專利名稱：草氨酸鈉在制備fto酶抑制劑和減肥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及草氨酸鈉的新用途，具體設計草氨酸鈉作為FTO酶抑制劑在減肥藥物制備中的新用途。
背景技術：
近年來，全球肥胖人數不斷增加，已經成為一個嚴重的社會問題和醫學問題。不僅如此，肥胖還是II型糖尿病、心臟病、癌癥等疾病的發病危險因素。目前常用的減肥方法有飲食控制、增加運動、服用減肥藥物甚至手術治療等，然而這些方法通常需要較多的時間投入，不易堅持，或者副作用較大，減肥效果不佳且易反彈，因此開發新型減肥藥物一直是醫學領域研究的熱點(參見Haslay and Jaμ es，Obesity，2005)。許多科學研究表明，肥胖和基因存在著廣泛的聯系，其中一種名為“FTO” (fat mass and obesity associated)的基因在肥胖的發生中發揮著重要作用。Frayling等研究表明，FTO基因攜帶者其肥胖的發生幾率比正常人高出70%之多(參見=Frayling,Timpson et al. Science, 2007)。FTO基因導致肥胖的機制可能與其抑制新陳代謝，降低能量消耗效率有關，另有報道FTO基因還可以引起病態的饑餓感，導致肥胖(參見=LardenCheung et al. Trends in Endocrinology &Metabolism，2011)。2009 年德國科學家 Julia Fischer 等在《自然》雜志上發表文章稱，通過基因敲除抑制小鼠體內FTO基因的表達后，將這些小鼠與FTO基因正常的老鼠進行對比，結果發現雖然這些小鼠的飲食相對增加，且運動量也較少，但這些小鼠的體重和脂肪組織含量均明顯低于正常小鼠(參見=Fischer Koch et al. Nature, 2009)(如圖1 3所示，其中圖1表示FTO基因抑制前后不同組織中FTO蛋白表達量的改變；圖2表示FTO基因抑制前后對小鼠體重和脂肪分布的影響；圖3表示FTO 基因抑制前后小鼠脂肪組織切片的病理變化)。不僅如此，研究表明抑制FTO肥胖基因還可以使代謝相關疾病如糖尿病、心血管疾病和某些腫瘤的發病率下降(參見Han Niu et al. Nature, 2010)。因此，抑制FTO基因的表達將有助于肥胖的控制。
發明內容
本發明的發明目的是提供一種草氨酸鈉的新用途，即草氨酸鈉作為FTO酶抑制劑的應用以及草氨酸鈉在制備減肥藥物中的應用。為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是草氨酸鈉在制備FTO酶抑制劑
H O
的應用，所述草氨酸鈉的化學結構式為H』0O』a
O
ο發明人通過體外細胞實驗首次發現，草氨酸鈉可以顯著抑制FTO基因的表達；而 FTO基因表達受到抑制后，動物的體重和脂肪組織會明顯下降，其作用機制與FTO基因調節機體食物攝入和控制能量代謝平衡有關。因此，本發明同時要求保護草氨酸鈉在制備減肥藥物中的應用。
上述技術方案中，所述減肥藥物除了包括主要成分草氨酸鈉外，需要的時候還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體；所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充齊 、粘合齊 、濕潤劑、崩解齊 、吸收促進齊 、表面活性齊 、吸附載體、潤滑劑等；所述藥物的劑型包括膠囊、片劑或注射劑，均可按照藥學領域的常規方法制備。上述技術方案中，所述減肥藥物適用的對象包括肥胖患者及體重超標者，尤其是 FTO基因攜帶者，可以有效地減輕體重和降低身體內脂肪組織含量。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點由于本發明采用草氨酸鈉作為新的減肥藥物，可以有效降低體重和脂肪組織，并且可預防肥胖相關疾病，如糖尿病、心血管疾病及相關腫瘤的發生。
圖1為現有文獻中FTO基因抑制前后不同組織中FTO表達量的改變；圖2為現有文獻中FTO基因抑制前后對小鼠體重和脂肪分布的影響；圖3為現有文獻中FTO基因抑制前后小鼠脂肪組織切片的病理變化；圖4為實施例中不同濃度草氨酸鈉對Α549細胞生長的影響；圖5為實施例中不同濃度草氨酸鈉對FTO基因mRNA的影響；圖6為實施例中加入草氨酸鈉(40mmol/L)后不同時間FTO的mRNA表達變化；圖7為實施例中草氨酸鈉對細胞內ATP濃度的影響。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一1. 1材料人A549細胞購于美國細胞收藏中心(ATCC)，并由本實驗室保存和培養； D-MEM培養基干粉，小牛血清，胰酶粉末購自Gibco公司；標準蛋白質分子量、SDS-PAGE上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、TE電泳緩沖液、IOX轉膜液、30% Acry-Bis, "Tris-Hcl、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)購自江蘇碧云天生物技術研究所；二甲基亞砜(DMSO)、瓊脂糖和Tween-20來自上海高科技生物工程有限公司。1. 2細胞培養A549細胞培養含10 %小牛血清，谷氨酸胺及100萬U/L青霉素和鏈霉素的D-MEM培養基。細胞置于5% C02，37°C培養箱內培養，每2-3天傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。1. 3在A549細胞培養液中加入不同濃度草氨酸鈉24h后，MTT法測定細胞的生長活性取對數期生長的A549細胞，用0. 25%的胰酶消化打勻細胞計數后，按每孔5 X IO3個細胞接種于96孔板中，每孔200 μ L，于C02培養箱中培養24h后，分別加入0、10、20、40、 80mmol/L的草氨酸鈉，繼續培養20h后，每孔加入20 μ L質量濃度為5mg/mL的MTT，繼續處理4h后棄上清，加入150 μ L的DMS0，混勻IOmin后，在酶標儀上測量波長為570/630nm處的吸光度值(0D值)。結果如圖4所示，隨著草氨酸鈉濃度的增加，細胞生長受到明顯的抑制，其IC5tl(抑制50%細胞生長的濃度)為65mmol/L ；圖4中，*與對照組比較，ρ < 0. 05 ；#與前一組比較，ρ < 0. 05。
1. 4在A549細胞培養液中加入不同濃度的草氨酸鈉處理24h后，收樣后進行 RT-PCR分析；所述RT-PCR方法為1)提取總RNA 采用1 μ 1 Trizol試劑裂解待測細胞。加入200 μ 1氯仿，劇烈振搖1 后室溫靜置15分鐘。離心收集上清，加入500 μ 1異丙醇并混勻，室溫靜置IOmin后離心獲取RNA沉淀。以70%乙醇洗滌2次，真空干燥RNA沉淀，最后溶于2Q μ DEPC水中。 紫外分光光度計測定OD26tl值并計算RNA濃度。2)合成cDNA 進行cDNA合成的反應條件為總RNA 5μ g、oligo dT引物1 μ 1、逆轉錄酶1 μ 1、dNTP混合物2 μ ，RNaseA抑制劑1 μ 1，總反應體系為2Q μ ，剩余體積由無RNA 酶的ddH20補足；上述混合物于37°C反應60min，然后以70°C作用IOmin結束反應，置于冰
上待用。3) RT-PCR反應以合成的cDNA為模板，使用FTO引物和作為陽性對照的GAPDH引物擴增相應基因。其中FTO的引物為=SEQ ID No. 1上游引物5' -CTGTGA CGA TGT GGA CAA TGA T-3'，SEQ ID No. 2 下游引物 5' -ACC TCT GAGTTC TGA AAC GAT G-3'，共 460bp。 GAPDH 的引物為=SEQ ID No. 3 上游引物 5' -CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3'，SEQ ID No. 4 下游引物 5' -CAACCT GGT CCT CAG TGT AG-3'，共 724bp。PCR 反應總體系為 25μ 1 反應體系中，GoTaq Green Master Mix 反應緩沖液 12. 5 μ 1，cDNA 模板 0· 5 μ 1，正向、反向引物均為0. 5 μ 1 (10 μ Μ)，剩余體積以ddH20補足。4)PCR 反應條件94°C預變性 5min ；94°C變性 50s，50°C退火 40s，72°C延伸 45s， 共30個循環，最后于72°C延伸Smin結束反應。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經 0. 5 μ g/ml溴乙錠染色后在凝膠成像分析儀上進行觀察。結果如圖5所示，隨著草氨酸鈉的濃度增加，FTO基因的mRNA水平逐漸下降，并且呈現劑量依賴性；圖5中，*與對照組比較，ρ < 0. 05 ；#與前一組比較，ρ < 0. 05。結果如圖6所示，結果提示FTO的表達存在著時間依賴性，當加入草氨酸鈉4h后， FTO的mRNA水平開始顯著下降；圖6中，*與對照組比較，ρ < 0. 05 與前一組比較，ρ < 0. 05。1. 5為進一步探討草氨酸鈉對細胞內能量代謝的影響，采用ATP檢測試劑盒對加入不同濃度草氨酸鈉后細胞內ATP的含量進行測定，ATP濃度的測量方法為采用碧云天 ATP檢測試劑盒檢測，取處于對數生長期的細胞加入不同濃度草氨酸鈉24h后，按照說明書加入活細胞裂解液并放置在冰上裂解lOmin，在每個檢測孔內加入100 μ 1的ATP檢測試劑， 然后每孔加上100 μ 1樣品，迅速混勻，立即用luminometer測定RLU值。最后與標準曲線比對，計算出細胞內ATP濃度。為消除檢測時細胞總數對結果的影響，對細胞進行MTT檢測細胞活性和BCA測量蛋白質濃度，取兩者平均值對ATP濃度進行校正，最終以細胞個數為 IXlO6個計算ATP濃度。結果如圖7所示，隨著草氨酸鈉的濃度增加，細胞內的ATP濃度逐漸下降；圖7中， *與對照組比較，ρ < 0. 05 ；#與前一組比較，P < 0. 05。1.6統計學處理所有實驗均重復3次，取平均值，結果用^± χ表示。灰度值采用 Bandscan 5. 0計算，每個條帶重復3次。所有數據分析采用SAS 8. 0統計軟件，兩組均數比較應用t檢驗，多組均數比較應用方差分析，ρ < 0. 05認為差異有統計學意義。
權利要求
1.草氨酸鈉在制備FTO酶抑制劑中的應用。
2.草氨酸鈉在制備減肥藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及草氨酸鈉的新用途，具體設計草氨酸鈉作為FTO酶抑制劑在減肥藥物制備中的新用途。發明人通過體外細胞實驗首次發現，草氨酸鈉可以顯著抑制FTO基因的表達；而FTO基因表達受到抑制后，動物的體重和脂肪組織會明顯下降，其作用機制與FTO基因調節機體食物攝入和控制能量代謝平衡有關。由于本發明采用草氨酸鈉作為新的減肥藥物，可以有效降低體重和脂肪組織，并且可預防肥胖相關疾病，如糖尿病、心血管疾病及相關腫瘤的發生。
文檔編號A61P3/04GK102552231SQ20111043934
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者徐加英, 楊洋, 樊賽軍, 秦立強 申請人:蘇州大學