一種制備高溫穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種制備高溫穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備高溫穩(wěn)定的含氧載體的藥物組合物的方法和由該方法制備的組合物。本發(fā)明還涉及所述高溫穩(wěn)定的含氧載體的藥物組合物在人和其他動物的癌癥治療、缺氧病癥(oxygen-d印rivation disorder)以及器官保存中的用途。
背景技術(shù)：
血紅蛋白在大多數(shù)脊椎動物中對于血管系統(tǒng)和組織之間的氣體交換具有重要作用。其負責(zé)經(jīng)由血液循環(huán)將氧從呼吸系統(tǒng)運送至體細胞，并且還將代謝廢物二氧化碳從體細胞運離至呼吸系統(tǒng)，在呼吸系統(tǒng)二氧化碳被呼出。由于血紅蛋白具有此氧運輸特性，因此如果其在離體狀態(tài)下可以被穩(wěn)定并且可以在體內(nèi)使用，則其可以被用作有效的供氧器。天然存在的血紅蛋白是四聚體，當(dāng)其存在于紅細胞內(nèi)時通常是穩(wěn)定的。然而，當(dāng)天然存在的血紅蛋白移出紅細胞中時，其在血漿中變得不穩(wěn)定，并且分裂成兩個α-β 二聚體。這些二聚體的每一個的分子量為約32kDa。這些二聚體當(dāng)通過腎臟過濾和分泌時可能導(dǎo)致實質(zhì)性的腎損傷。四聚體鍵的斷裂也負面地影響了在循環(huán)系統(tǒng)中功能性血紅蛋白存在的持久性。為了防止四聚體的分解，近年來在血紅蛋白加工方面的發(fā)展已經(jīng)引入了多種交聯(lián)技術(shù)來形成四聚體內(nèi)的分子內(nèi)鍵以及四聚體之間的分子間鍵，從而形成聚合血紅蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)聚合血紅蛋白是增加血紅蛋白的循環(huán)半衰期的優(yōu)選形式。然而，本發(fā)明人確定， 聚合血紅蛋白在血液循環(huán)中更容易轉(zhuǎn)變成為高鐵血紅蛋白。高鐵血紅蛋白不能結(jié)合氧因此不能氧合組織。因此，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的導(dǎo)致形成聚合血紅蛋白的交聯(lián)作用是有問題的。在本領(lǐng)域中存在著對允許分子內(nèi)交聯(lián)從而形成穩(wěn)定的四聚體而不同時形成聚合血紅蛋白的技術(shù)的需求?，F(xiàn)有技術(shù)為穩(wěn)定血紅蛋白進行的嘗試所存在的更多問題包括產(chǎn)生的四聚體血紅蛋白中包含無法接受的高百分比的二聚體單位；二聚體的存在使得血紅蛋白組合物不能令人滿意地施用于哺乳動物。血紅蛋白的二聚體形式可以導(dǎo)致哺乳動物身體的嚴重腎損傷； 此腎損傷可以嚴重到足以導(dǎo)致死亡的程度。因此，本領(lǐng)域中存在著對在終產(chǎn)物中形成含有少量不需要的二聚體形式的穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白的需求。現(xiàn)有技術(shù)為形成穩(wěn)定的血紅蛋白進行的嘗試所存在的更多問題包括蛋白雜質(zhì)諸如免疫球蛋白G的存在可以導(dǎo)致哺乳動物中的變態(tài)反應(yīng)效應(yīng)。因此，本領(lǐng)域中存在著對可以產(chǎn)生穩(wěn)定的不含蛋白雜質(zhì)的四聚體血紅蛋白的工藝的需求。
現(xiàn)有技術(shù)血紅蛋白制劑的其他問題包括在哺乳動物中輸液后產(chǎn)生血管收縮。已經(jīng)表明此血管收縮是由于內(nèi)皮衍生舒張因子與血紅蛋白分子的活性巰基結(jié)合所引起的。因此，本領(lǐng)域中存在著對形成穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白的需求，所述四聚體血紅蛋白在輸液后不會導(dǎo)致血管收縮。除了上述問題以外，在本領(lǐng)域中存在著對穩(wěn)定化的四聚體血紅蛋白的需求，而所述四聚體血紅蛋白須不含磷脂并且能夠以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備高溫穩(wěn)定的、純化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的方法，所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白適合用于哺乳動物而不會導(dǎo)致嚴重的腎損傷、血管不利影響或其他嚴重的不良反應(yīng)(包括死亡)。本發(fā)明還包括高溫穩(wěn)定的、純化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白和所述血紅蛋白用于氧合體內(nèi)和離體組織的用途。該方法包括哺乳動物全血的起始材料，所述全血至少包括紅細胞和血漿。將哺乳動物全血中的紅細胞與血漿分離，緊接著過濾從而獲得濾過的紅細胞級分。洗滌濾過的紅細胞級分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)。在快速細胞裂解設(shè)備中以50-1000升/小時的流速通過可控的低滲裂解來裂解所述洗滌過的紅細胞，持續(xù)足以裂解紅細胞卻不裂解白細胞的時間。進行過濾從而從所述裂解產(chǎn)物中去除至少一部分廢截留物。從所述裂解產(chǎn)物中提取第一血紅蛋白溶液。使用超濾濾器進行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成從第一血紅蛋白溶液中去除分子量比四聚體血紅蛋白高的雜質(zhì)并且進一步去除任何病毒和殘留的廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液。對所述第二血紅蛋白溶液進行流通柱色譜(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白雜質(zhì)、二聚體血紅蛋白和磷脂以形成無磷脂和低含量的二聚體的血紅蛋白溶液。使用配置成去除雜質(zhì)的濾器對所述無磷脂和低二聚體的血紅蛋白溶液進行第二超濾過程，產(chǎn)生濃縮純化的無磷脂和低二聚體的血紅蛋白溶液。在充分氧合的環(huán)境中通過巰基試劑封閉所述濃縮純化的無磷脂和低二聚體血紅蛋白溶液中血紅蛋白分子的巰基。得到的每個血紅蛋白分子具有至少一個包含巰基保護基團的半胱氨酸部分，使得所述血紅蛋白分子不能在所述半胱氨酸位點處結(jié)合內(nèi)皮衍生舒張因子。通過富馬酸二_3，5-二溴水楊酸酯(bis-3，5-dibromosalicy fumarate)交聯(lián)巰基保護的血紅蛋白的至少α-α和/或β-β亞單位從而形成高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白使得得到的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的分子量為60_70kDa。用合適的生理緩沖液交換所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白。通過使用切向流超濾去除任何殘留的未交聯(lián)的四聚體血紅蛋白和任何殘留的化學(xué)物質(zhì)。向所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入0. 2-0. 4% 的濃度的N-乙酰半胱氨酸從而將高鐵血紅蛋白的水平保持在5%以下。然后將所述無磷脂、低二聚體、巰基保護的高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入至藥學(xué)可接受的載體；所述藥學(xué)可接受的載體可以是生理緩沖液或水。緊接著此步驟，得到的血紅蛋白任選地包裝在氣密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、 乙烯-乙烯醇(PE，EVA，EV0H)輸液包裝中。該包裝阻止氧污染，氧污染會導(dǎo)致形成無活性的高鐵血紅蛋白。
通過上述方法制備的高溫穩(wěn)定的交聯(lián)血紅蛋白用于治療多種癌癥諸如白血病、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。破壞癌細胞的機制是改善腫瘤細胞中的氧合，從而提高對放射線和化療劑的敏感性。該高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白也用于在移植期間保存器官組織或用于在體內(nèi)缺少供氧的情況下(諸如在缺氧心臟中)保存心臟。


圖1描繪了不同物種血紅蛋白的氨基酸序列比對，包括牛，人，狗，豬和馬。圖2描繪了本發(fā)明的方法的流程圖。圖3示意性描繪了本發(fā)明的方法中使用的快速細胞裂解設(shè)備(instant cytolysis apparatus)0圖4是顯示在氧合和缺氧環(huán)境中血紅蛋白與巰基試劑的反應(yīng)的圖。圖5描繪了對于交聯(lián)四聚體血紅蛋白的高效液相色譜分析。圖6描繪了對交聯(lián)四聚體血紅蛋白的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析。圖7顯示了對(a)純化的血紅蛋白溶液和(b)交聯(lián)四聚體血紅蛋白的圓二色性 (CD)光譜分析。圖8顯示了交聯(lián)四聚體血紅蛋白的體外化學(xué)增敏作用。圖9描繪了使用本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白改善了正常組織中的氧合。圖10顯示了使用本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白改善了極度低氧的腫瘤區(qū)域中的氧合。圖11顯示了在用本發(fā)明的穩(wěn)定化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白治療后，嚴重失血性休克的大鼠模型中的平均動脈壓變化。圖12是流通柱色譜的洗脫圖；血紅蛋白溶液處于流過級分中。圖13示意性描繪了用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的具有超濾作用的流通CM柱色譜系統(tǒng)。圖14是氧合環(huán)境中的巰基反應(yīng)和缺氧環(huán)境中的反應(yīng)之間的比較。圖15證明與現(xiàn)有技術(shù)血紅蛋白相比本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的熱穩(wěn)定性更
尚ο圖16是用于本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的輸液袋的示意圖。圖17是用來測試體外高鐵血紅蛋白形成的設(shè)備的示意圖。圖18描繪了在圖17的設(shè)備中聚合血紅蛋白和本發(fā)明的血紅蛋白形成高鐵血紅蛋白的速率。
具體實施例方式血紅蛋白是哺乳動物和其他動物的血液的紅細胞中含鐵的氧運輸?shù)鞍住Ｑt蛋白顯示蛋白的三級和四級結(jié)構(gòu)兩者的特性。血紅蛋白中的大多數(shù)氨基酸形成由短的非螺旋段連接的α螺旋。氫鍵穩(wěn)定血紅蛋白內(nèi)部的螺旋段，產(chǎn)生其分子內(nèi)的吸引力，將各個多肽鏈折疊成特定的形狀。血紅蛋白分子是四個球狀蛋白亞單位的組合體。每個亞單位由排列成一組α-螺旋結(jié)構(gòu)段的多肽鏈構(gòu)成，所述α-螺旋結(jié)構(gòu)段以具有包埋的血紅素基團的“肌紅蛋白折疊”排列方式連接。血紅素基團由固定在稱為卟啉的雜環(huán)中的鐵原子組成。鐵原子與位于一個平面中
6的環(huán)中心中所有4個氮原子同等地結(jié)合。然后氧能夠結(jié)合于與卟啉環(huán)的平面垂直的鐵中心。因此，單個血紅蛋白分子具有與四個氧分子結(jié)合的能力。在成人中，最常見類型的血紅蛋白是稱為血紅蛋白A的四聚體，其由稱為α2β2 的兩個α和兩個β非共價結(jié)合的亞單位組成，每個亞單位分別由141和146個氨基酸殘基構(gòu)成。α和β亞單位的尺寸和結(jié)構(gòu)彼此非常類似。對于總分子量為約65kDa的四聚體，每個亞單位的分子量為約16kDa。四條多肽鏈通過鹽橋、氫鍵和疏水相互作用彼此結(jié)合。牛血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與人血紅蛋白類似(α鏈中的同一性為90. 14% ； β鏈中的同一性為84. 35%)。不同之處在于牛血紅蛋白中的兩個巰基位于β Cys 93處，而人血紅蛋白中的巰基分別位于α Cys 104、3Cys93和^Cys 112處。圖1顯示分別標(biāo)記為B、H、C、P和E 的牛、人、犬、豬和馬血紅蛋白的氨基酸序列比對。各種來源的氨基酸的不同之處用陰影表示。圖1表明當(dāng)比較其氨基酸序列時，人血紅蛋白與牛、犬、豬和馬血紅蛋白具有高度的相似性。在紅細胞內(nèi)部的天然存在的血紅蛋白中，α鏈與其相應(yīng)的β鏈的締合非常強并且在生理條件下不會離解。然而，在紅細胞外，一個α β 二聚體與另一個α β 二聚體的締合相當(dāng)弱。該結(jié)合具有分裂成兩個α β 二聚體的傾向，每個二聚體為約32kDa。這些不需要的二聚體足夠小從而被腎臟過濾和分泌，結(jié)果造成潛在的腎損傷和并導(dǎo)致其在血管內(nèi)的存留時間的實質(zhì)性減少。因此，從功效和安全性兩方面來看，穩(wěn)定在紅細胞外使用的任何血紅蛋白是必要的。下面概述了制備穩(wěn)定的血紅蛋白的方法；本發(fā)明的方法的概況呈現(xiàn)在圖2的流程圖中。首先，選擇全血來源作為來自紅細胞的血紅蛋白的來源。選擇哺乳動物全血，包括，但不限于，人、牛、豬、馬和犬全血。將紅細胞與血漿分離，過濾，和洗滌以去除血漿蛋白雜質(zhì)。為了從紅細胞釋放血紅蛋白，需裂解細胞膜。盡管多種技術(shù)可以用來裂解紅細胞， 但本發(fā)明利用精確可控的低滲裂解技術(shù)，且能夠滿足工業(yè)規(guī)模制備的需要。為此，用來裂解紅細胞的快速細胞裂解設(shè)備可見圖3。低滲裂解形成裂解產(chǎn)物溶液，其包含血紅蛋白和廢截留物。為了能夠進行工業(yè)規(guī)模制備，小心地控制裂解作用使得僅紅細胞被裂解卻不裂解白細胞或其他細胞。在一個實施方案中，選擇快速細胞裂解設(shè)備的尺寸使得紅細胞在約30秒內(nèi)穿越該設(shè)備并且所述快速細胞裂解設(shè)備包括靜態(tài)混合器。去離子水和蒸餾水用作低滲溶液。當(dāng)然要理解使用具有不同的鹽濃度的其他低滲溶液將導(dǎo)致紅細胞裂解的時限不同。由于可控的裂解步驟僅破壞紅細胞，不破壞白細胞或細胞性物質(zhì)，因此其使毒性蛋白、磷脂或 DNA從白細胞的釋放或細胞性物質(zhì)的釋放最小化。在30秒后即，在含有紅細胞的溶液已經(jīng)穿越快速細胞裂解設(shè)備的靜態(tài)混合器部分后立即加入高滲溶液。得到的血紅蛋白與使用其他裂解技術(shù)得到的血紅蛋白相比具有較高的純度和較低水平的污染物諸如不合乎需要的 DNA和磷脂。分別通過聚合酶鏈式反應(yīng)(檢出限=64pg)和HPLC(檢出限=lyg/mL)方法沒有在該血紅蛋白溶液中檢測到來自白細胞的不合乎需要的核酸和磷脂雜質(zhì)。進行兩個超濾過程；一個過程在流通柱色譜前去除分子量比血紅蛋白大的雜質(zhì)， 另一個過程在流通柱色譜后去除分子量比血紅蛋白小的雜質(zhì)。后一超濾過程濃縮血紅蛋白。在一些實施方案中，IOOkDa濾器用于第一超濾過程，而30kDa濾器用于第二超濾過程。流通柱色譜用來去除純化血紅蛋白溶液中的蛋白雜質(zhì)諸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些實施方案中，通過使用一種市售離子交換柱或其組合來進行柱色譜，所述離子交換柱諸如DEAE柱，CM柱，羥磷灰石柱等。用于柱色譜的典型pH為6-8. 5。在一個實施方案中，使用流通CM柱色譜步驟在pH 8.0下去除蛋白雜質(zhì)。進行酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)以檢測從柱色譜洗脫后樣品中殘留的蛋白雜質(zhì)和磷脂。此獨特的流通柱色譜分離能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)的分離方案，從而能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)規(guī)模的制備。ELISA結(jié)果顯示在洗脫的交聯(lián)四聚體血紅蛋白中這些雜質(zhì)的量非常低(免疫球蛋白-G :44. 3ng/mL;白蛋白20. 37ng/mL ； 碳酸酐酶81.2yg/mL)。使用不同類型的柱采用不同的pH值去除蛋白雜質(zhì)的結(jié)果顯示在下面的表1中。表1 使用不同的離子交換柱去除不同的蛋白雜質(zhì)
柱(pH條件)去除百分比(％) 碳酸酐酶白蛋白免疫球蛋白-GDEAE (在 pH 7.5 )___6829.8DEAE (在 pH 7.8 )___6050.9CM (在 pH 6.2 )___3221.8CM (在 pH 8.0 )5.653.266.4羥磷灰石(在ρΗ7.5)4.523.522.8為了防止內(nèi)皮衍生舒張因子與血紅蛋白的半胱氨酸位點的結(jié)合導(dǎo)致不合乎需要的血管收縮，使血紅蛋白在氧合條件下與巰基試劑進行反應(yīng)。這與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)正相反， 現(xiàn)有技術(shù)強調(diào)血紅蛋白和巰基試劑之間的反應(yīng)在缺氧條件下進行。本發(fā)明證明巰基試劑在氧合條件下與血紅蛋白的活性巰基較快地且完全地反應(yīng)。巰基試劑與血紅蛋白的巰基的反應(yīng)產(chǎn)生碘化物。因此，烷基化反應(yīng)的完成可以通過測量碘化物釋放來監(jiān)測。在時程試驗期間，與缺氧環(huán)境相比，在氧合環(huán)境中烷基化反應(yīng)更快和更有效地進行，如圖4和圖14中所示。與缺氧環(huán)境相比，在氧合環(huán)境中達到完成反應(yīng)所需的反應(yīng)時間減少至5小時以下。較短的反應(yīng)時間對于工業(yè)規(guī)模過程是非常重要的。其還減少了由不需要的雜質(zhì)引起的反應(yīng)， 該雜質(zhì)導(dǎo)致終產(chǎn)物的不良反應(yīng)。在巰基反應(yīng)過程后，血紅蛋白經(jīng)由富馬酸二-3，5-二溴水楊酸酯(DBSF)進行 α-α和/或β-β交聯(lián)。為了防止聚合血紅蛋白的形成，在缺氧環(huán)境中小心地控制反應(yīng)，血紅蛋白與DBSF的摩爾比控制在1 2.5-1 4.0之間，使得得到的α-α和/或β-β交聯(lián)的血紅蛋白是分子量為60-70kDa的四聚體血紅蛋白，證明不存在聚合血紅蛋白。DBSF反應(yīng)的收率高，>99%且終產(chǎn)物中的二聚體濃度低；在本發(fā)明的上下文中，低二聚體含量是指小于5%和，更優(yōu)選地，小于2% 二聚體。在一個實施方案中，選擇交聯(lián)使得β-β交聯(lián)的血紅蛋白大于總交聯(lián)四聚體血紅蛋白的50%。在另一個實施方案中，選擇交聯(lián)使得β-β 交聯(lián)的血紅蛋白為總交聯(lián)四聚體血紅蛋白的60%或更高。此外，可以選擇條件使得β-β 交聯(lián)的血紅蛋白大于總四聚體血紅蛋白的70%。存在一些證據(jù)，β-β交聯(lián)的血紅蛋白的氧親和力比α-α交聯(lián)四聚體血紅蛋白低。因此，可能存在這樣的情形，即為增加氧運輸?shù)男剩^高百分比的β-β交聯(lián)的血紅蛋白優(yōu)選于α-α交聯(lián)的血紅蛋白。此外，β-β交聯(lián)的血紅蛋白可能產(chǎn)生較少的α-β 二聚體，較少的α-β 二聚體將有助于減少腎毒性。N-乙酰半胱氨酸以0. 2-0. 4%的濃度加入至α-α和/或β-β交聯(lián)的四聚體血紅蛋白從而將高鐵血紅蛋白的水平保持在5%以下。取決于血紅蛋白的最終應(yīng)用，本發(fā)明的純化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白任選地在缺氧環(huán)境中包裝在氣密包裝中。本發(fā)明中使用的包裝使α-α和/或β-β交聯(lián)的四聚體血紅蛋白穩(wěn)定持續(xù)兩年以上。相反，本發(fā)明的血紅蛋白在氧合條件下在數(shù)天內(nèi)迅速地轉(zhuǎn)變成無活性的高鐵血紅蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)血紅蛋白溶液已經(jīng)包裝在具有高透氧性的PVC或Mericon 血袋中，由此縮短了產(chǎn)品的壽命。 在本發(fā)明的許多實施方案中，包含氧載體的含交聯(lián)血紅蛋白的藥物組合物通過靜脈注射遞送。因此，包裝設(shè)計和材料選擇針對靜脈注射應(yīng)用。EVA/EV0H材料的多層包裝用來使透氣性最小化并且避免形成無活性的高鐵血紅蛋白。設(shè)計與本發(fā)明的純化的交聯(lián)血紅蛋白一起使用的IOOmL輸液袋由厚度為0. 4mm的5層EVA/EV0H層壓材料制成，其透氧性為在室溫下每個大氣壓每M小時每100平方英寸0. 006-0. 132cm3 (0. 006-0. 132cm3/100平方英寸Λ4小時/大氣壓)。此材料是VI類塑料(由USP<88>定義)，其滿足體內(nèi)生物學(xué)反應(yīng)測試和物理化學(xué)測試并且適合于制造靜脈注射用輸液袋。此初級包裝袋可特別地用于保護α-α和/或β-β交聯(lián)的四聚體血紅蛋白溶液免于長期暴露氧，長期暴露氧導(dǎo)致其不穩(wěn)定并且最終影響其治療性能。對于血液產(chǎn)品的二次保護，已經(jīng)知道使用鋁外包裝以防止?jié)撛诘穆獠⑶覍a(chǎn)品保持在缺氧狀態(tài)。然而，在鋁外包裝中有存在針孔的可能性，使其氣密性受損并且使產(chǎn)品變得不穩(wěn)定。因此，本發(fā)明使用鋁外包裝袋作為二次包裝，其防止氧合并且還防止暴露于光。外包裝袋的組成包括0.012mm聚對苯二甲酸乙二酯(PET)，0. 007mm鋁(AL)，0.015mm 尼龍(NY)和0. Imm聚乙烯(PE)。外包裝薄膜的厚度為0. 14mm且其氧傳遞速率為在室溫下 0. 006cm3/100平方英寸/ 小時/大氣壓。此二次包裝延長了血紅蛋白的穩(wěn)定時間，從而延長了產(chǎn)品保存期限。高效液相色譜(HPLC)法、電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)法和圓二色性(CD)光譜法用來分析和表征α-α和/或β-β交聯(lián)的四聚體血紅蛋白。對于牛血來源，圖5通過HPLC 分析分子量分布來顯示產(chǎn)物的組成。HPLC分析法用來分別檢測四聚體和二聚體的量。HPLC 分析的流動相包含氯化鎂(0.75Μ)，其可以分離二聚體、未交聯(lián)的四聚體和穩(wěn)定的α-α和 /或交聯(lián)的四聚體。為了促進血紅蛋白離解成二聚體，在相同的離子強度下氯化鎂的有效性為氯化鈉的約30倍多。ESI-MS允許分析非常大的分子。其是一種電離技術(shù)，該技術(shù)通過電離蛋白質(zhì)，然后基于質(zhì)量/電荷比分離電離的蛋白質(zhì)來分析高分子量化合物。因此，可以準確地確定分子量和蛋白相互作用。在圖6中，ESI-MS分析結(jié)果表明穩(wěn)定的四聚體的尺寸為65kDa。 190-240nm的遠紫外⑶光譜揭示了血紅蛋白的珠蛋白部分的二級結(jié)構(gòu)。在圖7中，純化的和交聯(lián)的血紅蛋白的光譜的一致性揭示血紅蛋白鏈即使在通過DBSF交聯(lián)以后被正確地折疊。⑶結(jié)果顯示交聯(lián)血紅蛋白具有大約42% α-螺旋，38% β-折疊，2. 5% β-轉(zhuǎn)角和 16%無規(guī)卷曲。其進一步確定使用DBSF以形成交聯(lián)四聚體血紅蛋白的交聯(lián)步驟不影響血紅蛋白的二級結(jié)構(gòu)。由本發(fā)明的方法制備的純化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的分子量為60_70kDa，并且具有至少一個半胱氨酸部分，其中所述半胱氨酸部分包含巰基保護基團，使得該血紅蛋白不能在半胱氨酸位點處結(jié)合內(nèi)皮衍生舒張因子。此外，交聯(lián)四聚體血紅蛋白無熱原、無內(nèi)毒素 (< 0. 05EU/mL)且無基質(zhì)(< 1 % )。本發(fā)明的方法適用于交聯(lián)四聚體血紅蛋白的大規(guī)模工業(yè)制備。另外，交聯(lián)四聚體血紅蛋白與藥用載體(例如，水、生理緩沖液、在膠囊中)的組合適合于哺乳動物應(yīng)用。本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白用于組織氧合，用于癌癥治療，用于治療缺氧病癥諸如失血性休克，和用于低氧含量環(huán)境下的心臟保存(例如，心臟移植物)。交聯(lián)四聚體血紅蛋白的劑量在約0. 3-1. 3g/kg的濃度范圍內(nèi)選擇。對于在癌癥治療中的應(yīng)用，本發(fā)明的包含氧載體的藥物組合物作為組織氧合劑起作用，以改善腫瘤組織中的氧合，從而提高化學(xué)敏感性(例如，對化療的敏感性)和放射敏感性。圖8證明在體外應(yīng)用包含交聯(lián)四聚體血紅蛋白的組合物后癌癥腫瘤細胞的提高的化學(xué)敏感性。5種不同的癌細胞系(A) Jurkat (白血病)，(B)HKESCl (食管癌)，(C) C0L0205(結(jié)腸癌)，(D)A549/Cisp (肺癌)和(E)MCF-7/ADM(乳腺癌)用多種化療劑單獨， 或與本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白聯(lián)合治療。腫瘤細胞生長的抑制通過ATP腫瘤化學(xué)敏感性測定(ATP-TCA)(用于 Jurkat、C0L0205、AM9/Cisp 和 MCF-7/ADM 細胞系)或 MTT 細胞增殖測定(用于HKESCl細胞系)來確定。結(jié)果顯示通過在所有癌細胞系中添加本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白極大地提高了化學(xué)敏感性，這些癌細胞系包括兩個細胞系，A549/Cisp和 MCF-7/ADM，它們對化療高度耐藥。圖8中的結(jié)果顯示作為添加交聯(lián)四聚體血紅蛋白提高化學(xué)敏感性的結(jié)果，對白血病細胞、食管癌細胞、肺癌細胞、結(jié)腸癌細胞和乳腺癌細胞的治療功效大大增加。另外，在本發(fā)明中證明了本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白改善正常組織中(圖9)和極度低氧的腫瘤組織(圖10)(人鼻咽癌(CNE》)中的氧合的能力。沿人CNE2異種移植物的組織軌跡的代表性氧狀況顯示在圖10中。腫瘤塊內(nèi)的氧分壓通過與微定位系統(tǒng)(DTI Limited)耦聯(lián)的光纖氧傳感器(Oxford Optronix Limited)直接監(jiān)測。靜脈注射1. 2g/kg 交聯(lián)四聚體血紅蛋白后，中位數(shù)PA值分別在3小時內(nèi)從0. 2mmHg升高至3. 9mmHg，在6小時內(nèi)升高至10.6mmHg。即使在最低氧的區(qū)域中，本發(fā)明的包含氧載體的藥物組合物顯著地增加氧分壓。與本發(fā)明中制備的包含氧載體的藥物組合物相比，沒有其他類似的市售產(chǎn)品或任何現(xiàn)有的技術(shù)顯示這樣高的功效。對于在治療缺氧病癥和在心臟保存中的應(yīng)用，本發(fā)明的包含氧載體的藥物組合物作為將氧提供至靶器官的血液代用品起作用。在一些實施方案中，該組合物用作用于心臟保存的心臟停搏液。在用0. 5g/kg的本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白治療后嚴重失血性休克的大鼠模型中的平均動脈壓變化(參見實施例12b)顯示在圖11中。在嚴重失血性休克的大鼠模型中，在用穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白治療后，平均動脈壓恢復(fù)至安全和穩(wěn)定的水平，并且保持在基線以下。在用本發(fā)明的血紅蛋白治療后，平均動脈壓恢復(fù)至正常的反應(yīng)時間甚至比充當(dāng)陽性對照的施用大鼠全血后的平均動脈壓恢復(fù)至正常的反應(yīng)時間還短。上述結(jié)果表明在輸注本發(fā)明的血紅蛋白后的血管活性事件有益于維持穩(wěn)定和血液動力學(xué)狀態(tài)。以前的基于血紅蛋白的氧載體多引起血管收縮。例如，如由Katz等，2010所公開，1^111(^11代 產(chǎn)品 (Biopure Co.，USA)導(dǎo)致與基線(96 士 IOmmHg)相比較高的平均動脈壓(lM+9mmHg)。本發(fā)明的血紅蛋白用于輸液的應(yīng)用增加了鼠(從18%增加至75%)和小獵犬(從 46%增加至97%)的休克模型的存活率。通過輸注不同量的交聯(lián)四聚體血紅蛋白(參見實施例1 顯著地增加嚴重失血性休克動物模型的存活率。因此本發(fā)明的血紅蛋白可用于失血性休克的治療。實施例以下的實施例描述本發(fā)明的具體實施方案，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1總過程本發(fā)明的方法的示意性流程圖顯示在圖2中。牛全血采集在封閉的無菌容器/袋中，該容器/袋含有作為抗凝劑的3. 8% (w/v)枸櫞酸鈉溶液。然后將血液與枸櫞酸鈉溶液立即充分混合以抑制血凝塊。通過單采機制(apheresis mechanism)將紅細胞(RBC)從血漿和其他較小的血細胞分離并收集。為此步驟“細胞洗滌機”與Y滅菌的一次性離心機轉(zhuǎn)筒(centrifuge bowl) 一起使用。用等體積的0.9% (w/v氯化鈉)鹽水洗滌RBC。對紅細胞的細胞膜進行低滲沖擊，來裂解洗滌過的紅細胞以釋放血紅蛋白內(nèi)容物。圖3繪制了一種用于此目的的RBC專用快速細胞裂解設(shè)備。在RBC裂解后，使用IOOkDa 膜通過切向流超濾將血紅蛋白分子與其他蛋白分離。收集濾液中的血紅蛋白用于流通柱色譜，并且通過30kDa膜進一步濃縮至12-14g/dL。進行柱色譜法以去除蛋白雜質(zhì)。濃縮的血紅蛋白溶液首先通過巰基試劑(烷基化反應(yīng))在天然氧合條件下改性， 然后將各組分與DBSF反應(yīng)以形成穩(wěn)定的α-α和/或β-β交聯(lián)的四聚體血紅蛋白分子。實施例2時間&可控的低滲裂解和過濾采集新鮮牛全血并在冷卻條件下運輸。經(jīng)細胞洗滌機將紅細胞與血漿分離，隨后用0. 65 μ m過濾。在用0. 9%鹽水洗滌紅細胞(RBC)濾液后，通過低滲裂解破裂濾液。通過使用圖3中繪制的快速細胞裂解設(shè)備來進行低滲裂解。該快速細胞裂解設(shè)備包括靜態(tài)混合器以輔助細胞裂解。含有可控濃度的血紅蛋白(控制在12-14g/dL的范圍內(nèi))的RBC懸浮液與4體積的純凈水混合從而低滲沖擊RBC細胞膜?？刂频蜐B沖擊的時間以避免不希望的對白細胞和血小板的裂解。低滲溶液經(jīng)過該快速細胞裂解設(shè)備的靜態(tài)混合器部分持續(xù)約30 秒。在30秒后當(dāng)裂解產(chǎn)物離開靜態(tài)混合器時通過將裂解產(chǎn)物與1/10體積的高滲緩沖液混合而終止沖擊。使用的高滲溶液為0. IM磷酸鹽緩沖液，7.4%NaCl，pH 7.4。圖3的快速細胞裂解設(shè)備可以連續(xù)地處理50-1000升裂解產(chǎn)物/小時，和優(yōu)選地至少300升/小時。在RBC裂解后，紅細胞的裂解產(chǎn)物通過0. 22 μ m濾器過濾以獲得血紅蛋白溶液。聚合酶鏈式反應(yīng)法(檢出限=64pg)和HPLC (檢出限=1 μ g/mL)方法在該血紅蛋白溶液中都沒有檢測到來自白細胞的核酸和磷脂雜質(zhì)。進行第一次IOOkDa超濾以去除分子量大于血紅蛋白的雜質(zhì)。緊接著進行流通柱色譜以進一步純化該血紅蛋白溶液。然后進行第二次 30kDa超濾以去除分子量比血紅蛋白小的雜質(zhì)，并用于濃縮。實施例3
對無基質(zhì)血紅蛋白溶液的病毒清除研究為了證明本發(fā)明所述的產(chǎn)品的安全性，我們通過病毒驗證研究證明(1)0.65μπι 滲濾步驟和OUOOkDa超濾步驟的病毒清除能力。我們用按比例縮小的小規(guī)模反應(yīng)體系來實施這兩種方法，人為地向反應(yīng)體系中添加不同模型的病毒，如腦心肌炎病毒 (encephalomyocarditis virus)、偽狂犬病病毒(pseudorabies virus)、牛病毒性腹 寫病毒(bovine viral diarrhoea virus)禾口牛細小病毒(bovine parvovirus)。在此石if究中使用四種類型的病毒，可見下表2。這些病毒的生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)特征不同，并且對物理和化學(xué)藥劑或治療的抗性方面具有差異。表權(quán)利要求
1.一種制備高度純化的和高溫穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，所述包含氧載體的藥物組合物包含血紅蛋白，所述方法包括a)提供至少包含紅細胞和血漿的哺乳動物全血；b)將所述哺乳動物全血中的紅細胞與血漿分離；c)過濾與血漿分離的紅細胞從而獲得濾過的紅細胞級分；d)洗滌所述濾過的紅細胞級分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)，得到洗滌過的紅細胞；e)在快速細胞裂解設(shè)備中，通過可控的低滲裂解以50-1000升/小時的流速來破裂所述洗滌過的紅細胞，持續(xù)足以裂解紅細胞卻不裂解白細胞的時間，從而形成包含紅細胞裂解產(chǎn)物的溶液；f)進行過濾以從所述裂解產(chǎn)物中去除至少部分廢截留物；g)從所述裂解產(chǎn)物提取第一血紅蛋白溶液；h)使用超濾濾器進行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除分子量比四聚體血紅蛋白高的雜質(zhì)，以從第一血紅蛋白溶液中進一步去除任何病毒和殘留廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液；i)對所述第二血紅蛋白溶液進行流通柱色譜以去除磷脂、蛋白雜質(zhì)和二聚體血紅蛋白并形成無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液；j)使用被配置成去除雜質(zhì)的濾器對所述無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液進行第二超濾過程，產(chǎn)生濃縮純化的無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液；k)在充分氧合的環(huán)境中通過巰基試劑封閉所述濃縮純化的無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液中血紅蛋白分子的巰基使得各血紅蛋白分子具有至少一個包含巰基保護基團的半胱氨酸部分，使得所述血紅蛋白分子不能在所述半胱氨酸位點處結(jié)合內(nèi)皮衍生舒張因子；1)通過富馬酸二 _3，5- 二溴水楊酸酯交聯(lián)所述巰基保護的血紅蛋白，從而形成高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白，使得得到的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的分子量為60-70kDa，并且基本上由未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成； m)用合適的生理緩沖液交換所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白； η)通過洗滌去除任何殘留的未交聯(lián)的四聚體血紅蛋白和任何殘留的化學(xué)物質(zhì)； ο)向所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入濃度為0. 2-0. 4%的N-乙酰半胱氨酸從而將高鐵血紅蛋白的水平保持在5%以下；和P)將所述低二聚體、無磷脂、巰基保護的在高達80°C的溫度下高溫穩(wěn)定的不含聚合血紅蛋白的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入藥學(xué)可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述快速細胞裂解設(shè)備包括靜態(tài)混合器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白衍生自牛、豬、犬或馬血紅蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述柱色譜包含一個或多個陽離子交換柱和陰離子交換柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述離子交換柱為一個或多個DEAE柱、CM柱和/或羥磷灰石柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中通過富馬酸二-3，5-二溴水楊酸酯的血紅蛋白交聯(lián)包括至少α-α和/或β-β交聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中選擇交聯(lián)條件使得β-β交聯(lián)大于總交聯(lián)的50%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中選擇交聯(lián)條件使得β-β交聯(lián)大于總交聯(lián)的60%。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中選擇交聯(lián)條件使得β-β交聯(lián)大于總交聯(lián)的70%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述藥學(xué)可接受的載體為生理緩沖液或水。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，所述方法還包括將已制備的組合物包裝在多層柔性輸液包裝中，所述輸液包裝在日常環(huán)境條件下的透氧性為每24小時小于0. 0025cm3O
12.—種高度純化和高溫穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物，所述藥物組合物包含血紅蛋白，所述血紅蛋白基本上由通過權(quán)利要求1所述的方法形成的未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成。
13.一種氧合組織的方法，所述方法包括在體內(nèi)或離體條件下向所述組織提供權(quán)利要求12所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高溫穩(wěn)定的和高度純化的交聯(lián)的(任選地≥70％β-β交聯(lián))的四聚體血紅蛋白，其具有高效的氧輸送功能，所述四聚體血紅蛋白適合用于哺乳動物而不導(dǎo)致腎損傷和血管收縮。將二聚體形式的血紅蛋白變性并對來自全血的紅細胞進行純化。在快速細胞裂解設(shè)備中進行可控低滲裂解以防止白細胞的裂解。在裂解液中沒有檢測到來自白細胞的核酸和磷脂雜質(zhì)。在氧合環(huán)境中通過巰基試劑封閉活性巰基。流通柱色譜去除不同的血漿蛋白雜質(zhì)。將N-乙酰半胱氨酸加入至交聯(lián)的四聚體血紅蛋白以保持低水平的高鐵血紅蛋白。穩(wěn)定的血紅蛋白保存在帶有鋁外包裝的輸液袋中以防止氧侵入形成無活性的高鐵血紅蛋白。該產(chǎn)品用于組織氧合和癌癥治療。
文檔編號A61K35/14GK102405051SQ201180001285
公開日2012年4月4日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者郭瑞儀, 黃炳镠 申請人:郭瑞儀, 黃炳镠