專利名稱：一種精制聚肌胞的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其是精制聚肌胞的制備方法和用途。
背景技術：
聚肌胞為一種干擾素誘導劑。在體內細胞誘導下產生干擾素，有類似干擾素的作用，故有廣譜抗病毒和免疫調節功能。用于病毒感染性疾病和腫瘤的輔助治療。目前國內已經開展用聚肌胞作為疫苗佐劑進行的研究，其中中國專利公布了專利號為93105862. 7、名稱為聚肌胞復合物免疫佐劑及含有該佐劑的疫苗和專利號為 200810011586. 6、名稱為凍干疫苗及其稀釋溶液分別包裝的疫苗產品和稀釋溶液的制備方法。還有文獻名為皮卡佐劑和皮卡狂犬病疫苗的安全性等文章都對聚肌胞作為佐劑的可行性進行了研究。但是對于單獨聚肌胞作為抗癌輔助治療的相關報道還沒有，因此本發明就是針對目前的情況，利用聚肌胞的廣譜抗病毒的原理，將聚肌胞設計為一種可有效提高聚肌胞抗腫瘤效果的制劑。我們對市售PIC產品進行了一系列的檢測，包括內毒素、殘留DNA及殘余宿主菌體蛋白的含量檢測，對不同內毒素、殘留DNA及殘余宿主菌體蛋白PIC進行了動物的發熱試驗對比；進行了 PIC加速和長期穩定性實驗，制訂了 PIC內毒素、殘留DNA及殘余宿主菌體蛋白的檢驗標準。申請將內毒素、殘留DNA及殘余宿主菌體蛋白控制于標準范圍的PIC與市場銷售PIC品種進行臨床對比實驗研究，以期明確內毒素、殘留DNA及殘余宿主菌體蛋白標準范圍。在此基礎上，我們進行了精制聚肌胞的純化與合成工藝探索。精制聚肌胞是在原聚肌胞制備工藝的基礎上通過層析技術進行精制，最大限度地去除內毒素、殘留DNA及殘余宿主菌體蛋白等雜質，從而大大地提高了純度和有效成分的含量；其內控標準中主要成分純度總含量控制在95%以上，遠遠高于原聚肌胞注射液的純度；該精制聚肌胞制備是在-40°C冷凍干燥的，低溫可以最大限度地保持了有效成分及其活性。
發明內容
針對現有技術存在的缺陷，本發明的目的之一是提供一種精制聚肌胞制劑的產品，它可以提高產品質量，減少副作用，擴大聚肌胞產品的應用范圍。本發明的目的之二是提供上述精制聚肌胞的制備方法及其用途。一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于先用化學法純化聚肌苷酸和聚胞苷酸；再經過柱層析的方法對聚肌苷酸和聚胞苷酸進行精制；然后合并純化后聚肌苷酸和聚胞苷酸，配制成精制聚肌胞溶液；將配好的精制聚肌胞溶液經過超濾濃縮制成精制聚肌胞原液；最后用0. 45um濾芯過濾，高壓，加入輔料后進行分裝，成品即為精制聚肌胞。一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于
(1)用化學的方法提取聚肌苷酸和聚胞苷酸；(2)用柱層析的方法對聚肌苷酸和聚胞苷酸進行精制；(3)合并精制后的聚肌苷酸和聚胞苷酸，合成聚肌胞溶液；(4)用超濾的方法將合成的聚肌胞溶液進行濃縮；(5)濃縮后的聚肌胞經0. 45um濾芯過濾、高壓滅菌，加入輔料，即成精制聚肌胞制劑。一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于所述步驟(1)純化聚肌苷酸和聚肌胞酸的方法為用水飽和酚氯仿抽提。一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于所述步驟( 凝膠過濾所用的填料是 kpharose4FF。一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于所述步驟C3)合并聚肌苷酸和聚胞苷酸，用水浴鍋進行加熱。一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于所述步驟(4)超濾濃縮所用的膜包分子量為5KD。一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于所述步驟( 加入的輔料為甘露醇。
具體實施例方式具體實施例1(1)緩沖液的配制磷酸氫二鈉1.5g磷酸二氫鈉0. 2g注射用水IOOOml(2)水飽和酚氯仿抽提將聚肌苷酸和聚肌胞酸用0. 5%的SDS溶液溶解，配制成30mg/ml溶液，用1/4體積的水飽和酚、氯仿抽提，100r/min攪拌10分鐘，然后靜置20分鐘，取上清液加入2. 5mol/L醋酸鈉溶液至濃度為0. 15mol/L,混勻后再加入2倍體積乙醇，4°C放置12小時，3000r/min離心20分鐘，取沉淀。取沉淀加入一定量的PBS溶解備用。(3)聚肌苷酸和聚胞苷酸的精制將溶解好的聚肌苷酸和聚胞苷酸溶液，用注射器打入柱床內，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集洗脫峰。(4)合并聚肌苷酸和聚胞苷酸將精致的聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液分別加熱至60士5°C，然后將聚胞苷酸溶液緩慢加入聚肌苷酸溶液中，在IOOrpm轉速下攪拌60分鐘，同時調節PH8. O左右，滴加硫酸卡那霉素200萬單位，在滴加的同時不斷攪拌。(5)超濾在無菌環境下用截留分子量為5KD超濾膜對樣品進行濃縮，首先用無菌的每升含 100萬單位硫酸卡那霉素的磷酸鹽緩沖液循環平衡超濾膜2L，將合并好的聚肌胞濃縮2倍，然后用含有硫酸卡那霉素的磷酸鹽緩沖液洗脫4L。(6)過濾用0. 45um濾芯對超濾后的聚肌胞溶液進行過濾。(7)配制聚肌胞取上述聚肌胞樣品0. 2ml,即含Img聚肌胞、含200單位硫酸卡那霉素；加入 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液0. 017ml，加入8mol/L磷酸鹽緩沖液0. 017ml，最后補加甘露醇注射液至0. 5ml。具體實施例2(1)緩沖液的配制磷酸氫二鈉1.5g磷酸二氫鈉0. 2g注射用水IOOOml(2)水飽和酚氯仿抽提將聚肌苷酸和聚肌胞酸用0. 5%的SDS溶液溶解，配制成30mg/ml溶液，用1/4體積的水飽和酚、氯仿抽提，在lOOr/min攪拌10分鐘，然后靜置20分鐘。取上清液加入2. 5mol/L醋酸鈉溶液至濃度為0. 15mol/L,混勻后再加入2倍體積乙醇，4°C放置12小時，3000r/min離心20分鐘，取沉淀。取沉淀加入一定量的PBS溶解備用。(3)聚肌苷酸和聚胞苷酸的精制將溶解好的聚肌苷酸和聚胞苷酸溶液，用注射器打入柱床內，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫。收集洗脫峰。(4)合并聚肌苷酸和聚胞苷酸將精致的聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液分別加熱至60士5°C，然后將聚胞苷酸溶液緩慢加入聚肌苷酸溶液中，在IOOrpm轉速下攪拌60分鐘，同時調節PH8. 0左右，滴加硫酸卡那霉素200萬單位，在滴加的同時不斷攪拌。(5)超濾在無菌環境下用截留分子量為5KD超濾膜對樣品進行濃縮，首先用無菌的每升含 100萬單位硫酸卡那霉素的磷酸鹽緩沖液循環平衡超濾膜2L，將合并好的聚肌胞濃縮2倍， 然后用含有硫酸卡那霉素的磷酸鹽緩沖液洗脫4L。(6)過濾用0. 45um濾芯對超濾后的聚肌胞溶液進行過濾。(7)配制聚肌胞取上述聚肌胞樣品1500ml，即含Img聚肌胞、含350萬單位硫酸卡那霉素；加入 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液300ml，加入8mol/L磷酸鹽緩沖液300ml，最后補加甘露醇注射液至 2000ml ο上述參照實施例對該一種精制聚肌胞的制備方法及用途進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于先用化學法純化聚肌苷酸和聚胞苷酸；再經過柱層析的方法對聚肌苷酸和聚胞苷酸進行精制；然后合并精制后聚肌苷酸和聚胞苷酸，合成精制聚肌胞溶液；將精制聚肌胞溶液經過超濾濃縮制成精制聚肌胞原液； 最后用0. 45um濾芯過濾，高壓，加入輔料后進行分裝，成品即為精制聚肌胞溶液。
2.一種精制聚肌胞的制備方法及用途，根據權利要求1所述，其特征在于(1)用化學的方法純化聚肌苷酸和聚胞苷酸；(2)用凝膠過濾的方法對聚肌苷酸和聚胞苷酸進行精制；(4)用超濾的方法濃縮聚肌胞溶液，制成精制聚肌胞原液；(5)通過0.45um濾芯過濾，加入輔料。
3.一種精制聚肌胞的制備方法及用途，根據權利要求2所述，其特征在于所述步驟(1)純化聚肌苷酸和聚肌胞酸的方法為用水飽和酚氯仿抽提。
4.一種精制聚肌胞的制備方法及用途，根據權利要求2所述，其特征在于所述步驟(2)凝膠過濾所用的填料是kphar0Se4FF。
5.一種精制聚肌胞的制備方法及用途，根據權利要求2所述，其特征在于所述步驟(3)合成聚肌苷酸和聚胞苷酸，在水浴加熱下，用攪拌漿進行攪拌，進行合成。
6.一種精制聚肌胞的制備方法及用途，根據權利要求2所述，其特征在于所述步驟(4)超濾濃縮所用的膜包分子量為5KD。
7.一種精制聚肌胞的制備方法及用途，根據權利要求2所述，其特征在于所述步驟(5)加入的輔料是甘露醇。
8.根據權利要求2所述，一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征在于精制聚肌胞用于提高抗癌效果。
全文摘要
本發明提供了一種精制聚肌胞的制備方法及用途，其特征是通過化學方法純化聚肌苷酸和聚肌胞酸，分別經過精制之后，合并成聚肌胞溶液，再經過超濾濃縮，加入輔料制成一種精制聚肌胞，這種精制聚肌胞可有效提高抗癌效果。
文檔編號A61P35/00GK102488704SQ201110420069
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者侯本晶, 沈麗麗, 焦月, 王國新, 王智佳, 趙鋼 申請人:天津濟命生生物科技有限公司