專利名稱：用于治療關節疾病和損傷的關節內補充方法
技術領域：
本發明涉及生產包含脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的混合物的球狀水凝膠小珠的方法。本發明還涉及用于治療關節病癥、特別是骨關節炎的新型補充方法(supplementation me thod)和組合物。
背景技術：
骨關節炎(osteoarthritis, 0A)是一種伴有疼痛的進行性退行性病癥,其特征在于關節中軟骨的斷裂、關節內存在的滑液的變質和所導致的骨硬化。骨關節炎隨年齡增加，在60歲以上的人中具有高于60%的可能性。目前，為了緩解伴隨OA的機械性疼痛，目前的療法通常是通過施用鎮痛劑或抗炎藥劑的治療或通過部分或整個關節置換的外科手術療法。備選方法是粘性補充療法(viscosupplementation),其是向關節內注射減少摩擦和疼痛的生物相容性粘性(例如，透明質酸)潤滑劑。粘性補充療法用于補充潤滑并且保護關節的滑液。事實上，在OA患者中，滑液的變化是透明質素(或透明質酸HA的鹽)的濃度和分子量(Mw)的減少。包含高分子量HA制劑的關節內注射劑目前是可獲得的并且被用于治療膝蓋，髖部，拇指或踝的腕掌關節。這些制劑需要一次(Durolane TM,Q-Med AB，Uppsala，瑞典)、三
次(Synvisc ，高分子量交聯的 HA，Ortliovise ')至五次(.Hyalgan'81，Supartz :)關節內(IA)注射(根據關節，每次注射I至3ml，包含5至20mg/ml的HA)。表I :透明質酸(HA)制劑
商標名公司平均Mw (kD)
Synvisc (Hylan G-20) Biornatrix(IllltAj)6.000-7.000
Healon Pliarrnacia/ Upjohn ( 典)丨.900-3900
Ortliovisc Anika (美 I )1.700-2.900
Artlirum LCA (法 N)2.000
Adant Meiji Seika (I I 木)900-1.200
S叩Artz ，Artz ，Seikagaku (丨 I 木)600-1 ..200
_Artzal ___
Ostenil Cliemedica (法丨丨;:丨)丨 _200
Hyalgan _Fidia (意大利)__500-730_
DurolaneIMQ-Med AB (瑞典)2 9000HA制劑有多種特征變化，包括，例如，HA的來源(動物來源的或細菌的)，HA的濃度和Mw以及所用的化學交聯的類型和程度(如果存在的話)。通常，大部分注射型HA制劑在注射后具有數小時至數天的停留半衰期。一些研究已經比較了上述產品的功效并且差異性地推論出患有膝蓋OA的患者有顯著的疼痛減輕及功能改善。一些研究的結論是與安慰劑注射相比較充其量存在些微作用。其他研究觀察到每周注射3-5次上述產品中的一種，顯著改善OA患者的疼痛和功能狀態，并且，盡管改善滯后3-4周發生，但是作用在治療終止后可以持續至少六個月以上。其他研究觀察到對OA癥狀(不僅對膝蓋OA而且對踝部或拇指的腕掌關節0A)的有益效果，但是也有不利效果。 此外，臨床效果可以在第I周迅速出現并且可以持續6個月以上，但是在所有情形中，主要由于大部分HA制劑的短的停留半衰期，對于骨關節疼痛的持久(六個月至一年)作用必需進行多次注射。最后，W02007/135114描述了使用不產生不溶性團聚體的藻酸鹽和脫乙酰殼多糖的混合物的多糖組合物的粘性補充療法。團聚體是由于脫乙酰殼多糖的聚陽離子性質導致，該性質使其難以與其他多糖如透明質酸(一種聚陰離子)或藻酸鹽相容。根據W02007/135114，多糖如脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的沉淀/團聚阻止其任何制劑用作可注射的組合物。因此，在W02007/135114中，具有至少40%的高衍生度的脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的水性混合物的組合物被描述為是高度粘性的但不產生不溶性團聚體。對于開發保護軟骨免受機械張力、為OA患者提供有效緩解而無須多次注射并且避免不利作用的新型關節內補充產品存在持續的需求。現在我們已經發現制備包含藻酸鹽和脫乙酰殼多糖的均質水凝膠基質的新方法，其中脫乙酰殼多糖具有低的分子量和團聚體。可通過該新方法得到的所產生的藻酸鹽/脫乙酰殼多糖小珠當用于關節內補充時保持令人驚訝的均質性和穩定性。現在我們已經發現用于脫乙酰殼多糖/藻酸鹽小珠的單次關節內補充的新方法和組合物，所述脫乙酰殼多糖/藻酸鹽小珠在關節內長期停留(至少兩周)，而不增加滑液的粘度。前述概述和下述描述不是對所要求的發明的限制。發明概述本發明的一個方面涉及制備水凝膠基質的方法，所述方法包括下述步驟-提供藻酸鹽溶液，-提供具有低于60kD的Mw的脫乙酰殼多糖的溶液，-將藻酸鹽溶液與脫乙酰殼多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含0.5-0. 7% (w/v)的脫乙酰殼多糖和1-1.4% (w/v)的藻酸鹽，-將所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+陽離子的溶液中，和-從所述具有陽離子的溶液分離凝膠化(gellified)的小珠。在本發明方法的特定實施方案中，將混合溶液的液滴引入到Sr2+離子溶液中。在該方法的具體實施方案中，所述混合溶液包含0. 6%的脫乙酰殼多糖和或包含I. 2%的藻酸鹽。在本發明方法的具體實施方案中，所述混合溶液中藻酸鹽與脫乙酰殼多糖之間的比例是I. 4-2. 8，或I. 75-2. 25或約為2。在本發明方法的具體實施方案中，所述脫乙酰殼多糖具有35_45kD的Mw和/或是動物來源的，或優選是植物來源的。
在本發明方法的另一些具體實施方案中，所述方法進一步包括將所述小珠混合在熱敏性水凝膠中的步驟。此處，小珠和水凝膠之間的比例如為5/1至1/1，或4/1至2/1。在本發明方法的另一些具體實施方案中，小珠的形成通過使液滴穿過針頭來進行，從而得到直徑為0. 01-5mm的小珠。本發明的另一個方面涉及包含脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的均質混合物的球形水凝膠小珠，其中所述小珠可以通過上述方法得到。本發明的另一個方面涉及包含脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的均質混合物、直徑為
0.01-5mm的球形水凝膠小珠，其特征在于所述小珠包含1_1. 4%的藻酸鹽和0. 5-0. 7%的 脫乙酰殼多糖，例如，所述小珠包含I. 2%的藻酸鹽，或例如，所述小珠包含0. 6%的脫乙酰
殼多糖。在本發明小珠的具體實施方案中，藻酸鹽/脫乙酰殼多糖的比為I.4-2.8，優選
1.75-2. 25，最優選 I. 8-2. 2。在本發明小珠的另一些具體實施方案中，所述脫乙酰殼多糖具有35_45kD的Mw和/或是動物來源的或植物來源的。本發明還涉及關節內補充物，所述關節內補充物包含直徑為0.01_5mm、包含藻酸鹽和分子量低于60kD的脫乙酰殼多糖的均質混合物的球形水凝膠小珠，其特征在于所述小珠包含1-1. 4%的藻酸鹽和0. 5-0. 7%的脫乙酰殼多糖。所述關節內補充物可以進一步包含粘性熱凝膠，例如，多糖水凝膠，特別是脫乙酰殼多糖水凝膠。提及多糖，人們意指生物聚合物，如透明質酸(已知其具有由葡萄糖醛酸和N-乙酰-葡糖胺組成的重復二糖單位)，藻酸鹽和脫乙酰殼多糖。脫乙酰殼多糖是一種自然中可廣泛獲得的多糖，其通過殼多糖的化學脫乙酰作用獲得，并且是甲殼類動物外骨骼的主要組成成分，而且還來自蘑菇壁。其由D-葡糖胺單位和N-乙酸-D-葡糖胺單位組成。關節內補充物還可以包含選自由下列各項組成的組的成分非留體抗炎藥、麻醉齊U、阿片類鎮痛劑、皮質類固醇、抗腫瘤藥、單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、維生素、礦物質、
營養制品。關節內補充物還可以包含另外的活性或非活性成分，包括，例如，非甾體抗炎藥(NSAIDS)，例如，雙氯芬酸 TM(diclofenacTM)，布洛芬 TM(ibuprofenTM)，批羅昔康TM(piroxicamTM)；鎮痛劑，例如，利多卡因TM(LidocaineTM)和布比卡因TM(BupivacaineTM);阿片類鎮痛劑，例如可待因(codeine)和嗎啡(morphine);皮質類固醇類，例如，地塞米松(dexamethasone)和潑尼松(prednisone);抗腫瘤劑，如甲氨蝶呤TM (MethotrexateTM);抗病毒藥劑，例如阿昔洛韋TM (AcyclovirTM)和阿糖腺苷TM(VidarabineTM);單克隆抗體,例如HumiraTM和嵌合單克隆抗體，例如英利昔單抗TM (inf IiximabTM)。關節內注射型補充物還可以包含下述成分,如細胞，蛋白質、DNA、礦物質(例如硒、鍶)、維生素(例如生育酚)、營養制品(例如姜黃素(curcumin))或其他需要的生物活性物質。本發明還涉及用于治療受試者的關節病癥和用于減輕與關節損傷或關節病(包括骨關節炎和創傷性軟骨損傷(traumatic cartilage lesions))相關的疼痛和不適的補充方法。所述關節病的實例包括骨關節炎(原發性(自發性的)或繼發性的)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、關節損傷(joint injury)(例如創傷性或反復性運動損傷(traumatic or repetitive motion injury))、軟骨病變(cartilage pathology)(例如軟骨隹丐沉著癥(chondrocalconsis)、軟骨軟化癥(chondromalacia))、膿毒性關節炎(septicarthritis)。本發明還提供減輕與所述疾病相關的疼痛，修復骨骼和軟骨損傷和減緩疾病進展的方法。治療關節病癥的補充方法包括施用按照本發明制備的關節內補充物。補充方法可以包括單次或多次關節內注射或植入足以提供治療效果的量的補充物。
關節內注射或植入在人或非人哺乳動物的骨骼和/或軟骨缺陷中例如通過關節鏡檢查或使用注射裝置如注射器直接進行。施用位點的實例包括,膝部、肩部、踝部、顳下頜(temporo-madibular)和腕掌關節、肘部、髖部、腕部、椎間盤。本發明還提供一種補充設備，其包括具有單次劑量的補充物的預填充、單次用注射器。附圖
簡要說明圖I顯示按照本發明的方法得到的小珠。圖2顯示藻酸鹽小珠(A)和脫乙酰殼多糖/藻酸鹽小珠⑶的截面[脫乙酰殼多糖深灰色小梁(trabeculae);藻酸鹽淺灰色背景]。圖3以低的放大率顯示包埋在脫乙酰殼多糖水凝膠中的脫乙酰殼多糖/藻酸鹽小珠。圖4顯示包含0. 6%脫乙酰殼多糖/I. 2%藻酸鹽小珠的熱敏性脫乙酰殼多糖水凝膠(雙孢蘑燕(A. bisporus)脫乙酰殼多糖(40kD))的植入。圖5顯示植入15天后植入物的組織學評估。A :軟骨下骨；B :細胞群集的(cell-colonized)的水凝膠；C :細胞群集的脫乙酰殼多糖/藻酸鹽小珠；D :包埋在脫乙酰殼多糖空隙(lacunae)中的細胞。發明詳述本發明的一個方面涉及生產水凝膠基質的方法。該方法包括下述步驟-提供藻酸鹽溶液，-提供具有低于60kD的Mw的脫乙酰殼多糖的溶液，-將藻酸鹽溶液與脫乙酰殼多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含0.5-0. 7% (w/v)的脫乙酰殼多糖和1-1. 4%的藻酸鹽，-將所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+離子的溶液中-從具有陽離子的溶液分離凝膠化的小珠。通過該方法得到的水凝膠產生藻酸鈣和脫乙酰殼多糖的均質基質。如在本發明中得到的基質與現有技術的基質不同，現有技術的基質具有一種成分的核，其被另一種成分的層包被。與首先被凍干以獲得某種程度的孔隙度的基質相比，如在本發明中得到的基質具有優點，即，該基質的孔隙度可以更準確地確定。如在本發明中得到的基質具有優點，即，由低分子量的(尤其是15_50kDA的)脫乙酰殼多糖組成，其在藻酸鹽基質中自發形成均質網絡。如在實施例部分所示，用于制備水凝膠的藻酸鹽和脫乙酰殼多糖溶解在具有殺菌作用的強的堿性或酸性緩沖液中。這是本發明另外的優點。在根據本發明的方法中，可以混合藻酸鹽和脫乙酰殼多糖溶液以得到具有不同濃度的小珠。本發明的具體實施方案涉及這樣的小珠，其中，在通過鈣離子或鍶離子凝膠化之前，組合物包含 0. 4,0. 45,0. 5,0. 55,0. 60,0. 65,0. 70,0. 75 或 0. 80 % (w/v)的脫乙酰 殼多糖，并且獨立于其地包含 0. 9,0. 95,0. 1,0. 105,0. 11,0. 115,0. 12,0. 125,0. 13,0. 135、0. 14、0. 145或I. 5% (w/v)的藻酸鹽。在具體實施方案中，脫乙酰殼多糖的濃度范圍在
0.5-0.7%，或0.55-0. 65%。在其他具體實施方案中，藻酸鹽的濃度范圍在I.至I. 4%或
1.25至I. 35%。水凝膠的一個具體實施方案包含約0. 6%的脫乙酰殼多糖和約I. 2%的藻酸鹽。本發明的方法和組合物的其他實施方案涉及水凝膠組合物和其所得到的小珠，其中在混合溶液中藻酸鹽與脫乙酰殼多糖的比為I. 4-2. 8，更特別為I. 5-2. 7，更特別為
I.6-2. 6，或 I. 75-2. 25。該比率的具體值為約 I. 9，I. 95，2. 0，2. 05 和 I。在本發明的方法中，小珠的平均尺寸可以調整并且通過調節用于形成被引入到鈣或鍶溶液中的液滴的針頭的直徑而憑經驗確定。本文考慮直徑為0.01-5_的小珠。這些尺寸在操作容易性與營養物擴散到小珠中之間提供折衷。來自本發明的脫乙酰殼多糖可以分離自不同的動物來源，如甲殼類動物(crustaceans)(對奸殼)或烏賊類動物。備選地，脫乙酰殼多糖可以是植物來源的，更特別是真菌來源的，如毛霉目(Mucoralean)菌株，總狀毛霉(Mucor racemosus)和雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans),卵形抱球托霉(Gongronella butleri),黑曲霉(Aspergillus niger)，稻根霉菌(Rhizopus oryzae)，香 (Lentinus edodes)，鳳尾燕(Pleurotus sajo-caju),魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii),白色念珠菌(Candida albicans)或雙抱蘑 (Agaricus bisporus)。脫乙酰殼多糖還以多種類型的分子量存在。此處，脫乙酰殼多糖的鏈長可以對水凝膠的三維結構起作用。用于本發明的典型的脫乙酰殼多糖可以具有15-50kD、更具體是35-45kD的平均分子量。上述制備小珠的方法導致形成包含脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的均質混合物的球形水凝膠小珠。在具體的實施方案中，補充物被配制成由小珠和粘性凝膠形成的兩相補充材料。該補充物包括聚合基質(“凝膠”)和包含脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的球形三維小珠。這允許配制可植入的或可注射的凝膠，其在植入時確保在宿主組織或器官中的最佳空間分布。此處典型地與通過本發明方法制備的小珠一起用于補充物中的凝膠是熱敏性凝膠。這些凝膠在環境溫度保持液態(在用于引入到患者中的裝置中)，但是當引入機體時在約37°C變成固體。這種原位凝膠化保持小珠的空間分布。體外測試已經證明當加熱至37°C時，小珠在這樣的水凝膠中均勻分布。熱敏性水凝膠的實例包括聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)。其一種具體的類型是脫乙酰殼多糖。
不受理論限制，據信在微珠內的脫乙酰殼多糖網絡賦予小珠特定的機械特性，以使它們與僅由藻酸鹽制成的小珠相比更不可壓縮且更抗壓。本發明的基質提供在藻酸鹽凝膠內的相互連接的脫乙酰殼多糖小梁(trabeculae),其通過提供中性pH的水性介質而產生有利于細胞培養的環境。這樣的小梁由不溶性脫乙酰殼多糖得到，所述不溶性脫乙酰殼多糖在與藻酸鹽混合時形成團聚體，所述團聚體產生籃狀結構網絡或小梁。小梁的厚度和長度可變，并且為小珠提供特定的生物學特性和機械特性，如表型穩定性、可變形性、彈性和壓縮模量。
實施例實施例I.制備藻酸鹽/脫乙酰殼多糖小珠由脫乙酰殼多糖(最終為0. 6% )和藻酸鹽(最終為I. 2% )的均質混合物制備小珠。在混合之前，分別制備這兩種溶液。藻酸鹽和脫乙酰殼多糖溶液以下述方式制備制備在0. 16M NaOH中的2. 4% (W/v)的藻酸鹽溶液和在I. 666M HAc中的I. 333% (w/v)的脫乙酰殼多糖溶液。向10體積的藻酸鹽溶液中，加入I體積的IM Hepes (4-(2-羥乙基)-1_哌嗪乙烷磺酸)溶液。均質化后，逐漸加入9體積的脫乙酰殼多糖溶液，同時規律且劇烈攪拌。將脫乙酰殼多糖/藻酸鹽溶液緩慢通過25號針(25 gauges needle),以逐滴形式進A 102mM CaCl2溶液(Sigma-Aldrich (西格瑪-奧德里奇)，Bornem,比利時)中。在瞬時凝膠化后，允許小珠在該CaCl2溶液中再凝膠化10分鐘。在微觀尺度下，脫乙酰殼多糖(被曙紅染成紅色)形成由不同厚度和長度的小梁或纖維組成的籃狀結構(見圖2和3)。此處的間隙由藻酸鹽(蘇木精染色成紫色)填充。實施例2.將小珠配制在熱敏性水凝膠中將小珠與植物(雙孢蘑燕)脫乙酰殼多糖水凝膠(Kitozyme,Alleur,比利時)混合。該步驟在低于27°C進行以避免水凝膠膠凝。使用3/l(v/v)的小珠/水凝膠的比。實施例3.在動物模型中植入將如實施例2所述的凝膠植入到具有軟骨下骨和軟骨缺陷關節的兔中。(圖4)。植入15天后，評價所述植入物(圖5)。損傷仍然被植入物填充。小珠和粘性水凝膠在注射后至少兩周在損傷的關節內保持不變，同時保持安全性特征。此外，還觀察到植入物群集有來源于下面的骨髓的細胞。細胞匯集(encountered)在固定的熱敏性脫乙酰殼多糖水凝膠⑶以及在脫乙酰殼多糖藻酸鹽小珠(C)中(脫乙酰殼多糖小梁顯示為D)。該測試證實兩相植入物能夠容易地操作和植入。植入物的生物可降解性質確保植入后的逐漸吸收。實施例4.脫乙酰殼多糖分子量對小珠形成的影響在根據本發明的方法中已經使用了不同分子量的天然脫乙酰殼多糖。測量混合溶液(與軟骨細胞一起)的不同物理參數如PH和粘度。按照本領域公知的技術測量所得到的水凝膠的滲透性。表I
權利要求
1.一種生產用于關節內補充物的水凝膠的方法，所述方法包括下述步驟 -提供藻酸鹽溶液， -提供具有低于60kD的Mw的脫乙酰殼多糖的溶液， -將所述藻酸鹽溶液與所述脫乙酰殼多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含O. 5-0. 7% (w/v)的脫乙酰殼多糖和1-1.4% (w/v)的藻酸鹽， -將所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+陽離子的溶液中，和 -從所述具有陽離子的溶液分離凝膠化的小珠。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述混合溶液包含O.6%的脫乙酰殼多糖。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中所述混合溶液包含I.2%的藻酸鹽。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的方法，其中在所述混合溶液中，藻酸鹽和脫乙酰殼多糖以I. 75-2. 25的比率存在。
5.根據權利要求I至4中任一項所述的方法，其中所述脫乙酰殼多糖具有35-45kD的Mw0
6.根據權利要求I至5中任一項所述的方法，其中所述液滴通過針，以得到直徑為O. OI-5mm的小珠。
7.根據權利要求I至6中任一項所述的方法，其中脫乙酰殼多糖是動物來源的或植物來源的。
8.一種包含藻酸鹽和Mw低于60kD的脫乙酰殼多糖的均質混合物、直徑為O. 01-5mm的球形水凝膠小珠，其特征在于所述小珠包含1-1. 4%的藻酸鹽和O. 5-0. 7%的脫乙酰殼多糖。
9.根據權利要求8所述的小珠，其中所述小珠包含I.2%的藻酸鹽。
10.根據權利要求8或9所述的小珠，其中所述小珠包含O.6%的脫乙酰殼多糖。
11.根據權利要求8至10中任一項所述的小珠，其中所述脫乙酰殼多糖具有35-45kD的Mw。
12.權利要求8至11中任一項所述的小珠用于關節內補充的應用。
13.一種包含直徑為O. 01-5mm的球形水凝膠小珠的關節內補充物，所述球形水凝膠小珠包含藻酸鹽和Mw低于60kD的脫乙酰殼多糖的均質混合物，其特征在于所述小珠包含1-1. 4%的藻酸鹽和O. 5-0. 7%的脫乙酰殼多糖。
14.根據權利要求13所述的關節內補充物，其還包含粘性熱凝膠，優選脫乙酰殼多糖水凝膠。
15.根據權利要求13至14中任一項所述的關節內補充物，其中脫乙酰殼多糖是動物來源的或優選植物來源的。
16.根據權利要求13至15中任一項所述的關節內補充物，其還包含選自由下列各項組成的組的成分非留體抗炎藥、麻醉劑、阿片類鎮痛劑、皮質類固醇、抗腫瘤藥、單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、維生素、礦物質、營養制品。
17.一種用于治療人受試者或動物的關節的補充方法，所述方法包括權利要求8至11中任一項所述的水凝膠小珠的單次或多次關節內施用。
18.一種補充裝置，其包含權利要求8至11中任一項所述的水凝膠小珠。
全文摘要
一種生產用于關節內補充物的水凝膠的方法，所述方法包括下述步驟提供藻酸鹽溶液，提供具有低于60kD的Mw的脫乙酰殼多糖的溶液，將藻酸鹽溶液與脫乙酰殼多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含0.5-0.7％(w/v)的脫乙酰殼多糖和1-1.4％(w/v)的藻酸鹽，將所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+陽離子的溶液中，和從所述具有陽離子的溶液分離聚合的小珠。
文檔編號A61L27/52GK102762233SQ201180008577
公開日2012年10月31日 申請日期2011年2月11日 優先權日2010年2月25日
發明者伊夫·昂羅丹, 克里斯泰勒·桑謝, 弗雷德里克·奧普雷涅茨克, 皮埃爾·德里翁 申請人:列日大學, 基多塞米股份公司