專利名稱：一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，尤其涉及一種利用激流灌注式生物反應器生產豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，屬生物技術領域。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴重危害養豬業的傳染病。目前控制PRRS的主要方法是使用疫苗進行免疫預防，因此，高效價的病毒液是疫苗生產中非常重要的一個環節。豬繁殖與呼吸綜合征疫苗生產主要是通過轉瓶培養細胞，進而增殖豬繁殖與呼吸綜合征病毒。生產中細胞及病毒培養條件難以控制，導致細胞和疫苗質量不穩定，產品批間差異大，而且自動化程度低，勞動強度大，極大的限制了疫苗的質量與產量。隨著生物技術的飛速發展，傳統的生產方式已難以滿足市場的需求，使用生物反應器不緹是一種很好的選擇。但應用反應器生產疫苗也存在諸多問題比如因接種的細胞狀態不一、接種方式不科學導致疫苗批次間差異大、產品質量不穩定；因營養供給方式不科學導致細胞營養缺乏、生長不均勻；因細胞種子鏈擴增困難導致細胞再擴大培養難以實現； 以及因清洗、滅菌帶來的操作繁瑣、污染幾率增大、耗費能源等，諸多問題難以枚舉。綜上所述，本領域還需要繼續研發一種適用的培養豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，以進一步提高產品質量，優化生產條件，簡化生產工藝及流程。
發明內容
本發明目的是克服現有技術之缺陷，提供一種利用激流灌注式生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法。本發明所述技術問題是由以下技術方案實現的。一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，它利用一個激流灌注式生物反應器作為培養工具，所述激流灌注式生物反應器的液體循環系統由蠕動泵、硅膠管、激流袋、灌注袋、有孔硅膠管與紙片載體組成；所述第一蠕動泵通過硅膠管與激流袋、灌注袋連通、且蠕動泵控制流向為由灌注袋到激流袋；所述第二蠕動泵通過硅膠管與激流袋、 灌注袋連通、且控制流向為由激流袋到灌注袋；
制備操作按如下步驟進行
a.制苗用細胞的培養
將細胞懸液(宿主細胞和細胞生長液)接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋(6)，使細胞貼附在紙片載體(8)上，設定設備參數，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；
b.病毒接種與培養
當細胞達到最大密度時，排空反應器內液體，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種步驟a 所得制苗用細胞；加入細胞維持液，調節設備參數，啟動病毒培養程序，擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒；
c.病毒液收獲
收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液，備用；
d.疫苗的制備
將步驟C收獲的病毒液制備疫苗。上述制備方法，在步驟a中，宿主細胞是經過有限稀釋法克隆純化篩選的 Marc-145 或者 M104 細胞。上述制備方法，在步驟a中，細胞懸液接種采用兩步法，第一步從灌注袋(6)下部打入細胞懸液，充滿灌注袋(6)，靜置吸附Ih ；第二步將灌注袋(6)中的液體打出1/4 1/3，再從上部有孔硅膠管(7)內打入細胞懸液，至細胞懸液充滿灌注袋(6)，再靜置吸附 0. 5 Ih ；細胞接種密度為每克載體接種0. 6 1. 5 X IO7個細胞。上述制備方法，在步驟a中，系統參數設定為溫度Tl :37 37. 5°C、T2:42 450C、T3 :35 36°C，pH :7. 0 7. 4，DO 30% 70%，振蕩速度 30 50rpm。上述制備方法，在步驟a中，細胞生長液循環灌注速度隨培養時間的增加逐漸增大，使硅膠管3、硅膠管4內液體顏色保持基本一致。上述制備方法，在步驟a中，根據細胞耗糖及時補充細胞生長液和10 20g/L的葡萄糖，當殘糖量低于lg/L時，進行補液。上述制備方法，在步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒是經過蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞克隆株。上述制備方法，在步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種劑量為0. 01 0. 3M0I， 接毒吸附時間為30 45min。上述制備方法，在步驟b中，設備參數為溫度Tl :36 37°C、T2 :39 43°C、T3 35 36°C，pH :7. 2 7. 6，DO 30% 70%，振蕩速度 30 50rpm。上述制備方法，在步驟b中，接毒后18 20h時需要補充循環系統總體積1/10 1/5的2 5倍濃縮DMEM液和10 20g/L的葡萄糖。上述制備方法，在步驟a、步驟b中，營養液(細胞生長液、細胞維持液)的流動方式為液體流過灌注袋的方向是從下到上，從灌注袋(6)抽走液體的管道為深層管一有孔硅膠管(7)。上述制備方法，在步驟c中，收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液有三種方法第一種收獲方法為一次性收獲，在產毒高峰期(32 40h)—次性收獲；第二種方法為多次收獲， 18 24h時首次收獲，以后每隔6 他收獲一次，收獲同時補充新細胞維持液，共收獲3 5次；第三種方法為連續流加收獲，24 30h時開始收獲，連續收獲12 16h，控制每分鐘收獲量為細胞維持液總體積0. 5 2%，至44 50h時收獲剩余病毒液。上述制備方法，細胞生長液的配方為體積百分含量90% 擬％高糖DMEM液， 8% 10%新生犢牛血清，調整PH值為7. 2 7. 4 ；所述細胞維持液的配方為體積百分含量 98% 99%高糖DMEM液，1% 2%新生犢牛血清，調整PH值為7. 2 7. 6。上述制備方法，所述生物反應器有效培養體積為10LU00L和600L三種；制苗用細胞直接在IOL或者100L的生物反應器中培養；或者經過IOL — 100L或IOL — 100L — 600L 逐級擴大培養，實現細胞種子鏈逐級擴增。
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與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1、在本發明中，制苗用細胞預先經過有限稀釋法克隆純化篩選，保證了種子細胞的狀態均一，減小了批次間差異，確保了生產工藝參數和產品質量的穩定。2、在本發明中，反應器細胞接種采用兩步法，此方法可保證灌注袋(6)各點細胞接種均勻，紙片載體(8)利用充分，有利于提高產毒效價。3、本發明中在細胞培養過程中逐步提高細胞生長液的循環灌注速度，使營養物質的交換速度更適合細胞增殖。4、本發明在細胞培養過程中和病毒增殖過程中進行補液，保證了細胞和病毒增殖所需的營養物質，又提高了營養液的利用率，節約成本。5、本發明營養液的流動方式為倒灌注、深抽液。此灌注過程不但能保證灌注袋 (6)各處細胞營養均勻，又可達到供給細胞營養物質并帶走細胞代謝廢物的目的。6、本發明接種的豬繁殖與呼吸綜合征病毒系經蝕斑法亞克隆純化篩選的亞克隆株，保證了種毒的純度，減小了批次間差異，確保了生產工藝參數和產品質量的穩定。7、本發明病毒液的收獲可以根據目的不同，靈活選擇收獲方式。8、應用本法生產豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，細胞種子鏈能夠實現IOL 600L的逐級擴大，且三種規模設備培養的病毒效價基本一致；放大效果好，適合規模化生產。9、本發明中，使用一次性無生物毒性耗材，使用完畢直接進行無害化處理，減少了罐體式生物反應器的清洗、消毒、滅菌等復雜的工藝環節和工藝配套設施的安裝，解決了因消毒不徹底帶來的污染問題，同時節約能耗，整個生產工藝不涉及其他生物安全和公共衛生問題。
圖1是激流灌注式生物反應器的液體循環系統組成示意圖； 圖2是本發明的工藝路線圖3是接毒前細胞單日耗糖量曲線圖。圖中各標號為1.第一蠕動泵(灌注出液泵)、2.第二蠕動泵(灌注進液泵)，3、 4.硅膠管、5.激流袋、6.灌注袋、7.有孔硅膠管、8.紙片載體。
具體實施例方式為使本發明更容易理解，下面結合具體實施例進一步闡述本發明，本實施例僅用于說明本發明而不限于本發明權利的保護范圍。實施例1 AP20C型激流灌注式生物反應器生產豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98 株)
本實施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反應器，灌注袋6體積為5L，激流袋5)體積為15L，灌注袋(6)內含有150g聚酯纖維紙片載體8);理論有效培養體積收獲液體積)為 10L。圖1是激流灌注式生物反應器的液體循環系統組成示意圖；其中，制苗用細胞、 病毒全部在灌注袋內生長，營養液(細胞生長液、細胞維持液)通過外置蠕動泵(第一蠕動泵 1、第二蠕動泵2)在灌注袋和激流袋中循環。
種毒為采用蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株，保藏號為CCTCC V201138，于2011年11月27日保藏在中國典型培養物保藏中心。檢驗用強毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株在專利申請20101(^94953. 5 中有記載，保藏號NO. M67，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。A、準備工作
檢驗系統氣密性，校準電極，PBS處理紙片載體8，連接灌注袋6與激流袋5，用細胞生長液浸泡紙片載體8，平衡系統。B、生產具體步驟如下
a、制苗用細胞的培養
選擇有限稀釋法純化篩選后的Marc-145細胞作為宿主細胞，在IOL轉瓶中用含10%新生牛血清、PH7. 4的DMEM細胞生長液于37°C培養，長成良好單層時備用；以0. 025%胰酶對 7瓶長滿單層的細胞進行消化，制備種子液6L，細胞總數約2. 3 X IO9個。細胞接種采用兩步接種法，第一步從灌注袋6下部打入細胞懸液(Marc-145細胞和DMEM細胞生長液)4. 5L，靜置吸附Ih ；第二步將灌注袋6中的液體打出1. 5L，再從上部深層管內打入余下的細胞懸液，充滿灌注袋6，靜置吸附0. 5h ；同時在激流袋5內補充5. 5L 細胞生長液預熱；細胞接種密度為每克載體接種1. 5 X IO7個細胞；
吸附過程完成后，設置設備參數如下:T1 :37°C、T2 :42°C、Τ3 :36°C，PH :7. 3，DO :50%， 震蕩速度45rpm，液體循環速度250ml/min，啟動細胞培養程序，進行細胞培養；每日取樣測殘糖量，及時補充細胞營養液和10g/L的葡萄糖；逐漸增大液體循環速度；
b、病毒的接種與培養
細胞接種后第4日單日耗糖量達到3. 63g/d/L，且趨于平穩；確定細胞密度達到了接毒要求；排空反應器內液體，將經亞克隆純化篩選后效價為107 3TCID5Q/ml的PRRSV-R98毒液 IOOml打至激流袋5內，連同激流袋5內的4. OL無血清單倍DMEM，一同打至灌注袋6內，靜置吸附45min，同時在激流袋5中補充4. OL含血清4%的DMEM營養液，病毒接種劑量約為 0. 03M0I。吸附完成后，調整設備參數如下溫度Tl 36. 50C> T2 :39°C、T3 :36°C，pH :7. 4， DO :50%，振蕩速度45rpm，液體循環速度250ml/min，啟動病毒培養程序開始培養，接毒18h 時，補充2倍濃縮DMEM 2L，10g/L葡萄糖IOOrnl ；
c、病毒液收獲
接毒34h時開始收獲，一次性收獲灌注袋6內的上清病毒液，將含有紙片載體8和部分病毒液的灌注袋6凍融兩次后取上清病毒液與已收獲的病毒液混合，約10. 5L，于-20°C冷凍保存；
d、制苗毒液的檢驗
按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附錄進行檢驗，無細菌、霉菌、支原體生長； 病毒液對豬安全無副作用，收獲的病毒液用細胞測定效價，每Iml含病毒IO9 2tlTCID5ci ；
e、配苗、分裝及凍干
將檢驗合格的病毒液混合于同一容器，加入5%的蔗糖脫脂乳凍干保護劑充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98株)成品。C、疫苗安全性檢驗選用7日齡健康易感仔豬3頭，每頭豬頸部肌肉注射10頭份該疫苗。連續觀察14日， 免疫后仔豬精神、食欲無明顯變化，無異常臨床反應，疫苗安全性檢驗合格。D、疫苗效力檢驗
選用30日齡健康易感仔豬10頭，隨機分為兩組，第一組5頭各頸部肌肉注射該疫苗1 頭份，第二組5頭不接種疫苗，作為對照，在同等條件下隔離飼養。所有豬各滴鼻攻毒檢驗用強毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株病毒培養液:3ml(104_5TCID5cZml )，每日測溫， 連續觀察觀日。結果對照豬均發病，且死亡2頭，5頭免疫豬均未發病。疫苗效力檢驗合格。與轉瓶工藝比較轉瓶培養工藝每瓶收獲體積1L，病毒效價約是107_° 7 5 TCID50/ ml ；本次實驗病毒總產量是轉瓶工藝的500倍以上。實施例2用AP200型激流灌注式生物反應器生產豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98 株)
本實施例中所用的AP200型激流灌注式生物反應器，灌注袋6體積為50L，激流袋5體積為150L，灌注袋6內含有2000g聚酯纖維紙片載體8 ；理論有效培養體積(收獲液體積)為 IOOL0A、準備工作
選用AP20C型和AP200型兩種激流灌注式生物反應器，做培養細胞前準備工作。B、生產工作，具體步驟如下 a、制苗用細胞的培養
依實施例1方法用AP20C型生物反應器培養的Marc-145細胞，至第4日，單日耗糖量達到3. 8g/d/L時，用0. 025%胰酶消化灌注袋6)內細胞，制得細胞懸液17L，約含Marc-145 細胞2. 5X 101°個。將消化下來的細胞懸液中加入28L細胞生長液，采用兩步接種法接種于AP200灌注袋6內，細胞接種密度為每克載體接種1.25X 107個細胞。吸附同時在激流袋5內補充 55L細胞生長液預熱。吸附過程完成后，設置設備參數如下T1:37°C、T2:42°C、T3:35. 5°C, PH7. 2， 00:70%，震蕩速度43印111，液體循環速度3171^11。啟動細胞培養程序，進行細胞培養。每日取樣測殘糖量，及時補充營養液、逐漸增大液體循環速度。種子細胞接種至AP200型生物反應器后，單日葡萄糖的消耗量(g/d/L)呈現增長趨勢，以第4、5日增長速度最快，直至第6日細胞單日耗糖達到3. 69g/d/L，增長速度趨于緩慢，說明反應器內細胞增長速度趨緩，細胞已經增加到了最大密度，達到了接毒需要(見圖 3)。b、病毒的接種與培養
排空反應器內液體，將經亞克隆純化篩選的效價為107 4TCID5Q/ml的PRRSV-R98毒液 2000ml打至激流袋5內，與預先打入激流袋5的40L無血清單倍DMEM —同打至灌注袋6內， 靜置吸附45min，同時在激流袋5中補充40L含血清4%的DMEM營養液，病毒接種劑量約為 0. IMOI。吸附完成后，調整設備參數如下溫度Tl 36. 50C> T2 :39°C、T3 :36°C，pH :7. 4， DO :70%，振蕩速度45rpm，液體循環速度3. 8L/min。啟動病毒培養程序開始培養。接毒18h時，補充4倍濃縮DMEM 10L, 10g/L葡萄糖IL0C、病毒液的收獲
接毒40h時開始收獲。一次性收獲灌注袋6內上清病毒液，將含有紙片載體8和部分病毒液的灌注袋6凍融兩次后去上清病毒液液與已收獲的病毒液混合，約102L，于-20°C冷凍保存。d、制苗毒液的檢驗
按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附錄進行檢驗，無細菌、霉菌、支原體生長。 病毒液對豬安全無副作用，收獲的病毒液用細胞測定效價，每Iml含病毒109_ 12TCID5tlt5e、配苗、分裝及凍干
將檢驗合格的病毒液混合于同一容器，加入5%的蔗糖脫脂乳凍干保護劑充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得成品。C、疫苗安全性檢驗
選用7日齡健康易感仔豬3頭，每頭豬頸部肌肉注射10頭份該疫苗。連續觀察14日， 免疫后仔豬精神、食欲無明顯變化，無異常臨床反應，疫苗安全性檢驗合格。D、疫苗效力檢驗
選用30日齡健康易感仔豬10頭，隨機分為兩組，第一組5頭各頸部肌肉注射該疫苗1 頭份，第二組5頭不接種疫苗，作為對照，在同等條件下隔離飼養。所有豬各滴鼻攻毒檢驗用強毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株病毒培養液:3ml(104_5TCID5cZml )，每日測溫， 連續觀察觀日。結果對照豬均發病，且死亡3頭，5頭免疫豬均未發病。疫苗效力檢驗合格。實施例3三種收獲病毒液方法應用比較實驗 1、材料與方法
設備、種毒等材料同實施例2 ；
實驗分為三個組，均按照實施例2中同樣方法培養制苗用細胞、接種病毒、擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒，但三組采用不同的方法收獲病毒液，收獲的病毒液均按照常規方法測定病毒液體積和效價。第一組采用一次性收獲法見實施例2 ；
第二組采用多次收獲法24h時首次收獲，以后每隔他收獲一次，至4 時最后一次收獲，共收獲5次；前4次收獲，每次收獲病毒液體積總量的70 90%，并補充等體積量的細胞維持液，最后1次收獲操作與實施例2相同；混合收獲的全部病毒液；
第三組采用連續流加收獲法，24h時開始連續流加收獲，24 3 控制收獲速度1. 5L/ min,32 38h收獲速度1. OL/min,收獲同時連續補充等量細胞維持液；3 時停止連續流加收獲，繼續培養至48h，同實施例2操作收獲剩余病毒液；混合收獲的全部病毒液。2、結果
第一組收獲得病毒液體積最小，但是病毒液效價最高，第二組與第三組收獲病毒液體積較大，病毒液效價較低，但是病毒收獲總量高。(結果見表1)。表1收獲病毒液測定結果_
權利要求
1.一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，其特征在于，它利用一個激流灌注式生物反應器作為培養工具，所述激流灌注式生物反應器的液體循環系統由兩個蠕動泵、硅膠管、激流袋(5)、灌注袋(6)、有孔硅膠管(7)與紙片載體(8)組成；所述第一蠕動泵(1)通過硅膠管(3)與激流袋(5)、灌注袋(6)連通、且蠕動泵(1)控制流向為由灌注袋(6)到激流袋(5)；所述第二蠕動泵(2)通過硅膠管(4)與激流袋(5)、灌注袋(6)連通、 且控制流向為由激流袋(5)到灌注袋(6)；制備按如下步驟進行a.制苗用細胞的培養將細胞懸液，內含宿主細胞和細胞生長液，接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋 (6)，使細胞貼附在紙片載體(8)上，設定設備參數，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；b.病毒接種與培養當細胞達到最大密度時，排空反應器內液體，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種步驟a 所得制苗用細胞；加入細胞維持液，調節設備參數，啟動病毒培養程序，擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒；c.病毒液收獲收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液，備用；d.疫苗的制備將步驟c收獲的病毒液制備疫苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，宿主細胞是經過有限稀釋法克隆純化篩選的Marc-145或者M104細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，細胞懸液接種采用兩步法， 第一步從灌注袋(6)下部打入細胞懸液，充滿灌注袋(6)，靜置吸附Ih ；第二步將灌注袋 (6)中的液體打出1/4 1/3，再從上部有孔硅膠管(7)內打入細胞懸液，至細胞懸液充滿灌注袋(6)，再靜置吸附0. 5 Ih ；細胞接種密度為每克載體接種0. 6 1. 5 X IO7個細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，系統參數設定為溫度Tl 37 37. 5°C、T2 :42 45°C、T3 :35 36°C，pH :7. 0 7. 4，DO :30% 70%，振蕩速度 30 50rpmo
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，細胞生長液循環灌注速度隨培養時間的增加逐漸增大，使硅膠管(3)、硅膠管(4)內液體顏色保持基本一致。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，根據細胞耗糖及時補充細胞生長液和10 20g/L葡萄糖，當殘糖量低于lg/L時，進行補液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒是經過蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞克隆株。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種劑量為0. 01 0. 3M0I，接毒吸附時間為30 45min。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，設備參數為溫度Tl:36 37°C、T2 39 43°C、T3 :35 36°C，pH :7. 2 7. 6，DO :30% 70%，振蕩速度 30 50rpm。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，接毒后18 20h時需要補充循環系統總體積1/10 1/5的2 5倍濃縮DMEM液和10 20g/L的葡萄糖。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟a、步驟b中，細胞生長液或細胞維持液的流動方式為液體流過灌注袋的方向是從下到上，從灌注袋(6)抽走液體的管道為深層的有孔硅膠管(7)。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟c中，收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液采用三種方法中的任一種第一種收獲方法為一次性收獲，在病毒高峰期一次性收獲；第二種方法為多次收獲，18 24h時首次收獲，以后每隔6 他收獲一次，收獲同時補充新細胞維持液，共收獲3 5次；第三種方法為連續流加收獲，24 30h時開始收獲， 連續收獲12 16h，控制每分鐘收獲量為細胞維持液總體積0. 5 2%，至44 50h時收獲剩余病毒液。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述細胞生長液的配方為體積百分含量為90% 擬％的高糖DMEM液，8% 10%新生犢牛血清，調整PH值為7. 2 7. 4 ；所述細胞維持液的配方為體積百分含量98% 99%的高糖DMEM液，1% 21新生犢牛血清，調整 PH值為7. 2 7. 6。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述生物反應器有效培養體積為IOL 600L ；制苗用細胞直接在IOL或者100L的生物反應器中培養；或者經過IOL — 100L或 IOL — 100L — 600L逐級擴大培養，實現細胞種子鏈逐級擴增。
全文摘要
一種利用生物反應器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，它利用一個激流灌注式生物反應器作為培養工具，制備按如下步驟進行a.制苗用細胞的培養；b.病毒接種與培養；c.病毒液收獲；d.疫苗制備等工序。本發明具有操作簡便，污染幾率小，生產成本顯著降低，疫苗產量大，質量均一穩定，免疫效果優良等優點，整個生產工藝不涉及其他生物安全和公共衛生問題，適合大規模生產。
文檔編號A61P31/14GK102552896SQ20111045860
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者劉濤, 楊保收, 邱貞娜, 郁宏偉, 鄭朝朝 申請人:瑞普(保定)生物藥業有限公司