專利名稱：一種重組腺病毒的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組腺病毒，具體地說是涉及一種重組腺病毒的制備方法及其用途，該重組腺病毒包含hITF全長基因序列，屬生物醫學技術領域。
背景技術：
嚴重燒傷不僅可導致大面積的皮膚及皮下組織損毀，各臟器也都存在不同程度的損害，其中胃腸道損害尤為嚴重，腸道已被視為“燒(創)傷應激的中心器官之一”。燒傷后胃腸粘膜屏障功能受損是引發腸源性感染、腸源性高代高、全身炎癥反應綜合癥(S^S)， 乃至多器官功能障礙(MODS)的重要原因。因此，如何減輕嚴重燒傷后胃腸粘膜損傷，加速胃腸粘膜修復是目前燒傷救治中的重要問題。腸三葉因子(intestinal trefoil factor, ITF)是由腸杯狀細胞特異分泌的小分子多肽，它的59個氨基酸序列中有一段特殊的核心結構域，其間的6個半胱氨酸按特定(1-5，2-4和3-6)的順序，依次以二硫鍵兩兩相接，形成3個環狀結構，整個肽鏈由此發生彎曲和折疊，形如“三葉草”，故名腸三葉因子(ITF)。 ITF 一經發現便受到廣大學者的廣泛關注，大量的研究表明，ITF在腸粘膜的自我保護及修復機制中占據重要地位。作為一個具有廣泛應用前景的藥物前體，卻因為復雜的制備過程、 較低的產量限制了它的應用。基因治療是近年來出現的嶄新的治療手段，是將人正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用， 從而達到治療疾病目的的生物醫學高技術。若通過基因治療的途徑將ITF基因導入體內， 可以使ITF在體內大量表達，有望簡化繁瑣的操作程序、降低昂貴的生產成本。腺病毒作為目前使用最為廣泛的基因傳遞載體，具有眾多優點宿主范圍廣、安全、滴度高、多基因表達、穩定、外源基因容量大、可高水平介導外源基因表達、可感染增殖和非增殖細胞、與人類基因同源性以及免疫途徑簡便。經檢索，目前國內外尚未發現關于構建包含hITF基因的腺病毒載體的報道。
發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處，提供一種重組腺病毒的制備方法及其用途，該重組腺病毒為包含hITF全長基因序列的腺病毒，將hITF基因與穿梭質粒 (pAdTrack-CMV)相連接，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-hlTF ；再將重組穿梭質粒線性化后與骨架質粒PAdEasy-I在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構建重組腺病毒載體Ad-hlTF ； 該重組腺病毒可以高效感染腸上皮細胞，表達出分泌型hITF，顯著地促進腸上皮細胞遷移， 作為藥物對胃腸粘膜損傷具有治療作用。本發明是以如下技術方案實現的一種重組腺病毒的制備方法，它包含人腸三葉因子基因(hITF)的腺病毒，其特征是將hITF基因與穿梭質粒(pAdTrack-CMV)相連接，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-hlTF ；再將重組穿梭質粒線性化后與骨架質粒pAdEasy-1 在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構建重組腺病毒載體Ad-hlTF。所述的一種重組腺病毒的制備方法，其特征是包括如下步驟
(l)hITF基因的獲得腸粘膜組織中總RNA的提取以及引物的設計；(2)重組穿梭質粒的構建含有hITF的信號肽與成熟肽序列，與腺病毒穿梭質粒 PAdTrack-CMV具有相同的內切酶位點BglII、Not I，經相同的兩種內切酶酶切后，兩種質粒分別產生互補的粘性末端，在T4DNA連接酶的作用下，目的基因hITF與腺病毒穿梭質粒 pAdTrack-CMV 相連；(3)重組穿梭質粒與骨架質粒同源重組線性化的重組穿梭質粒加入到BJ5183感受態細菌，37°C過夜培養，挑陽性克隆搖菌、提質粒，Pac I酶切鑒定；(4)重組腺病毒的包裝脂質體介導pAd-hlTF質粒轉染HEK293細胞，腺病毒的收集與擴增以及腺病毒的滴度測定(TCID50法)；所述的重組腺病毒可以高效感染腸上皮細胞，表達出分泌型hITF，顯著地促進腸上皮細胞遷移，作為藥物對胃腸粘膜損傷具有治療作用。所述的重組腺病毒在燒傷小鼠基因治療胃腸粘膜損傷中的應用，首先制備30% TBSA ΙΙΓ燒傷小鼠模型；重組腺病毒灌胃，觀察治療作用。本發明的優點是傳統的hITF治療方法為，通過基因重組技術在體外制備hITF， 其制備過程復雜、純化手段繁瑣、保存條件嚴格，且產量低下；本發明通過制備含有hITF基因的重組腺病毒，口服該腺病毒后hITF可以在胃腸道內源源不斷的產生，無需制備、純化及保存hITF，而且產量高。
圖1為RT-PCR產物電泳圖；圖2為重組質粒酶切鑒定示意圖其中1:DL2000 Marker ；2，3 :Bgl II 和 Not I 雙酶切；4 λ DNA/Hind III ；圖3為重組腺病毒感染HEK293細胞(第一代)；圖4為重組腺病毒感染HEK293細胞(第二代)；圖5為腺病毒AchhITF感染HT-四細胞；圖6為HT-四細胞RT-PCR產物電泳圖；其中1:HT-29cell ；2 :Ad_EGFP感染細胞；3 :Ad_hITF感染細胞；M :DL2000marker圖為 7hITF 的 Western-blot 鑒定；其中(A)細胞總蛋白(B)上清蛋白；1 :Ad-hITF感染；2 =Ad-EGFP感染；3 :HT_29 細胞；圖8為AchhITF對HT-四細胞遷移的影響；其中A:Ad-hITF (Oh) ；B :Ad-hITF (24h) ；C =DMEM(Oh) ；D =DMEM (24h)圖9為各組小鼠腸粘膜病理切片。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明實施例1、重組腺病毒的構建(1)目的基因的獲得組織中總RNA的提取
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引物的設計hITF的信號肽+成熟肽cDNA編碼區的大小為219bp，編碼73個氨基酸。根據在 GenBank檢索得到的hITF mRNA序列(NM003226)，使用I^rimer 5. 0軟件設計以下引物弓丨物 1 5 ‘ -GAGACTCGAGATGCTGGGGCTGGTCCTGG-3 ‘，引物 2 5 ‘ -TTTAGAATTCGGAAGGTGCATTC TGCTTC-3'。上游和下游引物分別引入)(h0I、EC0RI酶切位點(下劃線)，為了閱讀框正確， 引物2添加堿基G (加粗)。反應條件94°C預變性5min后進入循環；94°C變性30sec，6rC退火30sec，72°C 延伸30sec，共30個循環；循環完成后72°C繼續延伸lOmin。結果PCR擴增出與預計長度一致的240bp片段(圖1)。(2)重組穿梭質粒的構建含有hITF的信號肽與成熟肽序列，與腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV具有相同的內切酶位點Bglll、Not I，經相同的兩種內切酶酶切后，兩種質粒分別產生互補的粘性末端，在T4DNA連接酶的作用下，目的基因hITF與腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV相連。重組穿梭質粒經Bgl II, Not I雙酶切后，切出996bp大小的片段，證實為陽性克隆(圖2)。(3)穿梭質粒與骨架質粒同源重組重組穿梭質粒I^c I線性化后加入到BJ5183感受態細菌，37°C過夜培養，挑陽性克隆搖菌、提質粒，Pac I酶切鑒定(4)重組腺病毒的包裝第一輪(脂質體轉染)線性化的腺病毒載體在lipofectamine2000介導下轉染HEK293細胞，2天后出現發綠色熒光細胞，此時光鏡下部分細胞形態沒有明顯改變；5天左右發光細胞大量增加，視野內熒光密集、明亮，成團出現；10天之后全部細胞變成綠色，光鏡下可觀察大量到細胞出現腫脹、變圓等典型的細胞病變效應(CPE)，部分細胞呈葡萄串樣聚集，部分細胞變圓后漂浮(圖3)。4. 2 第二輪將第一輪包裝病毒的上清液，繼續感染HEK293細胞，以進一步提高滴度。若病毒包裝不成功，后續感染HEK293細胞則不會出現熒光；若包裝成功，則會出現熒光，而且隨收集病毒代數的增加，滴度不斷提高，感染效率逐步提高，即HEK293細胞熒光的出現時間會越早，數量會越多。如圖4所示，第二輪感染后1天，出現較多的綠色細胞，此時細胞形態沒有明顯變化；2天后，綠色細胞大量、成團出現，部分細胞腫脹、變圓；3天后，幾乎所有細胞變綠，熒光強度高，大量細胞變圓、漂起(圖4)。(5)重組腺病毒滴度測定取病毒液200 μ 1，將病毒液用DMEM培養液稀釋至10—1倍，病毒液的體積變為2ml ； 從其中取出200 μ 1，將這200 μ 1再稀釋10倍，此時病毒液的體積為anl，而病毒液的濃度為原液的10_2倍；依次類推，直至稀釋至10_1(1，共10管，各管有病毒液1.8ml ；消化HEK293細胞，用DMEM培養液等細胞密度為1 XlO5Ail ；在96孔培養板中每孔加入此細胞懸液100 μ 1， 置于37°C、5%C02細胞培養箱中培養M小時；棄去培養液，滴加稀釋后的病毒液。滴加情況如下第一行滴加10,的病毒液，第二行滴加10_9，依次類推，到第8行時病毒液的稀釋倍數為10_3，每行的第11、12列不加病毒液，以作對照用；置于細胞培養箱中培養，于培養后第5天加入5% FCS-DMEM培養液50 μ 1/孔，繼續培養并于第8天再加入培養液50 μ 1/孔；于培養后第10天顯微鏡下觀察各孔，以培養孔中出現CPE現象為陽性，計數陽性細胞孔數。根據 Karbers公式計算所測樣本病毒載體滴度腺病毒載體滴度=101+1(rattS_°_5)+1TCID50/ml = 10l+l(Ktt -0.5)+l-0.7pfu/ml (注培養孔中只要出現一點CPE現象或綠色熒光，即可認為陽性；
陽性數計算從KT1至10,，IO-1和10_2陽性比例均為1 ；最低稀釋度100%陽性、最高稀釋度 100%陰性方可視為有效)。本方案在293細胞接種腺病毒后10天，觀察到在10_3，IO-4稀釋度的樣本中全部293細胞出現CPE現象，而10,稀釋度則沒有出現CPE現象。按Karbers 公式計算擴增所得腺病毒的滴度為=io1+1(1+1+1+1+1+1+1+1+0-5+0-°5)+1TCID50/ml = 1010TCID50/ml 或者=1093pfu/ml = 2X109pfu/ml實施例2、重組腺病毒促進腸上皮細胞遷移的實驗(1)腸上皮細胞的培養HT-四細胞采用含10% FCS的DMEM培養液，青霉素、鏈霉素各100U/ml，37°C 5% CO2培養，細胞隔天換液一次，每3-4天進行傳代，傳代比例為1 3，選取形態好的細胞用于實驗研究。(2)重組腺病毒感染腸上皮細胞HT-29細胞接種于6孔板細胞，密度5 X IO5個細胞/孔，放置于37°C培養箱內培養過夜，確保第二天的細胞密度達到80%，而且細胞狀態良好、細胞密度適中；選取1孔細胞消化計數，以MOI值50計算所需病毒載體量；以新鮮培養液漂洗6孔板的細胞2次，將病毒加入至6孔板中，新鮮培養液補足至anl，37°C 5% CO2的培養箱培養。結果顯示HT49細胞在MOI = 50條件下感染重組腺病毒，粗略估計感染率接近100% (任一視野，計數表達 GFP的細胞占細胞核的比例)，而細胞形態光鏡下沒有變化(圖5)；(3) RT-PCR 檢測重組腺病毒感染腸上皮細胞后2天收集細胞，提取總RNA，行RT-PCR檢測。圖6顯示，感染了重組腺病毒的腸上皮細胞可以擴出目的條帶，未感染及空病毒感染的細胞均未擴出條帶，說明重組腺病毒感染的腸上皮細胞能轉錄出hITF基因(圖6)。(4) Western blot 檢測重組腺病毒感染細胞6- 后改用無血清培養基，3天后提取細胞及上清，上清蛋白予TCA (三氯乙酸)沉淀濃縮，并經SDS-PAGE電泳后行flfestern blot檢測病毒感染細胞。圖7結果顯示，重組腺病毒感染后細胞內及上清均可以出現一條顯色帶，而未感染組則沒出現顯色帶，表明表達產物能與抗hITF的單克隆相結合，具有抗原性(圖7)。(5)Ad-hITF感染對結腸癌細胞遷移能力的影響收集對數期HT-四細胞，接種于M孔板，調節細胞數5 X IO5/孔，置37°C、5% CO2 溫箱培養；細胞培養過夜后，以MOI值為50的病毒感染細胞，370C 5% CO2培養2_3天；待全部細胞表達GFP后，用10 μ 1吸頭于M孔板底部勻速劃一直線，造成約300 μ m寬的線性機械損傷；用無血清培養液沖洗細胞表面兩次以去除細胞殘骸和碎片；加入無血清的DMEM 溶液繼續孵育，24h后觀察細胞移行情況，測量劃痕寬度變化。如圖8所示，實驗造成寬度約 300 μ m的劃痕，重組腺病毒感染HT-四細胞M小時后劃痕寬度明顯縮小，空載病毒組和無血清DMEM組劃痕寬度縮小不顯著。(圖8)。實施例3、重組腺病毒對燒傷小鼠的胃腸粘膜損傷的治療作用
(1)制備30% TBSA III0燒傷小鼠模型燒傷小鼠傷前禁食12h，l%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，背部電推剃毛后8%硫化鈉脫毛，3%固體汽油燒傷12sec，傷后立即腹腔注射50ml/kg的乳酸林格氏液抗休克，傷后予動物專用飼料喂養，自由進水。實驗分燒傷后天(post burn days，PBD)l、3、5、 7,四個時相點，每個時相點包括B和Ad-hlTF兩組，每組每時相點至少6只小鼠。Ad-hlTF 組于傷前2天予第一次重組腺病毒灌胃，燒傷小鼠麻醉清醒后給予第二次灌胃，劑量均為 2X 108pfu/只，B組給予等量生理鹽水灌胃2次。(2)重組腺病毒灌胃，觀察治療作用腸組織病理學觀察腸組織置10%福爾馬林液中固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，鏡下觀察、照相。 如圖9所示燒傷后3d，病理切片顯示，正常小鼠腸絨毛排列整齊，上皮細胞層完整，表面平滑，黏膜上附有薄層粘液(正常值)。燒傷組腸絨毛排列紊亂、斷裂，上皮細胞水腫、變性、壞死，甚至部分脫落以致固有層裸露(燒傷組)。Ad-hlTF組則上述病理變化減輕，主要以上皮細胞充血和水腫為主，中央乳糜管輕度擴張，腸黏膜上皮基本保持完整，未見腸黏膜大面積出血、壞死和脫落(治療組)。
權利要求
1.一種重組腺病毒的制備方法，它包含人腸三葉因子基因(hITF)的腺病毒， 其特征是將hITF基因與穿梭質粒(pAdTrack-CMV)相連接，構建重組穿梭質粒 pAdTrack-CMV-hlTF ；再將重組穿梭質粒線性化后與骨架質粒pAdEasy-Ι在大腸桿菌 BJ5183中同源重組，構建重組腺病毒載體Ad-hITF。
2.根據權利要求1所述的一種重組腺病毒的制備方法，其特征是包括如下步驟(1)hITF基因的獲得腸粘膜組織中總RNA的提取以及引物的設計；(2)重組穿梭質粒的構建含有hITF的信號肽與成熟肽序列，與腺病毒穿梭質粒 pAdTrack-CMV具有相同的內切酶位點Bglll、Not I，經相同的兩種內切酶酶切后，兩種質粒分別產生互補的粘性末端，在T4DNA連接酶的作用下，目的基因hITF與腺病毒穿梭質粒 pAdTrack-CMV 相連；(3)重組穿梭質粒與骨架質粒同源重組線性化的重組穿梭質粒加入到BJ5183感受態細菌，37°C過夜培養，挑陽性克隆搖菌、提質粒，Pac I酶切鑒定；(4)重組腺病毒的包裝脂質體介導pAd-hlTF質粒轉染HEK293細胞，腺病毒的收集與擴增以及腺病毒的滴度測定(TCID50法)；
3.—種重組腺病毒的用途，其特征是所述的重組腺病毒可以高效感染腸上皮細胞， 表達出分泌型hITF，顯著地促進腸上皮細胞遷移，作為藥物對胃腸粘膜損傷具有治療作用。
4.根據權利要求3所述的一種重組腺病毒的用途，其特征是所述的重組腺病毒在燒傷小鼠基因治療胃腸粘膜損傷中的應用，首先制備30% TBSA ΙΙΓ燒傷小鼠模型；重組腺病毒灌胃，觀察治療作用。
全文摘要
本發明涉及一種重組腺病毒，具體地說是涉及一種重組腺病毒的制備方法及其用途，該重組腺病毒包含hITF全長基因序列的腺病毒，屬生物醫學技術領域。本發明將hITF基因與穿梭質粒(pAdTrack-CMV)相連接，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-hITF；再將重組穿梭質粒線性化后與骨架質粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構建重組腺病毒載體Ad-hITF；該腺病毒可以高效感染腸上皮細胞，表達出分泌型hITF，顯著地促進腸上皮細胞遷移，作為藥物對胃腸粘膜損傷具有治療作用。
文檔編號A61K48/00GK102492723SQ20111040414
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者孫勇, 朱云 申請人:孫勇