專利名稱：一種提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法
技術領域：
本發明屬于發酵工程領域，涉及一種提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法。 具體涉及一種在靈芝菌絲體液體發酵中利用中藥提取物以及通過調控中藥種類、濃度和添加時間等因素誘導靈芝次生代謝產物靈芝三萜類化合物的產生與積累的方法。
背景技術：
靈芝(Ganoderma lucidum)是我國最著名的高等藥用真菌。作為藥物已有2000 多年的歷史。目前在靈芝中研究較多的化學成分有多糖類、三萜類、核苷類、留醇類、生物堿類、呋喃類、氨基酸多肽類、油脂類、微量元素等物質。靈芝三萜是靈芝的主要活性成分之一。據文獻報道，靈芝三萜具有抗腫瘤、保肝作用，抑制組胺釋放、血管緊張素轉化酶等活性。而通過各種方法(如紫外誘變選育)促使得到更多的靈芝的有效活性成分，已成為國內外學者研究和關注的熱點。靈芝代謝產物可能與中草藥的有效成分發生復方、協同作用，如靈芝在添加中草藥培養液的環境中可能加速靈芝萜類的形成，增加其生物活性。中藥的某些成分可能促進靈芝的生長和有效成分的產生，使靈芝的原有作用得到補充或增強，從而具有更強的保健、 預防或治療功能，以便于進一步制作出配伍更佳的新型復合發酵制劑，用于功能性食品的開發等方面。三萜類化合物為靈芝主要藥用成分之一，國內外已經有很多報道，另外通過添加外源物的方法研究其對靈芝菌絲體生物量和三萜類化合物含量的影響也有不少報道，如把中藥提取液作為靈芝外源誘導物。
發明內容
本發明的目的在于提供一種提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法。本發明的目的可以通過以下技術方案實現—種提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其在于在靈芝菌絲體液體發酵時，采用含中藥提取物的培養基進行靈芝菌絲體液體發酵培養。上述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其在于包括以下步驟(1)稱取中藥材，制備中藥提取物；(2)向PDA培養基中加入步驟1制備的中藥提取物，制備含有中藥提取物的PDA培
養基；(3)向步驟(2)制備的含有中藥提取物的PDA培養基中接入靈芝菌種，菌種接種量為5% 15% ；在溫度沘 30°C，轉速120 150r/min條件下，搖床培養7 10d。上述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其在于所述的中藥提取物的制備方法為稱取中藥材，加4 10倍量的水浸泡0. 5 池后，加熱提取2 3次，每次提取時間為15 40min，過濾，合并濾液并濃縮濾液后，將濃縮液置于容量瓶中定容，得到中藥提取物。
上述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其在于步驟O)中按生藥量計算，所述PDA培養基中中藥材的添加量為50 800mg/mL。上述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其在于用于制備所述中藥提取物的中藥材為板藍根、連翹、澤瀉、黃芪或酸棗仁。優選為板藍根、連翹或酸棗仁。上述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其在于按生藥量計算，板藍根添加量為50 800mg/mL，連翹添加量為50 100mg/mL，澤瀉添加量為100mg/mL，黃芪添加量為50mg/mL，酸棗仁添加量為100mg/mL。進行靈芝菌絲體液體發酵時，不能直接將中藥材加入培養基中，需要先制備制備中藥提取液，再將中藥提取液加入到培養基中制成含中藥提取物的培養基。IOOOmL含中藥提取物的PDA液體培養基，培養基組成為馬鈴薯汁IOOOmL,葡萄糖20克，中藥提取物。具體做法是馬鈴薯洗凈去皮切成小塊，稱取200g，加水IOOOmL煮沸 10 30分鐘，紗布過濾，再加20g葡萄糖，充分溶解后，用中藥提取液部分代替水定容至1 升，分裝到三角瓶，115°C滅菌30分鐘，冷卻后貯存用于靈芝培養。本發明利用在液體發酵基礎中添加中藥提取液，提高靈芝菌絲體的三萜產量。本發明的有益效果通過本發明的方法，可顯著提高靈芝菌絲體液體發酵時三萜類化合物的產量，且方法簡單，與常規培養方法相比采用本發明方法可使液體發酵的靈芝菌絲體中三萜類化合物的產量提高對％ 845%。
具體實施例方式下面結合實例對本發明做進一步詳細說明實施例11.稱取中藥材板藍根5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態30min，倒出提取液，補加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計算，得到濃度為lOOmg/mL的板藍根提取液。分別按照上述方法制備50mL 濃度為 200mg/mL、400mg/mL、800mg/mL、1200mg/mL、 1600mg/mL的板藍根提取液。2.分別用50mL不同濃度的板藍根提取液部分代替水配制IOOmL PDA培養基，則所配制的PDA培養基中板藍根的生藥量分別為50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL、 600mg/mL、800mg/mL。每個樣品設三個重復。115°C滅菌30分鐘。分別以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養7天。3.發酵結束后，用銅濾網收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95 %乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。檢測結果見表1。與比較例相比產量增加明顯，三萜產量增加百分比見表2。實施例2
1.稱取中藥材連翹5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態30min，倒出提取液，補加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計算，得到濃度為lOOmg/mL的連翹提取液。按照上述方法制備50mL濃度為200mg/mL的連翹提取液。2.分別用50ml不同濃度的連翹提取液部分代替水配制IOOml PDA培養基，則所配制的PDA培養基中連翹的生藥量分別為50mg/mL、100mg/mL。每個樣品設三個重復。115°C 滅菌30分鐘。分別以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養7天。3.發酵結束后，用銅濾網收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95 %乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。檢測結果見表1。三萜產量增加百分比見表2。實施例31.稱取中藥材澤瀉10g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態30min，倒出提取液，補加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計算，得到濃度為200mg/mL的澤瀉提取液。2.用50mL濃度為200mg/mL的澤瀉提取液部分代替水配制IOOmLPDA培養基，則所配制的PDA培養基中澤瀉的生藥量為100mg/mL。樣品設三個重復。115°C滅菌30分鐘。 以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養7天。3.發酵結束后，用銅濾網收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。檢測結果見表1。三萜產量增加百分比見表2。實施例41.稱取中藥材黃芪5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態30min，倒出提取液，補加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計算，得到濃度為lOOmg/mL的黃芪提取液。2.用50mL濃度為100mg/mL的黃芪提取液部分代替水配制IOOml PDA培養基，則所配制的PDA培養基中黃芪的生藥量分別為50mg/mL。每個樣品設三個重復。115°C滅菌 30分鐘。分別以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養7天。3.發酵結束后，用銅濾網收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin，取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。檢測結果見表1。三萜產量增加百分比見表2。實施例51.稱取中藥材酸棗仁10g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態30min，倒出提取液，補加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計算，得到濃度為200mg/mL的酸棗仁提取液。2.用50mL濃度為200mg/mL的酸棗仁提取液部分代替水配制IOOmLPDA培養基，則所配制的PDA培養基中酸棗仁的生藥量為100mg/mL。樣品設三個重復。115°C滅菌30分鐘。以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養7天。3.發酵結束后，用銅濾網收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。檢測結果見表1。三萜產量增加百分比見表2。比較例1.配制IOOmL PDA培養基，設三個重復。115°C滅菌30分鐘。以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養7天。2.發酵結束后，用銅濾網收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測定吸光度，測定靈芝三萜含量。測得靈芝三萜產量為0. 07g/L。表1添加不同種類不同用量中藥提取液的培養基培養靈芝菌絲體時三萜產量
權利要求
1.一種提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其特征在于在靈芝菌絲體液體發酵時，采用含中藥提取物的培養基進行靈芝菌絲體液體發酵培養。
2.根據權利要求1所述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱取中藥材，制備中藥提取物；(2)向PDA培養基中加入步驟1制備的中藥提取物，制備含有中藥提取物的PDA培養基；(3)向步驟( 制備的含有中藥提取物的PDA培養基中接入靈芝菌種，菌種接種量為 5% 15% ；在溫度28 30°C，轉速120 150r/min條件下，搖床培養7 10d。
3.根據權利要求2所述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其特征在于所述的中藥提取物的制備方法為稱取中藥材，加4 10倍量的水浸泡0. 5 池后，加熱煮沸提取2 3次，每次提取時間為15 40min，過濾，合并濾液并濃縮濾液后，將濃縮液置于容量瓶中定容，得到中藥提取物。
4.根據權利要求2所述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其特征在于步驟 ⑵中按生藥量計算，所述PDA培養基中中藥材的添加量為50 800mg/mL。
5.根據權利要求1 3所述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其特征在于用于制備所述中藥提取物的中藥材為板藍根、連翹、澤瀉、黃芪或酸棗仁。
6.根據權利要求5所述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其特征在于所述的中藥材為板藍根、連翹或酸棗仁。
7.根據權利要求5所述的提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法，其特征在于按生藥量計算，板藍根添加量為50 800mg/mL，連翹添加量為50 100mg/mL，澤瀉添加量為 100mg/mL，黃芪添加量為50mg/mL，酸棗仁添加量為100mg/mL。
全文摘要
本發明公開了一種利用中藥提取物提高靈芝液體發酵菌絲體三萜產量的方法。本發明靈芝菌絲體的培養采用液體培養，在靈芝菌絲體液體發酵時，采用含中藥提取物的培養基進行靈芝菌絲體液體發酵培養。將不同濃度的中藥提取液(如板藍根、連翹、澤瀉、黃芪、酸棗仁)加入靈芝液體培養基中接種培養，培養后測定靈芝菌絲體三萜產量顯著提高。本方法具有成本低，無污染，易實現工業化生產等優點。
文檔編號A61K36/074GK102488719SQ201110439918
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月25日 優先權日2011年12月25日
發明者任昂, 師亮, 李夢嬌, 林龍, 穆大帥, 趙明文 申請人:南京農業大學