蛋白質(zhì)的抗體對人類成纖維細胞展現(xiàn)高特異性。⑶104整合素β4鏈為205kDa跨膜·糖蛋白，它與整合素α6鏈(⑶49f)締合形成α6/β4復合物。已顯示此復合物充當角化細胞的分子標志物(亞當斯(Adams)和瓦特(Watt) 1991)。針對⑶104蛋白質(zhì)的抗體結合于100%的人類角化細胞。通過將樣品與維康特染料試劑(Viacount Dye Reagent)—起培育并且使用Guava PCA系統(tǒng)分析樣品來測定細胞計數(shù)和成活力。所述試劑由兩種染料構成，即，將所有有核細胞染色的膜可滲透性染料以及只將受損細胞或垂死細胞染色的膜不可滲透性染料。此染料組合的使用使得Guava PCA系統(tǒng)能夠估算樣品中所存在的細胞的總數(shù)，并且確定哪些細胞存活、凋亡或死亡。所述方法為專門開發(fā)的，特定用于確定自體培養(yǎng)的成纖維細胞的純度/身份。具體程序如下程序制備25% (ff/V)疊氮化鈉的PBS溶液制備FACS (熒光激活細胞分詵)緩沖液在IOOOmL 納根瓶(Nalgene bottle)中，將 966mL PBS、30mL FBS 以及 4mL 25% 疊氮化鈉的PBS溶液組合。制備1% (v/v) HuS 的 PBS 溶液每個測試樣品制備ImL l%HuS的PBS溶液。向標記為1%HuS等分試樣的I. 5mL管中加入990 μ L PBSo將10 μ L人類血清加入到標記為1%HuS的管中。樣品接收和制備核實在結果通過當日已進行每日Guava檢查。使用Guava PCA對測試小瓶進行細胞計數(shù)和成活力分析。記錄所獲得的平均細胞計數(shù)值。對于每個樣品組，每個測試小瓶標記如下四個1. 5mL微量離心管“⑶90 ”、“⑶104”、“小鼠”(對應于小鼠IgGl同型對照)以及“大鼠”(對應于大鼠IgG2b同型對照)。使用平均細胞計數(shù)結果，計算用于等分的細胞的適當體積，以使得每個管接收IXlO5個活細胞。實例
如果平均活細胞計數(shù)結果記載為I. 5X IO7個細胞/毫升，那么I X IO5除以
I.5X IO7個細胞/毫升即為適當體積。此體積(mL)乘以1000以將單位轉換成yL。I X 105/1. 5 X IO7個細胞/毫升=0. 0066mLX 1000=7 μ L細胞溶液等分試樣。將足量FACS緩沖液加入到每個管中使得總體積將為ImL。實例如果所加入的細胞溶液為7yL，那么從ImL或IOOOyL減去7yL。加入1000 μ L-7 μ L=993 μ L FACS 緩沖液。通過在渦旋設置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合測試小瓶?！⑦m量細胞溶液加入到FACS緩沖液中。通過在渦旋設置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。通過以3，OOOrpm離心3分鐘使每個樣品管中的細胞集結。如果難以形成集結粒，那么再次以3，OOOrpm使管離心3分鐘。如果在第二次離心之后集結粒形成足夠，那么繼續(xù)進行上清液抽吸。借助于吸移管，將上清液抽吸到含有20%漂白劑的去離子水溶液的廢物容器中。在每個管中留下約50 μ L上清液以使無意地抽吸細胞的情況降至最低。加入200 μ L l%HuS的PBS溶液。通過在渦旋設置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。在2-8 °C下將管培育25分鐘±5分鐘。將5. O μ L抗體或同型對照加入到各別管中。通過在渦旋設置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。在2-8 °C下將管培育25分鐘±5分鐘。避光。將800 μ L FACS緩沖液加入到每個管中。通過在渦旋設置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。借助于吸移管，抽吸上清液并且在每個管中留下約50 μ L上清液以使無意地抽吸細胞的情況降至最低。加入400 μ L FACS緩沖液。通過在渦旋設置8上連續(xù)渦旋3秒鐘來混合。使用GuavaPCA采集樣品打開CytoSoft 2. I. 5并且點擊主菜單中的“Guava Express”。點擊“新數(shù)據(jù)集(New Data Set)”并且遵循屏幕命令來生成新文件。確保在用以采集Guava Express采集屏幕的部分的事件(Events To Acquiresection of the Guava Express Acquisitionscreen)中輸入2000。調(diào)整關于小鼠IgGl同型對照的設置。在樣品信息控制面板內(nèi)輸入樣品部分、批次以及同型對照或抗體(例如“DR01200502001小鼠”)以標識樣品ID字段中的每個樣品。在渦旋設置8上使小鼠IgGl同型對照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點擊“設置(Settings)”。將出現(xiàn)消息窗P，選擇“調(diào)整設置(Adjust Settings)”。將出現(xiàn)另一個消息窗口，提示裝載對照樣品，選擇“確定(OK) ”。應出現(xiàn)“調(diào)整設置”屏幕并且系統(tǒng)將自動設置閾值以排除背景熒光。選擇一個FSC增益強度(Gain intensity)以將規(guī)定細胞群集的中心定位在FSC相對于成活力(PMl)圖(例如“x2”)的X軸上的右下方象限中在10e3之上。定位FSC相對于成活力(PMl)圖上的FSC閾值條以排除碎片。將PM2調(diào)整到300V。將PMl調(diào)整到300-400V之間，以使得陰性對照群體定位在FSC相對于PMl以及PMl相對于PM2點陣圖上的IOeO與IOel之間。采集小鼠IgGl同型對照在渦旋設置8上使小鼠IgGl同型對照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點擊“采集下一個樣品(Acquire Next Sample)”。確保將所有默認的門控選項設置成非門控(ungated)。在PMl熒光相對于計數(shù)的柱狀圖上，在默認位置處設置標記。點擊標記進行設置，以使得PMl門控樣品的柱狀圖事件的百分比為約I. 0%。 采集⑶90樣品在樣品信息控制面板內(nèi)輸入樣品部分、批次以及同型對照或抗體(例如“DR01200502001CD90”)以標識樣品ID字段中的每個樣品。核實將PMl熒光標記設置成與小鼠IgGl同型對照樣品相同的設置。調(diào)整關于大鼠IgG2b同型對照的設置在渦旋設置8上使大鼠IgGl同型對照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點擊“設置”。應出現(xiàn)“調(diào)整設置”屏幕并且系統(tǒng)將自動設置閾值以排除背景熒光。選擇一個FSC增益強度以將規(guī)定細胞群集的中心定位在FSC相對于成活力(PMl)圖(例如“x2”)的X軸上的右下方象限中在IO3之上。定位FSC相對于成活力(PMl)圖上的FSC閾值條以排除碎片。將PM2調(diào)整到300V。將PMl調(diào)整到300-400V之間，以使得陰性對照群體定位在FSC相對于PMl以及PMl相對于PM2點陣圖上的IOeO與IOel之間。米集大鼠,IrGI同型對照樣品在渦旋設置8上使大鼠IgGl同型對照管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到Guava PCA中并且點擊“采集下一個樣品”。將所有門控選項設置成非門控。在PMl熒光相對于計數(shù)的柱狀圖上，在默認位置處設置標記。點擊標記進行設置，以使得PMl門控樣品的柱狀圖事件的百分比為約1.0%。標記的位置以數(shù)值顯示在“標記位置”框中。采集⑶104樣品在渦旋設置8上使⑶104管連續(xù)渦旋3秒鐘，將其裝載到GuavaPCA中并且點擊“采集下一個樣品”。核實將PMl熒光標記設置成與大鼠IgGl同型對照樣品相同的設置。使用Guava PCA分析樣品點擊“執(zhí)行(Go)”從采集屏幕進行分析。點擊“打印(Print)”，接著點擊“確定(0K)”。在每個印刷報告上簽上姓名和日期。純度計算:PMl事件計數(shù)[用⑶90 (⑶90)標記的總事件]-PMl事件計數(shù)[用抗⑶90 (小鼠IgGl)標記的總事件]=用⑶90標記的總事件(針對背景/非特異性熒光歸一化)(例如1918個事件-20個事件=1898個事件)。PMl事件計數(shù)[用⑶104 (⑶104)標記的總事件]-PMl事件計數(shù)[用抗⑶104(大鼠IgG2b)標記的總事件]=用⑶104標記的總事件(針對背景/非特異性熒光歸一化)(例如31個事件-23個事件=8個事件)。用⑶90標記的總事件(針對背景/非特異性熒光歸一化)+用⑶104標記的總事件(針對背景/非特異性熒光歸一化)=總歸一化標記事件(例如1898個事件+8個事件=1906個事件)。如下計算純度％ 1898個總CD90事件/1906個總歸一化標記事件X 100=99. 58，或 100%。系統(tǒng)適宜性和規(guī)格在開始分析之前必須進行成功的珠粒檢查(Bead Check)?？偭Ｗ佑嫈?shù)必須采集2000。所有樣品的純度百分比必須彡98%。替代的制造方法或者，可將細胞從T-175燒瓶(或替代物)或T-500燒瓶(或替代物)繼代培養(yǎng)到含有微載體作為細胞生長表面的旋轉燒瓶中。微載體為小珠狀結構，它用作懸浮培養(yǎng)中的貼壁依賴性細胞的生長表面。所述微載體經(jīng)過設計以在小體積中產(chǎn)生大細胞產(chǎn)量。 在此設備中，將體積在50mL-300mL范圍內(nèi)的完全生長培養(yǎng)基加入到500mL、IL或2L無菌一次性旋轉燒瓶中。將無菌微載體加入到旋轉燒瓶中。在37±2.0°C以及
5.0±1. 0%C02培育箱中使培養(yǎng)物保持靜態(tài)或放置在處于低RPM (15-30RRM)下的攪拌板上較短的一段時間(1-24小時)以使得細胞粘附于載體。附著期之后，提高旋轉板的速度(30-120RPM)。每一到五天或當根據(jù)顏色變化培養(yǎng)基似乎耗盡時為細胞供給新鮮的完全生長培養(yǎng)基。以有規(guī)律的時間間隔通過對微載體進行采樣，分離細胞并且進行細胞計數(shù)和成活力分析來收集細胞。使用每個載體的細胞濃度來確定何時按比例放大培養(yǎng)。當產(chǎn)生足夠的細胞時，用PBS洗滌細胞并且使用胰蛋白酶-EDTA從微載體中收集細胞，并且在更大量的微載體以及更大體積的完全生長培養(yǎng)基(300mL-2L)中接種回旋轉燒瓶中。或者，可將額外的微載體以及完全生長培養(yǎng)基直接加入到含有現(xiàn)有微載體培養(yǎng)物的旋轉燒瓶中，允許在不使用胰蛋白酶處理和重新接種的情況下進行細胞的直接珠粒間轉移?；蛘?，如果從初始T-175或T-500燒瓶中產(chǎn)生足夠的細胞，那么可將細胞直接接種到按比例放大量的微載體中。附著期之后，提高旋轉板的速度(30-120RPM)。每一到五天或當根據(jù)顏色變化培養(yǎng)基似乎耗盡時為細胞供給新鮮的完全生長培養(yǎng)基。當濃度達到預期適應癥所需的細胞計數(shù)時，用PBS洗滌細胞并且使用胰蛋白酶-EDTA收集細胞。注射用藥品的所有出廠測試、低溫保存以及制備將遵循部分C和D中所述的工藝。一次性旋轉燒瓶中所用的微載體可由以下材料制成聚合物共混體(polyblend),如BioNOC II (賽宇生物工程公司(CescoBioengineering),由貝爾克生物技術公司(Bellco Biotechnology)配送，瓦恩蘭(Vineland),新澤西州(NJ))以及FibraCei (新布倫茲威克科學儀器公司(New Brunswick Scientific),埃迪遜(Edison),新澤西州(NJ));明膠,如 Cultispher-G(派賽爾生物公司(Percell Biolytica),阿斯托(Astrop),瑞典(Sweden));纖維素,如Cytopore (通用電氣醫(yī)療健康集團(GE Healthcare),皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西州(NJ));或經(jīng)過涂布/未經(jīng)過涂布的聚苯乙烯，如2D MicroHex (能肯公司(Nunc),威斯巴登(Weisbaden),德國(Germany));Cytodexfe(通用電氣醫(yī)療健康集團(GE Healthcare),皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西州(NJ))或 Hy-Q Sphere (賽默飛世爾科技公司(ThermoScientific Hyclone),洛根(Logan),猶他州(UT))?；蛘?，可在聚合物共混體2D微載體(如BioNOCn 以及FibraCel )上，使用自動波紋系統(tǒng)(如FibraStage (新布倫茲威克科學儀器公司(New Brunswick Scientific),埃迪遜(Edison),新澤西州(NJ))或BelloCell (賽宇生物工程公司(Cesco Bioengineering),由貝爾克生物技術公司(Bellco Biotechnology)配送，瓦恩蘭(Vineland),新澤西州(NJ)))代替旋轉燒瓶設備加工細胞。將細胞從T-175 (或替代物)或T-500燒瓶(或替代物)繼代培養(yǎng)到含有微載體和適當量的完全生長培養(yǎng)基的波紋瓶中，并且放置到系統(tǒng)中。所述系統(tǒng)將培養(yǎng)基泵送到微載體之上以對細胞進行供料，并且吸走培養(yǎng)基以允許在重復固定周期中進行氧化。以與上文所述相同的順序對細胞進行監(jiān)控，供料，洗滌并收集?；蛘撸墒褂米詣踊到y(tǒng)加工細胞。在消化活檢體組織之后或在完成第一次繼代培養(yǎng)(T-175燒瓶或替代物)之后，可將細胞接種到自動化裝置中。一種方法為自動化細胞擴增(ACE)系統(tǒng)，它是一系列可商購的或專門制造的連接在一起形成細胞生長平臺的組件，在所述平臺中細胞可在無人為干預下擴增。細胞在細胞塔中擴增，所述細胞塔由能夠支持貼壁依賴性細胞附著的圓盤堆疊組成。所述系統(tǒng)自動循環(huán)培養(yǎng)基且進行胰蛋白酶處理以便在完成細胞擴增階段后加以收集。或者，可將ACE系統(tǒng)按比例縮小成單批次單元型式，其包含由以下組成的一次性組件細胞生長表面、遞送管道、培養(yǎng)基和試劑，以及安置用于加熱/冷卻、培養(yǎng)基轉移以及執(zhí)行自動化編程周期的機構以及計算機處理容量的永久基座。驗收后，將每個經(jīng)過無菌照·射的ACE —次性單元從它的包裝中打開并且通過懸掛預先填充的袋子并將袋子通過無菌連接器連接到現(xiàn)有管道來裝載培養(yǎng)基和試劑。工藝如下繼續(xù)進行在生物安全柜(BSC)中，將來自已經(jīng)過酶消化的活檢體的細胞的懸浮液引入到已經(jīng)填充有含有抗生素的起始生長培養(yǎng)基的“前生長腔室”(細胞塔頂部的小單元)中。將一次性物品從BSC轉移到已處于適當位置處的永久ACE單元中。約三天后，對前生長腔室內(nèi)的細胞進行胰蛋白酶處理并且引入到預填充有完全生長培養(yǎng)基的細胞塔本身中。此處，通過CO2注射引起的“鼓泡作用”迫使培養(yǎng)基以使得細胞螺旋向下并且以均勻分布的方式沉降在圓盤表面上的速率循環(huán)。持續(xù)約七天，使細胞倍增。此時，檢查匯合度(在寫作當時方法未知)以核實培養(yǎng)物正在生長中。此時，還將完全生長培養(yǎng)基用新鮮的完全生長培養(yǎng)基替換。每七天替換CGM，持續(xù)三到四周。在培養(yǎng)期結束時，再一次檢查匯合度以核實有充分生長，從而可能得到用于預期治療的所需量的細胞。如果培養(yǎng)物充分匯合，那么就將其收集。從容器中排出耗盡的培養(yǎng)基(上清液)。接著將PBS泵送到容器中(用以洗滌培養(yǎng)基，來自細胞的FBS)并且?guī)缀趿⒓磁懦觥⒁鹊鞍酌?EDTA泵送到容器中以使細胞從生長表面脫離。將胰蛋白酶/細胞混合物從容器中排出并且進入旋轉分離器。將低溫保存劑泵送到容器中以從圓盤表面沖洗去任何殘余細胞，并且同樣送到旋轉分離器。旋轉分離器收集細胞，接著使細胞均勻地再懸浮于運送/注射培養(yǎng)基中。從旋轉分離器，細胞將通過自動化細胞計數(shù)裝置發(fā)送或收集樣品以通過實驗室分析進行細胞計數(shù)和成活力測試。一旦已計數(shù)到特定數(shù)目的細胞并且已達到適當細胞濃度，即將所收集的細胞遞送到收集小瓶中，可移出所述收集小瓶以將樣品等分用于低溫冷凍。或者，可使用自動化機器人系統(tǒng)在工藝的整個長度或在一部分中進行細胞供料、繼代培養(yǎng)以及收集?？蓪⒓毎谙⒔臃N到T-175燒瓶(或替代物)中之后直接引入到機器人裝置中。所述裝置可具有培育細胞、進行細胞計數(shù)和成活力分析以及進行供料并轉移到更大培養(yǎng)容器中的能力。所述系統(tǒng)還可以具有計算機化編目功能以追蹤個別批次。對于機器人選項可使用現(xiàn)有技術或定制系統(tǒng)。
P.劑量單位用于制備最終劑量單位的冷凍小瓶裝原料藥由成纖維細胞組成，所述成纖維細胞是從最終培養(yǎng)容器中收集，調(diào)配成所需細胞濃度并且在冷凍小瓶中低溫保存。將冷凍小瓶裝原料藥存儲在由MDM和Profreeze 加7. 5%DMS0組成的低溫保存培養(yǎng)基中，達到
2.2X IO7個細胞/毫升的目標。在經(jīng)歷控制速率冷凍周期之后，將冷凍小瓶裝原料藥冷凍存儲在液氮冷凍器的氣相中。將所收集的細胞匯集，在包括Profreeze、DMSO以及MDM培養(yǎng)基的低溫保存培養(yǎng)基中調(diào)配，等分到冷凍小瓶中，并且通過控制速率冷凍而作為冷凍小瓶裝原料藥材料冷凍存儲在液氣中。對瓶蓋和小瓶進行輻射滅菌并且從制造商處無菌接收。從冷凍存儲中移出治療所需要的所需體積的散裝材料，解凍并匯集。用4X散裝體積的PBS洗滌細胞并且以150Xg離心10分鐘(5±3°C)。此后通過再懸浮用4X散裝體積的DMEM洗滌并且以150Xg離心 10分鐘(5±3°C)。使經(jīng)過洗滌的細胞再懸浮于不含酚紅的DMEM中，達到1.0-2. OX IO7個細胞/毫升的目標濃度?；蛘?，可用Hypothermosol -FRS (美國生物科技公司(BioLifeSolutions),巴薩爾(Bothell),華盛頓州(WA))進行第二次4X洗漆以及最終再懸浮。接著在生物安全柜中將最終無菌冷凍小瓶容器手動填充到I. 2毫升/容器的體積。在2-8°C下存儲注射用藥品直到在2-8°C下冷藏的運送器材中運送到投藥場所為止?；蛘?，可從低溫存儲中移出原料藥小瓶并且直接運送到投藥場所以供稀釋和投藥。在直接注射概念中，收集細胞并且制備用于在較高細胞濃度(3. 0-4. O X IO7個細胞/毫升，與2. 2X IO7個細胞/毫升的當前目標相比)下低溫保存。在等待注射時，將冷凍的小瓶在干冰上或液氮杜瓦瓶(dewar)中運送到研究場所。在投藥場所用手或用加熱塊將小瓶解凍，并且在研究場所使用典型的注射稀釋劑對冷凍細胞進行1:1比率稀釋，所述注射稀釋劑如抑菌水、無菌水、氯化鈉或磷酸鹽緩沖鹽水?；蛘?，可使用DMEM作為稀釋劑。此概念消除了對洗滌并制備新鮮的注射懸浮液用于連夜運送到研究場所的需要?；蛘撸蓪臒炕蚣毎询B中新鮮收集的細胞在DMEM中調(diào)整到1.0-2. OXlO7個細胞/毫升的目標濃度，經(jīng)歷上文所述的所有散裝收集物和冷凍小瓶裝原料藥測試，并且作為最終注射產(chǎn)品在2-8°C下冷藏的運送器材中連夜新鮮運送到投藥場所。在此種情況下，可在收集上游進行無菌和支原體測試以在運送之前留有出結果的時間。II.投藥方法A.制備劑量單位azficel-T Azficel_T注射用藥品由每個患者自身所生存的自體成纖維細胞調(diào)配在不含酚紅的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中的懸浮液組成。Azficel-T成纖維細胞劑量調(diào)配物以兩個2mL小瓶供應，每個小瓶含有I. 2mL的I. 0-2. OX IO7個細胞/毫升的藥品。打算將無菌細胞懸浮液用于真皮內(nèi)注射。最初，在由FDA規(guī)范Azficel-T成纖維細胞劑量調(diào)配物之前，Azficel-成纖維細胞劑量調(diào)配物的細胞劑量是基于由臨床醫(yī)師投予的細胞數(shù)。成功地使用每1.2-1. 4mL注射液I. 5-7. OX IO7個細胞的劑量范圍。粘度成為濃度高于此范圍的成纖維細胞劑量調(diào)配物注射液的問題。此劑量范圍轉換成I. 1-5. SXlO7A細胞/毫升。在IND下進行的第一臨床研究中，調(diào)配0. 5-3. O X IO7個細胞/毫升。在第二臨床研究中，調(diào)配I. 0-3. OX IO7個細胞/毫升。所有后續(xù)臨床研究的標準出廠規(guī)格為I. 0-2. OX IO7
個細胞/毫升。在稍后的臨床研究IT-R-005和IT-R-006中，提供在兩個2. OmL冷凍小瓶中的每個小瓶中調(diào)配成I. 0-2. OX IO7個細胞/毫升的I. 2mL成纖維細胞的溶液。在所提供的2. 4mL中，打算將2. OmL用于以每線性厘米長度O. ImL的劑量注射，用于面部兩側總共20cm的最大預測鼻唇溝長度。打算過量O. 2mL以確?？蓮男∑恐蝎@得I. OmL，從而治療至多10線性厘米長度的鼻唇溝。B.投予劑量單位將小瓶加溫到室溫并且輕輕倒置以使沉降的細胞再懸浮。使用配備有可拆卸針或固定針的小單位注射器從容器中抽出細胞懸浮液。推薦使用短而尖的針和小單位注射器(例如O. 5mL胰島素注射器)來實現(xiàn)較佳的注射控制并且降低發(fā)炎風險。產(chǎn)品的真皮內(nèi)注射 需要29號或30號針。然而，可使用具有更大孔的21號可拆卸針的注射器以幫助從容器中抽出產(chǎn)品。一旦抽出，即可將21號針切換成30號針并且投予產(chǎn)品。一個批次由三次注射治療組成。對于治療鼻唇溝皺紋，單次注射治療(批次)需要兩個含有I. 2毫升/小瓶的azficelAzficel-T成纖維細胞劑量調(diào)配物的2mL小瓶。C.待治療的病狀皮膚的老化過程由內(nèi)在和外在兩種因素引發(fā)。促成內(nèi)在或自然老化的因素為結構性和功能性因素。在結構方面，表皮變得較薄，角質(zhì)細胞粘附性較小并且真皮-表皮接合處變平。在功能方面，成纖維細胞的數(shù)目和生物合成能力減小并且真皮變得萎縮并且相對無細胞以及無血管。暴露于紫外光輻射是外在老化或光老化的主要原因。外在老化特征為彈性缺失、粗糙度和干燥度增加、不規(guī)則的色素沉著、深皺紋形成、革質(zhì)外觀、形成皰疤以及傷口愈合減退?？梢姷睦匣庥^，尤其面部皺紋和溝，為患者設法要減少的常見結果。治療面部紋路、皺紋以及溝的選項包括外科手術、神經(jīng)毒素、填充劑、激光、非剝脫性療法、微晶磨皮術(microdermabrasion)以及化學去皮。這些治療中有許多在治療老化征象中的安全性、功效以及作用持續(xù)時間方面有所不同。相信本文所述的調(diào)配物會增加真皮中產(chǎn)生膠原蛋白的細胞的數(shù)目，其可能對改善皮膚具有多因子作用。使用自體人類成纖維細胞來治療輪廓畸形是由威廉K.波斯(WilliamK. Boss) , MD,哈肯薩克大學醫(yī)學中心醫(yī)學整形科副主席(Vice Chairman of theDepartment of Plastic Surgery at HackensackUniversity Medical Center)首創(chuàng)。他在真皮修復區(qū)域中所進行的工作始于1992年。他從患者手腕中移出一小片皮膚，培養(yǎng)來自活檢體的自體成纖維細胞，將自體細胞注射到患者手腕皮膚中的皺褶中，并且觀察到皺褶隨著時間推移而消失。他連續(xù)數(shù)年觀察所述區(qū)域并且注意到測試部位的皺褶保持被修正。對此單次治療無不良反應。在1995年3月進行小型臨床試驗。最初，將自體培養(yǎng)的成纖維細胞分兩到三次注射到約12名個體的所選皺皮和瘢痕中。追蹤12個月之后，在每個個體中都注意到進行性的改善。波斯博士(Dr. Boss)和馬科博士(Dr. Marko)報導了治療超過100名患者，在超過2年半的觀察期內(nèi)未觀察到過敏反應或不良反應的征象。在1995年12月，自體成纖維細胞在美國可商購得到。美國商業(yè)經(jīng)歷包括在皮膚學、面部整形外科以及再造整形外科領域中的約100名臨床醫(yī)師，他們治療具有面部皺皮、瘢痕、唇部發(fā)育不全、燒傷以及其他問題的患者。報導了近1，OOO名患者的患者經(jīng)歷，其中354名被納入到信息回顧報告的功效群體中。在加州大學洛杉肌分校(Universityof California Los Angeles, UCLA)對 10名健康成人進行使用成纖維細胞懸浮液的真皮內(nèi)注射用于治療顯著的面部皺皮以及凹陷的面部瘢痕的試點研究。以3周的時間間隔進行兩(2)個注射期之后，十名患者中有九名注意到治療實現(xiàn)的60-100%改善；臨床醫(yī)師觀察到類似觀察結果。通過光學測量(激光)證實所有經(jīng)過治療的畸形的尺寸減小10-85%。在顯微鏡下，有證據(jù)表明真皮層的厚度和密度增加。研究已顯示，將成纖維細胞懸浮液注射到真皮的輪廓缺陷中可使受損真皮和皮下組織得到修正。皮膚的真皮含有成纖維細胞，其主要負責分泌細胞外基質(zhì)組分，如膠原蛋白和彈性蛋白，所述組分為皮膚提供機械強度和完整性。雖然確切的機理未知，但是成纖維細胞懸浮液含有自體成纖維細胞，所述成纖維細胞當注射到患者皮膚中時會增加細胞外基質(zhì)組分的合成，由此增強皮膚完整性，最終使得細紋和皺紋減少。所述療法的效果并非即時 的，而是提供紋路和皺紋的外觀隨著時間推移的逐漸改善。成纖維細胞懸浮液最初在1995年由威廉波斯博士(Dr. WilliamBoss)進行的臨床研究中評估，接著從1995年12月到1999年2月在美國作為面部輪廓畸形的美容治療而投放市場。1999年2月之后，F(xiàn)DA被要求在PHS法案下規(guī)范所有體細胞療法。依據(jù)成纖維細胞懸浮液將歸入新的細胞和組織法規(guī)下的FDA通告，商業(yè)流通停止并且開始依據(jù)8641號新藥研究申請(IND)進行臨床開發(fā)。在兩項II期研究(研究IT-R-001和 IT-R-007)以及五項 III 期研究(研究 IT-R-002、IT-R-003A、IT-R-003B、IT-R-005 以及IT-R-006)中進行關于治療面部皺紋和皺褶的研究。研究IT-R-003A、IT-R-003B、IT-R-005以及IT-R-006提供穩(wěn)固的、受到良好控制的資料，其展示成纖維細胞懸浮液的安全性和功效概況。在痤瘡瘢痕的治療中研究成纖維細胞懸浮液(研究IT-A-008 ；13455號IND)。在研究IT-A-008期間99名個體接受成纖維細胞懸浮液治療。亦開發(fā)成纖維細胞懸浮液用于其他適應癥，包括治療限制性燒傷瘢痕(13308號IND)、聲帶瘢痕(9892號IND)以及牙齦修復(10805 號 IND)ο更早期的001和002試驗提供支持性的探索性資料，其指導003A/B和005/006試驗的設計。研究IT-R-001為成纖維細胞懸浮液用于治療皺皮(治療鼻唇和唇頰溝、口周紋、眉間紋、痤瘡瘢痕以及前額)的II期雙盲、隨機化以及安慰劑對照的研究。在研究的急性期，每個個體接受成纖維細胞懸浮液(O. 5 X IO7,1. O X IO7或2. O X IO7個細胞/毫升)或安慰劑的三次治療，投藥間隔約兩周。在研究的急性期個體(40)用成纖維細胞懸浮液(N=30)或安慰劑(N=IO)治療。研究IT-R-002為成纖維細胞懸浮液用于治療面部輪廓畸形和瘢痕的III期雙盲、隨機化以及安慰劑對照的研究。在此研究的急性期，每個個體接受含有2. OX IO7個細胞/毫升的成纖維細胞懸浮液或安慰劑的三次治療，每14±7天進行投藥。在研究的急性期個體(151)用成纖維細胞懸浮液(N=112)或安慰劑(N=39)治療。在兩個研究中，在試驗的急性期個體(213)用成纖維細胞懸浮液(N=IOO)或安慰劑(N=113)治療。雖然研究IT-R-003B對兩個聯(lián)合初級終點顯示出功效，但是研究IT-R-003A中的一個聯(lián)合初級終點未能滿足統(tǒng)計顯著性準則(對于研究者評估)，因而產(chǎn)生兩個新的方案作為成纖維細胞懸浮液的關鍵III期試驗(研究IT-R-005和IT-R-006)。相信003A中錯失終點的原因在于包括了次最佳的給藥。細胞濃度保持相同，但是所遞送的體積增加。鑒別出其他原因，包括培訓技術以及一系列注射之間的時間。研究IT-R-005和IT-R-006為成纖維細胞懸浮液在治療鼻唇溝皺紋中的功效和安全性的III期多中心、雙盲、隨機化、安慰劑對照的研究。依據(jù)服從FDA SPA協(xié)議的相同方案進行這些研究。在這些研究的急性期，每個個體接受含有I. 0-2. OX IO7個細胞/毫升的成纖維細胞懸浮液或安慰劑的三次治療，每5周±1周進行投藥。在研究IT-R-005中，83名個體用成纖維細胞懸浮液治療并且92名個體用安慰劑治療。在研究IT-R-006中，98名個體用成纖維細胞懸浮液治療并且99名個體用安慰劑治療。研究IT-R-007為成纖維細胞懸浮液在治療面部皺紋和皺褶中的安全性和功效的II期多中心、開放標記研究，所述研究經(jīng)過設計以獲得關于使用成纖維細胞懸浮液用于除鼻唇溝以外的用途的安全性和功效資料。在此研究的急性期，每個個體接受至多6mL的含有I. 0-2. O X IO7個細胞/毫升的成纖維細胞懸浮液的兩次治療，每5周± 10天進行投藥。在研究的急性期期間，45名個體用成纖維細胞懸浮液治療。此研究將個體暴露于總劑量為·005/006研究中所用的總劑量的三倍的成纖維細胞懸浮液。入選到成纖維細胞的III期關鍵功效試驗，即研究IT-R-005和IT-R-006(005/006)中的個體群體主要為年齡在50歲與60歲之間的女性白種人。個體年齡在23-82歲的范圍內(nèi)，平均年齡為56. I歲。入選到研究中時個體的鼻唇溝皺紋的嚴重程度在評估者皺紋嚴重程度評估量表上的3-5級范圍內(nèi)，右側皺紋的平均評分為3. 7并且左側皺紋的平均評分為3.6。入選到III期IT-R-003A和IT-R_003B(003A/B)研究中的群體類似于005/006中的群體。女性占003A/B研究中群體的94%并且群體的95%為白種人。在兩項研究中個體的平均年齡為54. I歲。雖然003A/B方案在設計方面極類似于005/006方案，但是003A/003B允許皺紋嚴重程度在更寬范圍內(nèi)的個體入選，在入選時初級鼻唇溝畸形的評分在評估者量表上的2-5級范圍內(nèi)，但是平均嚴重程度評分類似地為3. 9。所有關鍵功效研究都使用由個體自我評估手段以及臨床研究者進行的評估組成的聯(lián)合初級終點。 在005/006研究中，聯(lián)合初級功效終點為個體皺紋評估使用5點皺紋評估量表在隨訪6時對面部下端部分的皺紋進行的個體活動期綜合評估，其中反應定義為與基線相比時量表上兩個點或更佳的改善。評估者皺紋嚴重程度評估使用6點順序皺紋嚴重程度量表使用光導在隨訪6時對靜止狀態(tài)的兩側鼻唇溝皺紋進行的不知情評估者活動期評估，其中反應定義為與基線相比量表上兩個點或更佳的改善。選擇這些終點以提供公正評估(由不知情醫(yī)師評級)以及臨床相關性(個體對其自身外貌的看法)。評估者皺紋嚴重程度評估所用的量表為用于評估鼻唇溝(NLF)的6點順序皺紋嚴重程度量表，所述量表由藍博(Lemperle)等人，整形和再造外科學(Plast Reconstr Surg. ) 2001108 (6) : 1735-50 開發(fā)并驗證。藍博量表(Lemperlescale)已經(jīng)過驗證以檢測鼻唇溝皺紋的嚴重程度的一個點的改善。然而，因為外觀的評估可能是主觀的并且傾向于可變化，因此此終點的成功定義為每個NLF的兩個點的改善，SP，對于指定患者，左側與右側NLF在評估者的評估中都必需有兩個點的改善以便被視為反應者。藍博量表為皮膚學領域中公認的度量標準，且已成功地用于經(jīng)過FDA批準的產(chǎn)品在類似適應癥中的關鍵臨床試驗中。個體皺紋評估所用的量表是基于由科恩(Cohen)和霍姆斯(Holmes),整形和再造外科學(Plast Reconstr Surg. ) 200415; 114(4) :964-76使用的公開量表。如同評估者評估一樣，確立兩個點的改善作為對治療的成功反應的準則。003A/B研究經(jīng)設計成具有類似的聯(lián)合初級終點，但是使用不同于005/006研究的個體評估工具。如003A/B方案中所規(guī)定。聯(lián)合初級功效終點為使用研究者的6點順序量表以及個體的VAS評估在6個月隨訪時在初級鼻唇溝中成纖維細胞劑量調(diào)配物注射液的功效。方案中所提及的6點順序量表為 005/006研究中所用的相同藍博量表，不過005/006研究為量表上的每個點提供比003A/B研究中所用的更具描述性的文本。視覺類比量表用于個體評估。此量表要求個體通過在IOcm線上放置記號而將每個輪廓畸形從O(無缺陷)到100 (極嚴重缺陷)分級。雖然兩項研究使用此評估工具都滿足改善的統(tǒng)計顯著性，但是在005/006研究中VAS量表用順序個體皺紋評估量表替換以改善個體評估資料的臨床相關性以及可解釋性。005/006兩項研究的結果展示IT治療的個體與安慰劑治療的個體之間的反應有極其顯著的差異，如兩個聯(lián)合初級終點所度量。在003A/B研究中，對于四個終點中的三個終點觀察到IT治療的個體與安慰劑治療的個體之間的反應的統(tǒng)計顯著差異。在研究IT-R-003A中，IT治療的個體通過評估者評估而評為反應者的百分比高于安慰劑治療的個體，但是差異并不滿足統(tǒng)計顯著性。使用相同研究方案同時進行研究IT-R-005和IT-R-006，因此在研究設計方面沒有差異。還在獨立的方案下同時進行研究IT-R-003A和IT-R-003B。盡管如此，在每個研究組內(nèi)結果仍有差異。在005/006研究中成功地滿足所有初級終點，但是其中005研究報導了在成纖維細胞懸浮液治療組中的反應者比率對于個體和評估者評估分別為57%和33%，006研究報導了反應者比率對于相同量度為46%和19%。在003A研究中，在評估者評估中IT治療組中21%的個體被評為反應者,而在成纖維細胞劑量調(diào)配物組中48%的個體根據(jù)此量度在研究IT-R-003B中有反應。在005/006研究中，在兩個試驗之間的患者人口統(tǒng)計(性別、種族、年齡或基線嚴重程度)方面沒有顯著差異。然而，在每個研究內(nèi)在部位之間觀察到反應率的可變性。隨后，對參與的所有研究者進行培訓以使用相同技術進行鼻唇溝注射，且期望證明他們可以產(chǎn)生如對于注射到乳頭狀真皮中所期望產(chǎn)生的“水皰”。此在IT-R-003試驗之前不進行。還觀察到評估方法的差異。部位差異當與這些觀察結果相結合時得出結論部位之間的許多不一致性可能由于在注射技術與評估方面都缺乏普通培訓而引起。在回顧并分析來自003A/B研究的資料之后設計005/006研究。作為此回顧的結果，與003A/B研究相比作出許多修改以設計005/006方案。表6中提供可能促成觀察到的初級終點結果的差異的修改的概述。劑量和給藥方案的影響面部皺皮和鼻唇溝用于治療鼻唇溝的所選劑量(至多2mL的I. 0-2. O X IO7個細胞/毫升，每線性厘米長度投予O. ImL)不但基于在IND 8641下進行的臨床試驗中產(chǎn)生的資料，而且基于在美國和國外通過商業(yè)上使用成纖維細胞劑量調(diào)配物所獲得的信息。研究IT-R-OOl為安慰劑對照的II期劑量范圍研究，其評估O. 5、I. O以及2. OX IO7個細胞/毫升的成纖維細胞懸浮液(每線性厘米長度O. ImL)相對于安慰劑在治療面部皺皮中的安全性和初步功效。在最高劑量組(2. OX IO7個細胞/毫升)中，基線到初始注射之后四個月(研究IT-R-001的初級功效時間點)得到最佳結果。因此，此為所有后續(xù)研究中所用的細胞密度。在003A/B研究中，每線性厘米長度的劑量與針對此適應癥的其他azficel-T成纖維細胞劑量調(diào)配物研究中所用的劑量相同(每線性厘米長度O. lmL)。然而，每個治療的總劑量在總共IOcm的總治療區(qū)域上被限制為lmL。此差異是因為研究003A/B不可用于治療有時稱為近中唇溝皺紋的皺紋，其為從嘴角朝下巴向下延伸的溝或皺紋。在005/006中將總劑量增加到2mL，以允許治療近中唇溝皺紋，因為它常常與鼻唇溝皺紋相連并且因此為促成整體審美效果的組分。雖然所允許的總劑量并不是003A/B方案與005/006方案之間的唯一差異，但是所投予的產(chǎn)品體積的此增加被視為從005/006研究獲得的成功結果的促成因素?！せ谘芯空邚?03A/B研究提供的反饋以及005/006試驗的結果來確定5周±1周的推薦給藥時間間隔。003A/B研究者建議使用艾斯麗質(zhì)(Isolagen)，它在那些研究中的治療之間的時間(7到14天)不足以允許由一次注射誘發(fā)的發(fā)炎在施予下一次注射之前消退。此發(fā)炎持續(xù)時間只有在注射過程中才被注意到并且未被報導為不良事件。當在方案所允許的更長時間間隔下施予連續(xù)注射時，研究者報導注射部位更有可能似乎更接近于正常皮膚，此引起對注射深度和體積的更大控制。此使得在005/006研究中延長注射之間的時間間隔，首先延長到4周，接著延長到5周±1周。此變化也被視為成功的005/006研究結果的促成因素。在005/006研究中對意向治療群體(Intent to Treat Population)的初級功效分析評估成纖維細胞懸浮液與安慰劑治療組之間的治療反應，如聯(lián)合初級功效終點所度量。對于隨訪6時的評估者皺紋嚴重程度評估(聯(lián)合初級功效終點)，26%的IT隨機化個體相對于7%的安慰劑隨機化個體顯示兩側鼻唇溝皺紋有兩個點的改善。當只將實際上接受成纖維細胞劑量調(diào)配物或安慰劑的至少一次治療的那些個體納入到分析中(修正型意向治療(MITT)群體)時，在評估者皺紋嚴重程度評估上兩個點反應的百分比在IT治療的個體中為30%，相比之下安慰劑治療的個體為8%。在評估者皺紋嚴重程度評估上MITT群體中的一個點反應率在成纖維細胞劑量調(diào)配物治療的個體中為64%并且在安慰劑治療的個體中為36%。最后，在使用IT時所觀察的微秒的作用起始的示范中，由評估者和個體對功效進行的照相評估顯示在IT治療的個體與安慰劑治療的個體之間的治療反應中有高度統(tǒng)計顯著差異。當評估者將基線時獲取的個體照片與最后功效隨訪時獲取的照片并列比較時，MITT群體中57%的IT治療個體以及此群體中只有20%的安慰劑治療個體被評為有改善。在個體的照相評估(個體改善評估)上，當個體將其自身的基線照片與在最后功效隨訪時獲取的照片比較時，67%的IT治療個體以及26%的安慰劑治療個體顯示出改善。使用此評估手段所獲得的反應率相比于活動期評估結果有所增加，顯示微秒的、逐漸的作用起始，其在將外觀與基線比較之前可能不為個體或評估者所顯見?？傊?，出于上文所論述的原因，用于治療鼻唇溝皺紋的優(yōu)選劑量為在每個治療期將I到2mL的劑量調(diào)配物以每線性厘米長度O. ImL的劑量分布注射到皺紋的淺表乳頭狀真皮中，優(yōu)選持續(xù)三個治療期，隔開五周加減七到十天。用于治療多個面部區(qū)域(即“全面部”)中的皺皮的優(yōu)選劑量為在每個治療期將5到6mL的劑量調(diào)配物根據(jù)圖4中的治療圖以每線性厘米長度O. 05mL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中，優(yōu)選持續(xù)一個或兩個治療期，隔開五周加減七到十天。癉瘡瘢痕可使用經(jīng)過驗證的方法以及醫(yī)師客觀評估的痤瘡瘢痕嚴重程度的活 動期分級的量表，即“評估者活動期痤瘡瘢痕評估量表”來確定用于治療痤瘡瘢痕的適當劑量，所述量表采用在直接和切線照明下相對瘢痕外觀的比較性評估，參考圖2。表I.評估者活動期痤瘡瘢痕評估量表
等級術語___
0透明在治療區(qū)域中未見凹陷?？梢婞S斑部變色。
在直接照明下可容易地注意到單個凹陷(深)。
1極輕微所見的大多數(shù)或所有凹陷只有在切線照明下
Γ 才顯而易見(淺)。---
在直接照明不可容易地注意到極少到數(shù)個、但
2輕度少于一半的所有凹陷(深所見的大多數(shù)凹 __陷只有在切線照明下才顯而易見(淺)。
3中度多于一半的凹陷在直接照明下顯見(深)。
—4 I 重度 I在直接照明下可見所有或兒乎所有傷痕(深)。由林頓(Layton)等人在利茲總醫(yī)院(Leeds General Inf irmary)進行的研究中，通過萎縮性和肥厚性/瘢痕瘤性瘢痕的傷痕計數(shù)來評估痤瘡瘢痕的嚴重程度。萎縮性瘢痕-形態(tài)上定義為黃斑部萎縮性或濾泡性黃斑部萎縮性冰錐狀物-轉化為I到6范圍內(nèi)的評分，分別代表1-5個、6-10個、11-25個、26-50個、51-100個以及多于100個瘢痕。冰錐狀瘢痕描述為具有不規(guī)則邊沿、鋸齒狀邊緣以及尖銳邊界的瘢痕，其陡峭的側邊通向纖維性基底。黃斑部萎縮性瘢痕為柔軟而可擴大的，其中基底常常容易皺褶。濾泡性黃斑部萎縮性瘢痕描述為小的白色濾泡周丘疹或斑丘疹。作者因為瘢痕瘤性和肥厚性瘢痕較大程度的損形而各別地對其進行定量。2、4以及6的評分配置分別代表I到3個、4到7個或多于7個此類型瘢痕。瘢痕瘤性瘢痕描述為堅硬的并且延伸超出起始發(fā)炎性痤瘡傷痕的邊界的瘢痕,而肥厚性瘢痕定義為較少凸起并且適應初級痤瘡傷痕的區(qū)域。接著通過加上來自萎縮性和肥厚性種類的評分來獲得總瘢痕評分。此類總評分可各別地針對面部、胸部以及背部來計算以提供用于瘢痕評估的綜合系統(tǒng)，并且還提供用于評估有效劑量和治療方案的方式。在優(yōu)選實施例中，通過在每個治療期將2到12mL的成纖維細胞劑量調(diào)配物以每平方厘米瘢痕區(qū)O. ImL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中來治療痤瘡瘢痕，持續(xù)一到三個治療期，隔開十四天加減三天。_] 魅到達深層真皮的燒傷的潛在嚴重的長期后果為損傷后瘢痕。因嚴重燒傷而形成限制性瘢痕可能阻礙受影響區(qū)域的正?；顒硬⑶蚁拗苹顒臃秶?彎曲、內(nèi)收及/或伸展)。事實上，“影響功能的燒傷瘢痕和攣縮仍為燒傷最讓人沮喪的后期併發(fā)癥”(烏加烏(Iwuagwu)，整形和再造外科學(Plast Reconstr Surg. ) 1999 年 4 月;103 (4) : 1198-204)。這些瘢痕可通過引起疼痛以及功能性降低而對生活質(zhì)量有顯著的負面影響。視位置而定，限制性燒傷瘢痕可能引起上肢的顯著損傷以及功能喪失。成纖維細胞劑量調(diào)配物尤其適用于治療上肢的限制性燒傷瘢痕，具體來說降低個體所經(jīng)歷的損傷以及相關殘疾的程度。用于治療限制性燒傷瘢痕的優(yōu)選劑量為在每個治療期將I到IOmL的劑量調(diào)配物以每平方厘米瘢痕區(qū)O. 1-0. 5mL的劑量分布注射到經(jīng)過觸診的限制帶中，優(yōu)選地持續(xù)一到五次治療，隔開二到六周。來自英國的病例報告，其中可使用先前可用的成纖維細胞調(diào)配物，顯示成功用于 燒傷瘢痕和傷口而無不良作用。倫敦的克里斯·英格爾菲爾德博士(Dr. Chris Inglefield)報導了在頸部、下面部、眼睛和耳朵的部分有多處燒傷的男性的病例。所述個體先前已接受成纖維細胞調(diào)配物用于面部皺皮并且因此在他被燒傷之時存儲細胞。此使得他能夠在他初始受傷的六周內(nèi)接受面部燒傷治療。他在受傷之后三個月成功地接受三次額外治療。每次治療都在局部麻醉下進行并且包含通過30-40次注射所給予的3-4ml細胞。個體先前已用皮膚移植治療。所述個體在首次治療的三周內(nèi)報告他的面部和頸部的活動有所改善并且他的皮膚的肌理和柔韌性有所改善。印第安納大學的W.格雷戈里·切爾諾夫博士(Dr. W. GregoryChernoff)也已經(jīng)在十個難愈合性激光燒傷傷口中使用成纖維細胞調(diào)配物。盡管這些傷口在用成纖維細胞治療之前持續(xù)三到九個月未愈合，但是他注意到在最終注射細胞之后六周完全愈合(波斯(Boss)等人，2000 臨床整形外科學(Clinical Plastic Surgery) 27:613-626)。在美國，兩名燒傷受害者已經(jīng)從以贈送方式使用的成纖維細胞調(diào)配物中獲益，他們的難愈合性燒傷傷口有很大改善。奧克拉荷馬市爆炸案(Oklahoma City Bombing)的受害者悲慘地在爆炸中留下瘢痕。在持續(xù)數(shù)月的外科手術、激光重修表面以及其他治療以挽救她的生命并且改善她的外貌之后，用成纖維細胞對她進行治療以幫助已失敗的皮膚移植以及還留在她面部和頸部的其他難愈合性傷口。治療后，難愈合性傷口閉合并愈合。另外，她注意到她的瘢痕外觀有所改善。以贈送方式使用為基礎，用成纖維細胞調(diào)配物治療因激光燒傷而在前額和顴骨區(qū)上具有12個難愈合性傷口的另一名個體。她在被治療時的唯一替代物為牛皮移植物。在治療后，大多數(shù)傷口在注射六周內(nèi)愈合。以下病例報告表明成纖維細胞調(diào)配物可能不只是改善亞急性或愈合性燒傷傷口，而且還改善長久存在的已良好愈合但使人衰弱的限制性燒傷瘢痕。英國倫敦的克里斯 英格爾菲爾德博士(Dr. Chris Inglefield)報導了在呈遞之前兩年持續(xù)具有多處燒傷的一名女性的病例，導致較大的面部瘢痕，限制了她左側面部的表情。個體的損傷具有嚴重的負面心理后果并且她感覺到已經(jīng)“喪失了自我”。所述個體的面部接受三次治療，每次3mL。在六到八周內(nèi)，所述個體、她的家人以及治療醫(yī)師注意到顯著的改善，使得她的母親感覺到她的大女兒“回來了”。她面部活動的能力和皮膚肌理以及外觀一樣都有改善。同一個體接著在她的手部接受針對收縮性瘢痕以及難愈合性傷口的療法。在療法之前，個體在她的珠寶制作過程中難以操控小的物體。在治療之后的四周內(nèi)，傷口已愈合并且她執(zhí)行珠寶制作任務的能力改善。英國利茲的馬克 帕爾默博士(Dr. Mark Palmer)報導了針對頸部、肩部以及上臂上持續(xù)10年的長期傷口進行治療的另一名個體。在治療之前，個體的頸部和肩部的活動范圍嚴重受限并且她的長期疼痛需要每天用鴉片劑止痛。所述個體在她的頸部區(qū)域中接受總共兩次4mL治療。甚至在首次治療之后，個體便報告活動范圍以及皮膚肌理有所改善。通過第二次治療，個體的活動范圍接近正常并且注意到瘢痕外觀和肌理的驚人變化。同一個體隨后接受上臂瘢痕的治療。在治療之前，這些瘢痕已嚴重致殘，使得她由于疼痛而不能舉起她的手臂超過90°。在對兩個收縮性瘢痕帶進行單次治療(每個帶
I.5mL)之后截止到三個月，瘢痕已經(jīng)幾乎消失并且個體已恢復180°的活動范圍而沒有疼 痛。
權利要求
1.一種劑量調(diào)配物，其包含I. OX IO7到2. 7 X IO7個細胞/毫升，其中至少98%的所述細胞是自體人類成纖維細胞或其前驅體，其中至少85%為存活的；以及可選的低溫保存培養(yǎng)基。
2.如權利要求I所述的劑量調(diào)配物，其包含由伊斯科夫改良達爾伯克培養(yǎng)基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM)和 ProfreezeTM 加 7. 5% 二甲亞諷(DMSO)組成的低溫保存培養(yǎng)基。
3.如權利要求I所述的劑量調(diào)配物，其中98%或更多的所述細胞是成纖維細胞。
4.如權利要求I所述的劑量調(diào)配物，其包含1、2、3或6mL。
5.一種治療皮膚缺陷的方法，其包括在待治療的部位注射有效量的包含I. OX IO7到2. 7X IO7個細胞/毫升的劑量調(diào)配物,其中至少98%的所述細胞是自體人類成纖維細胞或其前驅體，其中至少85%為存活的，所述方法分兩次或三次治療進行，所述治療隔開四周或五周加減七到十天。
6.如權利要求5所述的方法，其用于治療皺皮、鼻唇和唇頰溝、口周紋、外眼角紋、眶周紋以及眉間紋。
7.如權利要求5所述的方法，其包括每線性厘米長度注射O.05到O. 5mL的所述劑量調(diào)配物。
8.如權利要求5所述的方法，其包括在每次治療中注射2到6mL。
9.如權利要求5所述的方法，其用于治療鼻唇溝皺紋，所述方法包括每個治療期投予I到2mL的所述劑量調(diào)配物，所述劑量調(diào)配物以每線性厘米長度O. ImL的劑量分布注射到所述皺紋的淺表乳頭狀真皮中，所述方法持續(xù)三個治療期，所述治療期隔開五周加減七到十天。
10.如權利要求5所述的方法，其用于治療多個面部區(qū)域中的皺皮，所述方法包括每個治療期將5到6mL以每線性厘米長度O. 05mL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中，所述方法持續(xù)一個或兩個治療期，所述治療期隔開五周加減七到十天。
11.如權利要求5所述的方法，其用于治療痤瘡瘢痕，所述方法包括每個治療期將2到12mL以每平方厘米瘢痕區(qū)O. ImL的劑量分布注射到淺表乳頭狀真皮中，所述方法持續(xù)一到三個治療期，所述治療期隔開十四天加減三天。
12.如權利要求5所述的方法，其用于治療限制性燒傷瘢痕，所述方法包括每個治療期將I至IOmL以每平方厘米瘢痕區(qū)O. 1-0. 5mL的劑量分布注射到所述燒傷瘢痕的經(jīng)過觸診的限制帶中，所述方法持續(xù)一到五次治療，所述治療隔開兩周到六周。
13.一種提供用于組織修復或再生的多能細胞的方法，其包括 提供包含I. OX IO7到2. 7 X IO7個細胞/毫升的劑量調(diào)配物，其中至少98%的所述細胞是自體人類成纖維細胞或其前驅體，其中至少85%為存活的；以及提供用于使所述細胞去分化的方式。
14.如權利要求13所述的方法,其中所述細胞是通過細胞編程、細胞融合或體細胞轉移而去分化的。
15.一種多能細胞調(diào)配物，它是通過使包含I. O X IO7到2. 7 X IO7個細胞/毫升的劑量調(diào)配物去分化而制備的，在所述劑量調(diào)配物中至少98%的所述細胞是自體人類成纖維細胞或其前驅體，其中至少85%為存活的。
全文摘要
劑量單位由自體細胞療法產(chǎn)品組成，所述產(chǎn)品由針對待治療的每個個體所生長的成纖維細胞構成。使用現(xiàn)行良好制造規(guī)范(CGMP)和標準組織培養(yǎng)程序從每個個體自身皮膚的活檢體生長的自體成纖維細胞的懸浮液在含有具有至少98%成纖維細胞純度以及至少85%成活力的低溫保存的成纖維細胞或其前驅體的小瓶中供應，用于以1.0-2.0×107個細胞/毫升的濃度投予1到6mL、優(yōu)選2mL的細胞。當注射到鼻唇溝皺紋(鼻側上延伸到嘴角的皺褶)中時，認為自體成纖維細胞會增加細胞外基質(zhì)組分(包括膠原蛋白)的合成，從而減輕這些皺紋的嚴重程度。已證實投藥劑量和時機對達成臨床上顯著的成果至關重要。
文檔編號A61K35/36GK102905711SQ201180023038
公開日2013年1月30日 申請日期2011年5月5日 優(yōu)先權日2010年5月7日
發(fā)明者約翰·馬斯洛斯基 申請人:法布羅賽爾科技公司