專利名稱：Sparc 血管生成結構域和使用方法
SPARC血管生成結構域和使用方法相關申請的交叉參考本專利申請要求2010年3月11日提交的美國臨時專利申請號61/313，050和2010年3月11日提交的61/313，047的權益，二者通過引用方式全文并入本文。
背景技術：
分泌的、酸性的、富含半胱氨酸的蛋白(SPARC)，也被稱作骨結合素(osteonectin)，是286個氨基酸的糖蛋白。SPARC具有針對多種配體的親和性，包括陽離子(例如Ca2+，Cu2+，Fe2+)，生長因子(例如血小板衍生的生長因子(PDGF)和血管內皮生長因子(VEGF))，細胞外基質(ECM)蛋白(例如膠原I-V和膠原IX，玻連蛋白和凝血酶敏感蛋白-1)，內皮細胞，血小板，白蛋白和羥磷灰石。SPARC的表達是發育調節的，并且主要在正常發育或響應于損傷而經歷重塑的組織中表達(見，例如Laneet a I.，FASEBJ.，8，163-173(1994))。在發育中的骨和牙齒中有高水平的SPARC蛋白表達。SPARC在數種攻擊性癌癥中上調，但是在大多數正常組織中不存在(Porter etal. , J. Histochem. Cytochem. , 43, 791 (1995)以及見下文)。在多種腫瘤(例如，膀胱、肝、卵巢、腎、腸和乳腺)中SPARC的表達被誘導。例如，在膀胱癌中，已經表明SPARC的表達與晚期癌相關。已經表明T2階段或更高階段的侵襲性膀胱腫瘤表達比Tl階段的膀胱腫瘤(或較低表面的腫瘤)更高水平的SPARC,并具有更差的預后(見,例如Yamanaka et al.，J.Urology, 166，2495-2499 (2001))。在腦膜瘤中，已經表明SPARC的表達僅與侵襲性腫瘤相關(見，例如 Rempel et al. , ClincalCancer Res.，5，237-241 (1999))。也已經在 74. 5% 的原位侵襲性乳腺癌損傷(見，例如 Bellahcene, et al. , Am. J. Pathol. , 146, 95-100 (1995))和54. 2% 的浸潤性乳腺導管癌(見，例如Kim et al.，J. Korean Med. Sci.，13，652-657(1998))中檢測到SPARC表達。也已經表明SPARC的表達與乳腺癌中的常見的微鈣化相關(見，例如Bellahcene et al.，見上文)，這說明SPARC的表達可能對于乳腺轉移酶對于骨的親和性起作用 ο 還已知 SPARC 結合白蛋白(見，例如 Schnitzer, J. Biol. Chem.，269，6072 (1994))。因此，利用SPARC在疾病中的作用、例如SPARC在一些癌癥中的作用的組合物和方法是需要的。特別地，利用SPARC的結構域特異性活性、例如SPARC羧基血管生成結構域的特異性活性的組合物和方法是需要的。
發明內容
本發明提供了分離的“SPARC血管生成結構域多肽”，所述多肽的用途，以及檢測和定量所述多肽的方法。此外，本發明提供了 “SPARC血管生成結構域多肽”的用途和檢測及定量包含該結構域的多肽的方法。本發明提供了使用治療法治療患有SPARC依賴性疾病的動物的方法，包括(a)定量所述動物的疾病位點處的SPARC血管生成結構域多肽的量，以及，任選地，定量包含SPARC血管生成結構域的全長SPARC的量；(b)在一個或多個患有相同的SPARC依賴性病況或疾病的、已知響應于所述治療法的其它動物的疾病位點處定量SPARC血管生成結構域多肽的量，以及，任選地，定量包含SPARC血管生成結構域的全長SPARC的量；(c)計算(b)中測定的SPARC血管生成結構域多肽的量的平均值，如果包括的話，計算(b)中測定的包含SPARC血管生成結構域的全長SPARC的量的平均值；(d)將(a)中測定的所述量與(c)中測定的所述平均值相比較；和(e)如果(a)中測定的所述量大于或等于(C)中測定的所述平均值，則施用所述治療法。"SPARC依賴性疾病”意思是需要一定水平的SPARC以維持疾病或病況的疾病或病況。“一個或多個患有SPARC依賴性病況或疾病的、已知響應于所述治療法的其它動物”意思是至少一個動物，但是也包括產生與(a)中的動物相比的統計上的顯著性的任何數目。存在于疾病位點生物活組織檢查材料中的SPARC血管生成結構域和SPARC血管生成結構域多肽可以通過本領域普通技術人員已知的任何適宜的方式來檢測和定量，包括例如，用于常規免疫組織化學和基于溶液的測定法(例如ELISA)的針對SPARC血管生成結構域的抗體和質譜法。“疾病位點”意思是疾病為活性的解剖位置。本發明提供了分離的多肽，其包含缺失SEQ ID NO: I的連續氨基酸的全長SPARC 多肽，和分離的、羧基截短的SPARC多肽，其為全長SPARC多肽的羧基末端的酶消化產物并且其保留不超過5%的SEQID NO: I的血管生成活性。本發明提供了治療動物中的腫瘤的方法，包括施用治療有效量的本文公開的缺乏血管生成活性的任意一種或多種SPARC多肽，包括例如，分離的、羧基截短的SPARC多肽，其為全長SPARC多肽的羧基末端的酶消化產物并且其保留不超過5%的SEQ ID NO: I的血管生成活性、特別是SEQ ID NO:2。本發明提供了預測患有SPARC依賴性疾病的動物對于治療法的陽性應答的方法，包括Ca)定量疾病位點處的SPARC血管生成結構域多肽和包含SPARC血管生成結構域的全長SPARC多肽的量；(b)將SPARC的所述量與患有SPARC依賴性疾病的、已知對該治療法有應答的動物中存在的SPARC的量進行比較；和(0)如果包含SEQ ID NO: I的多肽的量高于或低于閾值水平，則預測對于該治療法的陽性應答。本發明提供了治療患有SPARC依賴性病況或疾病的動物的方法，包括使用免疫有效量的(即引發免疫應答的量的)包含SPARC血管生成結構域多肽的免疫原接種所述動物。本發明提供了治療患有SPARC依賴性病況或疾病的動物的方法，包括向所述動物施用治療有效量的多肽，所述多肽結合SPARC血管生成結構域、抑制SPARC血管生成結構域的活性并在疾病位點處聚集。合適的SPARC血管生成結構域結合性肽包括，例如，其中多肽綴合于化療、放射或生物試劑。合適的SPARC血管生成結構域結合性多肽包括抗體和抗體片段。
圖I是顯示在PC3模型中與Abraxane和Sutent —起施用的外源SPARC的效果的數據的示意圖。圖2圖示了 HUVEC 3-D管形成測定法的結果，其表征了 SPARC的血管生成活性。圖3圖示了 SDS-PAGE測定法的結果，其中野生型SPARC與SPARC_d (2種C末端截短的SPARC蛋白的混合物)并排跑膠。圖4是獲自HUVEC 3_D管形成測定法的數據的示意圖，其表征了野生型SPARC和SPARC-d。
具體實施例方式人SPARC基因編碼303個氨基酸的SPARC蛋白(SEQ ID NO: I)。其主要翻譯產物是通過切割氨基末端信號序列而被加工的，產生SPARC的成熟形式即285個氨基酸的糖蛋白(統稱“全長SPARC”形式)。切割氨基末端信號序列之后，產生了 32-kD的分泌形式，其在SDS-PAGE上在43kD處遷移，這是因為糖基化的原因。結晶學數據表明SPARC蛋白具有3個模塊結構域。N末端結構域是酸性的并與鈣結合。中間的“卵泡抑素樣結構域”包含參與抑制血管生成和黏著斑形成的氨基酸以及(K)GHK血管生成肽。羧基末端“E-C結構域”包含參與高親和性鈣結合和抑制細胞擴展的氨基酸(Yan&Sage，J. Histochem.Cytochem. 7:1495—1505，1999)。令人驚奇的是，已經確定SPARC多肽的促血管生成活性位于成熟SPARC多肽的氨基酸233-286(SEQ ID NO: I)。以前，該活性被報道是位于SPARC的N末端區域(Sage H. AdvDent Res. 19959 (3Suppl) :5。由于SPARC的促細胞凋亡區域更靠近氨基末端,所以該發現提示缺失羧基末端血管生成結構域的SPARC多肽(例如SEQ ID NO: 2)對于SPARC依賴性疾病例如腫瘤可能比全長的成熟SPARC多肽更有活性。另外，雖然不希望被任何特定理論所限 制，但是，由于血管生成對于腫瘤生長是必需的，所以不含C末端血管生成結構域的SPARC(SEQ IDN0:2)可能與全長野生型SPARC競爭并在體內消除其促血管生成、促腫瘤活性。本發明提供了“SPARC血管生成結構域”的用途。如本文使用的該術語包括SEQ IDNO: I和相關的序列，例如這樣的實施方式其中SEQID NO: I具有至多5個保守性氨基酸變化、優選至多4個保守性氨基酸變化、更優選至多3個保守性氨基酸變化、更優選至多2個保守性氨基酸變化、更優選I個保守性氨基酸變化，并且其保留至少60%、優選至少50%、更優選至少40%、最優選至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。如本文使用的“SPARC血管生成結構域”也包括具有至多5個非保守性氨基酸變化、優選至多4個非保守性氨基酸變化、更優選至多3個非保守性氨基酸變化、更優選至多2個非保守性氨基酸變化、更優選I個非保守性氨基酸變化的SEQ ID NO: 1，并且其保留至少60%、優選至少50%、更優選至少40%、最優選至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。如本文使用的“SPARC血管生成結構域”也包括這樣的序列其與SEQ ID NO: I至少90%同一、優選與SEQ ID NO: I至少85%同一、更優選與SEQ ID NO: I至少80%同一、更優選與SEQ ID NO: I至少75%同一、更優選與SEQ ID NO: I至少70%同一，并且其保留至少60%、優選至少50%、更優選至少40%、最優選至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。百分率同一性是基于通過本領域普通技術人員已知的任意合適的計算機程序進行的比對，包括例如ClustalW, MAFFT或mAlign或如下文所討論。本發明提供了 SEQ ID NO: I的分離的多肽(“SPARC血管生成結構域多肽”)或SEQID N0:2的分離的多肽，其羧基和/或氨基末端具有至多另外的15個氨基酸，優選至多另外的12個氨基酸，更優選至多另外的10個氨基酸，更優選至多另外的8個氨基酸，更優選至多另外的5個氨基酸，更優選至多另外的4個氨基酸，更優選至多另外的3個氨基酸，更優選至多另外的2個氨基酸，最優選另外的I個氨基酸。相應地，本發明限定了 “SPARC血管生成結構域多肽”的大小，如該術語如本文中所使用的。本發明提供了分離的“SPARC血管生成結構域多肽”，包括例如，不具有或具有至多5個保守性氨基酸變化，優選至多4個保守性氨基酸變化、更優選至多3個保守性氨基酸變化、更優選至多2個保守性氨基酸變化、更優選I個保守性氨基酸變化的SEQ ID NO: I的多肽，并且其保留至少60%、優選至少50%、更優選至少40%、最優選至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本發明還提供了分離的“SPARC血管生成結構域多肽”，包括例如，不具有或具有至多5個非保守性氨基酸變化、優選至多4個非保守性氨基酸變化、更優選至多3個非保守性氨基酸變化、更優選至多2個非保守性氨基酸變化、更優選I個非保守性氨基酸變化的SEQID NO: I的多肽，并且其保留至少60%、優選至少50%、更優選至少40%、最優選至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本發明提供了分離的SPARC血管生成結構域多肽，包括例如這樣的多肽其與SEQID NO: I至少90%同一、優選與SEQ ID NO: I至少85%同一、更優選與SEQ ID NO: I至少80%同一、更優選與SEQ IDN0:1至少75%同一、更優選與SEQ ID NO: I至少70%同一，并且其保留至少60%、優選至少50%、更優選至少40%、最優選至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活 性。百分率同一性是基于通過本領域普通技術人員已知的任意合適的計算機程序進行的比對，包括例如ClustalW, MAFFT或mAlign或如下文所討論。本發明包括分離的多核苷酸，其包含編碼如本文描述的本發明的任一 SPARC多肽、包括SEQ ID NO: I和2和本文公開的它們的突變體的核酸序列，表達此類核酸序列的表達載體和包含此類多核苷酸的轉化的細胞。本發明提供了用于在需要血管生成的動物中刺激血管生成的方法，包括施用治療有效量的分離的SPARC血管生成結構域多肽，包括例如，編碼包含SEQ ID N0:1的序列的多肽的多核苷酸。本發明提供了用于治療和預防動物中的SPARC依賴性疾病的方法，包括施用治療有效量的編碼包含SEQ ID N0:2的序列的多肽的分離的多核苷酸。本發明提供了用于在需要血管生成的動物中刺激血管生成的方法，包括施用治療有效量的純化的分離的SPARC血管生成結構域多肽，包括例如，包含SEQ ID NO: I的序列的多肽或根據本發明和/或如本文描述的其突變體。相應地，本發明提供了治療病理性灌注不足、例如再狹窄、動脈硬化癥和邊緣低灌注以及治療缺血包括例如其中所述缺血是心肌缺血和中風的方法。本發明提供了缺失血管生成結構域的分離的SPARC多肽，包括例如，包含SEQ IDNO: 2的SPARC多肽，即缺失SEQ ID NO: I的連續氨基酸的成熟的SPARC多肽。本發明提供了分離的SPARC多肽，包括表位標簽化多肽，其為羧基截短的，即這樣的SPARC多肽，其為全長SPARC多肽的羧基末端的酶消化產物，并且保留不超過5%的SEQID NO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。羧基消化可通過任何適當的方法進行，包括酶促和化學消化。例如，本領域普通技術人員能常規地采用絲氨酸羧基肽酶、溶酶體Pro-X羧基肽酶、羧基肽酶C、羧基肽酶D、半胱氨酸型羧基肽酶、金屬外肽酶等用于該目的。見例如，Nakazawa T et al. Terminalproteomics:N—andC—terminal analyses for high-fidelity identification ofproteins using MS.，Proteomics. 2008Feb; 8 (4) : 673-85，該文獻通過引用方式并入本文。本發明提供了 SEQ ID NO:2的分離的多肽，其具有至多5個保守性氨基酸變化、優選至多4個保守性氨基酸變化、更優選至多3個保守性氨基酸變化、更優選至多2個保守性氨基酸變化、更優選I個保守性氨基酸變化，并且其保留不超過5%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本發明還提供了 SEQ ID NO:2的分離的多肽，其具有至多5個非保守性氨基酸變化、優選至多4個非保守性氨基酸變化、更優選至多3個非保守性氨基 酸變化、更優選至多2個非保守性氨基酸變化、更優選I個非保守性氨基酸變化，并且其保留不超過5%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本發明提供了分離的多肽，其與SEQ ID NO:2至少90%同一、優選與SEQ ID NO:2至少85%同一、更優選與SEQ ID NO: 2至少80%同一、更優選與SEQ ID NO: 2至少75%同一、更優選與SEQ ID NO: 2至少70%同一，并且其保留不超過5%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。百分率同一性是基于通過本領域普通技術人員已知的任意合適的計算機程序進行的比對，包括例如ClustalW, MAFFT或mAlign或如下文所討論。本發明提供了治療動物中的腫瘤的方法，包括施用治療有效量的具有至多5個保守性氨基酸變化、優選至多4個保守性氨基酸變化、更優選至多3個保守性氨基酸變化、更優選至多2個保守性氨基酸變化、更優選I個保守性氨基酸變化、并且保留不超過5%的SEQID NO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一種或多種SEQ ID N0:2的分離的多肽。本發明提供了治療動物中的腫瘤的方法，包括施用治療有效量的具有至多5個非保守性氨基酸變化、優選至多4個非保守性氨基酸變化、更優選至多3個非保守性氨基酸變化、更優選至多2個非保守性氨基酸變化、更優選I個非保守性氨基酸變化、并且保留不超過5%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一種或多種SEQ ID NO:2的分離的多肽。本發明提供了致敏動物中的腫瘤的方法，包括施用治療有效量的具有至多5個保守性氨基酸變化、優選至多4個保守性氨基酸變化、更優選至多3個保守性氨基酸變化、更優選至多2個保守性氨基酸變化、更優選I個保守性氨基酸變化、并且保留不超過5%的SEQID NO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一種或多種SEQ ID NO:2的分離的多肽和非SPARC治療法。本發明提供了致敏動物中的腫瘤的方法，包括施用治療有效量的具有至多5個非保守性氨基酸變化、優選至多4個非保守性氨基酸變化、更優選至多3個非保守性氨基酸變化、更優選至多2個非保守性氨基酸變化、更優選I個非保守性氨基酸變化、并且保留不超過5%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，優選不超過3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最優選不超過1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一種或多種SEQ ID NO:2的分離的多肽和非SPARC治療法。如本文使用的“SPARC依賴性”疾病是指這樣的疾病或病況，例如，需要足夠量的野生型SPARC以維持其病理過程的疾病。如本文使用的“抗-SPARC治療法”是指包括減小SPARC的活性或靶向SPARC以滅活它的分子的治療法。例如，抗SPARC治療法可以是結合SPARC的分子，其將活性試劑遞送至腫瘤或其它疾病的位點，可以是針對SPARC的抗體。SPARC依賴性疾病和病況包括例如，腫瘤、關節病、腎小球腎炎、膽管炎、逾常型傷Π愈合、重塑或血管生成。本發明還提供了使用治療有效量的如本文描述的任一種或多種SEQ ID N0:2的分離的多肽或其突變體來治療或致敏除了腫瘤或癌癥以外的增殖性疾病的方法。適合治療的增殖性疾病包括肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩、增殖性糖尿病性視網膜病、類風濕性關節炎、動靜脈畸形、粥樣硬化斑塊、延遲的傷口愈合、出血性關節、骨折不愈合、OsIer-Weber綜合征、牛皮癬、膿性肉芽腫、硬皮病、沙眼、月經過多、血管粘連和再狹窄。
本發明提供了治療或致敏動物中的腫瘤中的方法，其中所述腫瘤選自口腔腫瘤、咽腫瘤、消化系統腫瘤、呼吸系統腫瘤、骨腫瘤、軟骨腫瘤、骨轉移、肉瘤、皮膚腫瘤、黑素瘤、乳腺腫瘤、生殖系統腫瘤、尿道腫瘤、眶瘤、腦和中樞神經系統腫瘤、神經膠質瘤、內分泌系統腫瘤、甲狀腺腫瘤、食管腫瘤、胃腫瘤、小腸腫瘤、結腸腫瘤、直腸腫瘤、肛門腫瘤、肝腫瘤、膽囊腫瘤、胰腺腫瘤、喉腫瘤、肺的腫瘤、支氣管腫瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸腫瘤、子宮體腫瘤、卵巢腫瘤、外陰腫瘤、陰道腫瘤、前列腺腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、陰莖腫瘤、膀胱腫瘤、腎的腫瘤、腎盂的腫瘤、輸尿管的腫瘤、頭頸腫瘤、副甲狀腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病。本發明提供了致敏動物中的腫瘤的方法，其中非SPARC治療法是下列一種或多種化療、放射或生物學方案，包括例如，其中非SPARC治療法包括下列一種或多種多西紫杉醇、紫杉醇、紫杉烷、鉬化合物、抗葉酸劑、抗代謝劑、抗有絲分裂劑、DNA損傷劑、促細胞調亡劑、分化誘導劑、抗血管生成劑、抗生素、激素、肽、抗體及其組合。本發明提供了鑒定血管生成抑制劑的方法，包括(a)向血管生成模型系統施用有效量的任一種SEQ ID NO: I或其突變體的組合物；(b)向血管生成模型系統單獨同時施用候選血管生成抑制劑和權利要求1-4任一項的組合物；(C)定量(a)和(b)中產生的血管生成的量；和((1)如果(b)中相對于(a)中的血管生成減少，則鑒定所述候選血管生成抑制劑是真實的血管生成抑制劑。任何合適的血管生成模型系統都可用于本發明，包括例如，其中所述血管生成模型系統是HUVEC管形成測定法。如本文使用的“藥物”是能夠產生效應的、可以向患者或測試受試者施用的組合物。所述效應可以是化學的、生物的或物理的，所述患者或測試受試者可以是人、或非人動物，例如嚙齒類或轉基因小鼠。所述組合物可以包括具有不同的分子組成的、合成制備的、天然發現的、或部分合成來源的小的有機或無機分子。該類別中包括核苷酸、核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白、肽核酸或包含至少一種這些物質的復合物。藥物可以包含單獨的有效成分或與藥學上可接受的賦形劑組合的有效成分。如本文使用的“藥學上可接受的賦形劑”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、涂覆劑、抗細菌劑、抗微生物劑或抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑等。賦形劑可適用于靜脈內、腹膜內、肌肉內、鞘內或經口施用。賦形劑可以包括無菌水溶液或分散液，用于無菌可注射溶液或分散液的即時制備。用于制備藥物的此類介質的使用是本領域已知的。如本文使用的“藥理學有效量”或“有效量”的藥物是指使用以這樣的濃度存在的藥物的量所述濃度在所述藥物被使用的期間產生治療水平的藥物遞送。這可依賴于遞送模式、劑量的時間階段、接受藥物的受試者的年齡、體重、一般健康、性別和食譜。確定何種劑量是“藥理學有效量”需要常規優化，這是本領域普通技術人員能力內的。如本文使用的術語“癌癥”或“腫瘤”是指由喪失了對于正常生長控制的敏感性的細胞的增殖引起或特征在于喪失了對于正常生長控制的敏感性的細胞的增殖的增殖性病癥。如本申請中使用的術語“癌癥”包括腫瘤和任何其它增殖性病癥。相同組織類型的癌癥通常起源于相同的組織，并且可基于它們的生物學特征被分為不同的亞型。癌癥的4種一般類別為癌(上皮組織衍生的)、肉瘤(結締組織或中胚層衍生的)、白血病(形成血液的組織衍生的)和淋巴瘤(淋巴組織衍生的)。已知有超過200種不同類型的癌癥，可影響身體的每種器官和組織。不限定癌癥的定義的癌癥的具體類型包括黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、淋巴瘤、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞性 白血病。可被多種癌癥影響的器官和組織的實例包括胰腺、乳腺、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、前列腺、甲狀腺、垂體、腎上腺、腎、胃、食道、結腸或直腸、頭和頸、骨、神經系統、皮膚、血液、鼻咽組織、肺、尿道、子宮頸、陰道、外分泌腺和內分泌腺。或者，癌癥可以是多中心的或原發部位不明癌(CUPS)。如本文使用的“癌性細胞“是指已經經歷了轉化事件并且其生長調節程度不再如所述轉化事件之前那樣的細胞。腫瘤是指癌性細胞的集合，通常被發現為患者或測試受試者的組織中或組織上的固體或半固體團塊。具有病理性灌注不足的疾病或病況可根據本發明來治療，其中將有效量的一種或多種包含SEQ ID N0:1的多肽施用至動物，例如人。適合根據本發明來治療的灌注不足疾病或病況包括心肌缺血、心肌梗塞、糖尿病、神經病、ALS、口腔潰瘍、胃潰瘍、再狹窄、中風、TIA、先兆子癇等(關于另外的合適的疾病和病況,也參見Carmeliet, Angiogenesis inhealth and disease, Nature Medicine 9，653-660 (2003),通過引用方式并入本文)。具有逾常型血管生成的疾病、特別是SPARC依賴性的疾病可根據本發明來治療，其中將有效量的例如一種或多種靶向SPARC血管生成結構域的抗體或其它抗SPARC治療法施用至動物，例如人。適合根據本發明治療的具有逾常型血管生成的疾病包括癌癥、腫瘤、血管瘤、子宮內膜異位癥、糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、牛皮癬、關節炎、膿性肉芽腫、血管免疫母細胞淋巴結病、牙周病等(關于另外的合適的疾病和病況，也參見Carmeliet, Angiogenesis in health and disease, Nature Medicine 9,653-660(2003),通過引用方式并入本文)。具有逾常型傷口愈合和重塑的疾病、特別是SPARC依賴性的疾病可根據本發明來治療，其中將有效量的一種或多種靶向SPARC血管生成結構域的抗體或其它抗SPARC治療法施用至動物，例如人。適合根據本發明治療的具有逾常型傷口愈合和重塑的疾病包括疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、肺纖維化等(關于另外的合適的疾病和病況，也參見Carmeliet, Angiogenesis in health and disease, Nature Medicine 9,653-660(2003),通過引用方式并入本文)。
基于治療方案殺死癌細胞或減小腫瘤體積、減小總體癌癥生長(即通過減少血管生成)和/或抑制轉移的能力，可將癌細胞或癌性細胞描述為對于給定的治療方案或化療劑“敏感”或“抗性”。對于治療方案抗性的癌細胞可能不對該方案產生應答，并且可能持續增殖。對于治療方案敏感的癌細胞對于該方案可產生應答，引起細胞死亡、腫瘤體積減小、減小的總體生長(腫瘤負荷)或轉移的抑制。例如，這理想地表現為腫瘤尺寸、總體生長/腫瘤負荷或轉移發生率減小大約10%或更高，例如大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70%、大約80%、或更高，至大約2倍、大約3倍、大約4倍、大約5倍、大約10倍、大約15倍、大約20倍或更高。應答的監視可通過多種病理學、臨床和成像方法進行，如本文所描述和本領域技術人員已知。化療劑或試劑組合的共同主題是誘導癌性細胞的死亡。例如，DNA加合物例如亞硝基脲、白消安、噻替派、苯丁酸氮芥、順鉬、絲裂霉素、丙卡巴肼或達卡巴嗪通過迫使正在進行復制的細胞在細胞周期的M期之前修復受損的DNA來減緩癌細胞的生長，或者其本身可引起足夠的損傷以激發癌細胞的細胞調亡。也可通過臨床醫生可獲得的化療劑的多種集合來干擾其它事件，例如基因表達或轉錄，蛋白質翻譯，或復制的DNA的甲基化，并輔助激發癌細胞內的細胞調亡過程。或者，化療劑可使癌性細胞通過患者或測試受試者的體液或 獲得性免疫系統例如補體級聯或淋巴細胞攻擊而被殺死。不希望被任何特定理論限定，對于化療劑或試劑組合有抗性的癌性細胞可通過主動將藥物運輸出細胞之外而為其生存斗爭，例如通過過表達ABC轉運子MDRl P-糖蛋白(FORD et al 1993. Cytotechnol. 12:171-212)或獲得“相反突變”以對抗藥物。例如，影響檢測對于細胞DNA的損傷的能力的DNA修復酶中的突變可使受損傷的DNA復制并允許癌性細胞持續復制，使腫瘤擴大。隨著突變的累積，其它的將在正常細胞周期中發揮作用的調節點將停止發揮功能，非調控生長周期啟動級聯。化療抗性的另一個方面涉及腫瘤細胞避開細胞調亡。宿主生物對于失調的細胞生長的正常應答是在進入不受控復制的級聯開始之前啟動細胞調亡和消除缺陷細胞。然而，這可被癌性細胞破壞，例如，通過癌性細胞中破壞信號轉導事件，喪失黏附依賴性或接觸抑制，或喪失通常被認為是“腫瘤抑制劑”的促調亡因子,例如，p53、BRCAl或RB。對于細胞調亡的這種敏感性在癌癥治療中的重要性得到最近的證據的支持，其表明對于過去僅通過藥物被治愈的相對少數腫瘤的化療的選擇性很大程度上依賴于它們對于進行細胞調亡的容易的易感性(Johnstoneet al.，2002.Cell. 108(2) : 153-64)。如本文使用的“治療方案”或“治療法”是指施用對于癌性細胞有害的至少一種試齊U。用于本發明的合適的治療方案包括但不限于“化療方案”、“放療方案”、“另類治療方案(alternative therapeutic regimen)，，及其組合。如本文使用的“化療方案”或“化療法”是指施用有害的至少一種化療劑以破壞癌性細胞。對于臨床醫生而言有多種此類化療試劑。可向受試者施用單一大劑量的化療試劑或可以以較小劑量在一段時間內施用。可使用單一的化療劑(單試劑治療)或多種試劑可組合使用(組合治療)。可單獨使用化療以治療一些類型的癌癥。或者，化療可以與其它類型的治療例如放療或另類治療(例如免疫治療)組合，如本文所描述。另外，可以施用化學致敏劑，作為與化療劑的組合治療。如本文使用的“化療劑”是指可用于治療癌癥的藥物，一般具有直接殺死癌性細胞的能力。化療劑的實例包括烷基化試劑、抗代謝劑、天然產物、激素和拮抗劑和雜類試齊U。在括號中標注了別名的例子。烷基化試劑的實例包括氮芥類例如氮芥、環磷酰胺、異環磷酰胺、美法侖(L-沙可來新)和苯丁酸氮芥；乙烯亞胺和甲基三聚氰胺例如六甲基三聚氰胺和噻替派；烷基磺酸鹽類，例如白消安；亞硝基脲類，例如卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、洛莫司汀(CCNU)和鏈脲菌素(streptozotocin) ;DNA合成拮抗劑，例如磷酸雌二醇氮芥；和三嗪，例如達卡巴嗪(DTIC、二甲基-三氮烯咪唑甲酰胺)和替莫唑胺。抗代謝劑的實例包括葉酸類似物例如甲氨蝶呤(amethopterin);喃唳類似物,例如flu0r0uracin(5-氟尿苷、5-FU、5FU)、氟尿苷(氟脫氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿糖核苷)和吉西他濱；嘌呤類似物例如巰基嘌呤(6-巰嘌呤、6-MP)、硫代鳥嘌呤(6-硫鳥嘌呤、TG)和噴司他丁(2’ -脫氧助間型霉素、脫氧助間型霉素)、克拉屈濱和氟達拉濱；和拓撲異構酶抑制劑，例如安吖啶。天然產物的實例包括長春花生物堿例如長春花堿(VLB)和長春新堿；紫杉烷例如紫杉醇和多西紫杉醇(Taxotere);表鬼白毒素，例如依托泊甙和替尼泊甙；喜樹堿例如托泊替坎和伊立替康；抗生素例如更生霉素(放線菌素D)、紅比霉素(道諾霉素、紅比霉素)、多柔比星、博來霉素、絲裂霉素(絲裂霉素C)、伊 達比星、表柔比星；酶類，例如L-天冬酰胺酶；和生物學反應調節劑，例如干擾素α和白細胞介素2。激素和拮抗劑的實例包括黃體釋放激素激動劑，例如布舍瑞林；腎上腺皮質類固醇例如潑尼松和相關制劑；孕激素類例如羥基孕酮己酸酯、甲羥孕酮乙酸酯和甲地孕酮乙酸酯；雌激素例如己烯雌酚和炔雌醇和相關制劑；雌激素拮抗劑例如他莫昔芬和阿那曲唑；雄激素例如丙酸睪酮和氟甲睪酮和相關制劑；雄激素拮抗劑例如氟他胺和比卡魯胺；和促性腺激素釋放激素類似物例如亮丙瑞林。雜類試劑的實例包括沙立度胺；鉬絡合物例如順鉬(cis-DDP)、奧沙利鉬和卡鉬；蒽二酮類例如米托蒽醌；取代的脲例如羥基脲；甲基肼衍生物例如甲基芐肼(N-甲基肼、MIH);腎上腺皮質抑制劑例如米托坦(o，p’_DDD)和氨魯米特；RXR激動劑例如貝沙羅汀和酪氨酸激酶抑制劑例如伊馬替尼。化療劑的這些和另外的實例的別名和商品名和它們的使用方法包括劑量和施用方案是本領域技術人員已知的，可見于本領域普通技術人員已知的任何合適的參考文獻。特別地，用于本發明的合適的化療試劑包括但不限于納米顆粒白蛋白結合性紫杉醇。如本文使用的術語“放療方案”或“放療”是指施用放射以殺死癌性細胞。放射與細胞內的多種分子相互作用，但是引起細胞死亡的主要靶標是脫氧核糖核酸(DNA)。然而，放療通常也導致對于細胞和核膜和其它細胞器的損傷。DNA損傷通常涉及糖-磷酸酯骨架中的單鏈和雙鏈的斷裂。此外，會有DNA和蛋白質的交聯，這會破壞細胞功能。取決于放射的類型，DNA損傷的機制可以變化，相對生物有效性也可變化。例如，重粒子(例如質子、中子)直接損傷DNA，并具有較大的相對生物有效性。電磁放射引起間接離子化，其通過主要由細胞水分的離子化產生的短壽的、羥基自由基而作用。臨床應用放射由外線束輻射(來自外部來源)和近距離放射療法(使用植入或插入患者中的放射源)組成。外線束輻射由X射線和/或Y射線組成，而近距離放射療法應用放射活性細胞核，其衰變并發射α粒子，或與Y射線一起的β粒子。放療還可用于組合化療，其中化療劑用作放射致敏劑。適合于個體患者的放療的特定選擇可由技術人員在即時看護時確定，其中考慮到癌癥的組織和階段。如本文使用的術語“另類治療方案”或“另類治療”可包括例如，生物反應調節劑(包括多肽、碳水化合物和脂質生物反應調節劑)、毒素、凝集素、抗血管生成劑、受體酪氨酸激酶抑制劑(例如Iressa (吉非替尼)、Tareeva (埃羅替尼)、Erbitiix (西妥昔單抗)、甲磺酸伊馬替尼(Gleevec )、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米、萬珂)；vegfr2抑制劑例如PTK787 (ZK222584)，Aurora激酶抑制劑(例如ZM447439);哺乳動物雷帕霉素靶標(mTOR)抑制劑、環加氧酶-2(C0X-2)抑制劑、雷帕霉素抑制劑(例如西羅莫司、Rapamune.TM.);法尼基轉移酶抑制劑(例如替匹法尼，Zarnestra);基質金屬蛋白酶抑制劑(例如BAY 12-9566 ;硫酸化多糖替可加蘭)；血管生成抑制劑(例如Avastin. TM.(貝伐單抗)；夫馬潔林類似物，例如TNP-4 ;羧基氨基三唑；BB-94和BB-2516 ;沙立度胺；白細胞介素_12 ；利諾胺；肽片段；和針對血管生長因子和血管生長因子受體的抗體)；血小板衍生的生長因子受體抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、有絲分裂原激活的激酶抑制劑、有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶抑制劑、勞斯肉瘤病毒轉化癌基因(SRC)抑制劑、組蛋白脫乙酰基酶抑制劑、小的低氧可誘導因子抑制劑、hedgehog抑制劑和TGF-β信號傳導抑制劑。此外，免疫治療試劑也將被認為是另類治療方案。實例包括趨化因子、化學趨向素、白細胞介素或組織因子。合適的免疫治療劑還包括包含預成抗體的血清或Y球蛋白；非特異性免疫刺激佐劑；主動特異性免疫治療；和過繼免疫療法。另外，另類治療可包括其它基于生物的化學物質，例 如多核苷酸，包括反義分子、多肽、抗體、基因治療載體等。此類另類治療可以單獨施用或與本文描述的其它治療方案組合。另類治療方案中使用的這些試劑的別名和商品名以及另類治療方案中使用的試劑的另外的例子以及它們的使用方法包括劑量和施用方案是本領域技術人員已知的。此外，組合治療中的另類治療方案中使用的化療劑和其它試劑的使用方法也是本領域技術人員已知的。具體地，合適的另類治療方案包括但不限于針對癌細胞表面上的分子的抗體，例如針對下列的抗體Her2 (例如曲妥珠單抗)、EGF或EGF受體、VEGF (例如貝伐單抗)或VEGF受體、CD20等。治療劑還可包括調節一種或多種補體激活、細胞介導的細胞毒性、誘導細胞調亡、誘導細胞死亡和調理素作用的任何抗體或抗體片段。例如，此類抗體片段可以是完整或部分Fe結構域。“抗體”意思是但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。抗體可以是鼠、人、人源化、嵌合或源自其它物種。抗體是由免疫系統產生的、能夠識別和結合特異性抗原的蛋白。靶抗原一般具有多個結合位點，也稱作表位，其被多個抗體上的CDR識別。特異性結合不同表位的每種抗體具有不同的結構。因此，一種抗原可以具有一種以上的對應抗體。抗體包括全長免疫免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特異性結合目標靶抗原或其部分的抗原結合位點的分子。靶標包括癌細胞或產生與自身免疫疾病相關的自身免疫抗體的其它細胞。本文公開的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何類別(例如，IgG, IgE, IgM, IgD 和 IgA)或亞類(例如 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 和 IgA2)。免疫球蛋白可以源自任何物種。“抗體片段”包括全長抗體的一部分，其保留期望的生物活性。“抗體片段”一般是抗原結合區或其可變區。抗體片段的實例包括Fab, Fab’，F(ab’ )2和Fv片段；diabody ;線性抗體；由Fab表達文庫產生的片段；抗-獨特型(抗-Id)抗體，⑶R (互補決定區)，和任意上述的表位結合片段，其免疫特異性地結合癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原；單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。本文所述的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種的抗體或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或同源，而鏈的其余部分與源自另一物種的抗體或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們顯示出期望的生物活性(U.S. Pat. No. 4，816，567)。本文的感興趣的嵌合抗體包括“靈長類源化”的抗體，其包含源自非人靈長類(例如舊世界猴或猿)的可變域抗原結合序列和人的恒定區序列。“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”是指細胞介導的相互作用，其中表達Fe受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，隨后引起靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fe Y RIII，而單核細胞表達Fe Y RI、Fc Y RII和Fe Y RIII。為了測定目標分子的 ADCC 活性，可以進行體外 ADCC 測定法(U. S. Pat. No. 5，003，621; U. S. Pat. No. 5，821，337)。用于此類測定法的有用的效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者，或另外，目標分子的ADCC活性可以在體內測定，例如，在動物模型中，例如在Clyneset al PNAS (USA), 95:652-656 (1998)中公開的那樣。“誘導細胞死亡”的抗體是引起活細胞變為死亡的抗體。細胞死亡可以在體外在不存在補體和免疫效應子細胞的情況下測定以區分由抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)誘導的細胞死亡。因此，用于細胞死亡的測定法可使用熱滅活血清進行(即在不存在補體的情況下)和在不存在免疫效應子細胞的情況下進行。為了測定抗體是否能夠誘導細胞死亡，可以測定相對于未經處理的細胞的膜完整性的喪失，如通過碘化丙啶(PI)、臺盼藍或7AAD的攝取來測定。誘導細胞死亡的抗體是在BT474細胞中的PI攝取測定法中誘導PI攝取的那些抗體。“誘導細胞調亡”的抗體是誘導程序化細胞死亡的抗體，如通過annexin V的結合、DNA的片段化、細胞皺縮、內質網膨脹、細胞片段化和/或膜囊泡(稱作細胞凋亡小體)的形成所測定。如本文使用的“化學致敏劑”或“致敏劑”是可增強化療劑、放療治療或另類治療方案的治療效應、并因此改善此類治療或試劑的功效的藥物。腫瘤或癌性細胞對于治療的敏感性或抗性也可在動物中測定，例如人或嚙齒類，通過例如測定腫瘤體積，腫瘤負荷或一段時間內的轉移發生率。例如，對于人為大約2、大約3、大約4或大約6個月，對于小鼠為大約2-4、大約3-5或大約4-6周。如果相對于不存在組合物或方法的情況下的治療敏感性或抗性，治療敏感性的增加或抗性的減小是大約10%或更高，例如大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70%、大約80%或更高，至大約2倍、大約3倍、大約4倍、大約5倍、大約10倍、大約15倍、大約20倍或更高，則此類組合物或治療方法可以使腫瘤或癌細胞對于治療性處理的應答敏感化。對于治療性處理的敏感性或抗性的測定是本領域常規的，是本領域技術人員的技能范圍內的。術語“肽”、“多肽”和“蛋白”可相互替換地使用，是指包含至少2個通過肽鍵或修飾的肽鍵例如可向肽提供另外的期望的性質(例如延長的半衰期)的肽等排物(修飾的肽鍵)共價連接的氨基酸殘基的化合物。肽可包含至少2個氨基酸。本文描述的包含氨基酸的肽或蛋白也可通過天然過程被修飾，例如翻譯后加工，或通過化學修飾技術，這是本領域熟知的。修飾可發生于肽中的任意地方，包括肽骨架，氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。應該理解，相同類型的修飾可以以相同或不同的程度在給定肽的數個位點存在。對于肽的修飾的實例可包括PEG化，乙酰化，酰基化，ADP核糖基化，酰胺化，共價連接黃素，共價連接血紅素部分，共價連接核苷酸或核苷酸衍生物，共價連接脂質或脂質衍生物，共價連接磷脂酰肌醇，交聯，環化，形成二硫鍵，去甲基化，形成共價交聯，形成胱氨酸，形成焦谷氨酸鹽，甲酰化，Y-羧基化，糖基化，GPI錨定形成，羥基化，碘化，甲基化，豆蘧酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊烯化，外消旋化，硒化，硫酸化，轉運RNA介導的向蛋白質添加氨基酸，例如精氨酰化和泛素化。見，例如，Proteins-Structure andMolecularProperties, 2. sup. nd ed. , T. E. Creighton, W H. Freeman and Company, NewYork,1993 和 Wold F, Posttranslational Protein Modifications!Perspectives andProspects, pgs. l_12in Posttranslational CovalentModification of Proteins, B.C.Johnson, ed. , Academic Press, New York, 1983;Seifter et al. , Analysis for proteinmodifications and nonproteincofactors, Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 和 Rattanet al. (1992), Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging, "Ann NYAcad Sci 663:48-62。實質上相似的序列是與參考序列相差僅一個或多個如本文討論的保守性替代的氨基酸序列。此類序列可以例如與另一實質上相似的序列在功能上是同源的。本領域技術人員將認識到，可被替代的本發明的肽中的單個氨基酸的方面。氨基酸序列相似性或同一性可通過例如使用BLASTP和TBLASTN程序來計算，其使用BLAST (基本局部比對搜索工具)2. O算法。用于計算氨基酸序列相似性或同一性的技術是本領域技術人員熟知的，BLAST算法的使用描述于Altschul et al. 1990，J Mol.Biol. 215:403-410and Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402。在其上進行比對的序列可以從多個數據庫收集。蛋白質數據庫的實例包括SWISS-PROT，其也提供與蛋白質的功能、其結構域結構、翻譯后修飾、變體相關的高水平注釋(Bairoch A. and Apweiler R. (2000)Nucleic Acids Res. 28(1):45-48;Bairoch A. andApweiler R. (1997) J. Mol. Med. 75 (5) : 312-316; Junker V. L. et al. (1999) Bioinformaticsl5(12) :1066-1007), TrEMBL a computer-annotated supplement ofSffISS-PROT thatcontains all the translations of EMBL nucleotidesequence entries(Bairoch A. andApweiler R. (2000) Nucleic Acids Res. 28 (I) : 45-48) ;nr 數據庫比較所有的非冗余GenBank Q)S翻譯和來自其它數據庫例如FOB、SwissProt、PIR和PRF的蛋白質序列。蛋白質序列的比對可以這樣進行使用已有的算法搜索數據庫中與查詢序列相似的序列。一種比對方法是 Smith-Waterman 算法(Smith, T. F. and Waterman, M. S. 1981.Journal of Molecular Biologyl47 (I) : 195-197),其用于確定如何產生查詢序列與數據庫序列之間的優化比對。此比對這樣獲得確定查詢序列需要經歷怎樣的轉化以匹配數據庫序列。轉化包括以一個字符替換另一個，和插入或刪除一串字符。對于每個字符-字符比較分配得分一對于精確匹配和某些替代為正分，對于其它替代和插入/刪除為負分。從統計上衍生的評分矩陣獲得得分。產生最高得分的轉化的組合用于產生查詢序列與數據庫序列之間的比對。Needleman-Wunsch(Needleman, S. B. and ffunsch, C. D. 1970. Journal ofMolecular Biology 48 (3) : 443-453)算法類似于 Smith-Waterman 算法,但是序列比較是全局的而非局部的。全局比較迫使整個查詢序列針對整個數據庫序列進行比對。雖然局部比對總是起始并終止于匹配，但是全局比對可以起始或終止于插入或刪除(indel)。對于給定的查詢序列和數據庫序列，全局得分將小于或等于局部得分，這是由于末尾有插入刪除。作為上述算法的備選，Hidden Markov Model (HMM)搜索(Eddy, S. R. 1996. CurrentOpinion in Structural Biology6 (3) : 361-365)可用于產生蛋白質序列比對。HMM評分加權了匹配后跟插入/刪除或反之的概率。另外，HMM允許插入至刪除的轉變(反之亦可)和起始和終止狀態的評分，以控制全局地還是局部地運行搜索。—種或多種上述算法可用于比對程序以產生蛋白質序列比對。本領域技術人員具有多種序列比對程序以從中挑選，其中引入了多種不同算法。比對程序的一個實例是BLASTP (Altschul, S. F. , et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402)。其它比對程序有CLUSTAL W和PILEUP。來自BLASTP運行的標準輸出包含足夠的信息以進行進一步 的插入刪除分析，如下文描述。氨基酸可被描述為例如極性、非極性、酸性、堿性、芳香族或中性。極性氨基酸是可與水通過氫鍵合在生物或接近中性的pH相互作用的氨基酸。氨基酸的極性是在生物或接近中性的pH時的氫鍵合的程度的指示。極性氨基酸的實例包括絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和谷氨酸。非極性氨基酸的實例包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。酸性氨基酸在中性PH時具有凈負電荷。酸性氨基酸的實例包括天冬氨酸和谷氨酸。堿性氨基酸在中性PH時具有凈正電荷。堿性氨基酸的實例包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。芳香族氨基酸一般是非極性的，并且可以參與疏水相互作用。芳香族氨基酸的實例包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酪氨酸也可通過芳香側鏈上的羥基參與氫鍵合。中性、脂肪族氨基酸一般是非極性的和疏水性的。中性氨基酸的實例包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸。氨基酸可通過不止一種描述類別來描述。具有共同的描述類別的氨基酸可在肽中彼此替代。用于描述本發明的肽化合物的命名法沿用常規實踐，其中氨基在每個氨基酸殘基的左側，羧基在右側。在代表本發明的所選的具體實施方式
的序列中，雖然不具體顯示，但氨基和羧基末端基團理解為在生理PH值時假定的形式，除非另有指明。在氨基酸結構式中，每個殘基一般由單字符或三字符表示，對應于該氨基酸的通用名。氨基酸的親水指數(hydropathy index)是表示氨基酸找出水性環境(負值)或疏水環境(正值)的傾向的一個度量(Kyte&Doolittle 1982. JMol Biol 157:105-132)。標準氨基酸的親水指數包括丙氨酸(I. 8)、精氨酸(-4. 5)、天冬酰胺(-3. 5)、天冬氨酸(-3. 5)、半胱氨酸(2. 5)、谷氨酰胺(-3. 5)、谷氨酸(-3. 5)、甘氨酸(-0. 4)、組氨酸(-3. 2)、異亮氨酸(4. 5)、亮氨酸(3. 8)、賴氨酸(-3. 9)、甲硫氨酸(I. 9)、苯丙氨酸(2. 8)、脯氨酸(-1. 6)、絲氨酸(-0. 8)、蘇氨酸(-0. 7)、色氨酸(-0. 9)、酪氨酸(-1. 3)和纈氨酸(4. 2)。具有相似親水指數的氨基酸可在肽中相互替代。包含氨基酸的本文描述的肽應被理解為L或D構型。在本發明的肽和擬態中，D氨基酸可替代L氨基酸。本發明的肽中包含的氨基酸尤其是羧基或氨基末端的氨基酸可通過甲基化、酰胺化、乙酰化或以其它化學基團進行取代來進行修飾，這可改變肽的循環半衰期而不對它們的生物學活性造成不利影響。另外，在本發明的肽中可存在或不存在二硫鍵。自然界中可存在非標準氨基酸，其可以是遺傳編碼的或不是遺傳編碼的。遺傳編碼的非標準氨基酸的實例包括硒代半胱氨酸，有時被摻入一些蛋白質中的UGA密碼子處，其通常可以是終止密碼子；或吡咯賴氨酸，有時被插入一些蛋白質中的UAG密碼子處，其通常可以是終止密碼子。不是遺傳編碼的一些非天然氨基酸可形成于已經摻入肽中的標準氨基酸的修飾，或者可以是例如代謝中間體或前體。非標準氨基酸的實例 包括4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、6-N-甲基賴氨酸、Y-羧基谷氨酸、鎖鏈素、硒代半胱氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、羊毛硫氨酸、I-氨基環丙烷-I-羧酸、Y -氨基丁酸、肉堿、肌氨酸或N-甲酰基甲硫氨酸。標準和非標準氨基酸的合成變體也是已知的，并且可包括化學衍生的氨基酸，被標記以進行鑒定或追蹤的氨基酸，或在α碳上具有多種側鏈的氨基酸。此類側鏈的實例是本領域已知的，并且可以包括脂肪族、單一芳香族、多環芳香族、雜環、異核、氨基、烷基氨基、羧基、甲酸胺、竣基酷、狐、脈、輕基、燒氧基、疏基、燒基疏基或其它含雜原子的側鏈。其它合成氨基酸可包括α-亞氨基酸、非α氨基酸，例如β氨基酸，脫羧基或脫氨基酸。氨基酸的合成變體可以使用本領域已知的一般方法來合成，或者可以從商業供應者購買，例如RSPAmino Acids LLC(Shirley, Mass.)。為了進一步說明保守性氨基酸替代的含義，以下列出了 A-F組。下列組中的一個成員被同組中的另一成員替代被認為是保守性替代。A組包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和具有下列側鏈的修飾的氨基酸乙基、異丁基、一CH2CH20H、一CH2CH2CH20H、--CH2CHoHCH3和 CH2SCH3OB組包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和具有乙基側鏈的修飾的氨基酸。C組包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、環己基甲基和具有取代的芐基或苯基側鏈的修飾的氨基酸。D組包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代或非取代的脂肪族、芳香族或芐酯(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、環己基、芐基或取代的芐基)、谷氨酰胺、天冬酰胺、CO-NH-烷基化谷氨酰胺或天冬酰胺(例如甲基、乙基、正丙基和異丙基)和具有側鏈一(CH2) 3C00H的修飾的氨基酸，及其酯(取代或非取代的脂肪族、芳香族或芐酯)，其酰胺，和其取代或非取代的N烷基化酰胺。E組包括組氨酸、賴氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、P-環精氨酸、g-羥基精氨酸、N-脒基瓜氨酸、2-氨基胍基丁酸、賴氨酸的同源物、精氨酸的同源物和鳥氨酸。F組包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和具有被一OH或一SH取代的C1-C5直鏈或支鏈烷基側鏈的修飾的氨基酸。A-F組是示例性的，不是意在限制本發明。擬肽是包含非肽結構元件的模擬母肽的生物作用的化合物。擬肽可以不具有經典的肽性質，例如酶可裂解的肽鍵。母肽可以最初被鑒定為目標蛋白質上的結合序列或磷酸化位點，或者可以是天然產生的肽，例如肽激素。當篩選文庫例如擬肽文庫時，用于鑒定擬肽的測定法可包括母肽作為陽性對照用于比較目的。擬肽文庫是可具有類似于母肽的生物活性的化合物的文庫。如本文使用的術語“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式和混合的聚合物，正義和反義鏈，可以是化學或生物化學修飾的，或可包含非天然或衍生的核苷酸堿基，如本領域技術人員容易地理解。此類修飾包括例如，標記、甲基化、使用類似物取代一個或多個天然產生的核苷酸，核苷酸間修飾，例如，不帶電的連接(例如膦酸酯甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)，帶電的連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、懸垂部分(例如多肽)和修飾的連接(例如α異頭多核苷酸等)。還包括模擬多核苷酸的結合指定序列(通過氫鍵合和其它化學相互作用)的能力的合成的分子。如本文使用的“肽核酸”(PNA)是指修飾的核酸，其中核酸的糖磷酸酯骨架已被轉化為N-(2-氨基乙基)_甘氨酸骨架。雖然DNA/RNA的糖-磷酸酯骨架在中性條件下經歷負電荷，會產生互補鏈之間的靜電排斥，但是PNA的骨架結構內在地不具有電荷。因此，沒有靜電排斥。因此，與常規核酸相比，PNA具有較高的穩定性以形成雙鍵， 并具有識別堿性序列的高能力。此外，PNA—般比核酸更強健。PNA也可用于陣列中和如上文就寡核苷酸描述的其它雜交或其它反應。如本文使用的術語“載體”是指用于將外源或內源多核苷酸導入宿主細胞的多核苷酸化合物。載體包含核苷酸序列，其可編碼一個或多個多肽分子。天然狀態或已經歷重組工程化的質粒、粘粒、病毒和噬菌體是通常使用的用于提供包含至少一個希望的分離的多核苷酸分子的重組載體的非限制性實例。如本文使用的“腫瘤抑制劑”是具有限制細胞的不受調控的生長的正常生物作用的基因或基因產物。如果腫瘤抑制劑的功能喪失，則發生不受調控的細胞生長。腫瘤抑制劑的功能對應物是癌基因——促進正常細胞生長的基因可被稱作“原癌基因”。激活此類基因或基因產物的突變進一步將其轉化為“癌基因”，其使細胞生長活性持續，但是為非調節控模式。腫瘤抑制劑基因和基因產物的實例是文獻中熟知的，可包括PTC，BRCA1, BRCA2, pi6，APC, RB, WTl, EXT I, p53, NFl, TSC2, NF2, VHL 或 SPARC。本發明還提供了核酸構建體，其包含控制元件和可操作地連接于控制元件(例如適當的啟動子)以表達本文描述的多肽的本文描述的核酸分子。蛋白表達依賴于RNA轉錄的水平，其繼而又受到DNA信號的調節。類似地，mRNA的翻譯至少需要AUG起始密碼子，其通常位于信使的5’末端的大約10至大約100個核苷酸內。已表明AUG起始密碼子側翼的序列影響其被真核核糖體的識別，與完美的Kozak共有序列一致，產生優化翻譯(見，例如Kozak, J. Molec. Biol. 196:947-950 (1987))。同樣，外源核酸在細胞中的成功表達可能需要所得到的蛋白的翻譯后修飾。因此，本發明提供了編碼多肽的質粒，其中載體是例如P⑶NA3. I或其衍生物。本文描述的核酸分子優選包含可操作地連接于合適的啟動子的編碼區，所述啟動子優選在真核細胞中有功能。病毒啟動子，例如但不限于，RSV啟動子和腺病毒主要晚期啟動子可用于本發明。合適的非病毒啟動子包括但不限于磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和延伸因子I α。非病毒啟動子理想地是人啟動子。另外的合適的遺傳元件(其中很多是本領域已知的)也可連接于、附著于或插入本發明的核酸和構建體以提供另外的功能、表達水平或表達模式。也可使用用于表達SPARC家族基因的天然啟動子，在這種情況下它們優選不用于天然編碼它們的染色體中，除非被實質上改變該染色體的過程修飾。此類實質上改變的染色體可包括被逆轉錄病毒載體或相似的過程轉染和改變的染色體。或者，此類實質上改變的染色體可包含人工染色體例如HAC、YAC或BAC。另外，本文描述的核酸分子可以可操作地連接于增強子以促進轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，其刺激鄰近基因的轉錄。賦予來自很多物種的多種不同細胞類型中的所連接的基因的高水平轉錄的增強子的實例包括但不限于來自SV40的增強子和RSV-LTR。此類增強子可以與具有細胞類型特異性效應的其它增強子組合，或者任何增強子可以單獨使用。為了優化多肽的產生，本發明的核酸分子可以進一步包含多腺苷酸化位點(在核酸分子的編碼區之后)。同樣，優選的是所有的正確轉錄信號(和翻譯信號，如果適當)將被正確的排列，使得外源核酸將在其所被導入的細胞中正確表達。如果需要，外源核酸也可引入剪接位點(即，剪接受體和剪接供體位點)以促進mRNA產生，同時維持框內、全長轉錄物。此外，本發明的核酸分子還可包含合適的序列用于加工、分泌、細胞內定位等。核酸分子可被插入任何合適的載體。合適的載體包括但不限于病毒載體。合適 的病毒載體包括但不限于逆轉錄病毒載體、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和禽痘病毒載體。載體優選具有天然或工程化的轉化真核細胞例如CHO-Kl細胞的能力。另外，用于本發明中的載體可以是“裸的”核酸載體(即，具有極少或不具有封裝它們的蛋白質、糖和/或脂質的載體)，例如質粒或游離體，或者載體可以與其它分子復合。可與本發明的核酸適當組合的其它分子包括但不限于病毒被膜、陽離子脂質、脂質體、聚胺、金顆粒和靶向部分，例如配體、受體或靶向細胞分子的抗體。根據本發明的SPARC多肽可以從重組宿主細胞表達并純化。重組宿主細胞可以是原核或真核的，包括但不限于細菌例如大腸桿菌，真菌細胞例如酵母，昆蟲細胞包括但不限于果蠅和蠶衍生的細胞系，和哺乳動物細胞和細胞系。當根據本發明在細胞例如人類細胞中表達SPARC多肽時(無論在體外或在體內)，選擇的用于編碼Q3SPARC的多核苷酸的密碼子可以針對給定的細胞類型(即物種)進行優化。用于密碼子優化的很多技術是本領域已知的(見，例如 Jayaraj et al, Nucleic AcidsRes. 33 (9) : 3011-6 (2005) ; Fuglsang et al. , Protein Expr. Purif. 31(2):247-9(2003);ffu et al.，"The Synthetic GeneDesigner:a FlexibleWeb Platform to Explore Sequence Space of Synthetic GenesforHeterologous Expression, 〃csbw，2005IEEE Computational SystemsBioinformaticsConference—Workshops (CSBWi 05)，pp. 258-259 (2005))。在一些實施方式中，當表達和純化SPARC多肽時，使用用于改善蛋白質穩定性的技術以防止形成包涵體(其為不可溶級份)，因此獲得大量的多肽。積累于包涵體內的SPARC通常是無活性類型的SPARC，不保留其生理活性。純化的SPARC多肽的溶解性可通過本領域已知的方法來改進。例如，也可通過表達功能片段而非全長多肽來改善溶解性。另外，為了增大表達的蛋白的溶解性(例如在大腸桿菌中)，可以通過降低生長溫度、使用較弱的啟動子、使用較低拷貝數的質粒、降低誘導子濃度、改變生長培養基等來降低蛋白合成速率，如Georgiou&Valax (CurrentOpinionBiotechnol. 7:190-197(1996))中所描述。這降低了蛋白合成速率，通常會獲得更可溶的蛋白。也可添加對于蛋白的正確折疊或穩定性必不可少的輔基或輔因子，或添加緩沖劑以控制生長過程中的培養基中的PH波動，或添加1%的葡萄糖以抑制乳糖(其存在于多數富集培養基例如LB、2xYT中)對Iac啟動子的誘導。也可向培養基中添加多元醇(例如山梨醇)和蔗糖，因為這些添加物引起的滲透壓的升高導致滲透保護劑在細胞中的積累，其使天然蛋白結構穩定化。可以添加乙醇、低分子量的三元醇和二硫化物和NaCl。另外，分子伴侶和/或折疊酶可以與所需的多肽一起表達。分子伴侶通過與折疊中間體的短暫相互作用促進正確的異構化和細胞靶向。大腸桿菌分子伴侶系統包括但不限于=Gr0ES-Gr0EUDnaK-DnaJ-GrpE、CIpB。折疊酶加速速率限制步驟和折疊途徑。有3種類型的折疊酶發揮重要作用肽基脯氨酰順式/反式異構酶(ΡΡΓ S)、二硫化物氧化還原酶(DsbA)和二硫化物異構酶(DsbC)、蛋白質二硫化物異構酶(PDI)，其為催化蛋白質半胱氨酸氧化和二硫鍵異構化的真核蛋白。一種或多種這些蛋白與靶蛋白的共同表達可產生較高水平的可溶性靶蛋白。SPARC多肽可以以融合蛋白形式產生，以改善其溶解性和產量。融合蛋白包含SPARC多肽和與其框內融合的第二多肽。第二多肽可以是本領域已知的用于改善與其融合的多肽的溶解性的融合伴侶，例如，NusA，細菌鐵蛋白(BFR)，GrpE，硫氧還蛋白(TRX)和谷 胱甘肽-S-轉移酶(GST)。Novagen Inc. (Madison, Wis.)提供了 pET 43. I 系列載體，其允許形成NusA-靶標融合物。當用作融合伴侶時，DsbA和DsbC也顯示出對于表達水平具有有利效應，因此可用于與SPARC多肽融合以實現更高的溶解性。在一個實施方式中，以包含Q3SPARC缺失突變體多肽和融合伴侶硫氧還蛋白的融合多肽的形式產生SPARC多肽，如U. S. Pat. No. 6，387，664所描述，該文獻通過引用方式全文并入本文。可以在大腸桿菌中大量產生硫氧還蛋白-SPARC融合物，作為容易配制的可溶性蛋白，而不喪失生理活性。雖然U. S. Pat. No. 6，387，664提供了其中SPARC融合于硫氧還蛋白的C末端的SPARC融合蛋白，但是應理解，為了本發明的目的，SPARC多肽可融合于第二多肽的N末端或C末端，只要保持其致敏功能。本發明的多肽也可在體外合成，例如使用任何合適的體外翻譯系統，例如TNT Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega, Madison, WI)，兔網狀細胞裂解物，麥胚抽提物等。或者，根據本發明制備的多肽可以通過任何合適的固相或液相程序化學合成，包括例如平版印刷、Fmoc固相和t-Boc固相肽合成方法。“分離的或純化的”意思是構成至少75%、至少90%、至少95%、至少99%所存在的多肽或多核苷酸。根據本發明的多核苷酸可通過任何合適的方法純化。本發明的多肽可通過本領域普通技術人員已知的任何適當的方式純化，包括例如，Sage:Purification ofSPARC/osteonectin, Curr. Protocols Cell Biol. 2003Feb;Chapter 10:Unit 10. 11 中討論的方法，該文獻通過引用方式全文并入本文。或者，可以使用親和色譜或沉淀，使用任何合適的抗體，表位標簽，包括例如myc，gfp, V5, FITC, HA, S-tag, T7等或任何其它合適的親和系統，包括例如生物素/親和素，聚組氨酸/Nickel，GST等。就上述核酸和蛋白而言，用于本文的核酸、肽或蛋白的“對應性”的一個度量是序列之間的相對“同一性”。在肽或蛋白質的情況下，或在根據編碼的肽或蛋白確定的核酸的情況下，對應性包括與指定的肽或蛋白具有至少大約50%同一性、或者至少大約70%同一性、或者至少大約90%同一性、或甚至大約95%并且也可以是至少大約98%-99%同一性。核酸之間的同一性的優選度量與上文就肽所指定的是相同的，至少大約90%或至少大約98-99%同一性為最優選。
如本文使用的術語“同一性”是指兩個肽或兩個核酸分子之間的序列同一性。同一性可通過比較每個序列中的位置來確定，其可以與為了比較的目的是一致的。如果兩個氨基酸或核酸序列具有至少大約75%的序列同一性，優選至少大約90%的序列同一性，甚至更優選至少95%的序列同一'丨生，最優選至少大約98%-99%的同一'丨生,則它們被認為是實質上同一的。序列同一'丨生可通過目前使用的BLAST算法來確定，其最初描述于Altschul etal. (1990)J. Mol. Biol. 215:403-410。BLAST算法可以根據公開的缺省設定來使用。當被比較的序列中的某位置被相同的堿基或氨基酸占據時，該分子被認為在該位置具有同一性。序列之間的同一性的程度是序列具有的匹配位置的數目的函數。 核酸序列的同一性的另外的度量是確定兩個序列在低度嚴格條件下、優選在高度嚴格條件下是否彼此雜交。當此類序列在高度嚴格條件下雜交時，它們是實質上同一的。在低度嚴格條件下與濾器結合序列的雜交可以在例如下列條件下進行O. 5M NaHPO4, 7% 十二烷基硫酸鈉(SDS)，ImM EDTA, 65。C ;在 O. 2 倍的 SSC/0. ISDS 中在 42 ° C 洗漆(見 Ausubel et al. (eds. ) 1989, Current Protocols in MolecularBiology,Vol. 1，Green Publishing Associates, Inc.，and John Wiley&sons, Inc.，NewYork, at p. 2. 10. 3)。或者，在高度嚴格條件下與濾器結合的序列的雜交可以在例如下列條件下進行0. 5M NaHPO4, 7% (SDS)，ImMEDTA, 65。C ;在 O. 2 倍的 SSC/0. 1%SDS 中在68° C洗漆(見Ausubel etal. (eds. ) 1989,見上文)。雜交條件可以根據已知的方法修改，這取決于目標序列(見 Ti jssen, 1993，Laboratory Techniques in BiochemistryandMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I，Chapter2〃0verview of Principles in Hybridization and the Strategy ofNucleic Acid ProbeAssays"，Elsevier, N. Y.)。一般地，選擇嚴格條件為比特定序列在確定的離子強度和pH時的熱熔解點低大約5° C。本領域技術人員將理解序列內的突變位置的數值名稱是相對于特定序列。同樣，同一個位置可以被分配不同的數值名稱，這取決于序列編號的方式和所選的序列。此外，序列變化例如插入或刪除可改變相對位置，隨之改變特定核苷酸和突變位點處或突變位點周圍的數值名稱。基因治療是涉及改變活細胞的遺傳材料以對抗疾病的醫療干預。對于很多不同類型的癌癥和其它疾病在臨床試驗(以人進行的研究)中正在研究基因治療。因此，本發明還提供了編碼適合用于“基因治療”的SPARC多肽(見例如Patil et al.，AAPSJ. 7(1) :E61-77(2005))的分離的核酸分子。一般地，使用載體例如如本文公開的那些來將基因遞送至細胞。用于基因治療的多數常見類型的載體是病毒。在基因治療中用作載體的病毒是遺傳失能的它們不能復制自身。多數基因治療臨床試驗依賴于鼠逆轉錄病毒以遞送需要的基因。用作載體的其它病毒包括腺病毒、腺相關病毒、痘病毒和皰疹病毒。合適的病毒基因治療載體和它們在體內和離體的施用模式是本領域已知的。基因治療可在離體和體內進行。通常而言，在離體基因治療臨床試驗中，來自患者血液或骨髓的細胞被取出并在實驗室中生長。將細胞暴露于攜帶所需基因的病毒。病毒進入細胞，所需基因成為細胞DNA的一部分。細胞在實驗室中生長，然后通過注射進入靜脈而返回至患者。使用體內基因治療，可使用載體例如病毒或脂質體將所需基因遞送至患者體內的細胞。本領域普通技術人員將認識到，由于遺傳密碼的通用性，任何給定氨基酸序列的知識允許本領域普通技術人員容易地想到可編碼所述氨基酸序列的多肽的特定多核苷酸序列的有限數目。此外，本領域普通技術人員可容易地通過“密碼子優化”過程來確定編碼用于在任何給定物種中表達所述氨基酸序列的多肽的最佳的多核苷酸序列，密碼子優化是本領域熟知的(見例如，Villalobos et al. :Gene Designer:a syntheticbiology toolfor constructing artificial DNA segments. BMCBioinformatics. 2006Jun. 6;7:285)。如本文使用的“載體”是指用作介質用于將活性藥物成分(API)遞送至合適的體外或體內作用位點的任何物質。因此，載體可作為包含API的治療性或實驗性試劑的制劑的賦形劑。優選的載體能夠維持API為能夠與T細胞相互作用的形式。此類載體的實例包括但不限于水、磷酸鹽緩沖鹽水、鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液、含血清的溶液、Hank溶液和其它含水生理平衡溶液或細胞培養基。含水載體也可包含接近受體的生理條件所需的適 當的輔助物質，例如，增強化學穩定性和等滲性。合適的輔助物質包括例如，乙酸鈉，氯化鈉，乳酸鈉，氯化鉀，氯化鈣，脫水山梨醇單月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯和用于產生磷酸鹽緩沖液，Tris緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液的其它物質。如本文使用的“抗癌疫苗”意思是包含腫瘤相關抗原或表位(可引發針對它們的免疫應答)的組合物。在另一個實施方式中，本發明提供了包含具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的肽抗原或具有相對于SEQ ID NO: I所示氨基酸序列替代、刪除、插入和/或添加了一個或多個氨基酸并仍然具有免疫刺激活性的氨基酸序列的肽抗原的抗癌疫苗。在另一個方面，本發明提供了包含SEQID NO: I的肽的前述部分并具有免疫刺激活性的肽抗原。在另一個方面，本發明提供了具有相對于SEQ ID NO: I的肽抗原的前述部分替代、刪除、插入和/或添加了一個或多個氨基酸并仍然具有免疫刺激活性的氨基酸序列的肽抗原。上述肽抗原優選可激活識別癌抗原蛋白的細胞毒性T淋巴細胞。在另一個方面，本發明提供了輔助T細胞，細胞毒性T淋巴細胞，包含這些細胞的免疫細胞群體，其使用上述肽抗原或其混合物被體外刺激誘導。在另一個方面，本發明提供了輔助T細胞，細胞毒性T淋巴細胞，包含這些細胞的免疫細胞群體，其使用上述肽抗原或其混合物被體外刺激誘導，和免疫激活劑。免疫激活劑優選為細胞生長因子或細胞因子。疫苗優選可進一步包含佐劑，例如完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑，明礬，卡介苗，粘附分子的激動劑和改性劑，破傷風類毒素，咪喹莫特，montanide, MPL和QS21。在另一個方面，本發明提供了用于抑制腫瘤的方法，其包括將上述輔助T細胞、細胞毒性T淋巴細胞或包含這些細胞的免疫細胞群體導入體內。上述方法優選用于預防和/或治療癌癥。在另一個方面，本發明提供了用于產生本發明的輔助T細胞或細胞毒性T淋巴細胞或包含這些細胞的免疫細胞群體的細胞培養溶液，其包含上述肽抗原或其混合物。在另一個方面，本發明提供了用于產生本發明的輔助T細胞或細胞毒性T淋巴細胞或包含這些細胞的免疫細胞群體的細胞培養試劑盒，其包含上述細胞培養溶液和細胞培養容器。在另一個方面，本發明提供了編碼上述肽抗原的DNA。在另一個方面，本發明提供了癌癥疫苗，其包含本發明的上述DNA，或包含上述DNA的重組病毒或重組細菌。上述癌癥疫苗優選還包含佐劑。疫苗可包含多種肽，多種肽可依賴于待治療的腫瘤。疫苗還可包含抗原呈遞細胞，例如樹突細胞，更具體地，以肽脈沖化或載入了肽的樹突細胞，并用作細胞疫苗以刺激針對該肽并因此針對腫瘤的T細胞免疫力。本發明的藥物組合物的施用可通過任何合適的途徑進行，包括但不限于靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、腫瘤內、口、直腸、陰道、膀胱內和吸入施用，其中靜脈內和腫瘤內施用是最優選的。組合物還可包含任何其它合適成分，特別是用于增強組合物的穩定性和/或其終端用途。因此，存在本發明的組合物的多種合適的制劑。以下制劑和方法僅是示例性的，無意限制。
如果需要，藥物組合物還可包括另外的治療性或生物活性試劑。例如，可存在用于治療特定適應癥的治療因子。控制炎癥的因子，例如布洛芬或類固醇可以是組合物的一部分，以減少與體內施用藥物組合物相關的腫脹和炎癥，以及生理疼痛。載體通常可以是液體，但也可以是固體，或液體與固體的組合。載體理想地是生理上可接受的(例如，藥學上或藥理學上可接受的)載體(例如賦形劑或稀釋劑)。生理上可接受的載體是本領域熟知的和容易獲得的。載體的選擇至少部分地可通過靶組織和/或細胞的定位和用于施用組合物的特定方法來確定。通常而言，此類組合物可以配制為可注射的液體溶液或懸浮液；也可制備適合用于制備溶液或懸浮液(在注射前添加液體)的固體形式；制劑也可被乳化。適合注射使用的藥物制劑包括無菌水溶液或分散液；包含已知蛋白穩定劑和凍干保護劑的制劑，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制劑，以及用于即時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有的情形下，制劑必須是無菌的，并且必須到達容易脫離注射器的流動性程度。其在制備和儲存條件下必須是穩定的，并且必須抗微生物例如細菌和真菌的污染作用。作為游離堿或藥理學上可接受的鹽的活性化合物的溶液可在與表面活性劑例如羥基纖維素適當混合的水中制備。也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中制備分散液。在通常的儲存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。本發明的肽可以以中性或鹽的形式配制于組合物中。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離氨基形成的)并且是與無機酸例如鹽酸或磷酸形成的，或與有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成的。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無機堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機堿例如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等。適合于胃腸外施用的制劑包括含水和非含水的、等滲無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抗菌劑和使制劑與期望受體的血液等滲的溶質，以及含水和非含水的無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。制劑可以以單元劑量或多劑密封容器的形式呈現，例如安瓿和小瓶，并且可儲存于冷凍干燥(凍干)條件下，僅需在臨使用前添加用于注射的無菌液體賦形劑例如水。即時注射溶液和懸浮液可以從無菌粉末、顆粒和之前描述的種類的片劑制備而來。在本發明的優選實施方式中，配制含有肽配體結構域的綴合物用于注射(例如胃腸外施用)。在這個方面，制劑理想地適合于腫瘤內施用，但也可配制用于靜脈內注射，腹膜內注射，皮下注射等。如果需要，本發明還提供這樣的實施方式其中本發明的肽進一步綴合于聚乙二醇(PEG)。PEG綴合能夠延長這些多肽的半衰期，減小多肽的免疫原性和抗原性，并改善它們的生物活性。如果使用的話，可使用任何合適的PEG綴合方法，包括但不限于使甲氧基-PEG與肽的可利用的氨基或其它活性位點例如組氨酸或半胱 氨酸反應。另外，重組DNA技術可用于將具有PEG活性基團的氨基酸添加至含有肽配體結構域的綴合物。此外，可釋放的和雜交PEG化策略可用于本發明的方面，例如多肽的PEG化，其中添加至包含肽配體結構域的綴合物分子中的某些位點的PEG分子在體內被釋放。PEG綴合方法的實例是本領域已知的。見例如 Greenwald et al. , Adv. Drug Delivery Rev. 55:217-250 (2003)。適合通過吸入施用的制劑包括氣霧劑制劑。氣霧劑制劑可被置于加壓的可接受的推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等。它們也可被配制為非加壓制劑，用于從噴霧器或霧化器遞送。適合于肛門施用的制劑可以配制為栓劑，其是通過將活性成分與多種基底例如乳化基底或水溶性基底混合來制備的。適合陰道施用的制劑可呈現為子宮托、塞、霜、凝膠、糊、泡沫或噴霧，其包含活性成分和載體，例如本領域技術已知的適當載體。另外，本發明的組合物可包含另外的治療性或生物活性試劑。例如，可以存在用于治療特定適應癥的治療因子。控制炎癥的因子，例如布洛芬或類固醇可以是組合物的一部分，以減少與體內施用藥物組合物相關的腫脹和炎癥，以及生理疼痛。在吸入治療的情況下，本發明的藥物組合物理想地是氣霧劑的形式。用于施用試齊IJ(如果是固體形式)的氣霧劑和噴霧發生器是可獲得的。這些發生器提供可被呼吸或可吸入的顆粒，并以適合人類施用的速率產生一定體積的包含預先確定的定量劑量的藥物的氣霧劑。此類氣霧劑和噴霧發生器的實例包括本領域已知的定量劑量吸入器和吹入器。如果是液體形式，則本發明的藥物組合物可通過任何合適的裝置被氣霧化。當用于靜脈內、腹膜內或腫瘤內施用時，本發明的藥物組合物可包含活性化合物的無菌水性和非水性注射溶液、懸浮液或乳液，其制劑優選為與期望的受體的血液是等滲的。這些制劑可包含下列一種或多種抗氧化劑、緩沖劑、表面活性劑、共溶劑、抑菌劑和使組合物與期望受體的血液等滲的溶質，和本領域已知的其它制劑成分。水性和非水性無菌懸浮液可包含懸浮劑和增稠劑。組合物可以以單元劑量或多劑容器的形式呈現，例如密封的安瓶和小瓶。本發明的方法也可以是組合治療的一部分。詞語“組合治療”是指與另一種治療性組合物按照依次或同時的方式施用本發明的治療劑，從而在經歷治療的哺乳動物中實現該組合的有益效應。本發明的任意組合物的優化劑量可通過本領域普通技術人員已知的常規方法來確定。用于將合適的診斷劑、治療劑、化療劑、放射性核素、多肽等與抗體或其片段綴合的方法在本領域中有完善的描述。例如，本發明提供了結合SPARC的多肽，SPARC多肽或抗-SPARC多肽抗體綴合物，例如SPARC-放射性核素、SPARC-藥物、SPARC免疫調節劑或SPARC毒素綴合物。任意合適的方法可用于本發明以形成多肽綴合物。例如但不限于SPARC蛋白中的游離氨基，例如賴氨酸的ε氨基，可與反應劑例如碳二亞胺或異雙官能試劑綴合。或者，例如多肽的巰基可用于綴合。另外，結合于糖蛋白或抗SPARC抗體例如抗-SPARC多肽抗體的糖部分可被氧化以形成醛基，醛基可用于本領域已知的多種偶聯程序。根據本發明形成的綴合物可以在體內是穩定的或不穩定的，例如酶可降解的四肽鍵，或酸不穩定的順式烏頭酰基或腙連接。另外，編碼合適的融合蛋白的合適可用于產生偶聯的多肽，例如GFP或毒素融合蛋白。實施例I本實施例證明了 Sparc和Abraxane 與抗血管生成試劑Sutent 在PC3模型中的相互作用。測定了以單獨的Abraxane (15mg/kg,每日施用，持續5日)，Abraxane與Sutent (Sutent 以 30mg/kg 每日施用，持續 8 周)，Abraxane 和外源 SPARC (SPARC 以 O. 2mg/ms每周施用2次,施用8周)，Abraxane、Sutent和SPARC —起進行了處理的小鼠中的腫瘤體積。圖I顯示了這些測試條件下腫瘤體積(mm3)相對于時間(天數)的作圖。如圖所 示，施用Abraxane .在整個實驗過程中引起相對于對照而言顯著減小的腫瘤體積。當Abraxane 與sparc —起施用時,腫瘤體積稍微增大,這表明(如實施例I所示)外源施用的sparc在該系統中使Abraxane 失敏。當抗血管生成試劑Sutent 與sparc和Abraxane 一起施用時,SP ARC/Abraxane 組合的效果顯著改善。圖I還證明了 Abraxane 與抗血管生成試劑Sutent —起施用時產生比單獨施用Abraxane 大得多的腫瘤體積的減小。令人驚奇的是，施用外源sparc與Abraxane +Sutent 消除了一些 Abraxane +Sutent 的協同效應。這說明sparc拮抗Sutent 的抗血管生成活性。這些數據說明SPARC使這些特定的抗腫瘤試劑失敏的機制是通過血管生成活性。實施例2該實施例顯示了 SPARC的血管生成行為的表征。使用維持于中空纖維生物反應器中的HEK 293細胞表達和純化重組人SPARC和遺傳工程化的變體。使用HUVEC管形成測定法和HUVEC芽形成珠測定法測定rhSPARC及其變體的血管生成活性。在HUVEC管形成測定法中，rhSPARC在10 μ g/mL是促血管生成的，在100 μ g/mL是抗血管生成的。管形成測定法的結果可以見圖2。在芽形成測定法中，添加rhSPARC引起更多的被周細胞支持的成熟血管壁的形成，這說明了 SPARC除了最初的刺激血管生成本身之外的作用。在這些測定法中測試的具有刪除和單/雙氨基酸置換的另外的rhSPARC變體包括Q3刪除(BI02)、推定的血管生成結構域的倒位(BI05)、推測的血管生成結構域中的雙K>Q置換(BIOll)、推定的cat印hsin K識別位點的遺傳消除(BI08)和rhSPARC的蛋白水解裂解產物。末端氨基酸分析表明血管生成活性位于SEQ ID NO: I。實施例3該實施例顯示了 SPARC的血管生成結構域的鑒定。制備了 SPARC的蛋白水解降解產物并命名為SPARC-d。SPARC_d是由兩種形式的C末端截短的SPARC組成的混合物。圖3顯示了 SDSPAGE測定，其中SPARC d與野生型SPARC并排跑膠。SPARC-d的主要形式(在圖3中的凝膠中標記為B)是氨基酸233-286 (SEQ IDNO: 2)組成的C末端序列的缺失部分。
圖4顯示了以野生型SPARC和SPARC-D進行的HUVEC 3-D管形成測定法的結果。圖中可見野生型SPARC的血管生成行為，如之前的實施例中所描述；血管生成行為隨著濃度接近10ug/ml而升高,隨著濃度接近100ug/ml而降低。然而，SPARC_d的結果表明截短蛋白的C末端消除了 SPARC血管生成活性。基于該測定法的結果，可以鑒定SPARC的血管生成結構域的位置是C末端的54個氨基酸序列(SEQ ID NO: I)內。在描述本發明的上下文中特別是下列權利要求的語境中，術語“a”和“an”和“the”以及類似指稱的使用被理解為涵蓋了單數和復數，除非本文另有指明或上下文明顯矛盾。術語“包含” “具有” “包括”和“含有”被理解為開放式術語(即意味著“包括但不限于”)，除非另有指明。本文記載的數值范圍僅僅意在作為個別指稱落在該范圍內的每個單獨數值的簡便方法，除非本文另有指明，并且每個單獨數值皆包括在本說明書中，如同它個別地在本文中被記載一樣。本文描述的所有方法可通過任何合適的順序進行，除非本文另有指明或上下文明顯矛盾。本文提供的任何和所有實施例或示例性語言(例如“例如” )的使用僅是為了更好地例示本發明，不對本發明的范圍具有限制作用，除非另外要求。本說明書中的語言不應被理解為表明任何不要求保護的元件對于實施本發明是必不可少的。在本文中描述了優選實施方式，包括本發明人已知的實施本發明的最佳方式。這些優選實施方式的變體對于閱讀了上述說明書的本領域普通技術人員將變得明顯。本發明人預期技術人員會視需要利用此類變體，本發明人期望本發明以除了本文具體描述的方式實施。因此，本發明包括本文隨附的權利要求中提及的主題的所有修飾和等同物，如適用法律所允許。此外，上述描述的元件的所有可能變體的任何組合包括在本發明內，除非本文另有指明或上下文明顯矛盾。
權利要求
1.使用治療法治療患有SPARC依賴性疾病的動物的方法，包括 Ca)定量所述動物的疾病位點處的SPARC血管生成結構域多肽和包含SPARC血管生成結構域的全長SPARC的量； (b)定量一個或多個患有相同的SPARC依賴性疾病的、已知響應于所述治療法的其它動物的疾病位點處的SPARC血管生成結構域多肽和包含SPARC血管生成結構域的全長SPARC的量； (c)計算(b)中測定的SPARC血管生成結構域多肽和包含SPARC血管生成結構域的全長SPARC的量的平均值； Cd)將(a)中測定的所述量與(c)中測定的所述平均值相比較；和 (e)如果(a)中測定的所述量大于或等于(c)中測定的所述平均值，則施用所述治療法。
2.使用治療法治療患有SPARC依賴性疾病的動物的方法，包括 Ca)定量所述動物的疾病位點處的SPARC血管生成結構域多肽的量； (b)定量一個或多個患有與(a)中所述動物相同的SPARC依賴性疾病的、已知響應于所述治療法的其它動物的疾病位點處的SPARC血管生成結構域多肽的量； (c)計算(b)中測定的SPARC血管生成結構域多肽量的平均值； (d)將(a)中測定的所述量與(c)中測定的SPARC血管生成結構域多肽的量的平均值相比較；和 (e)如果(a)中測定的所述量大于或等于(C)中測定的所述量的平均值，則施用所述治療法。
3.權利要求I或2的方法，其中SPARC依賴性疾病是腫瘤、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩或子宮內膜異位癥或糖尿病性視網膜病。
4.權利要求I或2的方法，其中所述治療法是下列一種或多種化療、放射或生物學方案。
5.治療患有SPARC依賴性病況或疾病的動物的方法，包括向動物施用治療有效量的與包含SPARC血管生成結構域的多肽結合并在疾病位點處聚集的多肽。
6.權利要求5的方法，其中所述多肽綴合于化療、放射或生物試劑。
7.權利要求5或6的方法，其中所述多肽是抗體。
8.治療患有SPARC依賴性病況或疾病的動物的方法，包括向動物接種免疫有效量的包含SPARC血管生成結構域的免疫原。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述動物是人。
全文摘要
本發明提供了組合物和方法，其利用了SPARC羧基血管生成結構域的發現。
文檔編號A61P35/00GK102858362SQ201180020390
公開日2013年1月2日 申請日期2011年3月11日 優先權日2010年3月11日
發明者V·特里魯, D·克瑙爾, N·德塞 申請人:阿布拉西斯生物科學有限責任公司