專利名稱：對蝦補體1q結合蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種對蝦補體結合蛋白的基因序列，更具體涉及一種從斑節對蝦肝胰腺cDNA文庫中同源克隆出來一個補體Iq結合蛋白基因的序列、氨基酸序列、時空表達圖譜，本發明還涉及該基因的用途。
背景技術：
補體系統的主要生理功能是促進吞噬和溶解靶細胞，消除外來抗原的侵害，是機體免疫防御機制的重要組成部分。補體被外來抗原激活通過兩個途徑(1)經典途徑，被 IgM和IgG復合物或碳水化合物激活；和( 替代途徑，被非已表面分子或細菌內毒素激活。兩個途徑終極效果，是通過在細胞表面形成膜攻擊復合物，從而導致補體的激活。補體 Clq是經典激活途徑中的起始成分之一，是各種補體分子中分子量最大GlOkDa)的γ球蛋白。Clq通過其膠原區的肽鏈相互聚合，從而增強B細胞產生Ig的作用。另一方面，在一些非免疫性因素的刺激下，補體系統的活化又可產生炎癥反應，并影響凝血及纖溶系統，導致機體正常組織細胞的損傷。現已研究證明，補體的過度激活將導致多種疾病，例如急性胰腺炎、阿爾茨海默病、銀屑病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、 中風、心肌梗死、溶血性貧血、血液透析、多系統器官衰竭等(Sahu，LambriS et al.，2000)。 因此抑制過度激活的補體級聯反應，調節機能恢復動態平衡，對患此疾病獲癥狀的人有所裨益。補體Iq結合蛋白是一種高度糖基化的蛋白，其特異性結合Clq膠原樣結構域，調控補體Iq的活性，從而抑制補體系統過度激活。同時，ClqBP是絲裂原蛋白酶的底物，是 MAPK激酶級聯反應的一部分，與細胞多種生理過程，如細胞生長、發育、分裂、死亡等密切相關。此外，某些病毒在進化過程中演變出利用補體Iq進入宿主細胞的侵染策略。因此，對補體Iq結合蛋白的研究，將有助于了解多種生理活動。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種對蝦補體Iq結合蛋白的cDNA及由其編碼的氨基酸。本發明的第二個目的在于提供含有上述對蝦補體Iq結合蛋白的cDNA的表達載體。本發明的第三個目的在于提供一種制備重組對蝦補體Iq結合蛋白的方法及由該方法制備的重組對蝦補體Iq結合蛋白。本發明的第四個目的在于提供一種能與上述重組對蝦補體Iq結合蛋白特異性結合的抗體。本發明的最后一個目的在于提供上述能與重組對蝦補體Iq結合蛋白特異性結合的抗體在制備蝦類抗病或增強蝦類免疫力藥物中的應用及其在制備蝦類生殖調控藥物中的應用。
本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的一種對蝦補體Iq結合蛋白的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述對蝦補體Iq結合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。其核苷酸和氨基酸序列的對照如SEQ ID NO. 3所示。本發明上述對蝦補體Iq結合蛋白(以下簡稱ClqBP)的cDNA，其具體通過如下方法獲得通過以近源物種ClqBP基因的CDS序列的保守區設計的兼并引物，并用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到斑節對蝦ClqBP基因的全表達序列。ClqBP又稱p32，它與補體分子Clq的膠原樣區結合，調控補體系統的經典途徑。斑節對蝦ClqBP基因包括120bp 5’-非翻譯區序列，401bp 3’-非翻譯區序列。該基因編碼263個氨基酸組成的蛋白，分子量為 29kd0該基因在卵巢和免疫器官中高表達，并被外源刺激誘導表達，可在制備蝦類抗菌抗病毒，以及卵巢發育和生殖調控藥物中的應用。本發明的第二個目的是通過如下技術方案來實現的一種表達載體，所述的表達載體包含上述對蝦補體Iq結合蛋白的cDNA。本發明的第三個目的是通過如下技術方案來實現的一種制備重組對蝦補體Iq 結合蛋白的方法，包括用上述表達載體轉化寄主細胞，培養轉化體，獲得重組的對蝦補體Iq
結合蛋白ο其中，本發明所述的寄主細胞是原核或真核細胞。優選為大腸桿菌。本發明提供的一種重組對蝦補體Iq結合蛋白，包括用上述表達載體轉化寄主細胞，培養轉化體，從培養物獲得重組的對蝦補體Iq結合蛋白的步驟的方法制備獲得。本發明的第四個目的是通過如下技術方案來實現的一種能與上述重組對蝦補體 Iq結合蛋白特異性結合的抗體。包括將上述DNA序列表達的原核或真核表達的重組蛋白， 免疫鼠、雞等實驗動物獲得多克隆或單克隆抗體。本發明的最后一個目的是通過如下技術方案來實現的重組對蝦補體Iq結合蛋白在制備蝦類抗病毒或增強蝦類免疫力藥物中的應用。或上述重組對蝦補體Iq結合蛋白在制備蝦類生殖調控藥物中的應用。本發明的有益效果是本發明從對蝦樣品中得到一個新的對蝦補體Iq結合蛋白的cDNA序列，通過基因工程技術對其功能研究，發現該序列在真核或原核細胞中可以高效表達；本發明還將上述對蝦補體Iq結合蛋白的cDNA序列克隆到原核或真核表達載體上， 轉化大腸桿菌感受態細胞，通過陽性克隆子的誘導表達得到其重組蛋白，研究其性質發現， ClqBP基因在卵巢中特異性高表達，并受LPS刺激后上調，其多克隆抗體對白班綜合癥病毒具有阻斷作用，揭示其可以作為蝦類抗病或增強蝦類免疫力藥物使用，還對蝦類的生殖調控具有良好作用。
圖1顯示ClqBP的blastP結果，含有MAM33亞家族結構域；圖加是雄性斑節對蝦ClqBP的半定量分析，M :marker ；1.肝胰腺；2.腸；3.鰓； 4.淋巴；5.神經；6.胃；7.精巢；8.血細胞；圖沘是雌性斑節對蝦ClqBP的半定量分析。M :marker ；1.肝胰腺；2.腸；3.鰓； 4.淋巴；5.神經；6.胃；7.卵巢；8.血細胞；
圖3是ClqBP mRNA在斑節對蝦性腺不同發育階段中的表達，其中1.無節幼體; 2.蚤狀幼體；3.糠蝦幼體；4.籽蝦；5. 7-8cm雌蝦卵巢；6. 10-12cm雌蝦卵巢；7. I期卵巢； 8. II期卵巢；9. III期卵巢；10. IV期卵巢；11. V期卵巢；12. 7-8cm雄蝦精巢；13. 10-12cm 雄蝦精巢；14. 14-15cm雄蝦精巢；15. 15_16cm雄蝦精巢；16. 18_20cm雄蝦精巢；17. 20cm雄蝦精巢；圖4是斑節對蝦ClqBP基因在LPS刺激下的表達特征分析；圖5是ClqBP在大腸桿菌中的融合表達蛋白，其中M 蛋白marker ； 1. pET-ClqBP 的E. coliBL21重組菌株，IPTG誘導表達；2. pET_32a(+)空載體的E. coli BL21菌株，IPTG 誘導表達；圖6是Ni-NTA樹脂親和純化的ClqBP原核表達蛋白，其中M:蛋白marker ； l.pET-32a(+)空載體的Ε. coli BL21菌株，IPTG誘導表達；2. Ni-NTA樹脂親和純化的 pET-ClqBP，第二收集管；3. Ni-NTA樹脂親和純化的pET_ClqBP，第三收集管；圖7是ClqBP原核蛋白的免疫印跡結果，使用pET_ClqBP多克隆抗體進行免疫印跡；圖8是重組ClqBP (5mg/ml)以及重組ClqBP抗體對對蝦的阻斷效果圖。
具體實施例方式下面通過以下具體實施方式
對本發明作進一步闡述，但是本發明的內容完全不局限于此。1.總RNA的提取和肝胰腺全長cDNA文庫構建1. 1總RNA的提取取鮮活健康斑節對蝦(體重約150g)在實驗室內暫養3d后(水溫約，氣泵充氣)，解剖蝦體取出肝胰腺約lOOmg，放入ImL RLT Buffer (Qiagen, USA)中進行低溫研磨， 按照Qiagen Mini試劑盒使用說明提取總RNA，并使用DNase消化除去基因組。1. 2肝胰腺全長cDNA模板的制備按照GeneRacer kit (Invitrogen, USA)制備全長 cDNA 模板。取 3 μ g 總 RNA 經過小牛堿性磷酸酶(CIP)反應去除RNA 5’磷酸基團，經過煙草焦磷酸酶(TAP)去除RNA 5’ 帽子結構，利用RNA連接酶連上GeneRacer RNA Oligo，再利用GeneRacer OligodT引物在逆轉錄酶Superscript III的作用下50°C反應60min，從而獲得全長cDNA的模板。2.補體Iq結合蛋白基因cDNA全序列的克隆2. 1兼并引物設計依據，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、小鼠、斑馬魚、果蠅等)ClqBP同源基因⑶S序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼并引物。引物設計后采用乙睛亞磷酰胺化學法進行DNA合成，得到以下引物序列F 5' -GCCDCCCNGA CKCGVACT-3，R 5' -CTGANCGTAHAAAGMATNCTBGTA-3。2. 2ClqBP基因片段的獲取以近源物種ClqBP基因CDS序列的保守區設計的兼并引物，擴增片段大小約為 819bp。
GCCGCCCGGACTCGCACTCCTCTAATTCAAACAGTTTCCAGGACCAATTACCTGCGACTA60
TGAGTGCCATCAGCCGTGCTATGTACCGCCTTCAAGGCTCTCTGCTGCCGGGGGTCATGG120
GCATCCGGGGTGTCGTGGCGCCGTCCCGAAACCTGACGAGGAACTTGGTGGTGATGTGCT180
CCAACGCCGGTCACGGCCGCCGCACGCCGCTCCGGTCTTCCACGCTGTGCTCCTGCGGCT240
GCGGGATCCACGGCATGCACACGAGAGGAGATAGAGAGTTGGTAGAATTTCTACAAGAGG300
AMTATTGGCTGAGAAGAAAACAATGGCCAGTGGTGTTCCTTCACATATAGATGATTTCA360
AAGTTAGTGTTAATGATGCAGAGGTTACTCTTACMAGAACTTCCATGATGAGGTCATTG420
CCATCAGCCTCAACGTGAATCACACAGTAGACACTGAAGCCCCTGCTGAGTTGAGCCAAG480
ACCAGTCTGAAGGAGAGCTCMGAGTCGTCCCAGCTTTGAAGTTGATATCAAGGTTGGCT540
CGAAAACCCTGTCCTTCACGTGCTCTTACTCAGGACCAAGTGACATTACAGAAGGTCAAG600
ACCAGGTTGAGGATGCTTTTGGTATCMCGMCTTACCATGTATGAGGGCGAATGGAATG660
AAGAAGTCTACTGTGTTTCTGGAGATATTTTGGATGGCATGATGTATGATCTTTTAATGA720
ACATGTTGGAAGAGAGAGGAGTCACMATGAGTTTGCAGAGAAATTGAGCAATCTCTGCT780
CTGACTACGAGCATTCTTTATACGTTCAGTTACTTCAAA819ClqBP基因的部分序列以上述合成的cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，反應體系為10x PCR反應緩沖液 5μ L，25mmol/L MgCl23 μ L, 10mmol/L dNTP 2 μ L，10nmol/L 弓丨物 F 禾口 R 各 2 μ L， Taq酶1. 25U，用超純水將反應體系補充至50 μ L。反應條件為1個循環，94°C變性5min ； 35個循環:94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸45s ； 1個循環，72°C延伸IOmin ；4°C保溫。 所擴增的PCR產物用的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然后將純化的PCR產物克隆到pGEM-T載體(Promega，USA)中，轉化大腸桿菌DH-5 α感受態細胞， 挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經兼并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質粒DNA用Μ13 通用引物進行測序。2. 3ClqBP 全長 cDNA 的獲得根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物。利用cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)技術對目的基因的3'和5'末端進行PCR擴增。
依據序列合成 5，RACE 引物 5，-CGCCCTCATACATGGTAAGTTCGT-3，和 3，-RACE 弓丨物5’ -CTCCGGTCTTCCACGCTGTGCT-3’，采用上述合成的全長cDNA為模板，按照GeneRacer Kit(Invitrogen, USA)進行5’ RACE PCR擴增。第一次反應體積為20 μ 1，反應條件為個 94°C變性anin ；5個循環94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸Imin ；25個循環94°C變性 30s，65°C退火 30s，72°C延伸 Imin ；1 個循環，72°C延伸 IOmin ；4°C保溫。利用 5，RACE 巢式引物 5’ -AGCCGCAGGAGCACAGCGTGGAA-3’ 和 3’ RACE 巢式引物 5’ -CTGCTGAGTTGAGCCAA GACCAGTCTGA-3，進行巢式PCR，反應體積為50 μ 1，反應條件為94°C變性^iin ；30個循環 94°C變性 30s，68°C退火 30s，72°C延伸 Imin ； 1 個循環，72°C 延伸 IOmin ;4°C保溫。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，亞克隆PGEM-T載體，T7、SP6進行測序反應獲得約5’ RACE 片段301bp (圖2)以及3，RACE片段787bp的核酸序列(圖3)，拼接后獲得全長cDNA為 1310bp(圖 5)。TTTTTGGGTA TTTATTTAGG ACATCGTGTG CATCTCACGT GTACGAGAGG TTACAGGGAC 60CGCCGCCCGT ACTCGCACTC CTCTAATTCA AACAGTTTCC AGGACCAATT ACCTGCGACT 1200064]ATGAGTGCCATCAGCCGTGCTATGTACCGCCTTCMGGCTCTCTGCTGCCGGGGGTCATG180[
GGCATCCGGGGTGTCGTGGCGCCGTCCCGA AACCTGACGAGGAACTTGGTGGTGATGTGC240
TCCAACGCCGGTCACGGCCGCCGCACGCCGCTCCGGTCTTCCACGCTGTGCTCCTGCGGC300
T301
5，RACE獲得序列
CTGCTGAGTTGAGCCAAGACCAGTCTGAAGGAGAGCTCAAGAGTCGTCCCAGCTTTGAAG60
TTGATATCAAGGTTGGCTCGMAACCCTGTCCTTCACGTGCTCTTACTCAGGACCAAGTG120
ACATTACAGAAGGTCMGACCAGGTTGAGGATGCTTTTGGTATCMCGAACTTACCATGT180
ATGAGGGCGAATGGAATGAAGAAGTCTACTGTGTTTCTGGAGATATTTTGGATGGCATGA240
TGTATGATCTTTTAATGAACATGTTGGAAGAGAGAGGAGTCACAMTGARTTTGCAGAGA300
AATTGAGCAATCTCTGCTCTGACTACGAGCATTCTTTATACGTTCAGTTACTTCAAAAAG360
TGCAGGACTTCGTCAAGAGGMATAAGTGAGAAACTCTTGAACTGACAACAAATCACCAC420
AGTATCATCAAGCCCMGATTTCAAGTGAATGGATGGTCTGCCTTGCAAAAGTMCCATT480
TATGTTCCATTCTGAGTAGAMTGTMCAGATATTTCTTGTATTGGATATATCTAGGGCT540
GTTCATTTTCTTTTTTTCTTTTTTATATATAGTTACATAAAAATGAAGATTTTGATCATT600
AATAAAMATTGCTAACTTTTTATATGTTTACAGTTTGTTCTGTTGTATAGCTTATAATA660
TTTATCACTTMTGGTATCGTCTTTGCAAAAGGCAAGACACTGTMGTAATATGTACAGA720
AGAAGTCTAGGTTGAATGGCCTTGACTATCTCTTMTATATAACMAGATGGAMAAAM780
AAAAAM787
3，RACE獲得序列
2. 4ClqBP的生物信息學分析
Accession
Description
Total E_ score value
XP 002400595.
202 3e-50
complement component [Aedes aegypti] >gb|ABF18301.1| complement component 1 q XP 001661410.1 subcomponent binding protein-like protein [Aedes aegypti] >gb|EAT36844.1| complement 235 5e-60 component [Aedes aegypti]
ABD36320.1 mitochondrial matrix protein p32 [Bombyx mori]224 6e-57
glycoprotein gClqBP, putative [Ixodes scapularis] >gb|EEC11284.1| glycoprotein gClqBP, putative [Ixodes scapularis]
complement component 1 Q subcomponent-binding protein, mitochondrial [Mus musculus] >gb|AAL77246.1 |AF300619_1 p32-RACK [Mus musculus] >gb|AAH38075.1| Complement component 1, q subcomponent binding protein [Mus musculus] >emb|CAI26064.1| complement —component 1, q subcomponent binding protein [Mus musculus] >emb|CAM46325.1|
complement component 1, q subcomponent binding protein [Mus musculus] >gb|EDL12635.1| complement component 1, q subcomponent binding protein, isoform CRA_b [Mus musculus] CAA04531.1 glycoprotein gClqBP [Rattus norvegicus]125 5e-27ClqBP 的 blast 分析結果用Blast (http: //www, ncbi. nim. nih. gov/)進行同源性分析，結果如圖 4 所示， 該基因與伊蚊、蜱蟲、小鼠等的ClqBP蛋白有高度同源性，揭示該基因是ClqBP基因。禾Ij用 DNAstar等工具進行生物信息學分析，揭示起始密碼ATG位于121_口3核苷酸，終止密碼子
NP 031599.2
134 le-29位于907-909核苷酸，開放讀碼框為789個核苷酸，推測編碼一個263個氨基酸的蛋白(圖 5)。5，UTR為120bp，3，UTR為388bp，3，UTR存在典型的加尾信號AATAAA(圖5)。利用 SignalIP 軟件(http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)分析該蛋白在 1-22 氨基酸為信號肽序列，并且在78-159氨基酉S存在典型的MAM33結構域(附圖1)，揭示其屬于線粒體基質蛋白家族成員。
TTTTTGGGTATTTATTTAGGACATCGTGTGCATCTCACGTGTACGAGA48
GGTTACAGGGACCGCCGCCCGTACTCGCACTCCTCTAATTCAAACAGT96
TTCCAGGACCAATTACCTGCGACTATGAGTGCCATCAGCCGTGCTATG144
MetSerAlalieSerArgAlaMet
5
TACCGCCTTCAAGGCTCTCTGCTGCCGGGGGTCATGGGCATCCGGGGT192
TryArgLeuGlnGlySerLeuLeuProGlyValMetGlylieArgGly
101520
GTCGTGGCGCCGTCCCGAAACCTGACGAGGAACTTGGTGGTGATGTGC240
ValValAlaProSerArgAsnLeuThrArgAsnLeuValValMetCys
25303540
TCCAACGCCGGTCACGGCCGCCGCACGCCGCTCCGGTCTTCCACGCTG288
SerAsnAlaGlyThrGlyArgArgThrProLeuArgSerSerThrLeu
455055
TGCTCCTGCGGCTGCGGGATCCACGGCATGCACACGAGAGGAGATAGA336
CysSerCysGlyCysGlylieThrGlyMetHisThrArgGlyAspArg
606570
GAGTTGGTAGAATTTCTACAAGAGGAAATATTGGCTGAGAAGAAAACA384
GluLeuValGluPheLeuGlnGluGlulieLeuAlaGluLysLysThr
758085
ATGGCCAGTGGTGTTCCTTCACATATAGATGATTTCAAAGTTAGTGTT432
MetAlaSerGlyValProSerHislieAspAspPheLysValSerVal
9095100
AATGATGCAGAGGTTACTCTTACAAAGAACTTCCATGATGAGGTCATT480
AsnAspAlaGluValThrLeuThrLysAsnPheHisAspGluVallie
105110115120
GCCATCAGCCTCAACGTGAATCACACAGTAGACACTGAAGCCCCTGCT528
AlalieSerLeuAsnValAsnHisThrValAspThrGluAlaProAla
125130135
TTTGAAGTTGATATCAAGGTTGGCTCGAMACCCTGTCCTTCACGTGC576
GluLeuSerGlnAsp Gln Ser Glu Gly Glu Leu Lys Ser Arg Pro Ser
140145150
TTTGAAGTTGATATCAAGGTTGGCTCGAMACCCTGTCCTTCACGTGC624
PheGluValAsplieLysValGlySerLysThrLeuSerPheThrCys
155160165
TCTTACTCAGGACCAAGTGACATTACAGMGGTCAAGACCAGGTTGAG672
SerTyrSerGlyProSerAspLeuThrGluGlyGlnAspGlnValGlu
170175180
GATGCTTTTGGTATCAACGAACTTACCATGTATGAGGGCGMTGGAAT720
AspAlaPheGlylieAsnGluLeuThrMetTyrGluGlyGluTrpAsn
185190195200
GMGAAGTCTACTGTGTTTCTGGAGATATTTTGGATGGCATGATGTAT768
GluGluValTyrCysValSerGlyAsplieLeuAspGlyMetMetTyr
205210215
GATCTTTTAATGMCATGTTGGMGAGAGAGGAGTCACAAATGARTTT816
AspLeuLeuMetAsnMetLeuGluGluArgGlyValThrAsnGluPhe
220225230
GCAGAGAAATTGAGCAATCTCTGCTCTGACTACGAGCATTCTTTATAC864
AlaGluLysLeuSerAsnLeuCysSerAspTyrGluHisSerLeuTyr
235240245
GTTCAGTTACTTCMAAAGTGCAGGACTTCGTCAAGAGGAAATAAGTG912
ValGlnLeuLeuGlnLysValGlnAspPheValLysArgLys氺
250255260
AGAAACTCTTGAACTGACAACAAATCACCACAGTATCATCAAGCCCAA960
GATTTCAAGTGAATGGATGGTCTGCCTTGCAAAAGTAACCATTTATGT1008
TCCATTCTGAGTAGAAATGTAACAGATATTTCTTGTATTGGATATATC1056
TAGGGCTGTTCATTTTCTTTTTTTCTTTTTTATATATAGTTACATAAA1104
AATGAAGATTTTGATCATTAATAAAAAATTGCTAACTTTTTATATGTT1152
TACAGTTTGTTCTGTTGTATAGCTTATAATATTTATCACTTAATGGTA1200
TCGTCTTTGCAAAAGGCAAGACACTGTAAGTAATATGTACAGAAGAAG1248
TCTAGGTTGAATGGCCTTGACTATCTCTTAΑΤΑTATAACAAAGATGGA1296
AMAAAAAAAAAAA1310。
ClqBP的核苷酸序列和推測的氨基酸序列
3. PCR檢測ClqBP mRNA在雌雄斑節對蝦不同組織的分布
提取了雌雄斑節對蝦的不同組織(包括肝胰腺、腸、鰓、淋巴、神經、胃、精巢、卵巢、血細胞)的RNA。總RNA的提取方法見前所述取不同組織總 RNAl μg與反轉錄引物(Oligo-(dT) 18接頭引物)lyL(10pmol/L)混合，70°C加熱5min后，立即放置冰上，然后加入
5 X buffer, 2. 5mmol/L dNTP 混合液，Ribonuclease Inhibitor, M-MLV 反轉錄酶(Promega， USA)，反應體系為25 μ L0反應過程為42°C 60min, 70°C 15min,稀釋1倍后作為模板使用。
PCR 反應使用半定量引物 ClqBP-Fl (5' -GAACTTGGTGGTGATGTG-3‘)和 ClqBP-Rl (5 ，-CGTATAAAGAATGCTCGTAG-3，)擴增 ClqBP 基因，擴增看家基因 EF-1 α (EF-F15，-ATGGTTGT CAACTTTGCCCC-3，，EF-R15，-TTGACCTCCTTGATCACACC-3，)作為內參，以上述合成的 cDNA 作為模板。PCR反應條件為94°C變性aiiin ；χ個循環(ClqBP為30個循環，EF_1 α為26個循環)94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 Imin ； 1 個循環，72°C延伸 IOmin ；4°C保溫。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描成像，結果見附圖加和2b，可見在多種組織中均有表達，但在神經中沒有表達，在肝胰腺、鰓、淋巴、血細胞等免疫組織和細胞中高豐度表達，同時卵巢表達量顯著高于精巢。4. PCR檢測ClqBP mRNA在性腺不同發育階段的表達提取不同發育階段的斑節蝦，即無節幼體、蚤狀幼體、糠蝦幼體、籽蝦，以及體長為 7-20cm的雌雄斑節對蝦性腺進行總RNA抽提。不同時期精巢按照體長進行取樣，卵巢按照 I期、II期、III期、IV期、V期(分別為卵原細胞期、染色質核仁期、周邊核仁期、卵黃囊期、 成熟期)進行取樣。總RNA的提取方法、第一鏈CDNA逆轉錄和RT-PCR方法與前述相同。結果見附圖3，可見在無節幼體至籽蝦階段該基因表達量低或不表達，隨著性腺發育成熟開始有所表達。該基因在不同發育階段的卵巢表達量都較高，而在不同發育階段精巢中表達量均較低。再次印證了該基因是卵巢特異性表達的基因。5.熒光定量PCR檢測ClqBPmRNA在不同刺激物的表達LPS是多數真核生物天然免疫系統的有效刺激劑。LPS誘導表達的基因往往被認為參加了宿主抗菌的天然免疫過程。為確認ClqBP是否參與這一過程，進行了 LPS刺激表達實驗。健康斑節對蝦按照5 μ g/g的劑量注射50 μ 1 LPS,對照組注射50 μ L PBS緩沖液 (NaCl 137mM, KCl 2. 7mM, Na2HPO4IOmM, KH2P042mM, pH 7. 4)，于第二腹節處向心注射。注射后
0-24h取肝胰腺，剪碎后置于RNAlater中保存，并帶回實驗室分析。總RNA抽提方法和cDNA逆轉錄方法見前所述。根據ClqBP基因的全cDNA長設計熒光定量 PCR 弓 |，ClqBP-F2(5，-CTCAACGTGAATCACACAGTAGACACT-3，)，ClqBP_R2 (5，-ACTTC AAAGCTGGGACGACTCT-3，)，同時選用 EF-1 α 作為內參基因，引物序列 EF_F2(5，-AAGCCAGGT ATGGTTGTCAACTTT-3，), EF-R2 (5，-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3，)。熒光定量 PCR 反應體系為 20μ 10μ L 的 2XSYBR Green Real-time PCR Master Mix(TaKaRa, Japanese)， 1 μ L cDNA模板，2 μ L引物和7 μ L的雙蒸水，以蒸餾水代替模板作為陰性對照，每個樣品設置3個重復，反應參數為95°C預變性10s，然后95°C變性15s，55°C退火30s，72°C延伸30s， 共40個循環。實驗數據采用相對CT法進行數據分析。結果見附圖4，ClqBP在注射后池開始上調，到他達到表達高峰，表達量顯著高于對照組，隨著時間推移，表達量逐漸回落。說明ClqBP受LPS刺激后上調，是急性表達蛋白。6. ClqBP融合蛋白的制備以cDNA作為模板，利用PCR擴增ClqBP的部分開放讀碼框(l_210Aa)，PCR引物為 PETC-F :5，-ATGAATTCATGAGTGCCATCAGCCGTGCTA-3，；PETC-R :5，-ACCTCGAGAAGATCTCCAGA AACACA-3，；PCR 條件為 94°C 2min，94°C 30s，50°C，30s，72°C，lmin，共 30 循環。PCR 產物經 EcoRI, XhoI酶切后亞克隆到ρΕΤ-3^ι質粒，質粒經測序確認無誤后，轉化到大腸桿菌BL21 細胞，挑取單克隆培養至對數期，加入終濃度為0. 4mM的IPTG在37°C誘導表達3H附圖5顯示pET-ClqBP誘導表達為一個約43kD的融合蛋白，除去約21KD的標簽蛋白，ClqBP
1-210Aa的原核表達蛋白約22KD，與預測的分子量一致。利用融合表達蛋白的6個組氨酸標簽，使用Ni-NTA+樹脂和His BindPurification Kit(Novagen, USA)對 pET-ClqBP 進行親和層析純化。純化流程見 Novagen 試劑盒說明書。附圖6顯示His純化效果較好，純化的pET-ClqBP融合蛋白約43KD。7. ClqBP基因編碼蛋白的多克隆抗體制備將純化蛋白割膠回收(約100-200 μ g)，與3ml完全弗氏佐劑充分混勻孵化，在小鼠皮下多點注射，共注射8只小鼠，每只小鼠注射約50 μ g蛋白。第一次注射3周后加強免疫3次。加強注射劑量為10-20yg蛋白，使用不完全弗氏佐劑進行乳化。每次注射間隔10 天。第4次注射后將小鼠拔除眼球取血，將鼠血于37°C靜置Ih后，4000rpm離心IOminJl 取上層多抗血清，分裝保存于_80°C。附圖7顯示使用制備的多克隆抗體，可特異性的識別 ClqBP原核蛋白。8.重組ClqBP抗體對白斑綜合癥病毒的阻斷作用將純化獲得重組ClqBP (5mg/ml)以及重組ClqBP抗體(用PBS磷酸緩沖液1 10 稀釋)分別接種斑節對蝦成體，每組15-16尾。對照組一注射小鼠血清(用PBS 1 10稀釋)，對照組二注射磷酸緩沖液(PBS)。注射免疫物后12h，接種10_5濃度白斑綜合癥病毒 (WSSV)肌肉懸液，以后每隔Mi記錄死亡情況。結果顯示，對照組一和對照組二死亡規律相似，均在12天時累積死亡率達100% (圖幻；使用重組ClqBP抗體進行被動免疫，5天后較對照組死亡時間延遲，死亡率降低至80%，具有一定的阻斷效果(圖8)。相應的，注射重組 ClqBP具有加速發病的效果，斑節對蝦發病時間提前2-3天，累積死亡率達93% (圖8)。9. ClqBP基因在酵母中的表達將ClqBP基因的開放讀碼框的核苷酸序列與pGAPZA和pGAP α B表達載體制備成真核表達質粒，并轉入克隆菌株DH5 α。將表達質粒用限制性內切酶BspI消化，濃縮線性化DNA片段后，電轉化畢赤酵母，在kocin抗性平板上篩選出重組克隆，并在3ml YPD (100 μ g/ml) Zeocin培養，48h后分別取菌體和上清于12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。篩選出游特異蛋白表達的克隆。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種對蝦補體Iq結合蛋白的CDNA，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.—種對蝦補體Iq結合蛋白，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種表達載體，其特征是所述的表達載體包含權利要求1所述的對蝦補體Iq結合蛋白的cDNA。
4.一種制備重組對蝦補體Iq結合蛋白的方法，其特征是包括用權利要求3所述的表達載體轉化寄主細胞，培養轉化體，獲得重組的對蝦補體Iq結合蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征是所述的寄主細胞是原核或真核細胞。
6.一種重組對蝦補體Iq結合蛋白，其特征是包括用權利要求3所述的表達載體轉化寄主細胞，培養轉化體，從培養物獲得重組的對蝦補體Iq結合蛋白的步驟的方法制備。
7.一種能與權利要求6中所述的重組對蝦補體Iq結合蛋白特異性結合的抗體。
8.權利要求7所述的能與重組對蝦補體Iq結合蛋白特異性結合的抗體在制備蝦類抗病或增強蝦類免疫力藥物中的應用。
9.權利要求6所述的重組對蝦補體Iq結合蛋白在制備蝦類生殖調控藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種對蝦補體1q結合蛋白基因序列及其用途，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。還公開了含有上述對蝦補體1q結合蛋白cDNA的表達載體，及利用上述表達載體制備的重組對蝦補體1q結合蛋白及該重組對蝦補體1q結合蛋白的制備方法，還公開了一種能與上述重組對蝦補體1q結合蛋白特異性結合的抗體。還進一步公開了上述能與重組對蝦補體1q結合蛋白特異性結合的抗體在制備蝦類抗病或增強蝦類免疫力藥物中的應用。
文檔編號A61K38/17GK102559689SQ20111043892
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年1月30日
發明者劉先軍, 張殿昌, 楊麗詩, 楊其彬, 江世貴, 黃建華 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所