專利名稱：預防和抑制炎癥的小分子多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及預防和抑制炎癥的小分子多肽及其應用。本發明還涉及所述多肽的制法和應用，以及含所述多肽的藥物組合物。
背景技術：
炎癥是生物體對外界感染、外傷等損傷自身組織和細胞的一些因素所做的自然反應，牽涉到許多不同的細胞類型、介質和刺激物。急性炎癥是一種短期反應，往往促使機體愈合。與之相反，慢性炎癥是一種遷延的、功能失調的不良反應。事實上，慢性炎癥牽涉到生物體全身及局部的許多病理學狀態和疾病的發病機制，前者如腦神經失調，糖尿病，肝炎，風濕性關節炎以及人類不同部位腫瘤的發生；后者如眼葡萄膜炎，角膜炎癥等。流行病學調查顯示，作為主要的致盲性眼病之一，葡萄膜炎的發病率及患病率呈上升態勢。在美國和歐洲，葡萄膜炎大約占致盲性疾病的5-20% ;在發展中國家，這個數字大約為25%。由于葡萄膜炎主要 影響青壯年，治療棘手，易于反復發作，治療不及時或處理不當易導致失明，因此受到全球眼科學界的重視。自身免疫性疾病和感染是葡萄膜炎主要的致病因素。當機體發生感染時，體內巨噬細胞被細菌性毒素(如脂多糖等)激活，誘導分泌一系列炎性相關的細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子(TNF)-a、白介素6(IL)-6、(MCP)-1等，這些炎性因子在眾多慢性炎性疾病中起到至關重要的作用。長久以來，皮質類固醇激素是治療葡萄膜炎的首選藥物。尤其在治療頑固性葡萄膜炎時需長期用藥以防止其復發。然而皮質類固醇激素的潛在副作用很多，如易造成高眼壓、白內障、感染、傷口延期愈合等，使得藥物的臨床運用受到限制。免疫抑制劑(如環孢霉素A、FK506等)是抑制炎癥的二線藥物，同樣也有著肝腎損傷等嚴重的毒副作用。目前利用單克隆抗體等生物制劑(如抗腫瘤壞死因子制劑和白細胞介素受體拮抗劑、抑制淋巴細胞活化制劑、免疫調節和抗炎性細胞因子制劑等)拮抗或封閉與發病相關的淋巴細胞、細胞因子或細胞因子受體，具有一定的治療效果。然而由于生物制劑屬于大分子蛋白，合成困難、價格昂貴，很難進行臨床推廣。此外，在開發有效的抗炎制劑時，應充分考慮到眼科用藥的特殊性。首先，眼球內多個解剖和生理性的屏障存在削弱甚至阻遏了許多有效的大分子拮抗劑到達眼內病灶。以最常用的眼表給藥途徑為例，藥物必須要先后穿透親脂性的角膜上皮細胞緊密連接和親水性的角膜基質，因此只有具備適當脂溶性、低分子量或能與眼表組織內的轉運體結合的藥物才能到達前房發揮作用。如果以口服途徑給藥，存在于虹膜的血-房水屏障和存在于視網膜-脈絡膜的血-視網膜屏障會大大降低進入眼內的藥物濃度。其次，藥物在親水的淚液、房水、玻璃體液中溶解的程度與其有效性呈正相關。最后，眼科用藥的生物利用度很低，要使之提高，必須加大給藥的濃度。因此，本領域迫切需要開發一種適于眼球組織的安全有效的小分子抗炎制劑。
發明內容
本發明的目的是提供一類適于眼球組織的有效安全的可抑制炎癥反應的小分子多肽以及其片段、類似物和衍生物。本發明的另一目的是提供含所述多肽的制法和應用。在本發明的第一方面，提供了一種如式I所示的多肽，或其藥學上可接受的鹽[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8][Xaa9]-[XaalO]-[XaalI]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8]-[Xaal9]-[Xaa20]-[Xaa21]-[Xaa22]-[Xaa23](I)式(I)中，XaaO是無，或1_3個氨基酸構成肽段；Xaal 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala 或 Phe ；Xaa2是選自下組的氨基酸:Asp、Glu、Cys或Ser ；Xaa3 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala 或 Phe ；Xaa4是選自下組的氨基酸:Ser或Thr ;Xaa5 是選自下組的氨基酸:His、Arg、Gl、Lys、Arg、Glu 或 Asp ；Xaa6 是選自下組的氨基酸:Asn、Gin、His、Thr> Ser> Lys、Arg、Cys 或 Ser ；Xaa7是選自下組的氨基酸:Ser、Thr、Pro或Ala ；Xaa8 是選自下組的氨基酸:Ile、Leu、Val、Met、Ala 或 Phe ；Xaa9是選自下組的氨基酸:Ser、Thr、Glu或Asp ；XaalO是選自下組的氨基酸:Gln、Asn、Pro或Ala ；Xaall是選自下組的氨基酸:Glu、Asp、Pro或Ala ；Xaa12是選自下組的氨基酸:Ser或Thr ；Xaa13是選自下組的氨基酸:Ala、Val、Leu或Ile ;Xaa14 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala、Phe> Thr 或 Ser ；Xaa15 是選自下組的氨基酸:Tyr、Trp> Phe> Thr> Ser> Lys、Gln 或 Asn ；Xaa 16 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala 或 Phe ；Xaa17 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala、Phe> Cys 或 Ser ；Xaa18 是選自下組的氨基酸:Glu、Asp、Ala、Val 或 lie ；Xaa19是選自下組的氨基酸:Thr或Ser ；Xaa20 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala 或 Phe ；Xaa21是選自下組的氨基酸:Pro、Ala、Lys或Arg ；Xaa22是選自下組的氨基酸:Ser、Thr、Asp或Glu ；Xaa23是無，或1-3個氨基酸構成肽段；并且所述的多肽具有抑制炎癥反應的活性。在另一優選例中，所述多肽長度為22-25個氨基酸。
在另一優選例中，XaaO和Xaa23為無。在另一優選例中，XaaO和Xaa23是1_3個氨基酸構成的肽段。在另一優選例中，XaaO選自下組:W、RK、K、LHQ、HQ或Q。
在另一優選例中，Xaa23選自下組:R、RA、RAK。在另一優選例中，所述多肽選自下組:(a)具有SEQ ID NO: I所不氣基酸序列的多妝；(b)將SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經過1_5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎癥功能的由(a)衍生的多肽。在另一優選例中，所述的多肽還包括(c) ^fSEQ ID NO:1所示氨基酸序列根據人以外物種的NLRC5蛋白中的氨基酸序列進行相應修改而形成的，且具有抑制炎癥反應功能的由(a)衍生的多肽。在另一優選例中，所述的衍生多肽保留了彡70% (較佳地彡80%，更佳地^ 90% )的SEQ ID NO:1的所示多肽的抑制炎癥免疫反應的活性。在另一優選例中，所述的衍生多肽與SEQ ID NO:1的相同性彡80 %，較佳地彡90% ;更佳地彡95%。在本發明的第二方面，提供了一種抑制炎癥免疫反應的、式I化合物(或其衍生多肽)的二聚體和多聚體形式。在本發明的第三方面，提供了另一類具有抗炎抗性的多肽，它選自:(a)具有SEQ ID NO:3或5所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO:3或5所示氨基酸序列經過1_5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎癥功能的由(a)衍生的多肽。在本發明的第四方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發明第一方面或第三方面所述的多肽。在本發明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有:(i)本發明第一方面或第三方面所述的多肽或其藥學上可接受的鹽；和(ii)藥學上可接受的載體或賦形劑。在另一優選例中，所述的藥物組合物還包括藥學上可接受的抗炎或免疫抑制的藥物。在另一優選例中，抗炎或免疫抑制的藥物選自下組:潑尼松、地塞米松、倍氯米松等糖皮質激素藥物；水楊酸類、布洛芬、塞來考昔和羅非考昔等非留體類抗炎藥；環磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制劑。
在另一優選例中，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑或眼藥膏。在另一優選例中，所述的組合物為緩解劑型。在另一優選例中，所述的針劑為球后和眼內注射液。在本發明的第六方面，提供了本發明第一方面或第三方面所述的多肽或藥學上可接受的鹽的用途，(a)用于制備抑制炎癥免疫反應或治療炎癥免疫反應相關疾病的藥物；
(b)用于制備炎性因子的抑制劑；或(C)用于制備抗感染藥物。在另一優選例中，所述的炎性因子為TNF-α和細胞因子，較佳地，所述的細胞因子為IL-6。在另一優選例中，所述的與炎癥相關疾病的選自下組:自身免疫性眼病、炎癥性眼病、類風濕關節炎、幼年類風濕關節炎、血清陰性脊柱關節炎、銀屑病關節炎、銀屑病和炎癥性腸病。
在另一優選例中，所述的自身免疫性眼病包括:各類角結膜炎、虹膜睫狀體炎癥、中間部葡萄膜炎、后部葡萄膜炎、鞏膜炎、視網膜脈絡膜炎癥、增殖性玻璃體視網膜病變；炎癥因素參與其致病過程的疾病，包括糖尿病視網膜病變和老年性黃斑變性等。在本發明的第七方面，提供了一種抑制哺乳動物炎癥反應的方法，包括步驟:給需要的對象施用本發明第一方面或第三方面所述的多肽。在另一優選例中，所述的對象是人。在另一優選例中，所述的炎癥反應是與葡萄膜炎相關的炎癥反應。在本發明的第八方面，提供了一種制備藥物組合物的方法，包括步驟:將(i)本發明第一方面或第三方面所述的多肽或其藥學上可接受的鹽和(ii)藥學上可接受的載體或賦形劑進行混合，從而形成藥物組合物。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1顯示實施例1中的 LS22de鑒定結果，其中，圖1a為HPLC鑒定圖譜，圖1b為MS鑒定圖譜。圖2顯示LS22對鼠葡萄膜炎具有顯著的抑制作用，具體地，圖2a顯示，與空白對照組比較，LPS注射后的24小時，大鼠前房內滲出細胞計數明顯上升，而在LS22給藥組種，滲出細胞計數都有明顯降低；圖2b顯示，與空白對照組比較，LPS注射后的24小時，大鼠房水蛋白濃度明顯上升，而在LS22給藥組種，房水蛋白濃度都有明顯降低；圖2c為病理組織學檢查實驗，結果顯示，LPS后大鼠前房、睫狀體及后段玻璃體腔內有大量細胞滲出；圖2d顯示，在LS22干預下，組織中炎性細胞數明顯減少，抗炎作用明顯。圖3顯示LS22對TNF_a和IL_6的表達的作用結果，具體地，圖3a顯示，與空白對照組比較，LPS組細胞上清液中TNF-a水平明顯升高，LS22組對LPS誘導的TNF_a水平有明顯的抑制作用；圖313顯示，與空白對照組比較，LPS組細胞上清液中IL-6水平明顯升高，LS22組對LPS誘導的IL-6水平有明顯的抑制作用。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次制備了一類源自NLRC5蛋白的、具有抑制炎癥反應的，分子量不到3kDa(僅約2.4kDa)的小分子多肽。具體地，本發明人應用生物信息學的方法，基于同源性分析和生物學特性等分析，設計了源自NLRC5蛋白的數個候選序列，采用固相法將其合成，分離純化獲得高純度的小肽，并運用HPLC及MS對之進行鑒定，再經葡萄膜炎模型、LPS誘導的小鼠巨噬細胞增值模型，獲得了一類新型的、具有抗炎癥作用的小分子多肽。本發明的小肽的分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；安全性高，對生物組織毒副作用小；眼局部用藥生物利用度高，可減少劑量，從而減小全身副作用。在此基礎上完成了本發明。NLRC5 和 LRRNLRC5蛋白是核苷酸結合寡聚結構域樣受體(NLR)家族成員，由caspase聚集區(a caspase recruitment domain, CARD)、核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-bindingoligomerization domain, NOD)和亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeats domain, LRR)組成。富亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat, LRR)在富亮氨酸a2糖蛋白中被首次發現并命名的，現已發現LRRs蛋白廣泛存在于從病毒、酵母至哺乳動物的各種組織中。大部分富含LRRs的蛋白功能涉及到蛋白配體之間的相互作用。大部分的LRR大約20-30個氨基酸的長度，重復次數在2到52個。這些LRR蛋白被分為7個亞家族。所有的LRR重復序列可以分為高度保守序列和可變區域。高度保守序列由11個氨基酸LxxLxLxxNxL或12個氨基酸LxxLxLxxCxxL構架組成,并形成一個短的β折疊，在這些保守序列中，’ V是Leu、lie、Val 或 Phe, ‘N，是 Asn,、Thr> Ser 或 Cys, ’ C，是 Cys 或 Ser。在含有LRRS序列蛋白中，NLRs代表著一個細胞內PRRs (patternrecognition receptors)的大家族,其特征性的含有保守的核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)和亮氨酸重復序列(Leucine-richrepeats domain, LRR),其功能涉及到多種信號通路的激活。現已證實一些NLRs家族蛋白(如NODl、N0D2、NLRXl和NALP3) —旦遇到特定的病原相關分子模式(PAMPs)就可以誘導信號通路的轉導。活性多肽LS22多肽來源于核苷酸結合寡聚結構域樣受體(NLR)家族的成員-NLRC5。在本發明中，術語“本發明多肽”、“LS22多肽”、“LS22小肽”或“肽LS22”可互換使用，都指具有炎癥反應抑制活性的肽LS22氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的蛋白或多肽。此外，所述術語還包括具有抑制炎癥免疫反應功能的、SEQ ID NO:1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):1-5個(通常為1-4個，較佳地1-3個，更佳地1-2個，最佳地I個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為5個以內，較佳地為3個以內，更佳地為2個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的結構和功能。此外，所述術語還包括單體和多聚體形式的本發明多肽。例如，因此SEQ ID NO:1的相鄰上游殘基為W(小鼠)，或LHQ(牛屬)。本發明還包括LS22蛋白的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持抑制炎癥免疫反應功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)LS22多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導序列、分泌序列或6His等標簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。一類優選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相 比，有至多5個，較佳地至多3個，更佳地至多2個，最佳地I個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行氨基酸替換而產生。表權利要求
1.一種如式I所示的多肽，或其藥學上可接受的鹽[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8][Xaa9]-[XaalO]-[XaalI]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8]-[Xaal9]-[Xaa20]-[Xaa21]-[Xaa22]-[Xaa23](I) 式⑴中， XaaO是無，或1-3個氨基酸構成肽段； Xaal是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala或Phe ； Xaa2是選自下組的氨基酸:Asp、Glu、Cys或Ser ； Xaa3是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala或Phe ； Xaa4是選自下組的氨基酸:Ser或Thr ； Xaa5 是選自下組的氨基酸:His、Arg、Gl、Lys、Arg、Glu 或 Asp ； Xaa6 是選自下組的氨基酸:Asn、Gin、His、Thr、Ser、Lys> Arg、Cys 或 Ser ； Xaa7是選自下組的氨基酸:Ser、Thr、Pro或Ala ； Xaa8是選自下組的氨基酸:Ile、Leu、Val、Met、Ala或Phe ； Xaa9是選自下組的氨基酸 :Ser、Thr、Glu或Asp ； XaalO是選自下組的氨基酸:Gln、Asn、Pro或Ala ； Xaall是選自下組的氨基酸:Glu、Asp、Pro或Ala ； Xaa12是選自下組的氨基酸:Ser或Thr ； Xaa13是選自下組的氨基酸:Ala、Val、Leu或lie ; Xaa14 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala、Phe> Thr 或 Ser ； Xaa15 是選自下組的氨基酸:Tyr、Trp> Phe> Thr> Ser> Lys> Gln 或 Asn ； Xaa16是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala或Phe ； Xaa17 是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala、Phe> Cys 或 Ser ； Xaa18是選自下組的氨基酸:Glu、Asp、Ala、Val或lie ； Xaa19是選自下組的氨基酸:Thr或Ser ； Xaa20是選自下組的氨基酸:Leu、lie、Val、Met、Ala或Phe ； Xaa21是選自下組的氨基酸:Pro、Ala、Lys或Arg ； Xaa22是選自下組的氨基酸:Ser、Thr、Asp或Glu ； Xaa23是無，或1_3個氨基酸構成肽段； 并且所述的多肽具有抑制炎癥反應的活性。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO和Xaa23為無。
3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO和Xaa23是1_3個氨基酸構成的肽段。
4.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自下組: (a)具有SEQID NO:1所示氨基酸序列的多肽； (b)將SEQID NO:1所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎癥功能的由(a)衍生的多肽。
5.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權利要求1所述的多肽。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有: (i)權利要求1所述多肽或其藥學上可接受的鹽；和( )藥學上可接受的載體或賦形劑。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑或眼藥膏。
8.權利要求1所述的多肽或藥學上可接受的鹽的用途，其特征在于，(a)用于制備抑制炎癥免疫反應或治療炎癥免疫反應相關疾病的藥物；(b)用于制備炎性因子的抑制劑；或(c)用于制備抗感染藥物。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的與炎癥相關疾病的選自下組:自身免疫性眼病、炎癥性眼病、類風濕關節炎、幼年類風濕關節炎、血清陰性脊柱關節炎、銀屑病關節炎、銀屑病和炎癥性腸病。
10.一種制備藥物組合物的方法，其特征在于，包括步驟:將(i)權利要求1所述的多肽或其藥學上可接受的鹽和(ii)藥學上可接受的載體或賦形劑進行混合，從而形成藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及預防和抑制炎癥的小分子多肽及其應用。本發明還涉及所述小分子多肽的制法以及含所述多肽的藥物組合物。本發明多肽具有多種優點，例如分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體中保持較高的濃度；合成簡單、制備成本低等。
文檔編號A61P29/00GK103159851SQ20111042885
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者許迅, 許琰 申請人:上海市第一人民醫院, 許迅, 許琰