專利名稱：一種噬菌體口服微球制劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物藥物制劑領域，具體涉及一種噬菌體口服微球制劑及其制備方法。
背景技術：
長期以來動物細菌性疾病的防治主要依賴于抗生素，但隨之而來的是藥物殘留、 細菌耐藥性、環境污染等諸多問題。因此，積極尋求一種安全有效的新型抗菌制劑用于動物疾病防治乃當務之急。噬菌體是一類細菌性病毒，其中裂解性噬菌體在感染宿主菌后能快速復制增殖， 并最終破裂菌體細胞從而達到抗菌效果。目前噬菌體在防治動物細菌性疾病方面卓有成效。與傳統的抗生素相比，噬菌體治療具有特異性強、自我復制增殖、安全無殘留以及來源豐富等優勢，因此被認為是一種理想的抗生素替代品。但目前存在的問題是噬菌體缺乏合適的給藥劑型，尤其是在治療動物腸道疾病時，口服噬菌體的活性易遭胃酸和消化酶的破壞，喪失抗菌活性。目前只能通過口服抗酸劑中和胃酸這種原始的方式進行解決[文獻 1:Niu YD, Xu Y, McAllister ΤΑ, et al. Comparison of fecal versus rectoanal mucosal swab sampling for detecting Escherichia coli 0157 :H7 in experimentally inoculated cattle used in assessing bacteriophage as a mitigation strategy.J Food Prot,2008,71 :691-698]。因此，開發口服噬菌體制劑便成為噬菌體治療領域亟待解決的問題，而對噬菌體進行微囊化包埋，以制備成口服微球制劑不失為一種理想的策略。微囊化技術是指將固態、液態以及氣體活性物質包裹在天然或合成高分子材料中形成微小粒子并在特定條件下釋放的技術，目前已廣泛應用于口服藥物的控制釋放，酶和細胞的固定化等領域。但迄今尚未見到關于口服微囊化噬菌體的報道。一些病毒微囊化的研究則主要集中在口服疫苗方面，且一般是以聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)為載體材料，采用乳化-溶劑揮發法(Emulsion-solvent evaporation)對病毒活疫苗或滅活疫苗進行包埋，但該方法存在包封率低，微囊化過程中涉及到有機溶媒，易導致病毒變性或失活等問題[文獻 2 Ramya R，Verma PC, Chaturvedi VK, et al. Poly (lactide-co-glycolide) microspheres :a potent oral delivery system to elicit systemic immune response against inactivated rabies virus [J]. Vaccine, 2009，27 (15) :2138-2143.]。另夕卜，一些利用凝聚法在水相體系中制備出的載病毒微球，如精胺-硫酸軟骨素微球，雖避免了有機溶媒的使用，但最大不足是耐酸性差，且同樣存在包埋效率低的問題，也難以滿足噬菌體口服給藥體系的要求[文獻 3 =Moser CA, Speaker TJ, Offit PA. Effect of water-based microencapsulation on protection against EDIM rotavirus challenge in mice. J Virol, 1998,72(5) :3859-3862.]。而最近一項關于噬菌體微囊化的研究是以PLGA為材料，制備噬菌體的鼻腔給藥微球，也不適用于口服給藥體系[文獻4 =Puapermpoonsiri U，Spencer J，van der Walle CF. A freeze—dried formulation of bacteriophage encapsulated in biodegradable microspheres[J]. Eur J Pharm Biopharm,2009,72(1)26-33.]。雖然發明人曾經以殼聚糖-海藻酸鈉微球為載體有效實現對噬菌體!^elixOl的微囊化包埋，并顯著提高了噬菌體在模擬胃酸和膽汁中的穩定性，但作為口服控釋載體， 殼聚糖-海藻酸鈉微球的不足之處主要在于海藻酸鹽與二價金屬離子的凝膠反應是可逆的，在胃酸生理環境中，海藻酸鈣微球中作為交聯劑的Ca2+會與非凝膠離子(如Na+，K+) 發生交換反應，微球結構的穩定性下降，隨著微囊化噬菌體與胃酸接觸時間的延長，H+逐漸擴散至微球內部，噬菌體活性也逐漸下降，結果發現微囊化噬菌體i^elix 01在pH 2.4 的模擬胃液中孵育120min后效價降到檢測限以下[文獻5 :Ma YS, Pacan JC, Wang Q， et al. Microencapsulation of bacteriophage Felix 01 into chitosan—alginate microspheres for oral delivery[J]. Appl Environ Microbiol,2008,74(15) 4799-4805.]。為此，我們需要開發一種改進型噬菌體口服微球制劑，以進一步提高微囊化噬菌體在胃液中的穩定性。
發明內容
本發明提供了一種口服噬菌體微球制劑及制備方法，以解決噬菌體直接口服后活性易遭胃酸和消化酶的破壞，喪失抗菌活性的問題。為實現上述目的，本發明采取以下技術方案一種噬菌體口服微球制劑，包括噬菌體、載體材料和固化劑，其中噬菌體為裂菌活性成分，其含量為IO6 10"PFU/g ；載體材料為海藻酸鈉與乳清蛋白；固化劑為二價金屬陽離子鈣。其中，所述噬菌體口服微球的粒徑可以為200 2000 μ m。本發明還提供了本發明所述口服噬菌體微球制劑的制備方法，包括如下步驟(a)噬菌體懸液制備將噬菌體按感染負數為0. 01 10的比例加入到處對數生長期的宿主菌培養液中，37°C震蕩培養4 他，得到含有噬菌體的裂解液；然后將裂解液 4°C、6500Xg離心lOmin，收集上清液；上清液再經0. 22 μ m水系濾膜過濾后得到噬菌體懸液；(b)配制重量體積比為2 10%乳清蛋白水溶液，并將溶液PH值調至8.0 9.0， 然后加熱至80°C，并孵育30 60min，冷卻至常溫后備用；(C)將步驟(b)所得的乳清蛋白溶液與重量體積比為2 5%的海藻酸鈉溶液等體積混合；(d)將步驟(a)所得噬菌體懸液加入到步驟(C)所得乳清蛋白/海藻酸鈉混合溶液中，攪拌混勻，真空脫氣除去溶液中的氣泡；(e)將步驟(d)所得含有噬菌體的乳清蛋白/海藻酸鈉混合溶液制備成微液滴，滴入到50 200mM的氯化鈣溶液中進行固化反應，得到包埋有噬菌體的乳清蛋白/海藻酸鈉微球。本發明的有益效果1、本發明所述微球制劑中的載體材料為海藻酸鈉和乳清蛋白，兩種材料均具有安全無毒，不與核酸及蛋白發生反應，與噬菌體生物相容性好的特點。2、本發明所述微球制劑中的載體材料海藻酸鈉/乳清蛋白混合凝膠，可有效保護噬菌體免受胃酸和消化酶的破壞作用。3、本發明所述微球制劑中的噬菌體能在腸道環境中有效釋放。
4、本發明所述口服噬菌體微球制劑的制備方法是在常溫水相環境中完成的，條件溫和，避免了高溫，酸和有機溶劑，因此微囊化過程中噬菌體的生物活性能夠完全保留。5、本發明所述口服噬菌體微球制劑的制備方法對噬菌體的包埋效率達到93% 99%。
圖1載噬菌體乳清蛋白/海藻酸鈉微球顯微鏡照片。圖2微囊化噬菌體i^elix 01在模擬胃液中的穩定性。圖3微囊化噬菌體i^elix 01在模擬腸液中的釋放特征。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發明的上述內容作進一步詳細說明，但是本發明不受這些具體實施例的限定，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例1 口服噬菌體微球的制備(1)噬菌體懸液制備本實施例以沙門氏菌噬菌體i^elix 01為代表制備噬菌體懸液。具體步驟簡述如下，從TSA平板上挑取鼠傷寒沙門氏菌Mlmonella Typhimurium DT104單菌落一個，接種到5ml TSB培養基中，37°C 220rpm振蕩培養至菌液進入對數生長期 (0D600 0. 8)。取Iml上述菌液分別與100 μ 1效價約為109PFU/ml噬菌體i^elix 01貯存液混合(感染復數為0. 1)，37°C孵育15 20min，將此細菌-噬菌體混合液轉移至250ml 含IOmM MgSO4的TSB培養基中，37°C 220rpm振蕩培養18h，得到懸濁裂解液，4°C、6500 X g 離心lOmin，收集上清液；上清液再經0. 22 μ m—次性過濾裝置過濾，得到噬菌體懸液。(2)將6g乳清蛋白粉完全溶解在IOOml蒸餾水中，用IM NaOH調pH至8. 0，然后加熱至80°C并孵育30min以充分使之變性，冷卻至常溫后備用。(3)將步驟( 制備的乳清蛋白溶液與3%的海藻酸鈉溶液等體積混合。(4)將噬菌體i^elix 01懸液加入上述乳清蛋白/海藻酸鈉溶液中，使溶液中噬菌體終濃度為108PFU/ml，攪拌混勻后真空脫氣除去溶液中氣泡。(5)用振動噴嘴法將步驟(4)所得含有噬菌體的乳清蛋白/海藻酸鈉混合溶液制備成微液滴，滴入到50mM的氯化鈣溶液中進行固化反應，即可得到包埋有噬菌體的乳清蛋白/海藻酸鈉微球。實施例2 口服噬菌體微球的評價本實施例對實施例1制備的口服噬菌體微球的形態特征與粒徑大小、噬菌體的含量與包埋率、耐酸特性、體外釋放性能等主要特征進行了評價。2. 1微球形態特征與粒徑大小用光學顯微鏡觀察微球形態，并從樣品中隨機取50個微球，用目鏡測微尺測量粒徑，按下式計算微球的平均粒徑(μπι)
平均粒徑O) = YJi Iη結果如圖1所示，可見乳清蛋白/海藻酸鈉微球粒徑均一，球形規整，平均粒徑為 880 士80 μ m。
2. 2噬菌體載藥量與包埋率測定取Ig濕微球加入9ml微球破解液中，室溫下溶解5min后，檢測破解液中噬菌體效價，計算噬菌體載藥量，表示為PFU/g微球。噬菌體包埋率根據下式計算
麵(%)=微ttmf曰量麗初始投入的噬菌體量結果顯示乳清蛋白/海藻酸鈉微球中噬菌體的含量為IO8 109PFU/g，噬菌體平均包埋率達到93. 3士5.7%。2. 3微球中噬菌體對酸的耐受性檢測取5只試管，代表5個反應時間點，分別加入IOml模擬胃液(含胃蛋白酶3. 2mg/ ml, pH 2. 5)，并預熱至37°C。然后分別向每只試管里加入Ig濕態微球，37°C 100r/min振蕩溫育，分別于15，30，60，90，120min后吸去模擬胃液，并立即加入IOml SM緩沖液終止反應，再收集微球樣品并加入9ml微球破解液，室溫溶解5min以釋放微球中的噬菌體，然后檢測破解液中噬菌體的效價。實驗以SM緩沖液作為對照，共重復3次。檢測結果如圖2所示，實施例1制備的微囊化噬菌體i^elix 01經pH 2. 5的模擬胃液處理120min后，效價無顯著降低，表明微囊化噬菌體i^elix 01能抵御胃酸和胃蛋白酶的破壞作用。2. 4微球中噬菌體的體外釋放特征準確稱取500mg實施例1制備的乳清蛋白/海藻酸鈉微球，加入到50ml模擬腸液中(含胰蛋白酶10mg/ml，KH2P0450mM, pH 6. 8), 37 °C lOOr/min振蕩孵育，然后依次按照實驗指定時間取100 μ 1樣品，同時補加等溫等體積的釋放介質，檢測噬菌體效價，并計算噬菌體的累計釋放百分率。檢測結果如圖3所示，微囊化噬菌體i^elix Ol在模擬腸液中孵育4h后累積釋放百分率達到98 %，基本完全釋放。
權利要求
1.一種噬菌體口服微球制劑，包括噬菌體、載體材料和固化劑，其特征在于該噬菌體為裂菌活性成分，其含量為IO6 10"PFU/g ；載體材料為海藻酸鈉與乳清蛋白；固化劑為二價金屬陽離子鈣。
2.如權利要求1所述的噬菌體口服微球制劑，其特征在于所述微球的粒徑為200 2000 μ Hio
3.制備權利要求1或2所述噬菌體口服微球制劑的方法，其特征在于包括如下步驟(a)噬菌體懸液制備將噬菌體按感染負數為0.01 10的比例加入到處對數生長期的宿主菌培養液中，37°C震蕩培養4 他，得到含有噬菌體的裂解液；然后將裂解液4°C、 6500 Xg離心lOmin，收集上清液；上清液再經0. 22 μ m水系濾膜過濾后得到噬菌體懸液；(b)配制重量體積比為2 10%乳清蛋白水溶液，并將溶液pH值調至8.O 9. 0，然后加熱至80°C，并孵育30 60min，冷卻至常溫后備用；(c)將步驟(b)所得的乳清蛋白溶液與重量體積比為2 5%的海藻酸鈉溶液等體積混合；(d)將步驟(a)所得噬菌體懸液加入到步驟(c)所得乳清蛋白/海藻酸鈉混合溶液中， 攪拌混勻，真空脫氣除去溶液中的氣泡；(e)將步驟(d)所得含有噬菌體的乳清蛋白/海藻酸鈉混合溶液制備成微液滴，滴入到50 200mM的氯化鈣溶液中進行固化反應，得到包埋有噬菌體的乳清蛋白/海藻酸鈉微球。
全文摘要
本發明公開了一種噬菌體口服微球制劑及其制備方法，其特征是該噬菌體口服微球制劑包括噬菌體、載體材料和固化劑；噬菌體為裂菌活性成分，其含量為106-1011PFU/g；載體材料為海藻酸鈉與乳清蛋白；固化劑為二價金屬陽離子鈣。本發明還公開了這種噬菌體口服微球制劑的制備方法。本發明的效果和益處是本發明所述微球制劑可有效保護噬菌體免受胃酸和消化酶的破壞作用，并能使噬菌體在動物腸道環境中有效釋放；本發明所述口服噬菌體微球制劑的制備方法是在常溫水相環境中完成的，條件溫和，避免了高溫、酸和有機溶劑，因此微囊化過程中噬菌體的生物活性能夠完全保留。
文檔編號A61K47/42GK102416024SQ20111040447
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者尤建嵩, 徐永平, 曹振輝, 李曉宇, 李淑英, 譚德猛, 金禮吉, 馬永生 申請人:大連理工大學