使用了嗜熱微生物的混合物、溶解液及藥物的制作方法

專利名稱：使用了嗜熱微生物的混合物、溶解液及藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有能夠對包括人在內的動物進行粘膜免疫系統的活化和代謝調節的嗜熱微生物的混合物、溶解液及藥物。
背景技術：
已知使用了微生物的益生菌改善動物的腸內細菌層、活化腹瀉的預防和/或免疫等。例如，專利文獻I中公開了ー種源自對動物預防腹瀉等的菌體的殺菌處理成分。另外，專利文獻2中公開了含有作為乳酸菌的ー種的乳桿菌(Lactobacillus)屬的配合物。另外，專利文獻3中公開了ー種源自作為枯草菌的ー種的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的抗菌化合物。另外，專利文獻4中公開了對胃腸道具有定居性的微生物群，其是含有酵母、乳桿菌屬及雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬的共生組合物。進而，專利文獻5中公開了含有作為乳酸菌的一種的乳桿菌屬等的免疫增強劑。這些專利文獻中所公開的益生菌均是使 用常溫性的微生物的益生菌，不是使用嗜熱性的微生物的益生菌。另外，作為關于對動物施與常溫性的微生物對免疫系統和/或代謝調節系統的影響及其作用機制進行公開的例子，可以舉出如下內容。非專利文獻I中報告了枯草芽孢桿菌通過與兔的盲腸內的擬桿菌(Bacteroides)屬共生來增進CCL21基因的表達。另外，非專利文獻2中報告了作為源自動物的病原菌已知的沙門氏菌(Salmonella)經由作為粘膜免疫系統的傳感器的Toll樣受體-4來抑制作為免疫系統的B細胞的游走因子的趨化因子CXCL13和CCL12的表達。其中，所述趨化因子CXC13等，非專利文獻3中公開了其在生物體內承擔與淋巴結的發育相關的作用，專利文獻4中公開了其與呼吸系統的免疫功能的形成相關。另外，在非專利文獻5中，作為用于調節作為腸道中的免疫系統的調節部位的派爾集合淋巴結的功能的細菌，公開了分節絲狀菌(Segmented filamentous bacteria)。另夕卜，在非專利文獻6中，還進行了在Germ free animal (無菌動物)中導入如上所述的特殊的細菌，并加入人的菌群的嘗試。另ー方面，專利文獻6 8中公開了使用了嗜熱性的微生物的技木。該使用了嗜熱性的微生物的技術具有通過將有機性廢棄物進行再循環而可進行各用途的制劑化等許多應矚目的優點。但是，在上述各專利文獻中，雖然關于對畜產動物施與具有分解幾丁質能力的芽孢桿菌(Bacillus)屬時的源自糞尿的堆肥化的促迸、氣味減輕等進行了公開，但沒有關于其作用機制的詳細記載。即，在這些專利文獻中，未公開對動物施與嗜熱微生物時對生物體的直接效果、特別是對免疫系統和/或內分泌系統的影響。如上所述，現有的與免疫系統的調節相關的技術僅使用常溫性的微生物。特別是不能在進行免疫系統的控制的同吋，實現提高肌肉的増量效果、調節腸道的氣體代謝和/或脂肪代謝來降低源自腸道的內容物的地球變暖氣體、抑制體內的脂肪積累的效果。另外，現有的使用了嗜熱性的微生物的技術提倡肥料及飼料效果、環境改善效果。專利文獻I :日本專利2621588號公報
專利文獻2 日本專利3338446號公報專利文獻3 :日本特表2006-514019號公報專利文獻4 :日本特開2009-137962號公報專利文獻5 :日本特開2006-76961號公報專利文獻6 :日本專利3146305號公報專利文獻7 :日本專利3314302號公報專利文獻8 :日本特開2003-219864號公報非專利文獻I :Nicholas B et al. Microbialinduction of B and T cell are asin rabbit appendix. Dev Comp Immunol. 2008 ;32 (8) :980-981 非專利文獻 2 :Asheley L st John et al. Salmonella disrupts lymph nodearchitecture by TLR-4mediated suppressionofhomeostatic chemokines. NatureMedicine 2009 ；15(11) :1259-1266非專利文獻3 :Serge A van de Pavert et al. ChemokineCXCL13 is essentialfor lymph node initiation and is induced byretinoic acid and neuronalstimulation. Nature Immunology 2009; 10 (II) :1193-1200非特專利獻4 Juan E Moyron-Quiroz, et al. Roleof inducible bronchusassociated lymphoid tissue (iBALT)inrespiratory immunity. Nature Medicine. 2004 ；10(9) :927-934非專利文獻5:Klaasen HLBM et al. Infection andImmunity61:303-306, 1993etc.非專利文獻6 :腸內細菌學雜志22:109-114，2008

發明內容
發明要解決的課題但是，各專利文獻及非專利文獻中所公開的技術缺乏雙向檢驗關于對動物的影響的作用機制和對全身的健康狀態的影響的數據。特別是關于現有的使用了嗜熱性的微生物的技術，不是與使用實驗動物的研究成果相關的技術，缺乏關于用于謀求在除畜產動物以外的動物、特別是人中的應用的基礎研究等的見解。本發明是鑒于上述情況而完成的，基于使用了作為積累了普遍數據的實驗動物的小鼠以及大鼠的研究數據，其目的在于提供ー種使用了可調節粘膜免疫系統基因群、和/或腸、肝臟中的代謝相關基因群的嗜熱微生物的混合物、溶解液及藥物。用于解決課題的方法本發明的混合物或溶解液的特征在干，是通過在50°C 90°C使含有嗜熱微生物的有機物發酵而得到的，通過對動物施與該混合物或溶解液，從而調節該動物的選自粘膜免疫系統基因群、腸中的代謝相關基因群、肝臟中的代謝相關基因群中的至少I個基因群的表達，其中，作為所述嗜熱微生物，含有ー種以上嗜熱性的芽孢桿菌(Bacillus)屬、海洋芽胞桿菌(Oceanobacillus)屬、類芽抱桿菌(Paenibacillus)屬、厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)屬、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)屬、甲燒嗜熱菌(Methanopyrus)屬、Geogemma 屬、火葉菌(Pyrolobus)屬、熱網菌(Pyrodictium)屬、超熱菌(Hyperthermus)屬、火球菌(Pyrococcus)屬、火棒菌屬(Pyrobaculum)、熱球菌(Thermococcus)屬、氣火菌(Aeropyrum)屬、產水菌(Aquifex)屬、熱袍菌(Thermotoga)屬、熱脫硫桿菌(Thermodesulfobacterium)屬、棲熱菌(Thermus)屬、地芽孢桿菌(Geobacillus)屬、嗜熱絲孢菌(Thermomyces)屬、梭菌(Clostridium)屬的微生物。其中，所述嗜熱微生物與H. G. Schlegel著、“一般微生物學”(Thieme VerlagStuttgart，第5版，173高度嗜熱菌及超高度嗜熱菌的欄)中記載的耐熱性的基準(最適增殖溫度為40°C以上)一致。本發明的混合物或溶解液的特征在于，作為嗜熱微生物，含有嗜熱性復合菌BP-1051。本發明的混合物或溶解液的特征在于，作為嗜熱微生物，含有BP-863，該BP-863具有對用熱曬淀粉芽孢桿菌(Bacillus thermoamylovorans)的近源種難分解性的糖質的分解能力。 本發明的混合物或溶解液的特征在于，作為嗜熱微生物，含有嗜熱性種菌PTA-1773。本發明的藥物的特征在于，含有上述混合物或溶解液中的任ー種作為有效成分。發明的效果本發明的混合物或溶解液通過含有ー種以上嗜熱性的芽孢桿菌(Bacillus)屬、海洋芽胞桿菌(Oceanobacillus)屬、類芽孢桿菌(Paenibacillus)屬、厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)屬、賴氨酸芽抱桿菌(Lysinibacillus)屬、甲燒嗜熱菌(Methanopyrus)屬、Geogemma屬、火葉菌(Pyrolobus)屬、熱網菌(Pyrodictium)屬、超熱菌(Hyperthermus)屬、火球菌(Pyrococcus)屬、火棒菌屬(Pyrobaculum)、熱球菌(Thermococcus)屬、氣火菌(Aeropyrum)屬、產水菌(Aquifex)屬、熱袍菌(Thermotoga)屬、熱脫硫桿菌(Thermodesulfobacterium)屬、棲熱菌(Thermus)屬、地芽抱桿菌(Geobacillus)屬、嗜熱絲孢菌(Thermomyces)屬、梭菌(Clostridium)屬的微生物作為嗜熱微生物,對包括人在內的動物進行施與，由此與宿主的腸內菌群共存，可期待調節粘膜免疫系統基因群、腸中的代謝相關基因群、肝臟中的代謝相關基因群中的至少I個基因群的表達。另外，本混合物或溶解液即使通過在無菌環境下對包括人類的動物進行施與，也可期待調節粘膜免疫系統基因群等的表達。本發明的混合物或溶解液含有嗜熱性復合菌BP-1051作為嗜熱微生物，從而在腸內不存在菌相那樣的無菌條件下、及在腸內存在菌相的通常環境下的任ー環境下，都可期待通過對動物(包括人)進行施與，由此活化早期應對細菌感染、病毒感染的自然免疫系統，從而調節粘膜免疫系統基因群的表達、或調節腸、肝臟中的代謝相關基因群的表達。本發明的混合物或溶解液通過含有具有對用熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種難分解性的糖質的分解能力的BP-863、嗜熱性種菌PTA-1773中的任ー種作為嗜熱微生物，也可發揮上述同樣的效果。另外，設想所述BP-863活化腸道的派爾集合淋巴結的發育、以及生物體內的IL-18的產生。通常已知派爾集合淋巴結承擔免疫球蛋白的產生調節等，IL-18誘導Y干擾素的產生。因此，通過BP-863，在上述無菌條件下、或者上述通常條件下的任ー種條件下，都能夠有助于可以早期應對細菌感染、病毒感染的自然免疫系統的活化。
本發明的藥物通過含有上述混合物或溶解液的任ー種作為有效成分，可以發揮上述同樣的效果。另外，本發明的藥物，可對包括人在內的動物進行經ロ或者經氣管的施與。


圖I是關于本發明的混合物或溶解液的腸道內的作用機制的概念圖。圖2是表示本發明的混合物或溶解液對無菌小鼠的腸道功能的影響的概念圖；圖3是熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種N-Il株(NITE BP-863)的培養皿上的培養照片;圖4是熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種N-Il株(NITE BP-863)的電子顯微鏡圖像；圖5是在高脂肪食下飼養的小鼠(飲水自來水)的利用CT掃描得到的軀干部的 圖像；圖6是在高脂肪食下飼養的小鼠(飲水添加了 I. 0%溶解液I-B的自來水)的利用CT掃描得到的軀干部的圖像；圖7是表示施與了嗜熱性的微生物的無菌小鼠的肝臟中的IL-18的含量的圖；圖8是表示施與了嗜熱性的微生物的無菌小鼠的糞中的分泌型IgA的濃度的圖。
具體實施例方式以下，參照

本發明的實施方式。首先，對本發明的混合物或溶解液進行說明。本發明的混合物或溶解液通過高溫發酵含有嗜熱性的微生物的有機物而得到，通過對包括人在內的動物進行施與，從而調節該動物的粘膜免疫系統基因群、腸中的代謝相關基因群、肝臟中的代謝相關基因群中的至少I個基因群的表達。上述嗜熱性的微生物也如上述所記載，是最適増殖溫度為40°C以上的微生物。具體而言，可以舉出嗜熱性的芽孢桿菌屬、海洋芽胞桿菌屬、類芽孢桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬等的微生物。除此之外，可以舉出嗜熱性的甲燒嗜熱菌屬、Geogemma屬、火葉菌屬、熱網菌屬、超熱菌屬、火球菌屬、火棒菌屬、熱球菌屬、氣火菌屬、產水菌屬、熱袍菌屬、熱脫硫桿菌屬、棲熱菌屬、地芽孢桿菌屬、嗜熱絲孢菌屬、梭菌屬的微生物。另外，更具體而言，可以舉出嗜熱性種菌PTA-1773、嗜熱性復合菌BP-1051、作為熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)的BP-863、作為細菌門屬于厚壁菌門(Firmicutes)的熱陰溝芽孢桿菌(Bacillus thermocloacae)的近源種(在 GenBank 數據庫中登記為 no. AB298562)、熱曬淀粉芽孢桿菌(Bacillus thermoamylovorans)的近源種(在GenBank數據庫中登記為no. AB298559)。另タ卜，上述嗜熱性種菌PTA-1773于2000年5月I日在ATCC(American TypeCulture Collection (美國典型培養物保藏中心)，10801University BoulevardManassas, Virginia 20110-2209U. S. A.)國際保藏(保藏號PTA-1773)。嗜熱性種菌PTA-1773含有幾丁質分解能力高的微生物群、以及嗜熱性的乳酸菌，具體而言，含有放線細菌(Actinomycetales bacterium)屬、脂環酸芽抱桿菌(Alicyclobacillus)屬、雙芽抱桿菌(Amphibacillus)屬、厭氧芽抱桿菌(Anoxybacillus)屬、Atopostipes屬、短狀桿菌(Brachybacterium)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、樓桃芽抱桿菌(Cerasibacillus)屬、梭菌(Clostridium)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、短小桿菌(Curtobacterium)屬、喬治菌(Georgenia)屬、薄壁芽抱桿菌(Gracilibacillus)屬、Jeotgalicoccus 屬、Salinibacillus屬、蒂西耶氏菌(Tissierella)屬、脲芽胞桿菌(Ureibacillus)屬、漫游球菌(Vagococcus)屬、枝芽孢桿菌(Virgibacillus)屬、魏斯氏菌(Weissella)屬等的微生物。另外，嗜熱性復合菌BP-1051于2011年I月18日在獨立行政法人制品評價技術基盤機構的專利微生物保藏中心(NPMD)(日本〒292-0818千葉縣木更津市上總錸足2-5-8)國際保藏(保藏號=NITE BP-1051)。另外，作為熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)的BP-863于2010年I月15日在獨立行政法人制品評價技術基盤機構的專利微生物保藏中心(NPMD)(日本〒292-0818千葉縣木更津市上總錸足2-5-8)國際保藏(保藏號NITE BP-863)。上述有機物含有如上所述的嗜熱微生物且可高溫發酵。具體而言，可以舉出含有上述嗜熱性的微生物的海產品、農產品、它們的殘渣等有機性廢棄物、木材碎片等。其中，上述農產品包含玉米的外皮、玉米的芯(玉米棒)、大豆柏、草莓、蘑菇等含有作為難分解性的糖醇的阿拉伯糖、木糖醇、木聚糖等的原材料。另外，為了制作本發明的混合物或溶解液，在50°C 90°C的溫度下使上述有機物 發酵。在此，如果使有機物的發酵溫度低于50°C，則可能上述嗜熱性的微生物的増殖難以進行，而且常溫性的微生物也増殖，因此不適當。另外，如果使有機物的發酵溫度高于90°C，則上述嗜熱性的微生物可能被殺滅，因此不適當。本發明的混合物或溶解液可由通過上述發酵得到的發酵產物來制作。例如，本發明的混合物可以通過將上述發酵產物直接或者混合在飼料等中來制作。另外，本發明的溶解液可以通過用水稀釋上述發酵產物來制作。除此之外，以不使上述嗜熱性的微生物被殺滅為條件，本發明的混合物或溶解液可以通過任意的方法制作。如上制作的本發明的混合物或溶解液通過經ロ或經氣管對動物(包括人)進行施與，從而可以調節該動物的粘膜免疫系統基因群、腸中的代謝相關基因群、肝臟中的代謝相關基因群中的至少I個基因群的表達。設想本發明的混合物或溶解液的上述功能通過例如圖I中記載的機制產生。即，本發明的混合物或溶解液中所含的嗜熱性的微生物在與宿主的腸內菌群共存時，作用于粘膜免疫系統及代謝系統。首先，作為對粘膜免疫系統的作用，通過腸道中活化自然殺傷細胞(NK細胞)，以及促進趨化因子以及相關基因群的表達并促進淋巴組織的形成、B細胞的游走，從而使抗體產生增加。另外，作為代謝系統的作用，通過調節脂肪代謝的基因群的表達量使中性脂肪減少，以及調節氣體代謝的基因群的表達量，從而抑制甲烷氣體產生。另外，也設想本發明的混合物或代謝系統中所含的嗜熱性的微生物直接作用于粘膜免疫系統。這基于以下事實如圖2所示，在施與了本發明的混合物或溶解液的Germfree小鼠(無菌小鼠)中，派爾集合淋巴結的發育、糞便代謝的正常化、粘膜免疫系統的溫和的活化進行。因此，本發明的混合物或溶解液可以說是即使在腸內無菌的環境下也能夠以性狀相近的形式調節腸內代謝的益生菌。例如可期待在醫療領域中需要絕食的手術后治療中的應用。另外，本發明的混合物或溶解液含有的微生物為嗜熱性，因此，可在就要使用前進行60°C左右的滅菌，從而可以以防止了混入雜菌的形式進行靈活利用。另外，也可以通過更簡便的培養技術大量地增產具有新功能的益生菌以及益生元。接著，對本發明的藥物進行說明，本發明的藥物通過含有本發明的混合物或溶解液作為有效成分，來調節被施與的動物的粘膜免疫系統基因群、腸中的代謝相關基因群、肝臟中的代謝相關基因群中的至少I個基因群的表達，從而發揮效果。另外，本藥物可經ロ或經氣管對動物(包括人)進行施與。另外，本發明的藥物可根據需要適宜選擇賦形劑、増量劑、粘結劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩沖劑、保存劑、溶解輔助劑、矯味劑、無痛劑、穩定劑等藥學上容許的載體或添加劑進行混合來實現，從而可以制成溶液劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑等。另外，例如，作為上述賦形劑，可以舉出乳糖、白糖等糖類、淀粉類等。另外，作為崩解劑，可以舉出纖維素衍生物、淀粉類等。另外，作為粘結劑，可以舉出明膠、阿拉伯膠等高分子類。另外，作為潤滑剤，可以舉出蠟類、硬脂酸等。以下，通過實施例更具體地說明本發明，但本發明并不受這些實施例任何限定。另夕卜，實施例中所引用的文獻中的記載內容是作為本說明書的記載被參照的。實施例I (1-1)溶解液1-A、1_B的制作溶解液I-A 是將新澤等(Niisawa C，Oka S，Kodama H, Hirai M, Kumagai Y, MoriK, Matsumoto J, Miyamoto H, Miyamoto H(2008)Microbial analysis of compostedproduct of marine animal resources and isolation of antagonistic bacteria toplant pathogen from the compost. J Gen Appl Microbiol 54:149-158)報告的高溫發酵產物以重量比稀釋至200倍，在60 70°C下進行6小時以上的散氣處理而制作的。另外，溶解液I-B是通過共培養溶解液I-A中所含的嗜熱微生物和PTA-1773而制作的。(1-2)溶解液I-A中所含的微生物的分析上述溶解液I-A含有多種嗜熱微生物，作為優先菌種，含有嗜熱性復合菌BP-1051，對它們的堿基序列(16SrDNA序列)進行分析。該分析通過在標準培養基、普通瓊脂培養基、心浸液培養基等中接種溶解液I-A中所含的微生物，從增殖而得的菌株中提取DNA來進行。另外，在該分析中，應用已知的方法(Lane, D.J. (1991) 16S/23S rRNAsequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. btackebrandt, E.and Goodfellow, M. eds. , John Wiley & Sons Ltd. , Chichester, England, pp. 115-175)并使用作為通用引物的27F和1525R來實施PCR反應。反應溶液是混合25 μ L 2 XGoTaq HotStart Colorless Master Mix (Promega Co·, WI, USA)和 2pmol 的引物，用 50yL 的滅菌水溶解樣品而制作的。PCR循環是在94°C 15分鐘后，將94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 90秒的循環進行35個循環，在72°C下使其反應7分鐘。進而，用QIAquick PCR PurificationKit (Qiagen GmbH, Germany)純化 I. 5_kbp 長的 PCR 片段，使用 BigDye Terminatoror Cycle Sequencing Kit 通過全自動 DNA analyser system(Applied BiosystemsInc. , CA, USA)來確定堿基序列。進而,根據GenBank(http://ww. ucbi. ulm. nih. gov/)的數據庫等進行比對檢索。通過該分析而分析出的各微生物的堿基序列如序列號I 8所示。在此，在序列號I中顯示堿基序列的栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius)的近源種(IP-2)與栗褐芽孢桿菌的標準菌株(B NBRC15713T)具有97. 3%的同源性。另外，作為栗褐芽孢桿菌的近源種(IP-2)的特征，可以舉出革蘭氏陽性、寬度2μπκ長度2μπκ形成芽抱、無葡萄糖、乳糖等的糖分解能力、過氧化氫酶、氧化酶陽性等，另外，已知栗褐芽孢桿菌具有參與氮代謝的基因。
在序列號2中顯不喊基序列的Anoxybacillus kamchatkensis的近源種(IP-3)與 Anoxybacillus kamchatkensis 的標準菌株(IAM110611)具有 99. 5% 的同源性。另外,作為Anoxybacillus kamchatkensis的近源種(IP-3)的特征,可以舉出革蘭氏陽性、寬度O. 4 μ m、長度3 4μπκ形成芽孢、有淀粉、葡萄糖的分解能力、過氧化氫酶、氧化酶陽性、將硝酸鹽還原成亞硝酸等。另外,設想Anoxybacillus kamchatkensis具有脂肪酶活性、且脂質的分解能力聞。在序列號3中顯示堿基序列的泛酸枝芽孢桿菌(Virgibacilluspantothenticus)的近源種(IP-9)與泛酸枝芽孢桿菌的標準菌株(DSM24988T)具有99. 5%的同源性。另外，作為泛酸枝芽孢桿菌的近源種(IP-9)的特征，可以舉出革蘭氏陰性、寬度O. 5 μ m、長度5 6 μ m、形成大的芽孢、有淀粉、葡萄糖、塔格糖的分解能力、過氧化氫酶、氧化酶陽性、將硝酸鹽還原成亞硝酸等。另外，泛酸枝芽孢桿菌具有作為具有抗鹽性的成分的ectoine,該ectoine也作為保濕成分已知。在序列號4中顯示堿基序列的Bacillus fortis的近源種(IP-14)與Bacillusfort is的標準菌株(LMG220791)具有99. 7%的同源性。另夕卜，作為Bacillus fortis的近 源種(IP-14)的特征，可以舉出革蘭氏陽性、寬度0.5μπκ長度Ιμπκ形成芽孢、無淀粉、葡萄糖的分解能力、有海藻糖的分解能力，過氧化氫酶、氧化酶陽性、不將硝酸鹽還原成亞硝酸等。在序列號5中顯示堿基序列的Lysinibacillus xylanilyticus的近源種(IP-23)與Lysinibacillus xylanilyticus的標準菌株(YC6957T)具有95. 0%的同源性。另外，作為Lysinibacillus xylanilyticus的近源種(IP-23)的特征,可以舉出革蘭氏陽性、寬度O. 5μηι、長度3 5 μ m、形成芽孢、無糖分解能力、有胨分解能力，過氧化氫酶、氧化酶陽性、不將硝酸鹽還原成亞硝酸等。另外，已知Lysinibacillus xylanilyticus具有對難分解性的木聚糖的分解特性，但しysinibacillus xylanilyticus的近源種(IP-23)如上所述,完全沒有糖分解能力，僅胨的利用能力高，認為是新菌種。在序列號6中顯示堿基序列的Paenibacillus timonensis的近源種(IP-60)與Paenibacillus timonensis的標準菌株(CIP108005T)具有96. 9%的同源性。另夕卜，作為Paenibacillus timonensis的近源種(IP-60)的特征,可以舉出革蘭氏陽性、寬度O. 5 μ m、長度3 5 μ m、形成芽孢、有分解淀粉、木糖醇、木聚糖的能力、過氧化氫酶、氧化酶陰性、將硝酸鹽還原成亞硝酸等。另外，Paenibacillus timonensis木聚糖的分解能力未知,但Paenibacillus timonensis的近源種(IP-60)如上所述具有高的木聚糖分解能力，設想為新菌種。另外，對難分解性的糖醇的分解能力也與BP-863同程度地高。在序列號7中顯不喊基序列的Paenibacillus curdlanolyticus的近源種(IP-75)與 Paenibacillus curdlanolyticus 的標準菌株(IF0157241)具有 94. 6% 的同源性。另外，作為Paenibacillus curdlanolyticus的近源種(IP-75)的特征,可以舉出革蘭氏陽性、寬度O. 5 μ m、長度3 5 μ m、形成芽孢、有乳糖分解能力、過氧化氫酶、氧化酶陰性、不將硝酸鹽還原成亞硝酸等。另外，已知Paenibacillus curdlanolyticus具有對難分解性的木聚糖的分解特性。另外，Paenibacillus curdlanolyticus的近源種(IP-75),對難分解性的糖醇的分解能力也與BP-863同程度地高，設想為新菌種。另夕卜，在序列號8中顯示堿基序列的Bacillus ruris的近源種(IP-95)與Bacillus ruris的標準菌株(LMG22866T)具有99. 9%的同源性。另外，作為Bacillus ruris的近源種(IP-95)的特征，可以舉出革蘭氏陽性、寬度lym、長度2μπκ形成芽孢、有淀粉、葡萄糖、海藻糖分解能力、過氧化氫酶、氧化酶陽性、將硝酸鹽還原成亞硝酸等。實施例2(2-1)溶解液2的制作溶解液2如下制作在株式會社三六九所設置的3段式的通氣性發酵槽中，在70°C 90°C利用溶解液I-B中所含的微生物群來發酵含有海產殘渣的有機物，用水將其最終發酵物稀釋至100倍，在60°C以下且在曝氣條件下使其溶解10小時以上時間。(2-2)通過施與溶解液2來分析在無菌小鼠的盲腸便中成為優先種的微生物
對無菌飼養的Balb/c小鼠(雄性、10周齡)以O. 5%的濃度將溶解液2施與3周，對從其盲腸便中分離的微生物的堿基序列(16SrDNA序列)進行分析。另外，在飼養時，在調節為室溫24±1で、濕度55±5%的飼養室中用隔離器(アイ·シー·ュム社制)飼養上述Balb/c小鼠，飼料使用經放射線滅菌的飼料(オリヱン夕ル酵母社制制品名CMF)。另夕卜，堿基序列的分析通過與實施例I的(1-2)中敘述的方法同樣的方法進行。通過該分析所分析出的溶解液2中所含的各微生物的堿基序列如序列號9、10所示。在上述序列號9中顯示堿基序列的熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)為上述BP-863，與熱噬淀粉芽孢桿菌的標準菌株(LMG18084T)具有99. 9%的同源性。該熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)的生物化學特性如表I所示，另外，熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)的培養照片如圖3、圖4所示。[表 I]特征熱嗔淀粉芽孢桿菌的熱P藍淀粉芽孢桿菌的
近源種(!V-丨I)標準菌株(L\IG丨8084Γ)
菌落及顯微鏡觀察
菌落的顏色奶油色奶油色
菌的形狀__桿菌__桿菌_
菌的大小0.5><2-5i_im0.45-0.5x3-4jim
革蘭氏染色++
芽孢染色++
芽孢的位置端(接近端點)端(接近端點)
運動性VV(奩菌株中可變)
其它的生物化學竹技
吲咮產生_____
IPA產生-_
H2S產生--
脲分解--
硝酸鹽還原++
過氧化氫酶:++
氧!ィ匕^^++
酸產生能力試驗
葡萄糖++
廠 I 乳糖++I ---
犮芽糖++
半乳糖++
海藻糖__+__+_
甘露糖__+__+_
蔗糖++
果糖++
纖維ニ糖++
核糖++
木糖__+__V(在菌株中可變)
鼠李糖+-
D-阿拉伯糖__+__-_
松ニ糖_ +_ ND _
葡萄糖酸鈉+-
肌醇+-
木糖醇+-
衛矛醇+-
赤薄糖醇+-
山梨糖醇+-
甘露糖醇__+__-_
乳酸+(弱)ND
木聚糖+ND其中，表I中，與熱噬淀粉芽孢桿菌的標準菌株(LMG18084T)比較顯示熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)的生物化學性狀。另外，熱噬淀粉芽孢桿菌的標準菌株(LMG18084T)的生物化學性狀基于 Combet-Blanc, Y. , Ollivier, B. , Streicher, C.,Patel, B. K. C. , Dwivedi, P. P. , Pot, B. , Prensier, G. , Garcia, J. L. (1995) Baci I Iusthermoamylovorans sp. nov. , amoderately thermophilic and amylolytic bacterium.Int. J. Syst. Bacteriol. 45:9-16、及 Coorevits, A. , Logan, N. , Dinsdale, A. , Halket, G.,Scheldeman, P. , Heyndrickx, M. , Schumann, P. , VanLandschoot, A. , De Vos, P. (2010)Bacillus thermoIactis sp. nov. , isolated from dairy farms, and emended descriptionofBacillus thermoamylovorans. Int. J. Syst. Microbiol. 56:781-786 中記載的內容。上述熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)如表I中所示，與熱噬淀粉芽孢桿菌的標準菌株(LMG18084T)相比，對作為難分解性的糖醇的阿拉伯糖、木糖醇等具有高的分解能力。因此，熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)在利用于發酵飼料等時，可對目前飼料價值低的含有難分解性的糖醇等的玉米外皮、小麥柏、大豆柏、蘑菇、蔬菜柏等期待有效的分解能力。另外，熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)也被確認了作為難分解性的多糖類的木聚糖的分解能力。另外，熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il)如圖4的電子顯微鏡照片所示，在通常的培養基條件下，形成芽孢的菌體與桿菌共存。

在上述序列號10中顯示堿基序列的凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)的近源種(N-16)與凝結芽孢桿菌的標準菌株(ATCC7050T)具有99. 9%的同源性。作為該凝結芽孢桿菌的近源種(N-16)的特征，可以舉出革蘭氏陽性、寬度0.7μπκ長度3 5μπκ形成芽孢、無淀粉分解能力、有葡萄糖、海藻糖、塔格糖的分解能力、過氧化氫酶陽性、氧化酶陰性、不將硝酸鹽還原成亞硝酸等。(2-3)溶解液3、4、5的制作作為僅含有熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種(N-Il) (ΒΡ-863)的溶解液制作溶解液3。另外，作為僅含有凝結芽孢桿菌的近源種(N-16) (ΒΡ-1051中含有的分離菌)的溶解液制作溶解液4。另外，作為僅含有熱噬淀粉芽孢桿菌的標準菌(LMG18084T)的溶解液制作溶解液5。實施例3(3-1)溶解液トA的檢驗實驗[I]對Wistar大鼠(雄性、3周齡)(從九動社獲得)施與溶解液1-A，進行檢驗該溶解液I-A的基因群表達調節效果的實驗。其中，通過準備下述3組并比較來進行本實驗。(I-A)組通常飼養組(對照組)(I-B)組溶解液I-A的飲水添加組 (I-C)組溶解液I-A (其中，經O. 02 μ m過濾器滅菌處理)的飲水添加組其中，對于Wistar大鼠，(1-A) (1-C)組均將經5天預備飼養的Wistar大鼠用于實驗。另外，Wistar大鼠各組均為5只，每只用各自的計量器(夏目制作所社制)進行飼養。另外，飼料使用經放射線滅菌的飼料(ォリユン夕ル酵母社制制品名MF)，對I只Wistar大鼠，使其在每日25g的攝取限制內自由攝食。另外，飲水對于(1-A)組使用自來7K，對于(I-B)組使用添加有I. 0%溶解液I-A的自來水，對于(I-C)組使用添加有I. 0%的用0. 02 μ m過濾器進行了滅菌處理的溶解液I-A的自來水，使其自由攝取。上述(I-A) (I-C)組的Wistar大鼠分別飼養3個月后，采取它們的的腸道、肝臟、脾臟、血液等，迅速用液氮冷凍，然后，在-80°C的冰箱中保管。
使用上述采取的小腸道分析各組間的基因群的表達的變動。具體而言，在從采取的小腸道中除去派爾集合淋巴結后的部位中，實施RNA提取。在IOOmg以下的組織中添加Isogen( ニッポンジーン社制)ΙΟΟΟμ I,在用液氮冷凍的狀態下用乳缽進行粉碎，使用RNAeasy mini kit (Quiagen公司制)進行該RNA提取。然后,各基因群的表達量如下進行數值化使上述提取的RNA與搭載小鼠的全基因的微陣列(Agilent公司制)雜交并清洗后，通過陣列掃描儀(Agilent公司制)進行各點熒光值的計算及補正。其結果如表2、3所
/Jn ο[表2]
SI卷因符_量Wf~
XM 213585, LGC500183,
免疫球蛋白相關基因RGDl359539, Z93370,向上
XM 345745, X60291, A2m 維生素D-結合蛋白前體iCMl.-il.i向上趨化因子(C-C基序)配基c^dl3ScSf8,向上
趨鈀面子墓序]受體匕はも5cr7 W±
核受體共破活因手.I..................................................................................................XM.574285…——.——......................j@.Ji一.—
顆粒酶B/自然殺傷細胞蛋白酶前體ぜ122金b思S257602070==et±[表3]
.典因.基因符號，節—
HBVuX 柏關名■白 8 夭]!エ型，, Hbxaj^redicted南下
破酸酐 |ENSRNOT00000051309向下
_8」 載脂蛋白A-VApoa5南下
內皮縮血管肽Edn3向下 _熱激如曰 4_Hspa4_t°J T~表2表示相對于(I-A)組在(I-B)組中顯示2. O倍以上的表達量的上位6個基因群。在這些基因群中，免疫球蛋白相關基因、趨化因子(C-C基序)配基、趨化因子(C-C基序)受體、顆粒酶B/自然殺傷細胞蛋白酶前體為粘膜免疫系統基因群，維生素D-結合蛋白前體為代謝相關基因群。另外，雖然表中沒有，但作為粘膜免疫系統基因群的腫瘤壞死因子受體也相對于(I-A)組在(I-B)組中為I. 8倍左右的表達量。其中，作為上述免疫球蛋白相關基因，確認了抗獨特型免疫球蛋白M輕鏈、免疫球蛋白Y 2a恒定區、NGF-結合Ig輕鏈、Ig Y-I、鏈C區、Y _2a免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白K鏈可變區。另外，作為上述趨化因子(C-C基序)配基，小誘導細胞因子B13前體(CXCL13)(B淋巴細胞化學引誘物)顯著地表達。進行利用實時PCR的定量化，結果相對于(I-A)組在(I-B)組中確認了 3. 6倍(n=3)的增加傾向。表3表示相對于(I-A)組在(I-B)組中顯示二分之一以下的表達量的上位5個基因群。在這些基因群中，HBV pX相關蛋白參與病毒感染的控制，碳酸酐酶參與氣體代謝，載脂蛋白A-V參與脂肪代謝，內皮縮血管肽參與血壓調節，熱激蛋白4參與基因表達、蛋白質功能調節及細胞內信號等。另外，(I-C)組與(I-B)組不同，相對于(I-A)組的基因群的表達量的變動少。(3-2)溶解液I-B的檢驗實驗[I]對無菌小鼠施與溶解液1-B，進行檢驗該溶解液I-B的基因群表達量調節效果的實驗。其中，通過準備下述2組并比較來進行本實驗。(2-A)組通常飼養組(對照組)
(2-B)組溶解液I-B的飲水添加組另外，無菌小鼠(從東京大學大學院農學生命科學研究科獸醫公眾衛生學研究室獲得并委托該研究室飼養)(2-A)、(2-B)組均為5只，在各組內用相同的隔離器(アイ·シ一 ·ユム社制)進行飼養。另外，飼料使用經放射線滅菌的飼料(ォリユン夕ル酵母社制制品名CMF)，使其自由攝食。另外，飲水對于(2-A)組使用通過紫外線及高壓滅菌器滅菌后的水，對于(2-B)組使用在通過紫外線及高壓滅菌器滅菌后的水中添加有O. 5%溶解液I-B的水，使其自由攝取。上述(2-A)、(2_B)組的無菌小鼠分別飼養3周后，采取它們的腸道、肝臟、脾臟、血液等，迅速用液氮進行冷凍，然后在-80°C的冰箱中保管。然后，應用與本實施例(3-1)同樣的方法分析各組間的基因群的表達量的變動。由上述分析的結果也表明，在無菌小鼠中，通過施與溶解液1-B，雖然與表2及表3中所示的Wistar大鼠的情況同樣地變化的基因群少，但是，如表4所示的類似的作為粘膜免疫系統基因群的免疫球蛋白相關基因、趨化因子(C-C基序)配基、腫瘤壞死因子受體 高表達，代謝相關基因群的表達也被調節。此外，該結果由于對無菌小鼠的施與時間短至3周，因而設想為短時間施與的效果。[表4]
小鼠基因符號調節免喪壞蛋白相矢秦因 Igsf9, Igsf3, Semas3b 南上LU111J ' 趨化因手(C-C墓；f.)配基· Ccl25 西上_月中瘤壞死因手受體_TnfMlb_向上(3-3)溶解液I-A的檢驗實驗[2]關于在本實施例(3-1)中采取的Wistar大鼠的肝臟，分析(1_A)、(I-B)組間的基因群間的表達量的變動。本分析應用與本實施例(3-1)同樣的方法進行。分析結果如表5、6所示。[表5]
基囡揀尋調嗜一 喚寬受體 1148 (predicted)Olr1148あ上
免疫球蛋白相關基因反igk 向上'UDP糖基轉移酶2家族，多肽BOlrlSSO向上
TRAF2 結合蛋白 LOC310877; Ab2-389 向上 __醇Ife氫酶 6fclass V)___MIS_南ヒ[表6]
基因符號g節_
............................................促.乳.素.婆'樂.......................................................RAfPRO^rMGCl65486..............向卞
...........白'買源'物 7...........LQC3i0395' '雨 T.................羥基.類て................................................nsdT7b2............................'雨'ず'□
..............apelin, AGTRLl 配IApel向下
......187 (predicted)RGD1308636向下
........................萏NFlHi酶Sik向下
_破臘紙舖'酶A脫氫酶_Scdl. Scd2_南下表5表示相對于(I-A)組在(I-B)組的肝臟中顯著高表達的主要的上位5個基因群。在這些的基因群中，免疫球蛋白相關基因為粘膜免疫系統的基因，醇脫氫酶6(class V)為代謝相關系統的基因。另外，嗅覺受體1148 (predicted)、UDP糖基轉移酶2家族多肽B、TRAF2結合蛋白為參與其它的生理反應的基因。另外，雖然表中沒有，但作為代謝相關基因群的葡糖激酶等也高表達。
另外，作為上述免疫球蛋白相關基因，可以舉出IgK鏈、Ig種系K-鏈C-區基因、3’末端、抗NGF30抗體輕鏈mRNA、可變區和恒定區、免疫球蛋白α重鏈。表6表示相對于(I-A)組在(I-B)組的肝臟中顯著低表達的主要的上位8個基因群。在這些的基因群中，羥基類固醇(17-β)脫氫酶2影響睪酮的增減，硬脂酰輔酶A脫氫酶影響甘油三酯的減少等脂肪代謝整體。另外，apelin在慢性肝病及肥胖時增加。(3-4)溶液I-B的檢驗實驗[2]關于在本實施例(3-2)中采取的無菌小鼠的肝臟，分析(2-A)、(2_B)組間的基因群的表達量的變動。本分析使用與本實施例(3-1)同樣的方法進行，分析結果如表7、8所示。[表7]
權利要求
1.一種混合物或溶解液，其特征在于，是通過在50°c 90°C使含有嗜熱微生物的有機物發酵而得到的，通過對動物施與該混合物或溶解液，從而調節該動物的選自粘膜免疫系統基因群、腸中的代謝相關基因群、肝臟中的代謝相關基因群中的至少I個基因群的表達，其中，作為所述嗜熱微生物，含有I種以上嗜熱性的芽孢桿菌屬、海洋芽胞桿菌屬、類芽孢桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、甲燒嗜熱菌屬、Geoge_a屬、火葉菌屬、熱網菌屬、超熱菌屬、火球菌屬、火棒菌屬、熱球菌屬、氣火菌屬、產水菌屬、熱袍菌屬、熱脫硫桿菌屬、棲熱菌屬、地芽孢桿菌屬、嗜熱絲孢菌屬、梭菌屬的微生物。
2.如權利要求I所述的混合物或溶解液，其特征在于，作為所述嗜熱微生物，含有嗜熱性復合菌BP-1051。
3.如權利要求I所述的混合物或溶解液，其特征在于，作為所述嗜熱微生物，含有BP-863，該BP-863具有對用熱噬淀粉芽孢桿菌的近源種難分解性的糖質的分解能力。
4.如權利要求I所述的混合物或溶解液，其特征在于，作為所述嗜熱微生物，含有嗜熱性種菌PTA-1773。
5.一種藥物，含有權利要求I 4的任一項所述的混合物或溶解液作為有效成分。
全文摘要
本發明的課題是提供一種使用了可調節粘膜免疫系統基因群、和/或腸、肝臟中的代謝相關基因群的嗜熱微生物的混合物、溶解液及藥物。作為本發明的解決問題的方法是，提供一種混合物或溶解液，是通過在50℃～90℃使含有嗜熱微生物的有機物發酵而得到的，通過對動物施與該混合物或溶解液，從而調節該動物的選自粘膜免疫系統基因群、腸中的代謝相關基因群、肝臟中的代謝相關基因群中的至少1個基因群的表達，其中，作為所述嗜熱微生物，含有1種以上嗜熱性的芽孢桿菌(Bacillus)屬、海洋芽胞桿菌(Oceanobacillus)屬、類芽孢桿菌(Paenibacillus)屬、厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)屬、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)屬、甲烷嗜熱菌(Methanopyrus)屬、Geogemma屬、火葉菌(Pyrolobus)屬、熱網菌(Pyrodictium)屬、超熱菌(Hyperthermus)屬、火球菌(Pyrococcus)屬、火棒菌屬(Pyrobaculum)、熱球菌(Thermococcus)屬、氣火菌(Aeropyrum)屬、產水菌(Aquifex)屬、熱袍菌(Thermotoga)屬、熱脫硫桿菌(Thermodesulfobacterium)屬、棲熱菌(Thermus)屬、地芽孢桿菌(Geobacillus)屬、嗜熱絲孢菌(Thermomyces)屬、梭菌(Clostridium)屬的微生物。
文檔編號A61P1/00GK102844038SQ201180009184
公開日2012年12月26日 申請日期2011年2月9日 優先權日2010年2月10日
發明者宮本浩邦, 兒玉浩明, 西內巧, 松下映夫, 宮本久, 堀內三吉, 瀨田真奈未, 森建一, 服部正平, 小川和男 申請人:日環科學株式會社, 國立大學法人千葉大學, 國立大學法人金沢大學, 獨立行政法人水產大學校, 株式會社三六九, 京葉設備工程株式會社