專利名稱：緩釋核酸基質組合物的制作方法
技術領域：
本發明提供了用于延長釋放和/或控釋基于核酸的藥物/藥劑(試劑)的組合物，該組合物包含含有生物相容性聚合物的基于脂質的基質(脂質類基質)。本發明還提供了制備基質組合物(matrix compositions)的方法以及利用基質組合物來提供核酸活性劑的控釋的方法。
背景技術：
治療性核酸基因療法是藥物開發中的主要研究領域。已認為基因療法是這樣的期望的機制，其用來糾正導致與無法產生某些蛋白質有關的疾病的遺傳缺損并且用來克服獲得性疾病如自身免疫病和癌癥。基因療法可以為許多疾病的治療提供新的預防途徑。然而，基因療法的商業化的技術障礙在于，對于多核苷酸的遞送以及緩釋和/或控釋，需要實用、有效和安全的方式。由于在帶負電荷的細胞膜和在多核苷酸上的高負電荷之間的電荷排斥，多核苷酸并不容易滲透細胞膜。因此，多核苷酸具有較差的生物利用度，并且攝取進入細胞，通常〈1%。在動物模型中，基于病毒的載體已成功用來將基因給予期望的組織。在一些情況下，這些途徑已導致治療水平的蛋白質的長期(>2年)表達。然而，已廣泛地報告了基于病毒途徑的限度。例如，借助于這些載體的重新給予是不可能的，這是由于相對于病毒蛋白產生的體液免疫反應。除為獲得適當的可重復的載體供應所面臨的制造挑戰以外，還存在與病毒載體有關的顯著的安全問題，尤其是對于那些靶向肝用于基因表達的病毒載體。盡管存在與病毒基因療法有關的問題，但許多人已認為病毒比非病毒遞送載體更有效。通過寡核酸并利用稱作反義療法、RNA干擾(RNAi)、和酶核酸分子的技術，可以影響在細胞中特定基因表達的沉默或下調。反義療法是指通過使用互補DNA或RNA寡核酸來滅活靶DNA或mRNA序列從而抑制基因轉錄或翻譯的方法。反義分子可以是單鏈、雙鏈或三鏈螺旋。能夠抑制表達的其它藥劑是例如酶核酸分子如DNA酶和核酶，其能夠特異性地切割感興趣的mRNA轉錄物。DNA酶是單鏈脫氧核糖核苷酸，其能夠切割單和雙鏈靶序列。核酶是催化核糖核酸分子，其越來越多地用于基因表達的序列特異性抑制，其中通過編碼感興趣的蛋白質的mRNA的切割。RNA干擾是基因表達的轉錄后抑制的方法，其中上述基因表達在許多真核生物體中是保守的。它有助于控制哪些基因是主動的以及它們是如何主動的。對于RNA干擾來說，兩種類型的小RNA分子-微RNA (miRNA)和小分子干擾RNA (siRNA)-是重要的。RNA是基因的直接產物，并且這些小RNA可以結合于特定的其它RNA并增加或降低它們的活性，例如通過防止信使RNA產生蛋白質。RNA干擾在防衛細胞以抵抗寄生基因(病毒和轉座子)方面以及一般地在引導擴生和基因表達方面具有重要作用。雖然RNA干擾效應(其是通過小分子干擾RNA (siRNA)或微RNA加以介導)對人類治療具有潛在的應用，但通常用于寡核苷酸的快速給予的流體力學方法不適用于人類。對于制藥業來說，基于RNAi的療法的開發是相對較新的。雖然已克服開發上述藥物的許多障礙，但RNAi化合物到適當組織并進入細胞的最佳遞送仍然是一種挑戰。
核酸的遞送非病毒基因療法的一個問題是實現足夠核酸的遞送和表達以導致有形的、生理有關的表達。雖然數年以前已表明，在等滲鹽水中的DNA質粒(所謂的“裸’DNA)可以體內轉染各種細胞，但這樣的未受保護的質粒易被酶降解，從而導致在動物模型中攝取的不可重現性以及高度可變的表達和生物反應。在大多數組織中“裸”質粒的非常低的生物利用度還需要給予高劑量的質粒以產生藥理反應。因而，非病毒基因遞送的領域已被引向開發更加有效的合成遞送系統，其能夠增加質粒遞送的效率、賦予長期表達并提供儲存穩定劑型(如其它藥劑劑型所預期的)。促進細胞攝取DNA的化學方法包括使用DEAE-葡聚糖。然而，這可以導致細胞活力的喪失。磷酸鈣也是常用的化學藥劑，當 和DNA共沉淀時，其將DNA引入細胞。引入DNA的物理方法已變成用來再現地轉染細胞的有效方式。直接微注射是一種這樣的方法，其可以將DNA直接遞送到細胞核(Capecchi 1980，Cell, 22，479)。這便于分析單細胞轉染子。所謂的“生物導彈”方法利用涂布有DNA的高速顆粒物理上將DNA插入到細胞和/或細胞器中。電穿孔是用來轉染DNA的最常用的方法之一。該方法涉及使用高電壓電荷來瞬間通透細胞膜，從而使它們可滲透大分子復合物。然而，由于細胞內損傷，用來引入DNA的物理方法確實會導致細胞活力的相當大的喪失。最近一種稱作免疫穿孔的方法已變成用于將核酸引入細胞的公認的技術(Bildirici et al 2000，Nature, 405，298)。取決于所使用的核酸，可以實現40-50%的轉染效率。因而這些方法需要廣泛的優化并且還需要昂貴的設備。為了克服核酸(通常質粒DNA( “pDNA”)、或siRNAs/微RNA)的降解問題和增強基因轉染的效率，已開發了陽離子縮合劑(如多聚季銨鹽、樹狀聚物、殼聚糖、脂質、和肽)來保護核酸，其中通過借助于靜電相互作用來縮合它。然而，與“裸”DNA的轉染相比，縮合質粒顆粒用于體內轉染大量的例如肌細胞并不成功。另外的策略，其包括通過與保護性的、可相互作用的非縮合系統的相互作用來調節質粒表面電荷和疏水性，已顯示出優越于使用“裸"DNA來直接給予實體組織(例如，國際申請公開號WO 96/21470)。封裝核酸的生物可降解微球體也已用于基因遞送。例如，國際申請公開號WO00/78357披露了包括透明質酸的基質、薄膜、凝膠和水凝膠，其用二肼加以衍生化并交聯于核酸，以形成緩慢釋放微球體。基于脂質的藥物遞送系統在醫藥科學領域中是眾所周知的。通常它們用來配制具有較差的生物利用度或高毒性或兩者的藥物。在已獲得接受的流行的劑型中，有許多不同類型的脂質體，其包括小單層囊泡、多片層囊泡和許多其它類型的脂質體；不同類型的乳液，其包括油包水乳液、水包油乳液、水中油包水雙重乳液、亞微米乳液、微乳狀液；膠束和許多其它疏水性藥物載體。這些類型的基于脂質的遞送系統可以高度專門用來允許靶向藥物遞送或降低的毒性或增加的代謝穩定性等。在數天、數周和更長時間內的延長釋放并不是通常伴隨基于脂質的體內藥物遞送系統的分布。對于體外和體內基因遞送，由兩親陽離子分子構成的脂質體是有用的非病毒載體。在理論上，脂質的陽離子頭締合于DNA的帶負電荷的核酸主鏈以形成脂質核酸復合物。作為基因轉移載體，脂質核酸復合物具有許多優點。不同于病毒載體，脂質核酸復合物可以用來轉移基本上大小不受限制的表達盒。因為上述復合物缺乏蛋白質，所以它們可以誘發很少免疫原性和炎性反應。另外，它們不能復制或重組以形成傳染劑并且具有低整合頻率。陽離子脂質(例如脂質體)的使用已變成常用方法，因為它并不具有化學方法所顯示的毒性度。存在許多出版物，通過顯示在體外培養細胞中報道基因的可檢測表達，其令人信服地表明，兩親陽離子脂質可以體內和體外介導基因遞送。由于脂質核酸復合物有時并不和病毒載體同樣有效地實現成功的基因轉移，所以很多努力已致力于發現具有增加的轉染效率的陽離子脂質(Gao et al. , 1995, Gene Therapy 2,710-722)。許多工作已報道了在動物中以及在人類中兩親陽離子脂質核酸復合物用于體內轉染(在 Thierry et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995，92，9742-9746 中加以評論)。然而，用于制備具有穩定保質期的復合物的技術問題還沒有得到解決。例如，不同于病毒載體制備，就顆粒尺寸而言，脂質核酸復合物是不穩定的。因而難以獲得具有適用于全身注射的尺寸分布的均勻的脂質核酸復合物。脂質核酸復合物的大多數制劑是相對穩定的。因而，通常必須在30分鐘至數小時的短時期內使用這些復合物。在使用陽離子脂質作為用 于DNA遞送的載體的臨床試驗中，在床側混合兩種成分并立即使用。結構不穩定性以及隨著時間的推移脂質核酸復合物的轉染活性的喪失一直是脂質介導基因療法的未來開發的挑戰。在本領域中的許多的最新發展已專注于通過結合經過證實的陽離子遞送劑與另一個部分來改進陽離子系統。然而，陽離子主鏈共軛物(結合物)還沒有成功克服毒性并且沒有一種被批準用于治療用途。國際申請公開號WO95/24929披露了基因在生物相容性基質中的封裝或分散，優選可生物降解的聚合物基質，其中在延長期間內基因能夠擴散出基質。優選地，基質具有以下形式微顆粒如微球體、微膠囊、薄膜、植入物、或在裝置如支架上的涂層。美國專利號6，048，551披露了控釋基因遞送系統，其采用聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、和Ludragit R、L、和E系列的聚合物以及共聚物微球體來封裝基因載體。美國申請公開號20070141134披露了可以增強多核苷酸的細胞內遞送的組合物，其中可以將多核苷酸加入PEG屏蔽膠束顆粒以促進多核苷酸穿過細胞膜的遞送。通過共價和非共價方式來將多核苷酸加入屏蔽膠束顆粒。還可以將其它細胞靶向劑共價偶聯于屏蔽膠束顆粒以增強在體內的定位。國際專利申請公開號WO 2008/124634披露了一種方法，該方法用于在可生物降解聚合物中封裝核酸，尤其是siRNA、shRNA、微RNA、基因療法質粒、和其它寡核苷酸，從而在通過納米沉淀來形成納米顆粒以前將核酸配制成由無毒性和/或天然存在的脂質構成的反膠團。國際申請公開號WO 2009/127060披露一種核酸-脂質顆粒，該顆粒，除核酸以外，還包含陽離子脂質、非陽離子脂質和結合的脂質，其可以抑制顆粒的聚集。國際專利申請公開號WO 2010/007623(授權給本發明的一些發明人并在本發明的優先權日以后公布)披露了用于延長釋放疏水性分子如類固醇和抗生素的組合物，該組合物包含含有可生物降解聚合物的基于脂質的基質。理想地，緩釋藥物遞送系統應呈現通過所使用的特定賦形劑的類型和比例容易控制的動力學和其它特性。目前仍然未得到滿足的需求是改善的核酸組合物和方法，用于受控和延長遞送治療性核酸藥劑以接近組織和進入細胞，進而進行基因療法。在現有技術中，并沒有提出，包含脂質和生物相容性聚合物的基質組合物將具有用于遞送基于核酸的藥劑的改善的性能。
發明內容
本發明提供了用于延長釋放核酸藥劑，尤其是基于核酸的藥物的組合物，該組合物包含含有生物相容性聚合物的基于脂質的基質。基質組合物特別適用于核酸藥劑(核酸齊IJ)的局部遞送或局部應用。本發明還提供了用來產生基質組合物的方法和用來利用基質組合物以提供活性核酸組分的受控和/或緩釋的方法。本發明部分地基于以下意外的發現可以有效地將在包含聚乙二醇(PEG)的水基溶液中存在的帶負電荷的核酸加載到包含至少一種生物相容性聚合物的基于脂質的基質， 其中聚合物可以是可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物(非生物降解聚合物，不能生物降解聚合物)或它們的組合。另外，核酸可以以受控和/或延長的方式釋放自基質。本發明的基質組合物優越于迄今已知的用于核酸遞送的組合物和基質，這是因為它結合了核酸藥劑到細胞或組織的有效局部遞送和核酸藥劑的受控和/或持續釋放。在一個方面，本發明提供了基質組合物，該組合物包含(a)藥用生物相容性聚合物連同第一脂質成分，其包含至少一種具有極性基團的脂質；(b)第二脂質成分，其包含至少一種具有至少14個碳子的脂肪酸部分的磷脂；(c)至少一種核酸藥劑(試劑)；以及(d)聚乙二醇(PEG)，其中基質組合物適應于提供核酸的緩釋和/或控釋。具有治療或診斷效用的任何核酸分子可以用作本發明的基質組合物的一部分。核酸藥劑可以包括DNA分子、RNA分子、單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈。核酸藥劑的非限制性清單包括質粒0嫩、線狀0嫩(多核苷酸和寡核苷酸)、染色體0嫩、信使1 應(1111 應)、反義DNA/RNA、RNAi, siRNA、微RNA (miRNA)、核糖體RNA、鎖定核酸類似物(LNA)、寡核苷酸DNA(ODN)單和雙鏈、免疫刺激序列(ISS)、和核酶。根據本發明的核酸藥劑可以包括天然分子、修飾分子或人造分子。根據某些實施方式，核酸具有與PEG的非共價相互作用。根據某些實施方式，PEG是分子量為1，000-10，000的線性PEG。根據典型的實施方式，PEG分子量為1，000-8，000，更通常低于8，000。根據本發明的教導，還可以使用生物可降解PEG分子，尤其是包含可降解間隔區并具有較高分子量的PEG分子。分子量為5，000以下的PEG分子目前被批準用于制藥用途。因而，根據某些典型的實施方式，活性PEG分子具有可達5，000的分子量。根據一些實施方式，基質組合物包含至少一種陽離子脂質。根據某些實施方式，陽離子脂質選自由DC-膽固醇、1，2- 二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、二甲基雙十八烷基銨(DDAB)、I, 2- 二月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(乙基PC)、1，2- 二 -O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、和其它陽離子脂質組成的組。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。根據某些實施方式，生物相容性聚合物選自由可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物和它們的組合組成的組。根據某些實施方式，可生物降解聚合物包含聚酯，其選自由PLA(聚乳酸)、PGA(聚乙醇酸)、PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸))和它們的組合組成的組。根據其它實施方式，不可生物降解聚合物選自由聚乙二醇(PEG)、PEG丙烯酸酯、PEG甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸羥乙酯、2-甲基丙烯酰羥乙基磷酰膽堿(2-甲基丙烯酰基乙氧基磷酰膽堿)(MPC)、聚苯乙烯、衍生化聚苯乙烯、聚賴氨酸、聚N-乙基-4-乙烯基吡啶溴化物、聚甲基丙烯酸酯、硅氧烷、聚甲醛、聚氨酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸、和它們的單獨的衍生物或它們的共聚混合物組成的組。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。根據另外的實施方式，不可生物降解聚合物和可生物降解聚合物形成嵌段共聚物，例如，PLGA-PEG-PLGA 等。根據某些實施方式，具有極性基團的脂質選自由留醇、生育酚和磷脂酰乙醇胺組成的組。根據某些特定的實施方式，具有極性基團的脂質是留醇或其衍生物。根據典型的實施方式，留醇是膽固醇。根據某些實施方式，混合第一脂質成分與生物相容性聚合物以形成非共價締合。·
根據某些特定的實施方式，第一脂質成分是留醇或其衍生物，而生物相容性聚合物是可生物降解聚酯。根據這些實施方式，借助于非共價鍵，可生物降解聚酯締合于甾醇。根據一些實施方式，第二脂質成分包含磷脂酰膽堿(卵磷脂)或其衍生物。根據其它實施方式，第二脂質成分包含磷脂酰膽堿或其衍生物的混合物。根據另一些實施方式，第二脂質成分包含磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺或它們的衍生物的混合物。根據另外的實施方式，第二脂質成分進一步包含留醇和其衍生物。根據典型的實施方式，留醇是膽固醇。根據進一步的實施方式，第二脂質成分包含各種類型的磷脂的混合物。根據某些典型的實施方式，第二脂質成分進一步包含鞘脂、生育酚和聚乙二醇化脂質中的至少一種。根據另外的實施方式，總脂質與生物相容性聚合物的重量比為1:1以上至9:1以下。根據某些實施方式，基質組合物是均勻的(均質的，均相的)。在其它實施方式中，基質組合物具有基于脂質的基質的形式，其形狀和邊界由可生物降解聚合物來確定。在進一步的實施方式中，基質組合物具有植入物的形式。在某些特定的實施方式中，本發明提供了基質組合物，該組合物包含(a)可生物降解聚酯；(b)留醇；(c)磷脂酰乙醇胺，其具有至少14個碳原子的脂肪酸部分；(d)磷脂酰膽堿，其具有至少14個碳原子的脂肪酸部分；(e)核酸藥劑；和(f)PEG。在某些實施方式中，基質組合物包含按重量計至少50%脂質。在某些另外的實施方式中，基質組合物進一步包含靶向部分。在某些實施方式中，基質組合物能夠體內被降解成小泡，釋放核酸的一些或所有質量被整合到其中。在其它實施方式中，基質組合物能夠體內被降解以形成小泡，其中整合有活性劑和靶向部分。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。根據另外的方面，本發明提供了一種藥物組合物，該組合物包含本發明的基質組合物和藥用賦形劑。根據某些實施方式，在除去有機溶劑和水以后，本發明的基質組合物具有植入物的形式。在另一種實施方式中，植入物是均勻的。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。
根據某些實施方式，從本發明的組合物產生植入物的方法包括以下步驟(a)根據本發明的方法，產生散裝材料(bulk material)形式的基質組合物；以及(b)將散裝材料轉移到期望形狀的模具或固體容器中。按照另一個方面，本發明提供了用來制備用于遞送以及緩釋和/或控釋核酸藥劑的基質組合物的方法，該方法包括(a)將(i)生物相容性聚合物和(ii)包含至少一種具有極性基團的脂質的第一脂質成分混合到第一揮發性有機溶劑中；(b)將聚乙二醇混合到核酸藥劑的水基溶液中；(C)將在步驟(b)中獲得的溶液與第二揮發性有機溶劑和第二脂質成分混合，所述第二脂質成分包含至少一種具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂；
(d)混合在步驟(a)和(C)中獲得的溶液以形成均勻混合物；以及(e)除去揮發性溶劑和水，從而產生包含核酸藥劑的均勻多聚體-磷脂基質。根據某些實施方式，步驟(C)可選地進一步包括(i)通過蒸發除去溶劑，冷凍干燥或離心，以形成沉積物；以及(ii)將獲得的沉積物懸浮于第二揮發性有機溶劑中。根據在特定制劑中所使用的特定核酸和其它物質和活性核酸的預期用途，以及根據本文描述的本發明的實施方式，來選擇特定溶劑。按照核酸所期望的釋放速率并根據本文描述的本發明的實施方式來選擇形成本發明的基質的特定脂質。通常在根據所獲得的溶液的性能確定的受控溫度下通過蒸發來除去溶劑。利用真空進一步除去有機溶劑和水的殘留物。根據本發明，不同類型的揮發性有機溶液的使用使得能夠形成均勻的防水的基于脂質的基質組合物。根據各種實施方式，第一和第二溶劑可以是相同或不同的。根據一些實施方式，一種溶劑可以是非極性溶液而其它溶劑優選為水混溶性溶劑。根據某些實施方式，基質組合物是基本上沒有水。術語〃基本上沒有水〃是指包含按重量計小于1%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 8%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 6%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 4%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 2%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指不存在影響基質的防水性能的水量。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。在其它實施方式中，基質組合物是基本上沒有水。〃基本上沒有〃是指包含按重量計小于O. 1%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 08%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 06%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 04%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 02%水的組合物。在另一種實施方式中，該術語是指包含按重量計小于O. 01%水的組合物。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。在另一種實施方式中，基質組合物沒有水。在另一種實施方式中，該術語是指不包含可檢出量水的組合物。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。根據某些典型的實施方式，本發明提供了制備基質組合物的方法，該方法包括以下步驟
(a)將⑴可生物降解聚酯與(ii)甾醇混合到非極性揮發性有機溶劑中；(b)將分子量為1，000-8, 000的聚乙二醇混合到核酸藥劑的水基溶液中；(c)混合在步驟(b)中獲得的溶液與水混溶性揮發性有機溶劑，所述有機溶劑包含磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰膽堿和/或留醇；以及(d)混合在步驟(a)和(C)中獲得的溶液以形成均勻混合物；(e)除去有機溶劑和水；以及(f)通過真空進一步除去剩余溶劑。根據某些實施方式，可生物降解聚酯選自由PLA、PGA和PLGA組成的組。在其它實 施方式中，可生物降解聚酯是本領域已知的任何其它適宜的可生物降解聚酯或聚胺。在另外的實施方式中，在混合與水混溶性揮發性有機溶劑混合物以前，均化包含非極性有機溶劑的混合物。在其它實施方式中，在混合與包含非極性有機溶劑的混合物以前，均化包含水混溶性有機溶劑的混合物。在某些實施方式中，在步驟(a)的混合物中的聚合物是脂質飽和的。在另外的實施方式中，基質組合物是脂質飽和的。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。本發明的基質組合物可以用于完全或部分地涂布不同基體(基底，襯底，底物)的表面。根據某些實施方式，待涂布的基體包括至少一種材料，該材料選自由碳纖維、不銹鋼、鈷鉻、鈦合金、鉭、陶瓷和膠原或明膠組成的組。在其它實施方式中，基體可以包括任何醫療裝置和骨填料顆粒。骨填料顆粒可以是任何以下一種同種異體骨顆粒(即，來自人源)、異種骨顆粒(即，來自動物源)和人工骨顆粒。在其它實施方式中，利用涂布基體的治療和涂布基體的給予將按照本領域已知的用于類似的未涂布基體的治療和給予的程序。必須強調的是，可以考慮到以下4個主要因素來計劃利用本發明的組合物的緩釋期(i)聚合物和脂質含量之間的重量比，尤其是具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂；( )生物聚合物和脂質的生化和/或生物物理特性；(iii)在給定組合物中所使用的不同脂質之間的比例；以及(iv)核酸藥劑與聚乙二醇的溫育時間。具體地，應考慮聚合物的降解速率和脂質的流動性。例如，PLGA(85:15)聚合物將比PLGA(50:50)聚合物更慢地降解。在體溫下，磷脂酰膽堿(14:0)比磷脂酰膽堿(18:0)是更為流體的(更小剛性和更少有序的)。因此，例如，與加入由PLGA(50:50)和磷脂酰膽堿(14:0)構成的基質中的核酸藥劑的釋放速率相比，加入包含PLGA(85:15)和磷脂酰膽堿(18:0)的基質組合物中的核酸藥劑的釋放速率將更慢。將確定釋放速率的另一個方面是核酸的物理特性。另外，通過在第二脂質成分的配方中添加其它脂質可以進一步控制核酸藥齊U，尤其是基于核酸的藥物的釋放速率。這可以包括不同長度的脂肪酸如月桂酸(C12:0)、膜活性留醇(如膽固醇)或其它磷脂如磷脂酰乙醇胺。核酸藥劑與聚乙二醇的溫育時間會影響核酸從基質的釋放速率。較長溫育時間(許多小時)導致較高釋放速率。根據各種實施方式，經所期望的數天至數月的時間，活性劑釋放自組合物。根據某些實施方式，至少30%的基于核酸的藥劑以零級動力學釋放自基質組合物。根據其它實施方式，至少50%的基于核酸的藥劑以零級動力學釋放自組合物。根據下文的本發明的詳細描述，本發明的這些和其它特點和優點將變得更容易理解和顯而易見。
圖I是標準曲線，其示出在ssDNA濃度和連接于ssDNA的5’端的熒光探針的熒光強度之間的關系。圖2示出隨著時間的推移(天數)加載到在沒有聚乙二醇(PEG)的情況下制備的基質組合物中的ssDNA的釋放速率。相對于加載的ssDNA的估計量來歸一化釋放速率。圖3A和3B表示光學顯微鏡(X400)圖片，其示出在來自實施例2中描述的基質組合物的ssDNA的水合以后釋放的脂小泡。圖3A示出在水合以后釋放到介質中的典型的脂小泡。圖3B示出來自相同小泡的綠色熒光發射，其表明這些小泡包含熒光探針。圖4示出用釋放自基質組合物的ssDNA擴增的PCR產物的瓊脂糖凝膠。
圖5示出通過基因掃描分析測得的釋放自基質組合物的ssDNA的大小。圖6示出在ssDNA和PEG的不同溫育時間下隨著時間的推移(天數)加載到用聚乙二醇(PEG)制備的基質組合物中的ssDNA的釋放速率。圖7示出在基質組合物內使用具有不同長度的脂肪酸鏈作為主要脂質的磷脂對加載的ssDNA的釋放速率的影響。
具體實施例方式本發明提供了用于延長釋放和/或控釋核酸的組合物，該組合物包含含有生物相容性聚合物的基于脂質的基質。尤其是，本發明的基質組合物適用于核酸的局部釋放。本發明還提供了制備基質組合物的方法以及利用基質組合物來在對需要其的受試者體內提供活性組分的控釋的方法。根據一個方面，本發明提供了一種基質組合物，該組合物包含(a)藥用生物相容性聚合物連同第一脂質成分，所述第一脂質成分包含至少一種具有極性基團的脂質；(b)第二脂質成分，其包含至少一種具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂；(c)至少一種核酸藥劑；以及(d)聚乙二醇(PEG)，其中基質組合物適于提供核酸的緩釋。根據某些實施方式，生物相容性聚合物是可生物降解的。根據其它實施方式，生物相容性聚合物是非生物可降解的。根據另外的實施方式，生物相容性聚合物包含生物可降解和不可生物降解聚合物的組合，可選地作為嵌段共聚物。根據某些實施方式，本發明提供了一種基質組合物，該組合物包含(a)藥用可生物降解聚酯；(b)磷脂，其具有至少14個碳原子的脂肪酸部分；(c)藥物活性核酸藥劑；以及(d)PEG。核酸藥劑包含具有治療或診斷效用的任何核酸分子。根據一些實施方式，核酸藥劑包含DNA分子、RNA分子、單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈。根據其它實施方式，基于核酸的藥劑選自由質粒DNA、線狀DNA(多核苷酸和寡核苷酸)、染色體DNA、信使RNA(mRNA)、反義DNA/RNA、RNAi, siRNA、微RNA (miRNA)、核糖體RNA、鎖定核酸類似物(LNA)、單和雙鏈寡核苷酸DNA(ODN)、免疫刺激序列(ISS)、和核酶組成的組。根據某些典型的實施方式，核酸藥劑用于治療用途。根據一些實施方式，脂質飽和的基質組合物包含至少一種陽離子脂質。術語“陽離子脂質”是指任何數目的脂質物質，其在所選PH值(如生理pH值)下攜帶凈正電荷。這樣的脂質包括但不限于N，N- 二油基-N，N- 二甲基氯化銨(“DODAC”)；N-(2, 3- 二油基氧基)丙基)-N, N, N-三甲基氯化銨("DOTMA") ；N, N- 二硬脂酰-N, N- 二甲基溴化銨(“DDAB”)；N-(2，3- 二油酰基氧基)丙基)_N，N, N-三甲基氯化銨(“DOTAP”);3-(N_(N，，N’ -二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基)膽固醇(“DC-ChoI”)和N-(I，2-二肉豆蘧基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(“DMRIE”) 。另外，可獲得陽離子脂質的許多商業制劑，其可以用于本發明。這些商業制劑包括，例如，UP0FEGT丨N1;(市售陽離子脂質體，其包含DOTMA 和 I, 2- 二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)，來自 GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y., USA) iLIPOFECTAMINE"(市售陽離子脂質體，其包含N-(I-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺)乙基)N，N-二甲基三氟乙酸銨(“D0SPA”)和(“DOPE”)，來自GIBC0/BRL);以及TRANSFEC.TAM (市售陽離子脂質，其包含在乙醇中的雙十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(“DOGS”)，來自Promega Corp.，Madison, ffis.，USA)。在生理pH值以下，以下脂質是陽離子脂質并具有正電荷DODAP、DODMA、DMDMA等。不希望受限于任何具體理論或作用機制，基質的陽離子脂質可以促進將本發明的基質(包含核酸藥劑)內化到細胞或組織中。根據某些實施方式，細胞和/或組織形成人體的一部分。根據其它實施方式，可生物降解聚合物包含陽離子聚合物，如陽離子化瓜爾膠、二烯丙基季銨鹽/丙烯酰胺共聚物、季銨化聚乙烯吡咯烷酮和它們的衍生物、以及各種聚季銨鹽化合物。根據某些實施方式，第二脂質成分的磷脂是具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰膽堿。在另一種實施方式中，第二脂質成分的磷脂進一步包含具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺。在另一種實施方式中，第二脂質成分的磷脂進一步包括甾醇，尤其是膽固醇。在某些實施方式中，基質組合物是脂質飽和的。如在本文中所使用的，“脂質飽和的”是指在基質組合物的聚合物中脂質(包括磷脂)的飽和度，連同在基質中存在的任何核酸藥劑和可選的靶向部分，以及可以存在的任何其它脂質。基質組合物由存在的無論什么脂質來飽和。本發明的脂質飽和基質呈現另外的優點不需要合成乳化劑或表面活性劑如聚乙烯醇；因而，本發明的組合物通常基本上沒有聚乙烯醇。為獲得脂質飽和度來確定聚合物脂質比率的方法和確定基質的脂質飽和度的方法在本領域中是已知的。在其它實施方式中，基質組合物是均勻的。在另外的實施方式中，基質組合物具有脂質飽和基質的形式，其形狀和邊界由可生物降解聚合物來確定。根據某些實施方式，基質組合物具有植入物的形式。在某些特定的實施方式中，本發明提供了一種基質組合物，該組合物包含(a)可生物降解聚酯；(b)留醇；(c)具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺；(d)具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰膽堿；(e)至少一種基于核酸的藥物；以及(f)PEG。在其它典型的實施方式中，基質組合物是脂質飽和的。在其它典型的實施方式中，本發明提供了一種基質組合物，該組合物包含(a)可生物降解聚酯；(b)留醇；(c)具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺；(d)具有至少14個碳原子的脂肪酸部分的磷脂酰膽堿；(e)基于核酸的活性劑；以及(f)PEG。根據某些實施方式，可生物降解聚酯經由非共價鍵而締合于甾醇。如在本文中所提供的，本發明的基質能夠被模塑成具有不同厚度和形狀的三維構造。因此，可以產生成形的基質以呈現特定的形狀，包括球體、立方體、棒、管、片、或帶子。在基質的制備期間采用冷凍干燥步驟的情況下，形狀取決于模具或支撐物的形狀，上述模具或支撐物可以制造自任何惰性材料并且可以在所有側面(對于球體或立方體)或在有限數目的側面(對于片)接觸基質。當植入物設計需要時，可以將基質成形為體腔的形式。借助于剪刀、解剖刀、激光束或任何其它切割儀器來除去部分基質可以產生三維結構所需要的任何完善。每種可能性表示本發明的單獨的實施方式。根據另外的實施方式，本發明的基質組合物提供了骨移植材料的涂層。根據某種實施方式，骨移植材料選自由同種異體移植物、異質移植物、和異種移植物組成的組。根據另外的實施方式，本發明的基質可以結合于膠原或膠原基質蛋白。MM“磷脂酰膽堿”是指具有磷酸膽堿首基的磷酸甘油酯。在另一種實施方式中，磷脂酰膽堿化合物具有以下結構
權利要求
1.一種基質組合物，包含 a.生物相容性聚合物連同第一脂質成分，所述第一脂質成分包含至少一種具有極性基團的脂質； b.第二脂質成分，所述第二脂質成分包含具有至少14個碳的脂肪酸部分的至少一種憐脂；和 c.至少一種基于核酸的藥劑；以及 d.聚乙二醇(PEG)； 其中所述基質組合物適于提供核酸成分的緩釋和/或控釋。
2.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，所述PEG是分子量在1，000-10,000范圍內的線性PEG。
3.根據權利要求2所述的基質組合物，其中，所述PEG具有可達5，000的分子量。
4.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，所述具有極性基團的脂質選自由留醇、生育酚、磷脂酰乙醇胺和它們的衍生物組成的組。
5.根據權利要求4所述的基質組合物，其中，所述留醇是膽固醇。
6.根據權利要求5所述的基質組合物，其中，所述膽固醇以所述基質組合物的總脂質含量的5-50摩爾％的量存在。
7.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，所述第二脂質成分包括選自由磷脂酰膽堿或其衍生物；磷脂酰膽堿或其衍生物的混合物； 磷脂酰乙醇胺或其衍生物；以及它們的任意組合組成的組中的磷脂。
8.根據權利要求I所述的基質組合物，還包含陽離子脂質，所述陽離子脂質選自由DC-膽固醇、1，2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、二甲基雙十八烷基銨(DDAB)、1, 2- 二月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(乙基PC)、1，2- 二 -O-十八烯基_3_三甲基銨丙烷(DOTMA)以及它們的任意組合組成的組。
9.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，所述生物相容性聚合物選自由可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物和它們的組合組成的組。
10.根據權利要求9所述的基質組合物，其中，所述可生物降解聚合物是可生物降解聚酯，所述可生物降解聚酯選自由PLA (聚乳酸)、PGA (聚乙醇酸)、PLGA (聚(乳酸共乙醇酸))和它們的組合組成的組。
11.根據權利要求10所述的基質組合物，其中，所述不可生物降解聚合物選自由聚乙二醇(PEG)、PEG丙烯酸酯、PEG甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸羥乙酯、2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰膽堿(MPC)、聚苯乙烯、衍生化聚苯乙烯、聚賴氨酸、聚N-乙基-4-乙烯基-吡啶溴化物、聚甲基丙烯酸酯、硅酮、聚甲醛、聚氨酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸和它們的組合組成的組。
12.根據權利要求11所述的基質組合物，其中，所述生物相容性聚合物包含可生物降解聚合物和不可生物降解聚合物的共嵌段。
13.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，總脂質與所述可生物降解聚合物的重量比為1:1以上至9:1以下。
14.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，所述基質組合物是均勻的。
15.根據權利要求I所述的基質組合物，還包含鞘脂。
16.根據權利要求I所述的基質組合物，還包含生育酚。
17.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，所述基質組合物基本上沒有水。
18.根據權利要求I所述的基質組合物，還包含選自由磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、和磷脂酰肌醇組成的組中的另外的磷脂。
19.根據權利要求I所述的基質組合物，還包含具有14個以上碳原子的游離脂肪酸。
20.根據權利要求I所述的基質組合物，還包含聚乙二醇化脂質。
21.根據權利要求I所述的基質組合物，用于所述基于核酸的藥劑的緩釋，其中至少 30%的所述藥劑以零級動力學從所述組合物釋放。
22.根據權利要求21所述的基質組合物，用于所述基于核酸的藥劑的緩釋，其中至少50%的所述藥劑以零級動力學從所述組合物釋放。
23.根據權利要求I所述的基質組合物，其中，所述基于核酸的藥劑選自由質粒DNA、選自多核苷酸和寡核苷酸的線狀DNA、染色體DNA、信使RNA (mRNA)、反義DNA/RNA、RNAi,siRNA、微RNA (miRNA)、核糖體RNA、寡核苷酸DNA (ODN)單和雙鏈、siRNA、CpG免疫刺激序列(ISS)、鎖定核酸(LNA)以及核酶組成的組。
24.根據權利要求I所述的基質組合物，所述基質包含(a)可生物降解聚酯；(b)甾醇；(c)具有至少14個碳的脂肪酸部分的磷脂酰乙醇胺；(d)具有至少14個碳的脂肪酸部分的磷脂酰膽堿；(e)核酸藥劑；以及(f) PEG。
25.一種植入物，包含根據權利要求I所述的基質組合物。
26.一種用于將基于核酸的藥劑給予需要其的受試者的藥物組合物，包含根據權利要求I所述的基質組合物。
27.一種用于將基于核酸的藥劑給予需要其的受試者的方法，所述方法包括將根據權利要求I所述的基質組合物給予所述受試者，從而將基于核酸的藥劑給予需要其的受試者的步驟。
28.一種醫療裝置，包括基體和沉積在所述基體的至少一部分上的生物相容性涂層，其中所述生物相容性涂層包含根據權利要求I所述的基質組合物。
29.根據權利要求28所述的醫療裝置，其中，所述生物相容性涂層包括多層。
30.一種生產用于核酸藥劑的遞送和緩釋和/或控釋的基質組合物的方法，包括以下步驟 a.將(i)生物相容性聚合物和(ii)包含至少一種具有極性基團的脂質的第一脂質成分混合到第一揮發性有機溶劑中； b.將聚乙二醇混合到所述核酸藥劑的水基溶液中； c.將在步驟(b)中獲得的溶液與第二揮發性有機溶劑和包含至少一種磷脂的第二脂質成分混合，其中所述磷脂具有至少14個碳的脂肪酸部分； d.混合在步驟(a)和(c)中獲得的溶液以形成均勻混合物； 以及 e.除去所述揮發性溶劑和水， 從而生產包含所述核酸藥劑的均勻聚合物-磷脂基質。
31.根據權利要求30所述的方法，其中，步驟(c)還包括(i)通過蒸發、冷凍干燥或離心來除去所述溶劑以形成沉積物；以及(ii)將所得的沉積物懸浮在所述第二揮發性有機溶劑中。
32.根據權利要求30所述的方法，其中，所述PEG是分子量在1，000-10，000范圍內的線性PEG。
33.根據權利要求30所述的方法，其中，具有極性基團的所述脂質選自由留醇、生育酚、磷脂酰乙醇胺和它們的衍生物組成的組。
34.根據權利要求30所述的方法，其中，所述第二脂質成分包含選自由磷脂酰膽堿或其衍生物；磷脂酰膽堿或其衍生物的混合物；磷脂酰乙醇胺或其衍生物；以及它們的任意組合組成的組中的磷脂。
35.根據權利要求30所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物選自由可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物和它們的組合組成的組。
36.根據權利要求35所述的方法，其中，所述可生物降解聚合物是選自由PLA(聚乳酸)、PGA (聚乙醇酸)、PLGA (聚(乳酸-共-乙醇酸))、陽離子生物相容性聚合物和它們的組合組成的組中的可生物降解聚酯。
37.根據權利要求35所述的方法，其中，所述不可生物降解聚合物選自由聚乙二醇(PEG)、PEG丙烯酸酯、PEG甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸羥乙酯、2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰膽堿(MPC)、聚苯乙烯、衍生化聚苯乙烯、聚賴氨酸、聚N-乙基-4-乙烯基-吡啶溴化物、聚甲基丙烯酸酯、硅酮、聚甲醛、聚氨酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸和它們的組合組成的組。
38.根據權利要求30所述的方法，其中，在步驟(d)以后，將所獲得的溶液注入到液氮中，到水或熱空氣(噴霧干燥器)，以產生小泡。
39.根據權利要求30所述的方法，其中，在步驟(d)以后，將所獲得的溶液引入到模具中，并隨后除去液體，以獲得特定結構的基質。
全文摘要
本發明提供了用于延長釋放核酸藥劑，一種可生物降解聚合物的組合物。本發明還提供了生產基質組合物的方法和用于利用基質組合物來提供核酸藥劑的控釋的方法。
文檔編號A61K9/00GK102892406SQ201180006572
公開日2013年1月23日 申請日期2011年1月18日 優先權日2010年1月19日
發明者諾姆·埃馬努埃爾, 優素福·波森菲爾德 申請人:波利皮得有限公司