富含具有延伸的α鏈的血纖蛋白原的血纖蛋白原制備物的制作方法

專利名稱：富含具有延伸的α鏈的血纖蛋白原的血纖蛋白原制備物的制作方法
技術領域：
本發明涉及血纖蛋白原制備物及血纖蛋白原制備物在醫學中的應用。特別地，本發明涉及富含具有延 伸的α鏈的血纖蛋白原的血纖蛋白原制備物，及涉及產生這種制備物的方法及其應用。
背景技術：
血纖蛋白原(f ibrinogen)是ー種可溶的血楽;糖蛋白，其在人體內主要由肝實質細胞合成。其是ニ聚體分子，由通過ニ硫鍵連接的兩對三個稱作Αα、Ββ和Y的多肽鏈組成。所述三條多肽鏈由三個單獨的基因編碼。主要存在形式(HMW fib)攜帶Aa鏈，其作為625個氨基酸的前體合成，作為610個氨基酸的多肽鏈存在于在血漿中發現的血纖蛋白原中，B β鏈含有461個氨基酸，Y鏈含有411個氨基酸。所述三條多肽鏈從3個mRNA中單獨地合成。三條成分鏈(Aa、Ββ和Y)裝配成作為六條鏈的ニ聚體(Aa、Ββ，Υ)2的最終形式，該裝配在內質網(ER)的腔隙中發生。血纖蛋白原在血液中以高濃度(l_2g/L)循環，并且表現為高度的異質性。據估計在每個個體中有大約ー百萬個不同的血纖蛋白原分子循環。僅占總血纖蛋白原的一小部分(在大多數情況中不超過幾個百分數)的這些變體中的大多數在功能和結構方面不同。Aa鏈的羧基末端部分的蛋白酶解產生三種主要循環形式的血纖蛋白原，其具有明顯不同的分子量。血纖蛋白原以高分子量形式合成(HMW，分子量340kDa;循環中的主要形式的Aa鏈含有610個氨基酸)。一條A a鏈的降解產生LMW形式(MW=305kDa) ;LMW’形式(270kDa)是變體，其中兩條Aa鏈在羧基末端被部分降解。在健康個體的血液中，50_70%的血纖蛋白原是HMW，20-50%是具有一或兩條降解的Aa鏈的血纖蛋白原(de Maat andVerschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12,377)。所述 HMW 和 LMW’ 變體不出不同的凝血時間和血纖蛋白多聚體結構(Hasegawa N, Sasaki S. (1990)Thromb. Res. 57，183)。熟知的可變剪接變體是所謂的gamma prime(Y’)變體和a-ext Fib或Fib420變體。所述α-ext Fib或Fib420變體的分子量為420kDa，占總循環血纖蛋白原的1-3%(de Maat and Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377) 延伸的 a -ext Fib 同種型與常規的血纖蛋白原α -鏈不同，其由于可變剪接而存在額外的236個殘基的C末端球形結構域。在文獻中給出了關于Fib420的功能和特性的矛盾數據。基于對血漿衍生的a -ext Fib 的研究，Applegate et al, Blood (2000) 95:2297 推斷 α-ext Fib 的聚合和交聯性質與血漿衍生的HMWFib無明顯不同。他們的結論是所述額外的C-結構域對于凝血無作用，并提示所述結構域的功能也許支持整聯蛋白介導的細胞粘附。在EP I 495 051中，提示Fib420可能對降解較不敏感，及對血凝塊結構可能有作用。然而，未進行證實及未提示該作用在血凝塊結構或強度中可能是增強或是降低。Mosesson et al. (Biophys.Chem. 112，209:2004)基于臍帶血漿衍生的a -extFib研究了血凝塊的超微結構。他們報道了 α-ext Fib血凝塊的纖維比基于HMW血纖蛋白原的那些纖維更細及更多分支，但是其具有所有血纖蛋白纖維特有的相同周期性。所述作者提示α-ext Fib中延伸的α-鏈提供與細胞整聯蛋白相互作用的位點的功能。詳細描述本發明涉及血纖蛋白原制備物，其含有至少95%(w/w)的血纖蛋白原，并且其中至少10%的血纖蛋白原是Fib420形式。在本領域中，Fib420也稱作“ a -ext Fib”、“具有延伸的α -鏈的血纖蛋白原”或者“血纖蛋白原·”。在本發明中，這些術語可互換使用。所有這些術語均是指所述結構(Ααεχ ,Ββ , Y)的對稱分子，其中如在HMW fib中發現的兩條常規血纖蛋白原α-鏈由延伸的α鏈置換。
在本發明中，術語“血纖蛋白原制備物”是指分離形式的血纖蛋白原，例如血纖蛋白原的血漿分離物或者細胞上清分離物。其也可以是指合成的血纖蛋白原制備物。本發明的血纖蛋白原制備物優選含有基于總蛋白質的至少65%w/w、至少70%>w/w、至少75%w/w、至少80%w/w或者至少85%的血纖蛋白原。更優選地，其是純的制備物，其中基本上沒有污染物如其它蛋白質存在，其含有基于總蛋白質的至少90%w/w、至少95%w/w、至少96%w/w、至少97%w/w或者至少98%的血纖蛋白原。更優選地，本發明的血纖蛋白原制備物包含基于總蛋白質的至少99%w/w或者至少99. 5%w/w的血纖蛋白原。這種純血纖蛋白原制備物特別適合配制用于醫學應用中的組合物，如用于傷ロ治療和手術修復的組合物。根據本發明，所述制備物中至少10%的血纖蛋白原是Fib420形式。優選地，至少15%w/w、至少20%w/w、至少25%w/w或者至少30%w/w的血纖蛋白原是Fib420形式。更優選地，至少40%w/w、至少50%w/w、至少60%w/w、至少70%w/w、至少80%w/w或者至少90%w/w是Fib420形式。最優選地，至少95%w/w、至少99%w/w或者所有血纖蛋白原均是Fib420形式。本發明的血纖蛋白原制備物的一個優勢是血纖蛋白原制備物的纖溶酶介導的消化慢于血漿衍生的血纖蛋白原。其對于纖溶酶消化的增強的抗性可有益于治療患有血纖蛋白溶解亢進的患者，通常見于獲得性凝血功能障礙情況中。使用本發明的血纖蛋白原制備物，血凝塊較快速地形成，并且形成的血凝塊與血漿衍生的血纖蛋白原或HMW血纖蛋白原形成的血凝塊相比具有更高的血凝塊堅固性(firmness)。這意味著當使用本發明的血纖蛋白原制備物時，血纖蛋白血凝塊穩定性增強，本發明的血纖蛋白原制備物與現有制備物相比更強效。更強效的血纖蛋白原制備物使得給予的液體量和治療性蛋白質的量均降低。這對于靜脈內使用以治療稀釋性凝血功能障礙是有利的。目前對于靜脈內(i. V)注射血纖蛋白原以補償低凝血活性，需要高劑量的血纖蛋白原(毎次治療、g血纖蛋白原)。這是通過直接注射70mg/kg劑量給予的。由于血纖蛋白原通常在20mg/ml最大濃度可以被溶解,這意味著需要靜脈內給予成人大約250ml液體。通過提供更強效的血纖蛋白原以降低整個劑量是有益的。另ー優勢是使用本發明的血纖蛋白原制備物與使用血漿衍生的血纖蛋白原或HMW血纖蛋白原的制備物相比導致的血凝塊形成對因子XIII的依賴性降低。在緩沖液中由α-延伸的Fib (不存在因子XIII)形成的血凝塊的強度高于含有ー些因子XIII的血漿衍生的血纖蛋白原形成的血凝塊的強度。不需要因子XIII以形成堅實的血凝塊。因此，在一個實施方案中，本發明的血纖蛋白原制備物沒有因子XIII。使用ROTEM分析可以測量a -ext rhFib和血衆衍生的血纖蛋白原的凝血時間(CT)、血凝塊形成時間(CFT)和血凝塊堅固性。ROTEM (PentapharmGmbH, Munich, Germany)表不 Rotation ThromboElastoMetry。該技術利用在一次性試管中浸沒在(血液)樣品中的旋轉軸。在不同凝血條件下弾性(elasticity)的改變導致軸旋轉的改變，這在凝血 彈性描記圖中觀測到，反映出機械凝血參數(見例如LuddingtonR.J. (2005) Clin Lab Haematol. 200527 (2) : 81)。在相似條件下的ROTEM 系統檢測中，本發明的血纖蛋白原制備物的性能通常至少同樣好于或者優于其中血纖蛋白原變體分布類似于在人血漿中的變體分布(即少于5%w/w的血纖蛋白原是Fib420類型)的血纖蛋白原制備物或組合物。這是例如基于血漿衍生的血纖蛋白原的血纖蛋白原濃縮物的情況。這種濃縮物是可商購的。特別地，其血凝塊形成時間低于其中低于5%w/w的血纖蛋白原是Fib420類型的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間。優選地，本發明的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間是其中低于5%w/w的血纖蛋白原是Fib420類型的血纖蛋白原制備物如血漿衍生的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間的最多80%、最多60%、最多50%、最多40%、最多30%，、最多20%、最多10%。在實施例中呈現的使用α-ext rhFib的ROTEM試驗表明本發明的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間(CFT)低于純化的血漿衍生的血纖蛋白原在靜脈內應用產生的CFT。另ー方面，本發明涉及包含本發明的血纖蛋白原制備物的組合物。除了血纖蛋白原之外，所述組合物還可包含激活物，如凝血酶或凝血酶樣蛋白質，如reptilase。其也可包含適用于注射用制備物中的賦形劑。所述制備物可以是干燥形式及隨后用例如緩沖鹽水等重建，或者其可以是液體形式，是懸浮液或者溶液。合適的賦形劑材料可包括溶劑和助溶齊U，如こ醇、甘油、PEG、油等；增溶劑、濕潤劑、懸浮劑、乳化劑或者增稠劑，如羧甲基纖維素、水解的明膠、普流羅尼克(pluronics)、聚山梨醇酯等；螯合劑,如EDTA I丐、DTPA等；抗氧化劑和還原劑，如BHT、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉等；抗微生物防腐劑，如苯甲醇、苯酚、苯甲酸酯類(parabens)等；緩沖劑和pH調節劑,如氨丁三醇(tromethamine)、磷酸鈉、こ酸鈉、氫氧化鈉等；膨脹劑(bulking agent)、防護劑和張カ調節劑,如丙氨酸、白蛋白、葡聚糖、乳糖、山梨糖醇、氯化鈉、組氨酸等；特殊的添加劑，如西甲娃油(simethicone)作為抗泡沫劑,海藻糖用于降低蛋白質聚集。所述組合物可用于其中使用血漿衍生的或者重組的血纖蛋白原的任何應用中。主要應用是止血及密封組織。在本發明的一個實施方案中，所述組合物是藥物組合物。所述藥物組合物包含本發明的血纖蛋白原制備物及藥物可接受的載體。“藥物可接受的載體”是指利用其給予本發明的血纖蛋白原制備物的運載體、輔助劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑或者載體。藥物可接受的載體的實例包括但不限于水、緩沖鹽水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇、液體聚こニ醇等)、ニ甲基亞砜(DMSO)、油、洗滌劑、懸浮劑或者其合適的混合物。合適的藥物可接受的載體和配制物在Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19thEd. (Mack Publishing Co. , Easton, 1995)及〃 Remington: The Science And Practice OfPharmacy^by Alfonso R. Gennaro (Lippincott Williams & Wilkins, 2005)中描述。所述藥物組合物可局部使用，可包括水溶性、吸水性、水不溶性或者水溶脹性載體。合適的材料包括糖，如單糖和ニ糖，包括乳糖、甘露醇和海藻糖，或者葡聚糖及葡聚糖聚合物等，如Sephadex,其可以不同顆粒大小獲得,淀粉、pullulan衍生物、透明質酸酯等。纖維素產品如微晶纖維素(Avicel range)、甲基纖維素、羧甲基纖維素、超細(microfine)纖維素或者羥基丙基纖維素及其它材料如交聯的聚こ烯吡咯烷酮(PVP)可以單獨或混合使用。合適的載體也包括聚こニ醇(PEG)，優選分子量為大約1000 ;聚こ烯吡咯烷酮(PVP)，優選平均分子量為大約50，000 ;聚(丙烯酸)，PVA，聚(甲基こ烯基醚-馬來酸酐共聚物)，聚(環氧こ烯)，及葡聚糖，典型平均分子量為大約40，000。可包含片劑崩解劑。這些材料從傷口中吸收水分，迅速擴展及因此增強粉末混合物的止血成分的可濕性。合適的實例包括羧甲淀粉鈉(Explomb' 或Primojel )，其平均顆粒大小范圍為35-55 μ m。大約25%的葡萄糖単元是羧甲基化的；交聯的聚こ烯吡咯烷酮(Polyplasdone );藻酸鹽和褐藻酸；交聯的羧甲基纖維素鈉(Ac-Di-Sol)。可以使用的樹膠和凝膠劑包括例如黃苗膠、刺梧桐膠(karaya gum)、可溶淀粉、明膠、果膠、瓜爾豆膠和gelIan gum。特別優選的添加劑是Emdex ，即水合形式的dextrates (含有少量淀粉寡糖的噴霧結晶的葡萄糖)。其是高度精制的產物，由白色自由流動的噴霧結晶的大孔球體組成，中位粒徑為190-220 μ m。最優選的添加劑是NON-PAREILSEEDS : (Sugar Spheres)。這些用于多個藥物単位中，用以獲得改良的含量均勻度、一致和受控制的藥物釋放及高度藥物穩定性，大小范圍是 200-2000mm。藥物可接受的載體可包含泡騰組合(effervescent couple)。在泡騰反應后產生的氣體可以使血纖蛋白密封劑(fibrin sealant)擴展為“泡沫”和/或増加包含所述血纖蛋白密封劑的粉末的可濕性。隨著所述粉末應用于傷ロ，泡騰成分溶解、反應及釋放，即釋出ニ氧化碳，從而増加止血成分的可濕性，及因此增強血凝塊形成的時間。血纖蛋白密封劑一旦充分反應且血凝塊形成，其呈現出穩定泡沫形式。所述泡騰組合典型地包含檸檬酸或者檸檬酸氫鈉和碳酸氫鈉，但是也可以使用其它生理學可接受的酸/堿金屬或者堿土金屬碳酸鹽混合物，例如酒石酸、脂肪酸、反丁烯ニ酸或蘋果酸，以及碳酸(氫)鈉、鉀或鈣或者甘氨酸鈉碳酸鹽。通常地，發現當泡騰組合的成分在化學分子當量基礎上的相對比率在4:3至1:3范圍、更優選大約2:3時呈現出優選的口味特性，這個比率以酸性成分與堿性成分的分子當量比率表示。就檸檬酸與碳酸氫鈉的優選組合而言，這些值基于重量表示酸與堿成分的比率為1:1至0.3:1的范圍，優選0.5: I。本發明的藥物組合物適于促進組織粘附、改良傷ロ愈合或者適于靜脈內給予。在一個實施方案中，本發明的藥物組合物是血纖蛋白密封劑。本發明的血纖蛋白密封劑典型地包含凝血酶。所述密封劑可以是任何形式，干燥或液體形式。其中可使用本發明的血纖蛋白原制備物的干燥的密封劑的合適實例是Fibrocaps 粉末密封劑，其在W097/44015中被描述，且基于血纖蛋白原和凝血酶的微粒。所述單獨的成分通過噴霧干燥血纖蛋白原與海藻糖及凝血酶與海藻糖而制備。每種粉末成分均具有主要顆粒大小為大約直至50μπι直徑。所述Fibrocaps 血纖蛋白密封劑是這些成分的混合物，已經證實其是易于使用的穩定及有效的局部止血剤。所述產物可立即使用，不用重建，并可用于傷ロ治療、手術修復及作為血管外支架(extravascular stent)。在與含水液體如血液接觸時,暴露的凝血酶使暴露的血纖蛋白原轉變為不溶的血纖蛋白聚合物。本發明的血纖蛋白原制備物提 供進ー步改良的凝血性質。
本發明的組合物可用于傷ロ、傷ロ縫合、切ロ及可發生出血的其它開放性損傷。傷ロ包括對活生物體中的任何組織的損害。所述組織可以是內部組織(如器官)或外部組織(如眼或皮膚)，及可以是硬組織(如骨)或者軟組織(如肝或脾)。傷ロ可以是由任何原因導致，包括感染、手術干預、燒傷或創傷。本發明的組合物可用于手術干預如在胃腸道系統中，如食管、胃、小腸、大腸、直腸，實質性器官如肝、胰腺、脾、肺、腎、腎上腺、淋巴和甲狀腺；在耳、鼻和喉部區域(ENT)的手術介入，包括口腔外科手術，心血管外科手術，美容外科手術、神經外科手術，淋巴、膽汁和腦脊液(CSF)瘺，胸腔和肺手術期間的漏氣，胸腔手術包括氣管、支氣管和肺手術，婦科、血管科、泌尿科、骨科(如松質切除木)和急救外科手木。作為血管外支架或支持物，本發明的組合物可應用于一個節段的外面或者靜脈移植的全部。合適的血管外支架組合物是本發明的血纖蛋白原制備物與凝血酶的組合物。所 述組合物可以是任何合適形式，液體或干燥形式。在一個實施方案中，例如如上所述的ー種干燥粉末組合物用作血管外支架。所述干燥粉末組合物在天然存在于血管壁外部的有限量的體液中聚合，從而形成血管外支架。用本發明的血管外支架組合物包被的靜脈也是本發明的一部分。所述靜脈可以是需要被保護以免于過度伸展或者需要支持的任何靜脈，如靜脈曲張。在一優選的實施方案中，所述靜脈是靜脈移植物。在一個實施方案中，所述組合物在將靜脈移植物導入人或動物身體中之前應用。在另ー實施方案中，所述組合物在靜脈移植物已經導入人或動物身體中之后應用。另ー方面，本發明涉及使用本發明的血纖蛋白原制備物作為藥物。其可用于制備用于治療急性出血性事件、血纖蛋白溶解亢進、血纖蛋白原缺乏癥(獲得性或先天性)或者其它出血性疾病的藥物。在一個實施方案中，本發明的組合物用于在大出血部位減少出血的方法中。優選地，使用止血有效量的本發明的組合物。當用作局部止血劑時，可以實現止血時間(TTH)為大約10分鐘或更少，大約5分鐘或更少，或者大約3分鐘或更少。在本發明中，TTH是至出血停止的時間。如果使用加壓片(pressure sheet),則TTH的測量典型地從當將所述加壓片應用于出血部位時開始直至敷料可視化使出血停止和/或觀測到敷料內外無出血為止。另ー方面，本發明涉及制備本發明的血纖蛋白原制備物的方法。這種制備物可以使用本領域可利用的技術通過任何合適的方式制備。為了以經濟可行的方式產生a-extFib，需要高表達水平的完整的功能性血纖蛋白原，及因此優選重組產生方式。在本發明中，當氨基酸序列含有由核苷酸序列編碼的所有氨基酸時，任選地不含在正常細胞(分泌)加エ期間除去的氨基酸，此時血纖蛋白原或血纖蛋白原鏈是“完整形式”。因此，具有866或847個氨基酸的a -ext鏈是完整形式a -鏈的實例。血纖蛋白原的重組產生具有優于使用血漿衍生的材料的許多優勢。這些優勢包括其優選的安全性、產生沒有任何其它血液污染物的變體的純的均質制備物的可能性及無限制供應。此外，對于特殊應用(例如使用血纖蛋白原作為靜脈內止血剤)，需要正確的翻譯后修飾(例如糖基化)。因此，優選在真核生物、特別是在哺乳動物系統、更特別是在人系統中表達。在一優選的實施方案中，本發明的血纖蛋白原制備物通過包括如下步驟的方法制備
-提供包含核酸序列的表達載體，所述核酸序列編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈；-用所述表達載體轉化真核細胞；-在使得編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核酸序列表達的條件下維持所述轉化的真核細胞。真核宿主的表達載體為本領域已知，可以使用常規用于在真核細胞中表達的任何載體。表達載體典型地包含與被表達的核酸序列可操縱地連接的啟動子及核糖體結合位點，聚腺苷酸化信號，轉錄終止序列，上游調節結構域及增強子。在一個實施方案中，使用在哺乳動物細胞如CHO或PER.C6 中表達的表達載體。這種載體為本領域已知，合適的實例包括 pcDNA3· I 質粒，GATEWAY (Invitrogen), pCMV/Bsd (Invitrogen), pFN 載體(Promega)及多種其它載體系統。在本發明中，“血纖蛋白原的α -延伸的多肽鏈”可以是指具有信號序列的866個 氨基酸的血纖蛋白原α鏈，或者是指不具有信號序列的多肽鏈，以及是指其通過遺傳多態性或糖基化和磷酸化中的差異而產生的任何變體。合適的α延伸鏈氨基酸序列的實例在SEQ ID No. I中示出。術語“α鏈”和“ Aa鏈”在本發明文中可互換使用。本領域技術人員理解所述真核細胞必須也含有編碼血纖蛋白原的β和Y鏈的核酸序列以能產生血纖蛋白原分子。從α、β和Υ鏈中重組產生血纖蛋白原先前已經描述，見例如 PCT/EP2009/058754、US 6，037, 457 或 W095/023868 所述。在本發明中，術語“β鏈”和“Ββ鏈”可互換使用。其是指β鏈的野生型及變體，有或沒有信號序列。合適的血纖蛋白原β鏈氨基酸序列的實例在SEQ ID No. 2中示出。在本發明中，術語“gamma鏈”和“ Y鏈”可互換使用。其是指Y鏈的野生型及變體，有或沒有信號序列。合適的血纖蛋白原Y鏈氨基酸序列的實例在SEQ ID No. 3和4中示出。優選地，編碼血纖蛋白原鏈的核酸序列被優化。優化的核酸序列可以有效表達完整形式的重組血纖蛋白原。優選地，其被優化以在真核細胞培養系統中表達，如在COS細胞、BHK細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、CHO細胞、PER. C6細胞、HEK293細胞或昆蟲細胞培養系統中表達。更優選地，其被優化以在哺乳動物細胞培養系統中表達。最優選地，所述核酸序列被優化以在人細胞培養系統中表達，如在PER. C6細胞或HEK293細胞培養系統中表達。優化的核苷酸序列可以是DNA或RNA。優選是cDNA。編碼血纖蛋白原的α延伸的、β或Υ鏈的優化的核苷酸序列示出與其各自的非優化的對應序列具有至少70%相同性。在一個實施方案中，編碼血纖蛋白原的a-ext Fib、Ββ和Y鏈的優化的核苷酸序列與其各自的非優化的序列示出70-80%相同性。優選地，編碼血纖蛋白原的α延伸的、β或Y鏈的優化的核苷酸序列不含有順式作用位點，如剪接位點和poly(A)信號。用于本發明方法中及編碼血纖蛋白原α延伸的鏈的優化的核苷酸序列不含有在編碼人血纖蛋白原α鏈的基因中正常存在的39個堿基對直接重復序列。所述重復序列必須被改變而不改變編碼的蛋白質序列。在一優選的實施方案中，SEQ ID NO. 5所示優化的核苷酸序列或者這個序列的無信號序列的一部分(核苷酸60-2598)用于表達α延伸的鏈。
在另ー優選的實施方案中，SEQ ID NO. 6所示優化的核苷酸序列或者這個序列的無信號序列的一部分(核苷酸93-1473)用于表達β鏈。在另ー優選的實施方案中，SEQ ID NO. 7或8所示優化的核苷酸序列或者這個序列無信號序列的一部分(SEQ ID NO. 7的核苷酸51-1311及SEQID NO. 8的核苷酸51-1359)用于表達Y鏈。本發明的核酸序列可以編碼任何類型的血纖蛋白原鏈。優選其編碼哺乳動物血纖蛋白原鏈，更優選其編碼靈長類動物血纖蛋白原鏈，最優選其編碼人血纖蛋白原鏈。組合也是可能的，如一或兩個哺乳動物 血纖蛋白原鏈組合兩或ー個嚙齒動物血纖蛋白原鏈。本發明方法的重組表達使得Fib420的表達水平與重組HMW Fib的表達水平相似。


圖I :Western印跡分析。泳道I是含有血衆衍生的野生型血纖蛋白原(FIB3,Enzyme Research Laboratories)的對照組。泳道2含有克隆W115的培養上清，該克隆是表達a -ext rhFib的PER. C6克隆。分子量標記(MW)在左側標示。圖2 ROTEM分析。凝血時間、血凝塊形成時間及血凝塊堅固性通過ROTEM分析確定。左側圖示出在緩沖液中的血纖蛋白原制備物，右側圖示出與所述血纖蛋白原制備物I I混合的血漿。2A :緩沖液中血衆衍生的血纖蛋白原(Haemocomp lettan, CSLBenrmg, Marburg, bermanyノ ；2B :緩沖液中PER. C6衍生的重組HMW血纖蛋白原(α -625)；2C :緩沖液中PER. C6衍生的rhFib-ext血纖蛋白原(α -847)；2D 與血衆混合的血衆衍生的血纖蛋白原(Haemocomp lettan, CSLBenrmg, Marburg, bermanyノ ；2E :與血漿混合的PER. C6衍生的重組HMW血纖蛋白原(α -625)；2F :與血漿混合的PER. C6衍生的rhFib-ext血纖蛋白原(α -847)。圖3 :該圖示出加樣來自纖溶酶降解的血漿衍生的材料的材料的Coomassie染色的蛋白質凝膠(ERL FIB3,上圖；a-ext Fib,下圖)。條件在凝膠上方標示；圖中還示出保溫時間(0、1、5、30、60和120分鐘及ο/η(過夜))。在凝膠的右側示出麗標記。
實施例實施例I :優化的cDNA構建體的制備編碼a-ext Fib (Fib420)、B β和Y人血纖蛋白原多肽鏈的cDNA由GeneArt (Regensburg, Germany)以密碼子優化形式合成(i)除去順式作用位點(剪接位點，poly㈧信號)；(ii)修飾Aa鏈的重復序列；(iii)増加GC含量以延長mRNA半衰期；(iV)使密碼子使用適合于CHO (密碼子適應指數-CAI->0. 95)。將a -ext Fib (SEQ ID NO. 5)、B β (SEQ ID No. 6)和 Y (SEQ ID NO. 6)鏈的密碼子優化的cDNA亞克隆進pcDNA3. I衍生物中。將Aa-延伸的鏈(Fib420)克隆進 pcDNA3. I (+)neo 中，B β 鏈克隆進 pcDNA3. I (+)hygro 中，Y 鏈克隆進 pcDNA3. I (-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)中。
實施例2 :表達重組人a -ext Fib的PER. C6細胞系產生重組人血纖蛋白原的PER. C6細胞系的產生與PCT/EP2009/058754所述相似。總的來說，將細胞在MAb培養基中懸浮培養，用AMAXA nucleofection裝置(程序A-27)轉染，及使用Nucleofector試劑盒T,其具有編碼人血纖蛋白原蛋白的三條不同鏈(Aa -ext、Ββ和Y鏈)并含有優化的cDNA鏈(分別為SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 6和SEQ ID no. 7)的三個載體。在轉染和在96孔平板中鋪板之后，轉移325個克隆，在48孔平板中篩選。在擴增途徑(expansion path)結束時,將24個克隆移至搖瓶中，選擇其中8個在連續分批培養檢測中進行穩定性和表達分析。分批培養產量與使用表達610或625個氨基酸形式的A α鏈的細胞系獲得的產量相似，表明Aa鏈的延伸不削弱表達水平。這個結果最初未曾預料，因為血漿衍生的血纖蛋 白原與含有610/625Αα鏈的血纖蛋白原相比僅含有1_3%延伸的A α鏈。使用SDS-PAGE的蛋白質分析及Western印跡分析表明所述重組血纖蛋白原以完整形式產生，具有預期大小的α鏈(圖I)。實施例3 :從PER. C6細胞培養基中純化α -延伸的血纖蛋白原根據標準方法從細胞培養上清中純化重組人α-延伸的血纖蛋白原。簡而言之，將(MM)2SO4加入所述培養上清中至40%飽和度，通過離心收集沉淀。隨后，將沉淀物在TMAE加樣緩沖液(5mM Tris-HCl pH 8. 5，O. 01%Tween_20)中溶解，隨后用相同緩沖液透析。然后將蛋白質溶液加樣于Fractogel EMD TMAE (m) 40-90 μ m (3ml) (MerckKGaA, Darmstadt, Germany)離子交換柱上。隨后使用在20個柱體積中0_1M NaCl連續鹽梯度洗脫重組人α-延伸的血纖蛋白原。將在峰值部分的重組人血纖蛋白原通過加入(MM)2SO4至40%飽和度而再次沉淀，通過離心收集。最后，將所述材料在TBS(50mMTris-HCl, pH7. 4, IOOmM NaCl)中溶解，用TBS透析以除去任何殘余的(NH4)2S04。實施例4 :ROTEM分析 使用ROTEM分析測量a-ext rhFib和血漿衍生的血纖蛋白原的凝血時間(CT)、血凝塊形成時間(CFT)及血凝塊堅固性。ROTEM (Pentapharm GmbH, Munich, Germany)代表Rotation ThromboElastoMetry。該技術利用一次性試管中浸沒在(血液)樣品中的旋轉軸。在不同凝血條件下彈性(elasticity)的改變導致軸旋轉的改變,這在凝血彈性描記圖中觀測到，反映出機械凝血參數(見例如Luddington R. J. (2005)Clin LabHaematol. 200527(2):81)。將集合的正常(檸檬酸鹽)血漿與血漿衍生的血纖蛋白原(Haemocomplettan，CSLBehring GmbH, Marburg, Germany)或者 PER. C6 血纖蛋白原(HMW rhFib 或 a -ext rhFib)以1:1混合，均為在TBST(TBS+0. 001% Tween-20)中2mg/ml。也直接使用血纖蛋白原制備物(在TBST中2mg/ml)。加入CaCl2至終濃度為17mM(在血漿中測量)或I. 7mM(在緩沖液中測量)。為了開始凝集，加入α-凝血酶至終濃度為I IU/ml。緩沖液中或者與血漿
I I混合的血纖蛋白原制備物的ROTEM 分析圖在圖2中示出。A10、A20、CFT和MCF值(mm)在表I中示出。AlO和A20反映在加入α -凝血酶后10分鐘和20分鐘時血凝塊的堅固性。CFT反映從凝血開始直至檢測到20mm血凝塊堅固性的時間。MCF反映最大血凝塊堅固性。
結果表明緩沖液中a -ext rhFib的凝集產生比HMW rhFib (A10=4mm)觀測到的結果更強的血凝塊(A10=12mm)。血漿衍生的血纖蛋白原的AlO為15mm ;這種在緩沖液中較強的血凝塊形成可以由共純化的血液衍生的FXIII的活性解釋，后者與血纖蛋白単體(部分)交聯。在純化的重組血纖蛋白原中，不存在FXIII，因此不會發生交聯。這可以通過在稀釋的血漿(其含有FXIII)中進行實驗而補償。在這種情況中，形成較強的血凝塊。令人感興趣地，在這種情況中，α-ext rhFib與HMW rhFib或者血衆衍生的Fib相比形成較強的血凝塊并且更快速地形成，A20值分別為21、18和17mm 。表I
權利要求
1.血纖蛋白原制備物，其在ROTEM 凝血弾性描記法檢測中在相似條件下具有低于血漿衍生的血纖蛋白原制備物的血凝塊形成時間的血凝塊形成時間。
2.權利要求I的血纖蛋白原制備物，其含有至少95%(w/w)的血纖蛋白原，且其中至少10%(w/w)的血纖蛋白原是Fib420形式。
3.權利要求I或2的血纖蛋白原制備物，其沒有因子XIII。
4.包含權利要求1-3的血纖蛋白原制備物及藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述組合物適于促進組織粘附、改良傷ロ愈合或者適于靜脈內給予。
6.權利要求4或5的藥物組合物，其中所述藥物組合物是血纖蛋白密封劑或者局部止血劑。
7.權利要求4-6的藥物組合物，其進ー步包含凝血酶。
8.權利要求4-7的藥物組合物，其是干燥形式。
9.權利要求1-3的血纖蛋白原制備物用作藥物。
10.權利要求1-3的血纖蛋白原制備物或者權利要求4-8的藥物組合物用于治療急性出血性事件、血纖蛋白溶解亢進、血纖蛋白原缺陷或者其它出血性疾病的方法中。
11.權利要求1-3的血纖蛋白原制備物或者權利要求4-8的藥物組合物在制備用于治療急性出血性事件、血纖蛋白溶解亢進、血纖蛋白原缺陷或者其它出血性疾病的藥物中的應用。
12.制備Fib420血纖蛋白原制備物的方法，所述方法包括 -提供包含編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核苷酸序列的表達載體； -用所述表達載體轉化哺乳動物細胞； -在使得編碼所述血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核苷酸序列表達的條件下維持所述哺乳動物細胞。
13.權利要求12的方法，其中所述編碼血纖蛋白原的α-延伸的多肽鏈的核苷酸序列是優化的序列，優選是SEQ ID NO. 5所示的優化的序列。
14.權利要求12或13的方法，其中所述哺乳動物細胞是人細胞，優選PER.C6細胞。
全文摘要
本發明涉及富含α-延伸的血纖蛋白原的血纖蛋白原制備物。包含這種制備物的組合物與基于HMW Fib的制備物相比示出改良的凝血性質，后者典型地不含有或僅含有少量α-延伸的血纖蛋白原。特別地，由α-延伸的血纖蛋白原產生的血凝塊的形成時間和血凝塊強度得以改良。此外，與血漿衍生的血纖蛋白原相比，α-延伸的血纖蛋白原的纖溶酶介導的降解降低。
文檔編號A61K38/36GK102724995SQ201180005609
公開日2012年10月10日 申請日期2011年1月7日 優先權日2010年1月8日
發明者A·伯特, J·庫普曼, J·格林伯格 申請人:普羅菲布瑞克斯公司